Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Zellkultivierung menschlicher dopaminerger Neuronen im Mittelhirn, gefolgt von immunologischen Färbungen und der Generierung neuronaler phänotypischer Profile aus aufgenommenen mikroskopischen High-Content-Bildern, die die Identifizierung phänotypischer Variationen aufgrund genetischer oder chemischer Modulationen ermöglichen.
Abstract
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist mit einer Reihe zellbiologischer Prozesse verbunden, die den Verlust von dopaminergen (mDA) Neuronen im Mittelhirn verursachen. Vielen aktuellen In-vitro-PD-Zellmodellen mangelt es an Komplexität und sie berücksichtigen nicht mehrere Phänotypen. Phänotypisches Profiling in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten mDA-Neuronen kann diese Mängel beheben, indem gleichzeitig eine Reihe von neuronalen Phänotypen in einem Parkinson-relevanten Zelltyp parallel gemessen wird. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung und Analyse phänotypischer Profile von kommerziell erhältlichen humanen mDA-Neuronen. Ein neuronenspezifisches Fluoreszenz-Färbepanel wird verwendet, um die mit Kern, α-Synuclein, Tyrosinhydroxylase (TH) und Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 (MAP2) verwandten Phänotypen zu visualisieren. Das beschriebene phänotypische Profilierungsprotokoll ist skalierbar, da es 384-Well-Platten, automatisches Liquid Handling und Hochdurchsatzmikroskopie verwendet. Der Nutzen des Protokolls wird anhand gesunder mDA-Neuronen von Spendern und mDA-Neuronen veranschaulicht, die die PD-verknüpfte G2019S-Mutation im Gen für die Leucin-reiche Repeat-Kinase 2 (LRRK2) tragen. Beide Zelllinien wurden mit dem LRRK2-Kinase-Inhibitor PFE-360 behandelt und phänotypische Veränderungen gemessen. Darüber hinaus zeigen wir, wie multidimensionale phänotypische Profile mit Hilfe von Clustering oder maschinellem Lernen gesteuerten überwachten Klassifikationsmethoden analysiert werden können. Das beschriebene Protokoll wird besonders für Forscher interessant sein, die an der Modellierung neuronaler Krankheiten arbeiten oder die Wirkung chemischer Verbindungen in menschlichen Neuronen untersuchen.
Introduction
Bei der Parkinson-Krankheit (PD) sind verschiedene zellbiologische Prozesse gestört. Zum Beispiel wurden mitochondriale Dysfunktion, oxidativer Stress, Proteinabbaudefekte, Störung des vesikulären Transports und der endolysosomalen Funktion mit dem Verlust von dopaminergen (mDA) Neuronen im Mittelhirn in Verbindung gebracht, die häufig bei PD1 beobachtet werden. Daher scheint Parkinson mehrere Krankheitsmechanismen zu beinhalten, die miteinander interagieren und sich gegenseitig verschlimmern können. Eine nützliche Möglichkeit, dieses mechanistische Zusammenspiel zu untersuchen, ist die Erstellung eines umfassenden phänotypischen Fingerabdrucks oder Profils von dopaminergen (mDA) Neuronen im Mittelhirn.
Phänotypisches Profiling ist ein Ansatz, bei dem ein Profil einer Stichprobe auf der Grundlage einer Sammlung messbarer Merkmale erstellt wird, und zweitens werden auf der Grundlage dieses Profils Vorhersagen über eine Stichprobe getroffen 2,3. Das Ziel der Profilerstellung ist es, eine Vielzahl von Merkmalen zu erfassen, von denen einige zuvor möglicherweise nicht mit einer Krankheit oder Behandlung in Verbindung gebracht wurden3. Infolgedessen kann das Profiling unerwartete biologische Prozesse aufdecken. Die Erstellung von phänotypischen Profilen beruht in der Regel auf fluoreszenzgefärbten Zellen, und standardisierte Assays, wie z. B. Cell Painting, wurden entwickelt, um phänotypische Profile zu erstellen4. In jüngster Zeit wird phänotypisches Profiling beispielsweise für die Charakterisierung kleiner Moleküle oder die genaue Vorhersage von PD-Subtypen ausschließlich auf der Grundlage von patienteneigenen Fibroblasten eingesetzt 5,6. Trotz dieser Fortschritte wurde die phänotypische Profilerstellung bisher nur selten auf post-mitotisch differenzierte Zellen angewendet, wie z. B. von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete mDA-Neuronen, die PD-assoziierte Mutationen wie LRRK2 G2019S exprimieren. Zu den wesentlichen Herausforderungen von iPSC-abgeleiteten Modellen gehören das Vorhandensein subtiler oder variabler pathologischer Merkmale über Differenzierungschargen oder Genotypen hinweg und die Tatsache, dass isolierte PD-Phänotypen nicht die volle Komplexität der Krankheit erfassen. Darüber hinaus sind neuronale iPSC-Modelle zwar physiologisch relevant, werden aber aufgrund von Bedenken hinsichtlich der technischen Komplexität nur selten in der PD-Wirkstoffforschung eingesetzt 7,8.
Wir haben zuvor eine robuste Methodik entwickelt, um mehrere Parkinson-bedingte pathophysiologische Phänotypen in menschlichen mDA-Neuronen zu messen, die sowohl empfindlich auf genetische als auch auf durch chemische Verbindungen induzierte phänotypische Veränderungen reagieren9. Dieser Artikel beschreibt detailliert eine weiter optimierte Version dieser Methodik, um phänotypische Profile aus mDA-Neuronen zu erstellen (Abbildung 1). Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen phänotypischen Profiling-Ansätzen, wie z.B. die Verwendung hochwertiger mDA-Neuronen und die technische Reproduzierbarkeit. Dieses Protokoll ermöglicht zum ersten Mal ein phänotypisches Profiling in physiologisch relevanten post-mitotischen mDA-Neuronen nach chemischen Störungen in einer hochskalierbaren Weise. Vollständig differenzierte und kryokonservierte mDA-Neuronen sind kommerziell erhältlich, wodurch die Variabilität der Differenzierung von Charge zu Charge erheblich verringert wird. Zweitens kann die technische Variabilität durch ein klar definiertes Versuchsdesign (d. h. Kulturdauer oder Vermeidung von Randvertiefungen), automatisiertes Liquid Handling und automatisierte Mikroskopie weiter reduziert werden. Darüber hinaus werden hier die ersten Schritte der phänotypischen Profilanalyse unter Verwendung von unüberwachtem Clustering oder überwachten Klassifikationsansätzen skizziert, die zeigen, wie phänotypische Profiling-Daten analysiert werden können. Dieses Protokoll wird für Forscher von Nutzen sein, die sich für phänotypische Veränderungen von mDA-Neuronen interessieren, die durch genetische oder chemische Störungen induziert werden, insbesondere wenn ein hochgradig skalierbarer Studienaufbau erforderlich ist, z. B. bei Screening-Kampagnen oder wenn die Wirkung einer kleineren Anzahl von Verbindungen untersucht werden soll, z. B. um toxische Wirkungen zu bestimmen. Zusammenfassend wird erwartet, dass die Anwendung des phänotypischen Profilings menschlicher Neuronen eine wertvolle Technik ist, um komplexe krankheitsbedingte Phänotypen zu untersuchen und die zellulären Effekte von Wirkstoffkandidaten zu charakterisieren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls zur Generierung bildbasierter phänotypischer Profile aus humanen iPSC-abgeleiteten mDA-Neuronen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Protocol
1. Vorbereitung des Mediums und der Platten für das Neuronen-Seeding (Tag 1)
- Um die Platten für die Aussaat der Neuronen an Tag 1 vorzubereiten, erwärmen Sie Laminin kurz vor der Anwendung auf Raumtemperatur (RT). Bereiten Sie die Lamininlösung vor, indem Sie die Laminin-Stammlösung (0,1 mg/ml) 1/10 in kaltem PBS+/+ (mit Ca 2+ und Mg2+) verdünnen.
HINWEIS: Alle Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Zusammensetzung von Lösungen und Puffern ist in den Tabellen 1-4 beschrieben. - Dann werden 25 μl der Lamininlösung in jede Vertiefung einer Poly-D-Lysin (PDL) vorbeschichteten 384-Well-Platte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die beschichteten Platten können bei 4 °C bis zu einer Woche gelagert werden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier bis zu einer Woche pausiert werden. Versiegeln Sie die Platten mit Kunststofffolie. - Bereiten Sie Complete Maintenance Media vor und lagern Sie es bis zu einem Monat bei 4 °C (Tabelle 1).
2. Auftauen von Neuronen (Tag 0)
- Um die Neuronen an Tag 0 aufzutauen, wird ein Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt und das Complete Maintenance Media lichtgeschützt auf RT gestellt.
- Nehmen Sie das Fläschchen mit den im Handel erhältlichen gefrorenen Neuronen (siehe Materialtabelle) aus dem Flüssigstickstofftank und legen Sie es auf Trockeneis. Stellen Sie dann die Durchstechflasche für 2 Minuten in das Wasserbad. Sobald die Flüssigkeit vollständig aufgetaut ist, desinfizieren Sie die Durchstechflasche mit 70%igem Ethanol.
- Die aufgetauten Neuronen werden mit einer P1000-Pipette (ca. 370 μl) abgesaugt und in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen ohne Auf- und Abpipettieren überführt. Als nächstes wird die Durchstechflasche mit 630 μl Complete Maintenance Medium gespült und tropfenweise (45°-Winkel) in das 50-ml-Röhrchen gegeben. Während der Dosierung langsam rühren.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Medium langsam Tropfen für Tropfen zu dosieren, um einen osmotischen Bruch der Zellen zu vermeiden. Ein Winkel von 45° und leichtes Rühren minimiert den hohen lokalen osmotischen Druck während des Pipettierens. - In ähnlicher Weise 1 ml vollständiges Erhaltungsmedium in das 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer P1000-Pipette geben. Fügen Sie dann langsam 2 ml Complete Maintenance Medium hinzu. Während der Abgabe vorsichtig umrühren.
- Zähle die Zellen. Bereiten Sie ein Mikroröhrchen mit 10 μl Trypanblau und 10 μl Zellsuspension vor und geben Sie es in einen Objektträger der Zählkammer (10 μl). Führen Sie die Zählung mit einem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle) oder manuell durch.
- Nach dem Zählen zentrifugieren Sie das 50-ml-Röhrchen mit den Neuronen bei 400 x g 5 Minuten lang bei RT und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer P1000-Pipette und 1 ml Complete Maintenance Medium. Geben Sie dann das erforderliche Volumen hinzu, um die gewünschte Konzentration zu erreichen (300.000 Zellen/ml, siehe auch nächster Schritt).
3. Aussaat von Neuronen auf präparierten Platten (Tag 0)
- Um Neuronen auf den vorbereiteten Platten an Tag 0 auszusäen, nehmen Sie die beschichteten Platten aus dem Kühlschrank, legen Sie sie unter die Zellkulturhaube und lassen Sie sie etwa 30 Minuten lang zu RT äquilibrieren.
- Saugen Sie kurz vor der Aussaat 15 μl Beschichtungslösung mit einem automatisierten Liquid Handler oder einer 16-Kanal-Pipette an. Lassen Sie ca. 10 μl pro Vertiefung stehen, um eine Beschädigung der Beschichtung zu vermeiden.
- Als nächstes werden 50 μl der Zelllösung mit 300.000 Zellen/ml (hergestellt in Schritt 2.6) pro Vertiefung mit einer 16-Kanal-Pipette abgegeben, was zu 15.000 ausgesäten Neuronen pro Vertiefung und einem Endvolumen pro Vertiefung von 60 μl führt.
- Vermeiden Sie bei einer 384-Well-Platte die Verwendung der Spalten 1, 2, 23, 24 und der Zeilen A, B, O und P, um mögliche Kanteneffekte zu minimieren, die sich auf die phänotypischen Profile auswirken können. Füllen Sie die unbenutzten leeren Vertiefungen mit 80 μl PBS. Die Platten werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
4. Mediumwechsel oder Compound-Behandlung (Tag 3)
- Abhängig von der Anzahl der Vertiefungen eine angemessene Menge des Complete Maintenance Mediums bei RT vorwärmen. Vor Licht schützen.
- Wenn ein Medienwechsel erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Wenn eine Behandlung der Verbindung gewünscht wird, überprüfen Sie die Konzentration der Verbindung und das verwendete Lösungsmittel (Wasser, DMSO, Methanol usw.).
- Bereiten Sie eine 1,5-fach konzentrierte Verbindungslösung für alle gewünschten zu testenden Konzentrationen vor. Bereiten Sie die Verdünnungen der Verbindung mit Complete Maintenance Medium vor.
HINWEIS: Verwenden Sie als neutrale Kontrolle das entsprechende Lösungsmittel in der gleichen Konzentration wie die getestete Verbindung. Wenn mehrere oder unbekannte Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden, ist es ratsam, ein separates Dosis-Wirkungs-Experiment durchzuführen, um die Auswirkungen des Lösungsmittels auf das phänotypische Profil zu messen. - Wenn ein automatisches Pipettiersystem verwendet wird, geben Sie 60 μl der 1,5-fachen Verbindungslösung auf eine 384-Well-Aufbewahrungsplatte. Alternativ können Sie auch eine 16-Kanal-Pipette verwenden. Wenn ein Medienwechsel erforderlich ist, fügen Sie stattdessen 60 μl Complete Maintenance Medium hinzu.
- Mit dem automatischen Pipettiersystem werden 40 μl Medium pro Vertiefung von der neuronenhaltigen Platte abgesaugt und verworfen, um 20 μl pro Vertiefung zu erhalten. Geben Sie dann 40 μl/Well 1,5x Verbindungslösung von der 384-Well-Speicherplatte in jede Well, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten.
HINWEIS: Es ist wichtig, keinen vollständigen Medienwechsel durchzuführen, sondern immer Restmedium in der Vertiefung zu belassen, um eine Beschädigung des neuronalen Teppichs oder der Beschichtung zu vermeiden. - Falls die neuronale Kultur länger als die in diesem Protokoll beschriebenen 6 Tage dauert, wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
5. Neuronenfixierung und -färbung (Tage 6 bis 7)
- Um die Neuronen an den Tagen 6 und 7 zu fixieren und zu färben, verwenden Sie einen automatischen Liquid Handler für alle Abgabe- und Waschschritte. Alternativ können Sie auch eine 16-Kanal-Pipette verwenden.
- Bereiten Sie eine 10%ige Triton X-100-Lösung vor, indem Sie Triton X-100 in 1x PBS verdünnen. Vortex, bis die Lösung homogen ist. Bei 4 °C lagern.
- Um die Neuronen zu fixieren, geben Sie 20 μl/Well 16% PFA ab, was zu einer Endkonzentration von 4% führt. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten bei RT und waschen Sie sie dreimal mit 1x PBS. Lassen Sie 20 μl/Well PBS nach der letzten Wäsche stehen.
VORSICHT: PFA ist als gefährliche Substanz anerkannt, von der bekannt ist, dass sie orale, dermale und respiratorische Toxizität verursacht. Es stellt auch eine Gefahr für die Augen dar und kann zu genetischen Mutationen und Krebs führen. Der richtige Umgang mit PFA erfordert die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, wie z. B. Augen- und Gesichtsschutz, sowie die Sicherstellung einer ordnungsgemäßen Belüftung. Es ist wichtig, die Freisetzung von PFA in die Umwelt zu verhindern. - Für die Permeabilisierung und Blockierung wird eine 2-fache Blockierungslösung hergestellt (Tabelle 2).
- 20 μl/Well 2x Blockierungslösung (1x Endkonzentration) zugeben, 1 h bei RT inkubieren und einmal mit PBS waschen. Bewahren Sie 20 μl/Well PBS nach dem Waschen auf.
- Für die Färbung von Primärantikörpern (siehe Materialtabelle) ist ein 2-facher Primärfärbepuff herzustellen (Tabelle 3).
- 20 μl/Well 2x primären Färbepuffer (1x Endkonzentration) zugeben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Am nächsten Morgen an Tag 7 dreimal mit PBS waschen. Lassen Sie nach dem Waschen 20 μl/Wells PBS stehen.
- Für die Färbung von Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) ist ein 2-facher sekundärer Färbepuff vorzubereiten (Tabelle 4).
- 20 μl/Well 2x sekundären Färbepuffer (1x Endkonzentration) hinzufügen, 2 h bei RT ohne Licht inkubieren und dreimal mit PBS waschen. Lassen Sie 100 μl PBS/Well nach der letzten Wäsche stehen.
- Fügen Sie der Platte eine Aluminiumversiegelung hinzu, um die Verdunstung zu minimieren. Alternativ können Sie die Platte auch mit Plastikfolie und Alufolie abdecken. Fahren Sie mit der Bildaufnahme fort oder lagern Sie die Platte bei 4 °C.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier bis zu einer Woche pausiert werden. Wenn Hintergrundfluoreszenz beobachtet wird, sollten Sie die Blockierungszeit erhöhen. Wenn die Färbung nicht ausreicht, versuchen Sie, die Primärantikörperkonzentration oder die Inkubationszeit zu erhöhen.
- Fügen Sie der Platte eine Aluminiumversiegelung hinzu, um die Verdunstung zu minimieren. Alternativ können Sie die Platte auch mit Plastikfolie und Alufolie abdecken. Fahren Sie mit der Bildaufnahme fort oder lagern Sie die Platte bei 4 °C.
6. Bildgebung fluoreszenzgefärbter Neuronen (Tag 7)
- Nehmen Sie Bilder der plattierten, kultivierten und gefärbten Neuronen an Tag 7 auf. Idealerweise verwenden Sie ein automatisiertes konfokales Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle). Alternativ können Sie Bilder auch manuell erfassen.
- Erfassen Sie die Hoechst-, TH-, α-Synuclein- und MAP2-Kanäle mit 405-nm-, 488-nm-, 561-nm- bzw. 647-nm-Lasern (Abbildung 2).
HINWEIS: Um eine ausreichende Menge an detaillierten Daten für die phänotypische Profilerstellung zu generieren, verwenden Sie ein 40-faches Objektiv und erfassen Sie 16 Felder/Wells mit Z-Stapeln, die aus 3 Z-Schichten bestehen, die durch 2 μm getrennt sind. Falls es pipettierbedingte Schäden im neuronalen Teppich gibt, versuchen Sie, eine Bildgebung dieser Bereiche zu vermeiden. - Stellen Sie je nach Mikroskop und Kamera die Belichtungszeiten und Anregungsintensitäten für jeden der vier Fluoreszenzkanäle separat ein, um einen optimalen Dynamikbereich der Fluoreszenzintensitäten zu erhalten.
HINWEIS: Bildgebungssoftware liefert oft ein Histogramm, um die ideale Belichtungszeit zu bestimmen. Ist das Histogramm im niedrigen Signalbereich zu stark nach links verschoben, dann ist die Belichtungszeit zu kurz oder die Anregungsintensität zu gering. Befindet sich rechts beim maximalen Signalpegel eine scharfe Klippe, so ist der Signalwert gesättigt. Reduzieren Sie in diesem Fall die Anregungsintensität oder verkürzen Sie die Belichtungszeit. - Speichern Sie Bilder in einem verlustfreien und offenen Format wie .tif.
7. Bildverarbeitung (Tag 8)
- Bildsegmentierung und phänotypische Merkmalsextraktion sind für die Erstellung quantitativer phänotypischer Profile erforderlich. Verwenden Sie die PhenoLink-Software für die Bildsegmentierung und Merkmalsextraktion (Materialtabelle). Eine Anleitung zur Installation von PhenoLink finden Sie im GitHub-Repository (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
HINWEIS: Die Bildsegmentierung wird verwendet, um verschiedene Objekte oder Regionen in einem Bild zu identifizieren und zu trennen, während die Extraktion phänotypischer Merkmale verwendet wird, um relevante Informationen aus diesen Regionen zu analysieren und zu extrahieren. Es stehen mehrere alternative Softwarelösungen zur Verfügung, wie z. B. CellProfiler10, ImageJ/FIJI 11, Napari 12 oder die Knime Analytics Platform13, um quantitative Informationen aus Mehrkanal-Fluoreszenzbildern zu extrahieren. - Führen Sie eine Bildsegmentierung für beleuchtungskorrigierte RAW-Bilder durch. Bestimmen Sie die jeweiligen Intensitätsschwellen des Fluoreszenzkanals empirisch pro Platte, so dass das Hintergrundsignal minimal ist und das gewünschte segmentierte Signal dem Signal im Rohbild entspricht. Platten, die am selben Tag verarbeitet und gefärbt werden, erfordern in der Regel vergleichbare Kanalintensitätsschwellen für die Segmentierung.
- Definieren Sie die Größe und Intensität des Zellkerns, um lebende von toten Zellen zu trennen. Wenn Sie 40x-Bilder verwenden, behalten Sie alle anderen Standardparameter bei und führen Sie die Software aus. Pro Well werden einhundertsechsundzwanzig quantitative Bildmerkmale berechnet (Ergänzende Tabelle 1).
- Verwenden Sie die resultierenden tabellarischen quantitativen Daten, um phänotypische Profile zu erstellen und phänotypische Profile aus verschiedenen Zelllinien oder Behandlungsbedingungen zu vergleichen. Jede Zeile entspricht einem biologischen Zustand (Well) und jede Spalte entspricht einem bestimmten phänotypischen Merkmal.
HINWEIS: Wir stellen eine Beispielausgabedatei zusammen mit der Datenanalyse-Pipeline zur Verfügung, um ihre Verwendung zu veranschaulichen (siehe Materialtabelle). Zusätzlich zeigt Abbildung 3 die Zusammensetzung eines phänotypischen Profils.
8. Erstellung und Visualisierung phänotypischer Profile (Tag 8)
- Wenn Sie Python und Jupyter nicht auf Ihrem Computer installiert haben, installieren Sie die Anaconda-Distribution, und öffnen Sie die Jupyter-Software. Laden Sie das bereitgestellte Jupyter-Notebook und alle anderen bereitgestellten Dateien herunter, und speichern Sie sie im selben Verzeichnis (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie die Jupyter-Notebook-Datei mit der Jupyter-Software.
HINWEIS: Anaconda ist eine kostenlose Open-Source-Plattform für Programmiersprachen wie Python. Diese Plattform wird mit dem Python-Interpreter Jupyter geliefert, der das bereitgestellte Jupyter-Notebook ausführen kann, um phänotypische Profile (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling) zu erstellen und zu analysieren. - Führen Sie das Jupyter-Notebook mithilfe der Jupyter-Software Zelle für Zelle aus. Die bereitgestellten Beispieldaten-, FTH- und .txt-Anforderungsdateien müssen sich im selben Verzeichnis wie das Jupyter-Notebook befinden. Jede Jupyter Notebook-Zelle ist mit Anmerkungen versehen, um ihre Funktionalität zu erläutern.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Jupyter-Notebook in der richtigen Reihenfolge zu verwenden, beginnend mit dem Laden und Skalieren der Daten, und Zelle für Zelle bis zum Ende fortzufahren. Alle Daten- und Grafikausgaben werden in einem neu erstellten Ordner im Quellverzeichnis des Jupyter Notebooks gespeichert. Abbildung 4 zeigt den Workflow und die Workflow-Ausgabe.
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Representative Results
Das phänotypische Profiling in mDA-Neuronen ist ein effizienter Weg, um mehrere Aspekte der Zellbiologie und ihre Veränderungen während der experimentellen Modulation zu quantifizieren. Um diese Methodik zu veranschaulichen, wurden in dieser Studie kryokonservierte LRRK2 G2019S und gesunde Spender-mDA-Neuronen verwendet. Diese Neuronen wurden seit ca. 37 Tagen differenziert, sind postmitotisch und exprimieren neuronale Marker (TUBB3 und MAP2) und dopaminerge Neuronenmarker, einschließlich Tyrosinhydroxylase (TH) in Kombination mit FOXA2, während der gliale Marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) fehlt14. Dem beschriebenen Protokoll folgend, wurden beide Zelllinien 6 Tage lang kultiviert und mit 0,1 μM PFE-360, einem LRRK2-Kinase-Inhibitor, behandelt. Die Neuronen wurden mit dem Kernfarbstoff Hoechst und Antikörpern gegen α-Synuclein, TH und MAP2 gefärbt (Abbildung 2).
Als nächstes wurden die Bilder segmentiert und phänotypische Merkmale extrahiert. Wir haben 126 quantitative Merkmale bestimmt, die zu gut basierten phänotypischen Profilen aggregiert werden können (Abbildung 3A,B). Auf jedes Merkmal und seinen Wert gemäß der Versuchsbedingung kann zugegriffen werden. Einige Merkmale zeigten Veränderungen nach der Behandlung mit Wirkstoffen. Zum Beispiel nahm die Intensität der α-Synuclein-Fluoreszenz in TH-positiven Zellen nach PFE-360-Behandlung ab (Abbildung 3C, links). Andere Merkmale zeigten nur Unterschiede zwischen den getesteten Zelllinien, jedoch nicht bei der Behandlung mit Substanzen. Dies war zum Beispiel der Fall bei der Länge des MAP2-Neuritennetzwerks oder dem Verhältnis von TH-positiven Neuronen (Abbildung 3C, Mitte und rechts). Es ist wichtig, das gesamte phänotypische Profil zu betrachten, um die phänotypischen Variationen in verschiedenen Zelllinien oder Wirkstoffbehandlungen weniger selektiv und umfassend zu analysieren.
Während der Bildanalyse werden immer alle 126 Merkmale berechnet. Ebenso werden bei der Datenanalyse alle Merkmale berücksichtigt, aber der Algorithmus des maschinellen Lernens weist einzelnen Merkmalen Gewichtungen zu, um die biologischen Klassen zu trennen. Der Datenanalyse-Workflow beginnt mit dem Laden von Daten und der Featureskalierung (Abbildung 4A). Die Skalierung ist für maschinelles Lernen wichtig, da sie zur Normalisierung der Daten beiträgt und sicherstellt, dass sich jedes Feature in einer ähnlichen Größenordnung befindet. Dies kann dazu beitragen, die Leistung von Machine Learning-Algorithmen zu verbessern, indem sie weniger empfindlich auf die Skalierung der Eingabefeatures reagieren. Darüber hinaus kann die Skalierung dazu beitragen, die Interpretierbarkeit von Machine Learning-Modellen zu verbessern, indem die relative Bedeutung verschiedener Features leichter verglichen werden kann. Im nächsten Schritt wird eine Clustering-Analyse durchgeführt (Abbildung 4B). Clustering kann nützlich sein, um die Struktur hochdimensionaler Datasets zu untersuchen und Muster in den Daten zu identifizieren, die bei der Betrachtung einzelner Features möglicherweise nicht sofort erkennbar sind. Hierarchisches Clustering basierend auf dem Kosinusabstand zwischen gut basierten phänotypischen Profilen zeigte starke Unterschiede zwischen den Zelllinien, jedoch weniger für die medikamentöse Behandlung. Daten aus PFE-360-behandelten Vertiefungen, die innerhalb der DMSO-behandelten Kontrolle zusammengefasst waren, deuten auf keine starken Unterschiede bei dieser Vergleichsmetrik hin. Neben dem Clustering sind Dimensionsreduktionsansätze auch nützliche Werkzeuge, um die Ähnlichkeiten und Unterschiede von multidimensionalen phänotypischen Profiling-Daten zu visualisieren. Hier haben wir die Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP) verwendet15 (Abbildung 4C). Ähnlich wie der vorherige Kosinus-Distanz-basierte Ansatz zeigte PaCMAP hauptsächlich Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien und in geringerem Maße zwischen PFE-360- oder DMSO-Kontroll-behandelten Wells. Sowohl das Cosinus-Distanz-Clustering als auch PaCMAP sind unüberwachte Methoden und es ist unwahrscheinlich, dass sie kleine Unterschiede erkennen, die nur in ausgewählten phänotypischen Merkmalen vorhanden sind, z. B. weil eine Verbindung nur wenige Phänotypen verändert (d. h. nur neuritenbezogene Merkmale). Um diese Einschränkung der phänotypischen Profilanalyse zu beheben, führten wir eine durch maschinelles Lernen gesteuerte überwachte Klassifikation durch. Konkret haben wir die Light gradient-boosting machine (LightGBM) (Abbildung 4D). LightGBM ist ein überwachter Algorithmus für maschinelles Lernen, der Entscheidungsbaumalgorithmen verwendet, um ein Modell zu erstellen, das für die Rangfolge oder Klassifizierung verwendet werden kann16. LightGBM wurde entwickelt, um schneller und effizienter zu sein als herkömmliche baumbasierte Algorithmen wie den Random-Forest-Algorithmus. Der Algorithmus wurde mit phänotypischen Profildaten von einer Platte trainiert und testete das trainierte Modell an Daten von einer zweiten unabhängigen Platte. Das LightGBM-Modell hatte eine Gesamtgenauigkeit von 85 % und sagte die experimentelle Kategorie (Zelllinie oder Verbindung) der meisten Wells korrekt voraus. Die Genauigkeit für die Vorhersage von Zelllinien war höher als für die Vorhersage von Verbindungen, aber auch 60% der mit Substanzen behandelten Wells wurden korrekt vorhergesagt, was klassischen unüberwachten Methoden überlegen ist. LightGBM ermöglicht den Zugang zur Bedeutung der jeweiligen phänotypischen Merkmale für die Klassifikation der vier Klassen (Abbildung 4D). Wichtige phänotypische Merkmale, die die Zelllinien und die medikamentöse Behandlung unterscheiden, hängen beispielsweise mit der zellulären Oberfläche oder den zellulären Intensitäten der MAP2- und TH-Färbungen zusammen. Die Oberfläche des doppelt positiven Zytoplasmas von TH und α-Synuclein war das wichtigste Merkmal, das Zelllinien und Substanzbehandlungen unterschied, gefolgt vom Verhältnis der toten Zellen. Wir stellen ein Jupyter-Notebook zur Verfügung, das die Datendarstellung und alle hier beschriebenen unüberwachten und überwachten Analysemethoden durchführt (siehe Material-Tabelle). Die erhaltenen Ergebnisse veranschaulichen das Potenzial des phänotypischen Profilings zur Unterscheidung von Zelllinien und Wirkstoffbehandlungseffekten in menschlichen mDA-Neuronen.
Abbildung 2: Immunfärbung von humanen iPSC-abgeleiteten mDA-Neuronen. Es werden repräsentative Bilder aller aufgenommenen Fluoreszenzkanäle gezeigt. Gesunde Spender- oder LRRK2 G2019S-Mutation tragende mDA-Neuronen wurden entweder mit DMSO oder mit 0,1 μM des LRRK2-Kinase-Inhibitors PFE-360 behandelt. Die Behandlung wurde an Tag 3 durchgeführt und die Zellen wurden an Tag 6 fixiert, wie im Protokoll beschrieben. Maßstabsleisten: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erstellung eines phänotypischen Profils aus einzelnen phänotypischen Merkmalen. (A) Ausgewählte phänotypische Merkmale, die aus den einzelnen Fluoreszenzkanälen extrahiert werden können, sind dargestellt. (B) Phänotypische Merkmale können zu einem phänotypischen Profil aggregiert werden. Mehrere phänotypische Profile können unter verschiedenen experimentellen Bedingungen auf der 384-Well-Platte generiert werden. (C) Beispiele für phänotypische Merkmale und ihre entsprechenden Werte pro Versuchsbedingung. Jeder Datenpunkt entspricht einer Messung aus einer Vertiefung. Welchs t-Test für ungleiche Varianzen wurde für Signifikanztests verwendet. Die statistische Signifikanz wird als * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 und nicht signifikant (ns = p > 0,05) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Phänotypische mDA-Neuronenprofile enthalten quantitative Informationen und können zur Klassifizierung von Phänotypen verwendet werden . (A) Schematische Übersicht über den Datenanalyse-Workflow. (B) Aggregierte phänotypische Profile von Kontroll- und medikamentenbehandelten mDA-Neuronen. (C) Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP) unüberwachte Dimensionsreduktion von phänotypischen Profildaten. (D) Light gradient-boosting machine (LightGBM) überwachte die Klassifizierung von phänotypischen Profildaten. Der Klassifikationsalgorithmus wurde mit phänotypischen Profildaten einer Platte trainiert und zur Vorhersage experimenteller Klassen in einer zweiten Platte angewendet. Linkes Bild: Die Konfusionsmatrix zeigt die Beziehung zwischen den vier wahren Datenklassen und den vier vom Modell vorhergesagten Klassen. Insgesamt prognostiziert das Modell die Datenklasse in 85 % der Fälle korrekt. Rechts: Die 10 wichtigsten phänotypischen Merkmale für den LightGBM-Klassifikator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenzien | Für 100 mL |
| iCell Basismedium 1 | 100 ml |
| iCell Neurale Ergänzung B | 2 ml |
| iCell Nahrungsergänzungsmittel für das Nervensystem | 1 ml |
Tabelle 1: Zusammensetzung der kompletten Wartungsmedien.
| Reagenz | 2x Lösung | Endkonzentration | Für 100 mL |
| PBS 1x | 1 | 1 | 78 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS-Lagerlösung | 20% | 10% | 20 ml |
Tabelle 2: Zusammensetzung der 2x Blockierungslösung.
| Reagenz | 2x Konzentration | Endkonzentration | Für 100 mL |
| PBS 1x | 1 | 1 | 87,36 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS-Lagerlösung | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-TH | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-α-Synuclein | 1/250 | 1/500 | 0,4 ml |
| Anti-MAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0,04 ml |
Tabelle 3: Zusammensetzung des primären Färbepuffers.
| Reagenz | 2x Konzentration | Endkonzentration | Für 100 mL |
| PBS 1x | 1 | 1 | 86,7 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS-Lagerlösung | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-Maus A488 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-Kaninchen A555 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-Huhn A647 | 1/125 | 1/250 | 0,8 ml |
| Hoechst | 1/1000 | 1/2000 | 0,1 ml |
Tabelle 4: Zusammensetzung von 2x sekundärem Färbepuffer.
Ergänzende Tabelle 1: Übersicht über alle extrahierten phänotypischen Merkmale. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Phänotypisches Profiling ist eine Technik zur Messung einer großen Anzahl von Phänotypen in Zellen durch Fluoreszenzfärbungen, Mikroskopie und Bildanalyse3. Phänotypische Profile können über Zelllinien oder andere experimentelle Bedingungen hinweg erstellt und verglichen werden, um komplexe Veränderungen in der Zellbiologie zu verstehen, die bei Verwendung einer einzigen Auslesung möglicherweise unbemerkt bleiben. Hier beschreiben wir die Anwendung von phänotypischem Profiling auf humane iPSC-abgeleitete mDA-Neuronen, einen Zelltyp, der häufig zur Modellierung der PD-Zellbiologie verwendet wird17,18,19. Das phänotypische Profiling in mDA-Neuronen hat mehrere Vorteile gegenüber bisher verwendeten Profiling-Ansätzen, die generische Fluoreszenzfärbungen verwenden4, nicht-neuronale Zelltypen 5,6 oder nicht skalierbar sind 7,8. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht ein phänotypisches Profiling in physiologisch relevanten post-mitotischen mDA-Neuronen. Zweitens verringert die Verwendung von iPSC-abgeleiteten kryokonservierten mDA-Neuronen die Variabilität der Differenzierung von Charge zu Charge signifikant. Drittens kann durch die Verwendung eines klar definierten Versuchsdesigns, automatisiertes Liquid Handling und automatisierte Mikroskopie die technische Variabilität weiter reduziert werden, was das Protokoll hochgradig skalierbar macht und die Möglichkeit eröffnet, mDA-Neuronen für phänotypische Screening-Kampagnen zu verwenden. Schließlich gibt die überwachte Klassifikation den Benutzern die Möglichkeit, die wichtigsten Merkmale phänotypischer Profile zu gruppieren und zu verstehen, und kann daher dazu beitragen, neue Biologie aufzudecken.
Das phänotypische Profiling ermöglicht die Erforschung einzelner Merkmale, um Folgehypothesen zu entwickeln, die zu nachfolgenden mechanistischen Studien führen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass sich LRRK2 G2019S mDA-Neuronen von Kontroll-mDA-Neuronen anhand ihres α-Synuclein-Gehalts, der MAP2-Neuritenlänge und des Verhältnisses von TH-positiven Zellen unterscheiden (Abbildung 3C). Die Behandlung mit dem LRRK2-Kinase-Inhibitor PFE-360 verändert jedoch nur den Gehalt an α-Synuclein und hat keinen Einfluss auf die MAP2-Neuritenlänge oder das Verhältnis von TH-positiven Zellen. Eine wünschenswerte chemische Verbindung sollte ein Ensemble von Phänotypen retten. Ein phänotypisches Profil enthält die erforderlichen Informationen und kann mit Hilfe von Clustering- oder Dimensionalitätsreduktionstechniken untersucht werden, die dazu beitragen können, komplexe Merkmalsinteraktionen in 2-dimensionalen Diagrammen zu visualisieren. Die auf dem Kosinusabstand basierende Clusterbildung ermöglicht die genaue Trennung beider Zelllinien (Abbildung 4B). Die Dimensionsreduktion mit PaCMAP verdeutlicht weiterhin, wie beide Zelllinien unterschiedliche Cluster bilden und dass die PFE-360-Behandlung zu unterscheidbaren, aber dennoch ähnlichen Phänotypen führt, was wahrscheinlich auf die Auswirkungen auf nur wenige gemessene Merkmale wie den α-Synuclein-Gehalt zurückzuführen ist (Abbildung 4C). Im Gegensatz dazu kann überwachtes maschinelles Lernen dazu beitragen, interessante Profile anhand ihrer Merkmale vorherzusagen. Das LightGBM-Modell, das mit den Daten trainiert wurde, sagte die gesunden Spender- und LRRK2-mutierten mDA-Neuronen in den Testdaten genau voraus. Die Identifizierung von PFE-360-behandelten Neuronen war weniger genau, vermutlich weil die Auswirkungen chemischer Verbindungen auf die Phänotypen schwächer sind als die genetischen Effekte (Abbildung 4C). Die Oberfläche des doppelt positiven Zytoplasmas von TH und α-Synuclein war das wichtigste Merkmal, das Zelllinien und Wirkstoffbehandlungen unterschied, gefolgt vom Verhältnis der toten Zellen. Mehrere andere Top-Merkmale hingen mit der Zelloberfläche zusammen. Daher scheint die Zellgröße ein allgemeines Unterscheidungsmerkmal zwischen gesunden Kontroll- und LRRK2-mutierten mDA-Neuronen zu sein (Abbildung 4D). Dieser Ansatz zeigt daher, wie maschinelles Lernen die wichtigsten phänotypischen Merkmale in einem komplexen Datensatz identifizieren kann, die dann verwendet werden können, um neue Hypothesen zu entwickeln und diese Hypothesen in sekundären Assays zu testen.
CellPainting hat sich zu einem beliebten Ansatz zur Erstellung phänotypischer Profile entwickelt und verwendet einen standardisierten Satz von Fluoreszenzsonden und ein definiertes Protokoll 3,4,20,21,22,23. Hier entschied man sich für ein mDA-Neuronen-spezifisches Färbepanel, bestehend aus der Hoechst-Kernfärbung und Antikörpern gegen α-Synuclein, TH und MAP2. Andere Fluoreszenzfärbungen mit einem Lysosomen-assoziierten LAMP1-Antikörper oder Mitochondrien-Targeting-Farbstoffen TMRM oder MitoTracker wurden von uns in der Vergangenheit angewendet und konzentrieren sich auf spezifischere Aspekte der Parkinson-Zellbiologie9. Die Standard-Lichtmikroskopie ist insofern begrenzt, als nur vier Fluoreszenzwellenlängen aufgelöst werden können. Das Hinzufügen von lysosomalen oder mitochondrialen Färbungen zum aktuellen Färbepanel ist daher nicht ohne weiteres möglich. Je nach biologischer Fragestellung konnten Färbungen ausgetauscht werden. Alternativ könnten zwei biologische Strukturen mit der gleichen Wellenlänge gefärbt werden, unter der Bedingung, dass ihre Morphologie unterscheidbar ist und sie in verschiedenen Zellkompartimenten lokalisiert sind.
Um die Screening-Kompatibilität des Protokolls zu erhöhen, wurde es so konzipiert, dass es eine minimale Anzahl von Pipettierschritten und eine kurze Kulturdauer erfordert. Entscheidend für die Methode sind alle Liquid-Handling-Schritte, da sie die Beschichtung beeinträchtigen oder zur Ablösung von Neuronen führen können. Wie im Protokoll angegeben, wird empfohlen, immer eine Restmenge des Mediums im Well zu verbleiben. Es ist auch wichtig, mit den mDA-Neuronen vorsichtig umzugehen, da es sich um einen sehr fragilen Zelltyp handelt. Führen Sie das Auftauen genau wie angegeben durch, um einen übermäßigen Zelltod durch osmotischen Bruch der Zellmembran zu verhindern. Die Seeding-Dichte wurde optimiert, um ausreichend Daten pro Well zu generieren und gleichzeitig überlappende Strukturen wie Neuriten oder Kerne in den Bildern zu vermeiden. Phänotypische Profile reagieren sehr empfindlich auf Positionseffekte in der Platte 2,4,23. Wie im Protokoll angegeben, sollten Sie keine Randvertiefungen verwenden. Darüber hinaus wird empfohlen, bei der Planung eines Experiments mindestens fünf technische Replikate pro Versuchsbedingung zu verwenden. Im Idealfall verteilen Sie die Replikate zufällig über die Platte.
Wie bei jeder Methode hat auch das neuronale phänotypische Profiling seine Grenzen. Phänotypische Profiling-Datensätze können sehr groß sein, insbesondere wenn sie für einzelne Zellen berechnet werden. Obwohl mehr phänotypische Merkmale von Vorteil sein können, wie z. B. die Aufdeckung eines bisher unbekannten Mechanismus oder die Gewährleistung der Stabilität des Assaysystems, kann dies auch zu unerwünschtem Rauschen führen und schwieriger zu interpretieren sein als sorgfältig ausgewählte einzelne Merkmale. So sind z. B. Modellüberanpassungen oder Scheinkorrelationen Herausforderungen, die bei großen Datensätzen häufiger auftreten 4,24. Das phänotypische Profiling soll daher nicht das hypothesengetriebene Versuchsdesign ersetzen, sondern vielmehr als Ausgangspunkt für neue Hypothesen dienen, die dann getestet werden können. Parkinson ist eine neurodegenerative Erkrankung und manifestiert sich oft erst spät im Leben. Die Untersuchung der Parkinson-assoziierten Krankheitsbiologie in iPSC-abgeleiteten Neuronen kann daher eine Einschränkung darstellen, insbesondere wenn der Fokus auf klassischen Spätstadien der Parkinson-Krankheit liegt, wie z. B. der α-Synuclein-Aggregation 17,25,26. Im Gegenteil, aufgrund des relativ späten Beginns der Parkinson-Krankheit wird die präsymptomatische Phase als lang eingeschätzt. Signifikante Pathologien könnten daher bereits auf zellulärer Basis in neuronalen iPSC-mDA-Modellen nachweisbar sein, während das Gehirn auf systemischer Ebene in der Lage ist, neuronale und funktionelle Verluste über viele Jahre hinweg zu kompensieren27,28.
In Zukunft kann dieses Protokoll auf andere iPSC-abgeleitete Neuronentypen, wie kortikale oder Motoneuronen, angepasst werden, indem mDA-Neuronen-relevante Färbungen durch Färbungen ersetzt werden, die sich beispielsweise auf die synaptische Biologie oder intrazelluläre Aggregate konzentrieren. Kortikale Neuronen könnten beispielsweise durch Pan-Neuriten-Färbung gegen β-Tubulin III und prä- und postsynaptische Proteine wie Synapsin1 und Homer charakterisiert werden, für die hochwertige Antikörper beschrieben wurden29. Motoneuronen konnten mit Antikörpern gegen Cholin-Acetyltransferase (ChAT), TAR-DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43) und RNA-Granula-Marker30 phänotypisiert werden. Zusammenfassend wird erwartet, dass das vorgestellte Protokoll zur Erstellung neuronaler phänotypischer Profile für die Forschungsgemeinschaft nützlich sein wird, um die Auswirkungen chemischer oder genetischer Störungen auf ein breites Spektrum neuronaler Phänotypen zu untersuchen.
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Disclosures
Alle Autoren sind bei Ksilink angestellt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei allen Kolleginnen und Kollegen von Ksilink für ihre wertvolle Hilfe und die Diskussionen, die zur Gestaltung des vorgestellten Protokolls geführt haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
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