Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fenotypisk profilering av humane stamcellederiverte midbrain dopaminerge nevroner

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ksilink

Summary

Denne protokollen beskriver celledyrking av humane midbrain dopaminerge nevroner, etterfulgt av immunologisk farging og generering av neuronale fenotypiske profiler fra ervervede mikroskopiske bilder med høyt innhold som tillater identifisering av fenotypiske variasjoner på grunn av genetiske eller kjemiske modulasjoner.

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er knyttet til en rekke cellebiologiske prosesser som forårsaker midbrain dopaminerge (mDA) nevrontap. Mange nåværende in vitro PD-cellulære modeller mangler kompleksitet og tar ikke hensyn til flere fenotyper. Fenotypisk profilering i humane induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede mDA-nevroner kan adressere disse manglene ved samtidig å måle en rekke nevrale fenotyper i en PD-relevant celletype parallelt. Her beskriver vi en protokoll for å oppnå og analysere fenotypiske profiler fra kommersielt tilgjengelige humane mDA-nevroner. Et nevronspesifikt fluorescerende fargepanel brukes til å visualisere kjernefysiske, α-synuclein, tyrosinhydroksylase (TH) og mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2) relaterte fenotyper. Den beskrevne fenotypiske profileringsprotokollen er skalerbar da den bruker 384-brønnplater, automatisk væskehåndtering og mikroskopi med høy gjennomstrømning. Nytten av protokollen eksemplifiseres ved bruk av friske donor mDA-nevroner og mDA-nevroner som bærer den PD-koblede G2019S-mutasjonen i Leucin-rik gjentatt kinase 2 (LRRK2) genet. Begge cellelinjene ble behandlet med LRRK2-kinasehemmeren PFE-360 og fenotypiske forandringer ble målt. I tillegg demonstrerer vi hvordan flerdimensjonale fenotypiske profiler kan analyseres ved hjelp av clustering eller maskinlæringsdrevne overvåkede klassifiseringsmetoder. Den beskrevne protokollen vil spesielt interessere forskere som arbeider med modellering av nevronsykdom eller studerer kjemiske sammensatte effekter i humane nevroner.

Introduction

En rekke cellebiologiske prosesser forstyrres i Parkinsons sykdom (PD). For eksempel har mitokondriell dysfunksjon, oksidativt stress, proteinnedbrytningsdefekter, forstyrrelse av vesikulær trafikk og endolysosomal funksjon vært assosiert med midbrain dopaminerge (mDA) nevrontap, er ofte observert i PD1. Derfor ser PD ut til å involvere flere sykdomsmekanismer som kan samhandle med og forverre hverandre. En nyttig måte å undersøke dette mekanistiske samspillet på er å lage et omfattende fenotypisk fingeravtrykk eller profil av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner.

Fenotypisk profilering er en tilnærming som innebærer å lage en profil av en prøve basert på en samling av målbare egenskaper, og for det andre innebærer det å gjøre spådommer om et utvalg basert på denne profilen 2,3. Målet med profilering er å fange opp et mangfoldig utvalg av funksjoner, hvorav noen kanskje ikke tidligere har vært forbundet med en sykdom eller behandling3. Som et resultat kan profilering avsløre uventede biologiske prosesser. Fenotypisk profilering er vanligvis avhengig av fluorescerende fargede celler, og standardiserte analyser, for eksempel Cell Painting, er utviklet for å lage fenotypiske profiler4. Nylig har fenotypisk profilering for eksempel blitt brukt til karakterisering av små molekyler eller nøyaktig prediksjon av PD-subtyper utelukkende basert på pasientavledede fibroblaster 5,6. Til tross for disse fremskrittene har fenotypisk profilering sjelden blitt brukt på postmitotiske differensierte celler, slik som humane induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede mDA-nevroner som uttrykker PD-koblede mutasjoner som LRRK2 G2019S. Betydelige utfordringer med iPSC-avledede modeller inkluderer tilstedeværelsen av subtile eller variable patologiske trekk på tvers av differensieringspartier eller genotyper, og det faktum at isolerte PD-fenotyper ikke fanger opp sykdommens fulle kompleksitet. Videre, mens iPSC nevronmodeller er fysiologisk relevante, blir de sjelden brukt i PD-oppdagelsesprosesser på grunn av bekymringer om teknisk kompleksitet 7,8.

Vi har tidligere utviklet en robust metodikk for å måle flere PD-relaterte patofysiologiske fenotyper i humane mDA-nevroner som både er følsomme for genetiske og kjemiske forbindelsesinduserte fenotypiske endringer9. Denne artikkelen beskriver i detalj en ytterligere optimalisert versjon av denne metoden for å lage fenotypiske profiler fra mDA-nevroner (figur 1). Denne protokollen har flere fordeler i forhold til de tidligere beskrevne fenotypiske profileringsmetodene, for eksempel bruk av høykvalitets mDA-nevroner og teknisk reproduserbarhet. For første gang muliggjør denne protokollen fenotypisk profilering i fysiologisk relevante postmitotiske mDA-nevroner etter kjemiske forstyrrelser på en svært skalerbar måte. Fullt differensierte og kryopreserverte mDA-nevroner er kommersielt tilgjengelige, noe som reduserer batch-til-batch-differensieringsvariabiliteten betydelig. For det andre kan teknisk variabilitet reduseres ytterligere ved å bruke et veldefinert eksperimentelt design (dvs. kulturvarighet eller unngå kantbrønner), automatisert væskehåndtering og automatisert mikroskopi. I tillegg er de første trinnene i fenotypisk profilanalyse ved hjelp av ikke-overvåket klynging eller veiledede klassifiseringstilnærminger skissert her, noe som indikerer hvordan fenotypiske profileringsdata kan analyseres. Denne protokollen vil være til nytte for forskere som er interessert i fenotypiske endringer av mDA-nevroner indusert av genetiske eller kjemiske forstyrrelser, spesielt når et svært skalerbart studieoppsett kreves, for eksempel under screeningskampanjer eller når effekten av et mindre antall forbindelser skal studeres, for eksempel for å bestemme toksiske effekter. Oppsummert forventes det at anvendelsen av fenotypisk profilering av humane nevroner er en verdifull teknikk for å studere komplekse sykdomsrelaterte fenotyper og karakterisere de cellulære effektene av legemiddelkandidater.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentell protokoll for å generere bildebaserte fenotypiske profiler fra humane iPSC-deriverte mDA-nevroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av medium og plater for nevronsåing (dag 1)

  1. For å forberede platene for nevronsåing på dag 1, varm Laminin til romtemperatur (RT) like før bruk. Tilbered Lamininoppløsningen ved å fortynne Laminin-oppløsningen (0,1 mg/ml) 1/10 i kald PBS+/+ (med Ca 2+ og Mg2+).
    MERK: Alle reagenser er oppført i materialfortegnelsen. Sammensetning av løsninger og buffere er beskrevet i tabell 1-4.
  2. Deretter tilsettes 25 μL av lamininoppløsningen til hver brønn i en poly-D-lysin (PDL) forhåndsbelagt 384-brønnsplate, og inkuberes over natten ved 4 °C. De belagte platene kan oppbevares ved 4 °C i opptil en uke.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her i opptil en uke. Forsegle plater med plastfilm.
  3. Klargjør komplette vedlikeholdsmedier og oppbevar ved 4 °C i opptil én måned (tabell 1).

2. Tining av nevroner (dag 0)

  1. For å tine nevronene på dag 0, forvarm et vannbad til 37 °C og øk det komplette vedlikeholdsmediet til RT, beskyttet mot lys.
  2. Ta hetteglasset med kommersielt oppnådde frosne nevroner (se materialfortegnelse) ut av tanken med flytende nitrogen og legg det på tørris. Legg deretter hetteglasset i vannbadet i 2 minutter. Når væsken er helt tint, desinfiser hetteglasset med 70% etanol.
  3. Aspirer de tinte nevronene med en P1000-pipette (rundt 370 μL) og overfør dem i et 50 ml sentrifugerør uten opp-og-ned-pipettering. Skyll deretter hetteglasset med 630 mikrol komplett vedlikeholdsmedium, dispenser dråpe for dråpe (45° vinkel) i 50 ml røret. Agiter sakte mens du dispenserer.
    MERK: Det er viktig å dispensere mediet sakte, dråpe for dråpe, for å unngå osmotisk ruptur av cellene. En 45° vinkel og lett omrøring minimerer høyt lokalt osmotisk trykk under pipettering.
  4. Tilsett på samme måte 1 ml komplett vedlikeholdsmedium i 50 ml sentrifugerøret med en P1000-pipette. Deretter tilsettes sakte 2 ml komplett vedlikeholdsmedium. Rør forsiktig mens du dispenserer.
  5. Tell cellene. Forbered et mikrorør med 10 μL Trypan Blue og 10 μL cellesuspensjon og legg til et lysbilde i tellekammeret (10 μL). Utfør telling ved hjelp av en automatisert celleteller (se Materialfortegnelse) eller manuelt.
  6. Etter telling, sentrifuger 50 ml røret som inneholder nevronene ved 400 x g i 5 minutter ved RT, og fjern supernatanten. Bryt pelleten forsiktig med en P1000-pipette og 1 ml komplett vedlikeholdsmedium. Tilsett deretter nødvendig volum for å nå ønsket konsentrasjon (300 000 celler/ml, se også neste trinn).

3. Såing av nevroner på forberedte plater (dag 0)

  1. For å frø nevroner på de forberedte platene på dag 0, ta de belagte platene ut av kjøleskapet, legg dem under cellekulturhetten og la dem balansere til RT i ca. 30 minutter.
  2. Like før såing, aspirer 15 μL beleggløsning med en automatisert væskebehandler eller en 16-kanals pipette. La det være igjen ca. 10 μL per brønn for å unngå skade på belegget.
  3. Deretter dispenserer du 50 μL av celleoppløsningen inneholdende 300 000 celler/ml (fremstilt i trinn 2,6) per brønn med en 16-kanals pipette, noe som resulterer i 15 000 frøede nevroner per brønn og et endelig volum per brønn på 60 μL.
  4. I en 384-brønnsplate, unngå å bruke kolonne 1, 2, 23, 24 og rad A, B, O og P for å minimere mulige kanteffekter som kan påvirke fenotypiske profiler. Fyll de ubrukte tomme brønnene med 80 μL PBS. Inkuber platene ved 37 °C og 5 % CO2.

4. Middels endring eller sammensatt behandling (dag 3)

  1. Avhengig av antall brønner, forvarm et passende volum komplett vedlikeholdsmedium ved RT. Beskytt mot lys.
  2. Hvis en middels endring er nødvendig, går du videre til trinn 4.4. Hvis sammensatt behandling er ønsket, må du kontrollere sammensetningen av forbindelsen og det brukte løsningsmidlet (vann, DMSO, metanol, etc.).
  3. Klargjør en 1,5x konsentrert forbindelsesløsning for alle ønskede konsentrasjoner som skal testes. Forbered de sammensatte fortynningene ved hjelp av komplett vedlikeholdsmedium.
    MERK: Som en nøytral kontroll, bruk det respektive løsningsmidlet i samme konsentrasjon som den testede forbindelsen. Hvis flere eller ukjente forbindelser ved forskjellige konsentrasjoner brukes, anbefales det å utføre et separat dose-respons-eksperiment for å måle løsningsmiddeleffekter på den fenotypiske profilen.
  4. Hvis et automatisk pipetteringssystem brukes, tilsett 60 μL av den 1,5x sammensatte løsningen til en 384-brønns lagringsplate. Alternativt kan du bruke en 16-kanals pipette. Hvis en middels endring er nødvendig, legger du til 60 μL komplett vedlikeholdsmedium i stedet.
  5. Bruk det automatiske pipetteringssystemet, aspirer og kast 40 μL medium per brønn fra den nevronholdige platen for å holde 20 μL / brønn. Deretter tilsettes 40 μL/brønn med 1,5x sammensatt løsning fra lagringsplaten med 384 brønner til hver brønn for å oppnå ønsket sluttkonsentrasjon.
    MERK: Det er viktig å ikke utføre fulle middels endringer, men å alltid forlate gjenværende medium i brønnen for å forhindre skade på nevronteppet eller belegget.
  6. Hvis nevronkultur utføres i mer enn de 6 dagene som er beskrevet i denne protokollen, må du endre mediet hver 2-3 dag.

5. Nevronfiksering og farging (dag 6 til 7)

  1. For å fikse og flekke nevronene på dag 6 og 7, bruk en automatisert væskebehandler for alle dispenserings- og vasketrinn. Alternativt kan du bruke en 16-kanals pipette.
  2. Forbered en 10% Triton X-100 løsning ved å fortynne Triton X-100 i 1x PBS. Vortex til løsningen er homogen. Oppbevares ved 4 °C.
  3. For å fikse nevronene, dispenser 20 μL / brønn på 16% PFA som resulterer i en 4% endelig konsentrasjon. Inkuber platen i 30 min ved RT, og vask den tre ganger med 1x PBS. La det stå 20 μL/brønn med PBS etter siste vask.
    FORSIKTIG: PFA er anerkjent som et farlig stoff som er kjent for å forårsake oral, dermal og respiratorisk toksisitet. Det utgjør også en trussel mot øynene og kan føre til genetiske mutasjoner og kreft. Riktig håndtering av PFA krever bruk av egnet personlig verneutstyr, for eksempel øye- og ansiktsbeskyttelse, i tillegg til å sikre riktig ventilasjon. Det er viktig å forhindre utslipp av PFA i miljøet.
  4. For permeabilisering og blokkering, lag en 2x blokkeringsløsning (tabell 2).
  5. Tilsett 20 μL / brønn med 2x blokkeringsløsning (1x endelig konsentrasjon), inkuber i 1 time ved RT, og vask en gang med PBS. Hold 20 μL / brønn av PBS etter vask.
  6. For primær antistofffarging (se materialtabell), lag en 2x primærfargebuffer (tabell 3).
  7. Tilsett 20 μL/brønn med 2x primærfargebuffer (1x sluttkonsentrasjon) og rug over natten ved 4 °C. Neste morgen på dag 7, vask tre ganger med PBS. La det stå 20 μL/brønn PBS etter vask.
  8. For sekundærfarging av antistoff (se materialtabell), lag en 2x sekundær fargebuffer (tabell 4).
  9. Tilsett 20 μL / brønn med 2x sekundær fargebuffer (1x endelig konsentrasjon), inkuber i 2 timer ved RT vekk fra lys, og vask tre ganger med PBS. La det stå 100 μL PBS/godt etter siste vask.
    1. Tilsett aluminiumsforsegling på platen for å minimere fordampning. Alternativt kan du dekke platen med plastfilm og aluminiumsfolie. Gå videre til bildeopptak, eller oppbevar platen ved 4 °C.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her i opptil en uke. Hvis bakgrunnsfluorescens observeres, bør du vurdere å øke blokkeringstiden. Hvis fargingen er utilstrekkelig, prøv å øke den primære antistoffkonsentrasjonen eller inkubasjonstiden.

6. Avbildning av fluorescerende fargede nevroner (dag 7)

  1. Få bilder av de belagte, dyrkede og fargede nevronene på dag 7. Ideelt sett bruk et automatisert konfokalfluorescensmikroskop (se materialtabell). Alternativt kan du skaffe bilder manuelt.
  2. Skaff deg Hoechst-, TH-, α-synuclein- og MAP2-kanalene ved bruk av henholdsvis 405 nm, 488 nm, 561 nm og 647 nm lasere (figur 2).
    MERK: For å generere tilstrekkelig mengde detaljerte data for fenotypisk profilering, bruk et 40x mål og hent 16 felt/brønn ved hjelp av Z-stakker bestående av 3 Z-skiver atskilt med 2 μm. I tilfelle det er pipetteringsrelaterte skader i nevronteppet, prøv å unngå avbildning av disse områdene.
  3. Avhengig av mikroskop og kamera, juster eksponeringstider og eksitasjonsintensiteter for hver av de fire fluorescerende kanalene separat for å oppnå et optimalt dynamisk område av fluorescerende intensiteter.
    MERK: Bildebehandlingsprogramvare gir ofte et histogram for å bestemme den ideelle eksponeringstiden. Hvis histogrammet forskyves for mye til venstre i det lave signalområdet, er eksponeringstiden for kort eller eksitasjonsintensiteten for lav. Hvis det er en skarp klippe på maksimalt signalnivå til høyre, er signalverdien mettet. I dette tilfellet reduserer du eksitasjonsintensiteten eller forkorter eksponeringstiden.
  4. Lagre bilder i et tapsfritt og åpent format, for eksempel .tif.

7. Bildebehandling (dag 8)

  1. Bildesegmentering og fenotypisk egenskapsekstraksjon er nødvendig for å lage kvantitative fenotypiske profiler. Bruk PhenoLink-programvaren for bildesegmentering og funksjonsutvinning (materialfortegnelse). Instruksjoner for å installere PhenoLink finner du i GitHub-depotet (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
    MERK: Bildesegmentering brukes til å identifisere og skille forskjellige objekter eller regioner i et bilde, mens fenotypisk funksjonsuttrekking brukes til å analysere og trekke ut relevant informasjon fra disse regionene. Flere alternative programvareløsninger, for eksempel CellProfiler 10, ImageJ / FIJI 11, Napari12 eller Knime Analytics Platform13, er tilgjengelige for å trekke ut kvantitativ informasjon fra flerkanals fluorescensbilder.
  2. Utfør bildesegmentering på belysningskorrigerte RAW-bilder. Bestem de respektive fluorescerende kanalintensitetstersklene empirisk per plate slik at bakgrunnssignalet er minimalt, og ønsket segmentert signal tilsvarer signalet i råbildet. Plater som behandles og beises på samme dag, krever vanligvis sammenlignbare terskler for kanalintensitet for segmentering.
  3. Definer kjernens størrelse og intensitet for å skille levende fra døde celler. Når du bruker 40x-bilder, beholder du alle andre standardparametere og kjører programvaren. Hundre og tjueseks kvantitative bildefunksjoner vil bli beregnet per brønn (tilleggstabell 1).
  4. Bruk de resulterende tabellkvantitative dataene til å konstruere fenotypiske profiler og sammenligne fenotypiske profiler fra forskjellige cellelinjer eller behandlingsbetingelser. Hver rad tilsvarer en biologisk tilstand (brønn) og hver kolonne tilsvarer et bestemt fenotypisk trekk.
    MERK: Vi tilbyr et eksempel på utdatafil sammen med dataanalyserørledningen for å illustrere bruken (se Materialfortegnelse). I tillegg viser figur 3 sammensetningen av en fenotypisk profil.

8. Fenotypisk profilgenerering og visualisering (dag 8)

  1. Hvis du ikke har Python og Jupyter installert på datamaskinen din, installerer du Anaconda Distribution og åpner Jupyter-programvaren. Last ned den medfølgende Jupyter-notatboken og alle andre medfølgende filer, og lagre dem i samme katalog (se Materialfortegnelse). Åpne Jupyter-notisbokfilen ved hjelp av Jupyter-programvaren.
    MERK: Anaconda er en gratis og åpen kildekode-plattform for programmeringsspråk som Python. Denne plattformen leveres med Python-tolkeren Jupyter som kan utføre den medfølgende Jupyter-notatboken for å lage og analysere fenotypiske profiler (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
  2. Utfør Jupyter notebook celle for celle ved hjelp av Jupyter-programvaren. De medfølgende eksempeldataene, .fth og krav .txt filer må være plassert i samme katalog som Jupyter-notatboken. Hver Jupyter notatbokcelle er kommentert for å forklare funksjonaliteten.
    MERK: Det er avgjørende å bruke Jupyter-notatboken i riktig rekkefølge som starter med datalasting og skalering, og å fortsette celle for celle til slutten. Alle data og grafikk vil bli lagret i en nyopprettet mappe i Jupyter bærbare kildekatalogen. Figur 4 viser arbeidsflyten og arbeidsflytutdataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fenotypisk profilering i mDA-nevroner er en effektiv måte å kvantifisere flere aspekter av cellulær biologi og deres endringer under den eksperimentelle modulasjonen. For å eksemplifisere denne metodikken brukte denne studien kryopreservert LRRK2 G2019S og friske donor mDA-nevroner. Disse nevronene har blitt differensiert i ca. 37 dager, er postmitotiske og ekspressnevronale markører (TUBB3 og MAP2) og dopaminerge nevronmarkører, inkludert tyrosinhydroksylase (TH) i kombinasjon med FOXA2, mens gliamarkøren Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) er fraværende14. Etter den beskrevne protokollen ble begge cellelinjene dyrket i 6 dager og behandlet med 0,1 μM PFE-360, en LRRK2-kinasehemmer. Nevronene ble farget med atomflekken Hoechst og antistoffer mot α-synuclein, TH og MAP2 (figur 2).

Deretter ble bilder segmentert, og fenotypiske trekk ble trukket ut. Vi bestemte 126 kvantitative trekk som kan aggregeres til velbaserte fenotypiske profiler (figur 3A,B). Hver funksjon og dens verdi per eksperimentell tilstand kan nås. Noen funksjoner viste endringer ved sammensatt behandling. For eksempel ble α-synuclein-fluorescensintensiteten i TH-positive celler redusert ved PFE-360-behandling (figur 3C, venstre panel). Andre funksjoner presenterte bare forskjeller mellom de testede cellelinjene, men ikke ved sammensatt behandling. Dette var for eksempel tilfellet for MAP2 nevrittnettverkslengden eller forholdet mellom TH-positive nevroner (figur 3C, midtre og høyre panel). Det er viktig å vurdere den komplette fenotypiske profilen for å analysere fenotypiske variasjoner i forskjellige cellelinjer eller sammensatte behandlinger på en mindre selektiv og omfattende måte.

Under bildeanalysetrinnet beregnes alltid alle 126 funksjonene. På samme måte, under dataanalyse, vurderes alle funksjoner, men maskinlæringsalgoritmen tilordner vekter til individuelle funksjoner for å skille de biologiske klassene. Arbeidsflyten for dataanalyse starter med datainnlasting og funksjonsskalering (Figur 4A). Skalering er viktig for maskinlæring fordi det bidrar til å normalisere dataene og sikrer at hver funksjon er i samme skala. Dette kan bidra til å forbedre ytelsen til maskinlæringsalgoritmer ved å gjøre dem mindre følsomme for omfanget av inndatafunksjonene. I tillegg kan skalering bidra til å forbedre tolkbarheten til maskinlæringsmodeller ved å gjøre det enklere å sammenligne den relative betydningen av forskjellige funksjoner. I neste trinn utføres klyngeanalyse (Figur 4B). Klynger kan være nyttige for å utforske strukturen i høydimensjonale datasett og identifisere mønstre i dataene som kanskje ikke er umiddelbart synlige når man ser på enkeltfunksjoner. Hierarkisk clustering basert på Cosinusavstanden mellom velbaserte fenotypiske profiler viste sterke forskjeller mellom cellelinjer, men mindre for medikamentell behandling. Data fra PFE-360-behandlede brønner gruppert innenfor DMSO-behandlet kontroll, noe som indikerer ingen sterke forskjeller ved bruk av denne sammenligningsmetrikken. I tillegg til klynger er dimensjonsreduksjonstilnærminger også nyttige verktøy for å visualisere likheter og forskjeller i flerdimensjonale fenotypiske profileringsdata. Her benyttet vi oss av Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP)15 (Figur 4C). I likhet med den tidligere cosinusavstandsbaserte tilnærmingen viste PaCMAP hovedsakelig forskjeller mellom de to cellelinjene og i mindre grad mellom PFE-360 eller DMSO kontrollbehandlede brønner. Både cosinusavstandsklynger og PaCMAP er ikke-overvåkede metoder og vil neppe fange opp små forskjeller som bare er tilstede i utvalgte fenotypiske trekk, for eksempel fordi en forbindelse bare endrer noen få fenotyper (dvs. bare nevrittrelaterte egenskaper). For å løse denne begrensningen av fenotypisk profilanalyse utførte vi maskinlæringsdrevet overvåket klassifisering. Spesielt brukte vi Light gradient-boosting machine (LightGBM) (Figur 4D). LightGBM er en overvåket maskinlæringsalgoritme som bruker beslutningstrealgoritmer for å lage en modell som kan brukes til rangering eller klassifisering16. LightGBM er designet for å være raskere og mer effektiv enn tradisjonelle trebaserte algoritmer som Random forest-algoritmen. Algoritmen ble trent med fenotypiske profildata fra en plate og testet den trente modellen på data fra en annen uavhengig plate. LightGBM-modellen hadde en samlet nøyaktighet på 85% og forutsa korrekt eksperimentell kategori (cellelinje eller forbindelse) for de fleste brønner. Nøyaktigheten for prediksjon av cellelinjer var høyere enn for sammensatt prediksjon, men også 60% av sammensatte behandlede brønner ble spådd riktig, noe som er bedre enn klassiske ikke-overvåkede metoder. LightGBM gir tilgang til betydningen av de respektive fenotypiske trekkene for klassifiseringen av de fire klassene (Figur 4D). Viktige fenotypiske egenskaper som skiller cellelinjene og medikamentelle behandlinger er for eksempel relatert til celleoverflaten eller celleintensiteten til MAP2- og TH-fargene. Overflaten av TH og α-synuclein dobbelt positiv cytoplasma var den viktigste egenskapen som skilte cellelinjer og sammensatte behandlinger, etterfulgt av forholdet mellom døde celler. Vi tilbyr en Jupyter notatbok som utfører dataplotting og alle uovervåkede og overvåkede analysemetoder beskrevet her (se Tabell over materialer). De oppnådde resultatene illustrerer potensialet for fenotypisk profilering for å skille cellelinjer og sammensatte behandlingseffekter i humane mDA-nevroner.

Figure 2
Figur 2: Immunfarging av humane iPSC-deriverte mDA-nevroner. Representative bilder av alle ervervede fluorescerende kanaler vises. Friske donor- eller LRRK2 G2019S-mutasjonsbærende mDA-nevroner ble enten behandlet med DMSO eller med 0,1 μM av LRRK2-kinasehemmeren PFE-360. Behandlingen ble utført på dag 3 og cellene ble fiksert på dag 6 som beskrevet i protokollen. Skala barer: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Opprettelse av en fenotypisk profil fra individuelle fenotypiske trekk. (A) Utvalgte fenotypiske egenskaper som kan ekstraheres fra de enkelte fluorescenskanalene vises. (B) Fenotypiske trekk kan aggregeres i en fenotypisk profil. Flere fenotypiske profiler kan genereres på tvers av forskjellige eksperimentelle forhold som er tilstede på 384-brønnplaten. (C) Eksempler på fenotypiske egenskaper og deres tilsvarende verdier per eksperimentell tilstand. Hvert datapunkt tilsvarer en måling fra en brønn. Welchs t-test med ulik variasjon ble brukt til signifikanstesting. Statistisk signifikans er presentert som * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 , og ikke signifikant (ns = p > 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: mDA nevron fenotypiske profiler inneholder kvantitativ informasjon og kan brukes til å klassifisere fenotyper . (A) Skjematisk oversikt over arbeidsflyten for dataanalyse. (B) Aggregerte fenotypiske profiler av kontroll- og legemiddelbehandlede mDA-nevroner. (C) Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP) uovervåket dimensjonsreduksjon av fenotypiske profildata. (D) Light gradient-boosting machine (LightGBM) overvåket klassifisering av fenotypiske profildata. Klassifiseringsalgoritmen ble trent på fenotypiske profildata fra en plate og ble brukt til å forutsi eksperimentelle klasser i en annen plate. Venstre panel: Forvirringsmatrisen viser forholdet mellom de fire sanne dataklassene og de fire forutsagte klassene etter modellen. Samlet sett forutsier modellen dataklassen riktig i 85% av tilfellene. Høyre panel: De 10 viktigste fenotypiske funksjonene for LightGBM-klassifisereren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reagenser For 100 ml
iCell Base Medium 1 100 ml
iCell nevrale supplement B 2 ml
iCell Nervesystem Supplement 1 ml

Tabell 1: Sammensetning av komplette vedlikeholdsmedier.

Reagent 2x løsning Endelig konsentrasjon For 100 ml
PBS 1x 1 1 78 ml
Triton 10% 0.20% 0.10% 2 ml
FBS lager løsning 20% 10% 20 ml

Tabell 2: Sammensetning av 2x blokkeringsløsning.

Reagent 2x konsentrasjon Endelig konsentrasjon For 100 ml
PBS 1x 1 1 87,36 ml
Triton 10% 0.20% 0.10% 2 ml
FBS lager løsning 10% 5% 10 ml
Anti-TH 1/500 1/1000 0,2 ml
Anti-α-synuclein 1/250 1/500 0,4 ml
Anti-MAP2 1/2500 1/5000 0,04 ml

Tabell 3: Sammensetning av primær fargebuffer.

Reagent 2x konsentrasjon Endelig konsentrasjon For 100 ml
PBS 1x 1 1 86,7 ml
Triton 10% 0.20% 0.10% 2 ml
FBS lager løsning 10% 5% 10 ml
Anti-mus A488 1/500 1/1000 0,2 ml
Anti-kanin A555 1/500 1/1000 0,2 ml
Anti-kylling A647 1/125 1/250 0,8 ml
Hoechst 1/1000 1/2000 0,1 ml

Tabell 4: Sammensetning av 2x sekundær fargebuffer.

Tilleggstabell 1: Oversikt over alle ekstraherte fenotypiske trekk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fenotypisk profilering er en teknikk for å måle et stort antall fenotyper i celler ved å bruke fluorescerende farginger, mikroskopi og bildeanalyse3. Fenotypiske profiler kan oppnås og sammenlignes på tvers av cellelinjer eller andre eksperimentelle forhold for å forstå komplekse endringer i cellulær biologi som kan gå ubemerket hen når du bruker en enkelt avlesning. Her beskriver vi anvendelsen av fenotypisk profilering på humane iPSC-avledede mDA-nevroner, en celletype som ofte brukes til å modellere PD-cellebiologi17,18,19. Fenotypisk profilering i mDA-nevroner har flere fordeler i forhold til tidligere brukte profileringstilnærminger som bruker generiske fluorescerende farginger4, ikke-nevronale celletyper5,6 eller ikke er skalerbare 7,8. Metoden som presenteres her muliggjør fenotypisk profilering i fysiologisk relevante postmitotiske mDA-nevroner. For det andre reduserer bruken av iPSC-avledede kryopreserverte mDA-nevroner signifikant batch-til-batch-differensieringsvariabilitet. For det tredje, ved å benytte et veldefinert eksperimentelt design, automatisert væskehåndtering og automatisert mikroskopi, kan teknisk variabilitet reduseres ytterligere og gjøre protokollen svært skalerbar og åpner muligheten for å bruke mDA-nevroner for fenotypiske screeningkampanjer. Til slutt gir veiledet klassifisering brukerne muligheten til å gruppere og forstå nøkkelfunksjonene i fenotypiske profiler og kan derfor bidra til å avdekke ny biologi.

Fenotypisk profilering gjør det mulig å utforske individuelle funksjoner for å utvikle oppfølgingshypoteser som fører til oppfølgingsmekanistiske studier. For eksempel viste vi at LRRK2 G2019S mDA-nevroner skiller seg fra kontroll-mDA-nevroner basert på deres α-synucleininnhold, MAP2-nevittlengde og forholdet mellom TH-positive celler (figur 3C). Sammensatt behandling med LRRK2-kinasehemmeren PFE-360 endrer imidlertid bare innholdet av α-synuclein og har ingen effekt på MAP2-nevittlengden eller forholdet mellom TH-positive celler. En ønskelig kjemisk forbindelse bør redde et ensemble av fenotyper. En fenotypisk profil inneholder den nødvendige informasjonen og kan utforskes ved hjelp av klynge- eller dimensjonalitetsreduksjonsteknikker, som kan bidra til å visualisere komplekse funksjonsinteraksjoner i 2-dimensjonale plott. Cosinusavstandsbasert clustering tillater nøyaktig separasjon av begge cellelinjer (figur 4B). Dimensjonsreduksjon ved hjelp av PaCMAP illustrerer videre hvordan begge cellelinjene danner distinkte klynger, og at PFE-360-behandling fører til skillbare, men fortsatt like generelle fenotyper, sannsynligvis på grunn av påvirkning på bare noen få målte egenskaper som α-synucleininnhold (figur 4C). Derimot kan overvåket maskinlæring bidra til å forutsi profiler av interesse basert på funksjonene deres. LightGBM-modellen trent på dataene forutsa nøyaktig de friske donor- og LRRK2-muterte mDA-nevronene i testdataene. Identifiseringen av PFE-360-behandlede nevroner var mindre nøyaktig, antagelig fordi kjemiske sammensatte effekter på fenotyper er svakere enn genetiske effekter (figur 4C). Overflaten av TH og α-synuclein dobbelt positiv cytoplasma var den viktigste funksjonen som skilte cellelinjer og sammensatte behandlinger, etterfulgt av forholdet mellom døde celler. Flere andre toppfunksjoner var relatert til celleoverflaten. Derfor synes cellestørrelse å være et generelt kjennetegn mellom sunn kontroll og LRRK2-muterte mDA-nevroner (figur 4D). Denne tilnærmingen demonstrerer derfor hvordan maskinlæring kan identifisere de mest definerende fenotypiske egenskapene i et komplekst datasett, som deretter kan brukes til å utvikle nye hypoteser og teste disse hypotesene i sekundære analyser.

CellPainting har blitt en populær tilnærming for å lage fenotypiske profiler og bruker et standardisert sett med fluorescerende prober og en definert protokoll 3,4,20,21,22,23. Det ble her besluttet å bruke et mer mDA nevronspesifikt fargepanel bestående av Hoechst kjernefysisk flekk og antistoffer mot α-synuclein, TH og MAP2. Andre fluorescerende farginger ved bruk av et lysosomassosiert LAMP1-antistoff eller mitokondrie-målrettede fargestoffer TMRM eller MitoTracker har blitt brukt av oss tidligere og fokuserer på mer spesifikke aspekter av PD-cellulær biologi9. Standard lysmikroskopi er begrenset i den forstand at bare fire fluorescerende bølgelengder kan løses. Tilsetning av lysosomale eller mitokondrielle farginger til det nåværende fargepanelet er derfor ikke lett mulig. Avhengig av det biologiske spørsmålet, kan flekker byttes. Alternativt kan to biologiske strukturer farges med samme bølgelengde under forutsetning av at deres morfologi kan skilles og at de er lokalisert i forskjellige cellerom.

For å øke screeningkompatibiliteten til protokollen ble den utformet for å kreve et minimum antall pipetteringstrinn og en kort kulturvarighet. Kritisk for metoden er alle flytende håndteringstrinn, siden de kan påvirke belegget eller resultere i frigjøring av nevroner. Som angitt i protokollen, anbefales det at en gjenværende mengde medium alltid forblir i brønnen. Det er også viktig å håndtere mDA-nevronene med forsiktighet siden de er en svært skjøre celletype. Utfør tining nøyaktig som angitt for å forhindre overdreven celledød på grunn av osmotisk ruptur av cellemembranen. Såtettheten ble optimalisert for å generere tilstrekkelige data per brønn samtidig som den forhindret overdreven overlappende strukturer, for eksempel nevritter eller kjerner i bildene. Fenotypiske profiler er svært følsomme for posisjonseffekter i platen 2,4,23. Som angitt i protokollen, må du ikke bruke kantbrønner. I tillegg anbefales det å bruke minst fem tekniske replikater per eksperimentelle tilstand når du planlegger et eksperiment. Ideelt sett fordel replikatene tilfeldig over platen.

Som med enhver metode har nevral fenotypisk profilering begrensninger. Datasett for fenotypisk profilering kan være svært store, spesielt når de beregnes for enkeltceller. Selv om det kan være fordelaktig å ha flere fenotypiske egenskaper, for eksempel å avsløre en tidligere ukjent mekanisme eller sikre stabilitet i analysesystemet, kan det også introdusere uønsket støy og være mer utfordrende å tolke enn nøye utvalgte individuelle funksjoner. For eksempel er modellovertilpasning eller falske korrelasjoner utfordringer som forekommer hyppigere i store datasett 4,24. Fenotypisk profilering er derfor ikke ment å erstatte hypotesedrevet eksperimentelt design, men heller å tjene som utgangspunkt for nye hypoteser som deretter kan testes. PD er en nevrodegenerativ sykdom og manifesterer seg ofte først sent i livet. Å studere PD-bundet sykdomsbiologi i iPSC-avledede nevroner kan derfor være en begrensning, spesielt når fokuset er på klassiske senfasekjennetegn ved PD, som α-synuclein-aggregering 17,25,26. Tvert imot, på grunn av relativt sen debut av PD, er den presymptomatiske fasen estimert til å være lang. Signifikante patologier kan derfor allerede være påviselige på cellebasis i iPSC mDA nevronmodeller, mens hjernen på systemnivå er i stand til å kompensere for nevronalt og funksjonelt tap i mange år27,28.

I fremtiden kan denne protokollen tilpasses andre iPSC-avledede nevrontyper, for eksempel kortikale eller motoriske nevroner, ved å erstatte mDA nevronrelevante farginger med flekker med fokus på for eksempel synaptisk biologi eller intracellulære aggregater. Kortikale nevroner kan for eksempel karakteriseres ved hjelp av panneurittfarging mot β-tubulin III og pre- og postsynaptiske proteiner som Synapsin1 og Homer, der antistoffer av høy kvalitet er beskrevet29. Motornevroner kunne fenotypes med antistoffer mot kolinacetyltransferase (ChAT), TJÆRE-DNA-bindende protein 43 (TDP-43) og RNA-granulatmarkører30. Oppsummert forventes det at den presenterte protokollen for å lage nevrale fenotypiske profiler vil være nyttig for forskningsmiljøet for å utforske effekten av kjemiske eller genetiske forstyrrelser på et bredt spekter av nevrale fenotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er ansatt i Ksilink.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke alle kolleger på Ksilink for deres verdifulle hjelp og diskusjoner som førte til utformingen av den presenterte protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti- chicken – Alexa 647 Jackson ImmunoRearch 703-605-155 Immunofluorescence
Anaconda https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2 Novus NB300-213 Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488 Thermo Fisher A11001 Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555 Thermo Fisher A21429 Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase Merck T2928 Immunofluorescence
Anti-α-synuclein Abcam 138501 Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head Agilent If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope  Yokogawa CV7000 The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter Invitrogen Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+ Gibco 14040-133 Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser  BioTek (Agilent)  If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %) Euromedex EM-15710-S Fixation before staining
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
iCell Base Medium 1 Fujifilm M1010 Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M Fujifilm C1087 Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 Fujifilm C1149 Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell Nervous System Supplement Fujifilm M1031 Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B Fujifilm M1029 Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook In-house development https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin Biolamina LN521 Plate coating
PFE-360 MedChemExpress HY-120085 LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink In-house development https://github.com/Ksilink/PhenoLink Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated Perkin Elmer 6057500 Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL Thermo Scientific AB-0781 Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton Sigma T9284 Permeabilization before lysis
Trypan Blue Sigma T8154-20ML Determination of living cells
Vprep Pipetting System  Agilent Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
  3. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  4. Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  5. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
  6. Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
  7. Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
  8. Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
  9. Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
  10. Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
  13. Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
  14. Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
  15. Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
  16. Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
  17. Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
  18. Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
  19. Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
  20. Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
  21. Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
  22. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
  23. Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
  24. Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
  25. Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
  26. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  27. Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
  28. Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
  29. Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
  30. Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).

Tags

Fenotypisk profilering humane stamceller midbrain dopaminerge nevroner Parkinsons sykdom in vitro PD cellulære modeller induserte pluripotente stamceller (iPSC) nevrale fenotyper fluorescerende fargepanel kjernefarging α-synuclein tyrosinhydroksylase (TH) mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2) fenotypisk profileringsprotokoll skalerbare 384-brønnsplater automatisk væskehåndtering høy gjennomstrømningsmikroskopi G2019S-mutasjon Leucinrik gjentatt kinase 2 (LRRK2) gen LRRK2 kinasehemmer PFE-360 fenotypiske endringer flerdimensjonale fenotypiske profiler klyngeanalyse maskinlæringsdrevet veiledet klassifikasjon
Fenotypisk profilering av humane stamcellederiverte midbrain dopaminerge nevroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J.… More

Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J. H. Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (197), e65570, doi:10.3791/65570 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter