Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Фенотипическое профилирование дофаминергических нейронов среднего мозга человека, полученных из стволовых клеток человека

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ksilink

Summary

Этот протокол описывает культивирование клеток дофаминергических нейронов среднего мозга человека с последующим иммунологическим окрашиванием и генерацией нейрональных фенотипических профилей из полученных микроскопических изображений с высоким содержанием, позволяющих идентифицировать фенотипические вариации, обусловленные генетическими или химическими модуляциями.

Abstract

Болезнь Паркинсона (БП) связана с рядом клеточных биологических процессов, которые вызывают потерю дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА). Многие современные клеточные модели БП in vitro недостаточно сложны и не учитывают множественные фенотипы. Фенотипическое профилирование нейронов мДА, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), может устранить эти недостатки путем одновременного измерения ряда фенотипов нейронов в PD-релевантном типе клеток. В данной статье мы опишем протокол получения и анализа фенотипических профилей коммерчески доступных нейронов мДА человека. Нейрон-специфическая флуоресцентная окрашивающая панель используется для визуализации фенотипов, связанных с ядерным α-синуклеином, тирозингидроксилазой (ТГ) и микротрубочками-ассоциированным белком 2 (MAP2). Описанный протокол фенотипического профилирования является масштабируемым, так как в нем используются 384-луночные планшеты, автоматическая работа с жидкостями и высокопроизводительная микроскопия. Полезность протокола проиллюстрирована на примере здоровых донорских нейронов mDA и нейронов mDA, несущих PD-сцепленную мутацию G2019S в гене лейцин-богатой повторной киназы 2 (LRRK2). Обе клеточные линии обрабатывали ингибитором киназы LRRK2 PFE-360 и измеряли фенотипические изменения. Кроме того, мы демонстрируем, как многомерные фенотипические профили могут быть проанализированы с помощью кластеризации или методов классификации с учителем на основе машинного обучения. Описанный протокол будет особенно интересен исследователям, работающим над моделированием заболеваний нейронов или изучающими эффекты химических соединений в нейронах человека.

Introduction

При болезни Паркинсона (БП) нарушаются различные клеточные биологические процессы. Например, митохондриальная дисфункция, окислительный стресс, дефекты деградации белков, нарушение везикулярного транспорта и эндолизосомальной функции, связанные с потерей дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА), обычно наблюдаются при БП1. Таким образом, болезнь Паркинсона, по-видимому, включает в себя несколько механизмов заболевания, которые могут взаимодействовать друг с другом и ухудшать друг друга. Одним из полезных способов исследования этого механистического взаимодействия является создание комплексного фенотипического отпечатка пальца или профиля дофаминергических нейронов среднего мозга (mDA).

Фенотипическое профилирование – это подход, который включает в себя создание профиля выборки на основе набора измеримых характеристик и, во-вторых, прогнозирование выборки на основе этого профиля 2,3. Цель профилирования состоит в том, чтобы зафиксировать широкий спектр признаков, некоторые из которых, возможно, ранее не были связаны с заболеванием или лечением3. В результате профилирование может выявить неожиданные биологические процессы. Фенотипическое профилирование, как правило, опирается на флуоресцентно окрашенные клетки, и для создания фенотипическихпрофилей были разработаны стандартизированные анализы, такие как Cell Painting. В последнее время фенотипическое профилирование, например, применяется для характеризации малых молекул или точного прогнозирования подтипов БП исключительно на основе фибробластов, полученных от пациентов 5,6. Несмотря на эти достижения, фенотипическое профилирование редко применялось к постмитотическим дифференцированным клеткам, таким как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (iPSC) нейроны mDA, которые экспрессируют PD-сцепленные мутации, такие как LRRK2 G2019S. К существенным проблемам моделей, полученных на основе ИПСК, относятся наличие малозаметных или вариабельных патологических признаков в группах дифференцировки или генотипах, а также тот факт, что изолированные фенотипы БП не охватывают всю сложность заболевания. Кроме того, несмотря на то, что нейронные модели ИПСК являются физиологически значимыми, они редко используются в процессах разработки лекарств для лечения БП из-за опасений по поводу технической сложности 7,8.

Ранее мы разработали надежную методологию для измерения нескольких патофизиологических фенотипов, связанных с болезнью Паркинсона, в нейронах мДА человека, которые чувствительны как к генетическим, так и к химическим соединениям фенотипическимизменениям. В данной статье подробно описывается дальнейшая оптимизированная версия этой методики для создания фенотипических профилей из нейронов mDA (рис. 1). Этот протокол имеет ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными подходами к фенотипическому профилированию, такими как использование высококачественных нейронов mDA и техническая воспроизводимость. Впервые этот протокол позволяет осуществлять фенотипическое профилирование физиологически значимых постмитотических нейронов mDA после химических возмущений с высокой степенью масштабируемости. Полностью дифференцированные и криоконсервированные нейроны mDA коммерчески доступны, что значительно снижает вариабельность дифференцировки от партии к партии. Во-вторых, техническая вариабельность может быть дополнительно снижена за счет использования четко определенного плана эксперимента (т.е. продолжительности культивирования или отказа от краевых лунок), автоматизированной обработки жидкостей и автоматизированной микроскопии. Кроме того, здесь описаны начальные этапы анализа фенотипического профиля с использованием неконтролируемой кластеризации или контролируемой классификации, а также указано, как можно анализировать данные фенотипического профилирования. Этот протокол будет полезен исследователям, интересующимся фенотипическими изменениями нейронов mDA, индуцированными генетическими или химическими возмущениями, в частности, когда требуется высокомасштабируемая исследовательская установка, например, во время скрининговых кампаний или когда необходимо изучить влияние меньшего числа соединений, например, для определения токсических эффектов. Таким образом, предполагается, что применение фенотипического профилирования нейронов человека является ценным методом для изучения сложных фенотипов, связанных с заболеванием, и характеристики клеточных эффектов кандидатов в лекарственные препараты.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментального протокола для создания фенотипических профилей на основе изображений из нейронов мДА человека, полученных из ИПСК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка среды и планшетов для посева нейронов (День 1)

  1. Чтобы подготовить планшеты к посеву нейронов в День-1, подогрейте ламинин до комнатной температуры (RT) непосредственно перед использованием. Приготовьте раствор ламинина, разбавив исходный раствор ламинина (0,1 мг/мл) 1/10 в холодном PBS+/+ (с Ca 2+ и Mg2+).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты перечислены в таблице материалов. Составы растворов и буферов описаны в таблицах 1-4.
  2. Затем добавьте 25 мкл раствора ламинина в каждую лунку 384-луночного планшета с полимер-D-лизином (PDL) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 °C до одной недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на срок до одной недели. Запечатайте пластины с помощью полиэтиленовой пленки.
  3. Подготовьте полный материал для технического обслуживания и храните при температуре 4 °C до одного месяца (Таблица 1).

2. Размораживание нейронов (День 0)

  1. Чтобы разморозить нейроны на 0-й день, разогрейте водяную баню до 37 °C и уравновешивайте Complete Maintenance Media до RT, защищенного от света.
  2. Выньте флакон с коммерчески полученными замороженными нейронами (см. Таблицу материалов) из резервуара с жидким азотом и поместите его на сухой лед. Затем поместите флакон на водяную баню на 2 минуты. Как только жидкость полностью оттает, продезинфицируйте флакон 70% этиловым спиртом.
  3. Аспирируйте размороженные нейроны с помощью пипетки P1000 (около 370 мкл) и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 50 мл без пипетирования вверх-вниз. Затем промойте флакон 630 мкл Complete Maintenance Medium, капля за каплей (под углом 45°) в пробирку объемом 50 мл. Медленно перемешивайте во время дозирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно дозировать среду медленно, капля за каплей, чтобы избежать осмотического разрыва клеток. Угол наклона 45° и легкое перемешивание сводят к минимуму высокое локальное осмотическое давление во время пипетирования.
  4. Аналогичным образом добавьте 1 мл питательной среды в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки P1000. Затем медленно добавьте 2 мл Complete Maintenance Medium. Тщательно перемешайте во время дозирования.
  5. Подсчитайте ячейки. Приготовьте микропробирку с 10 мкл трипанового синего и 10 мкл клеточной суспензии и добавьте в предметное стекло счетной камеры (10 мкл). Выполняйте подсчет с помощью автоматического счетчика ячеек (см. Таблицу материалов) или вручную.
  6. После подсчета центрифугируют пробирку объемом 50 мл, содержащую нейроны, при 400 x g в течение 5 мин при RT и удаляют надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте гранулу с помощью пипетки P1000 и 1 мл средства для комплексного обслуживания. Затем добавьте необходимый объем, чтобы достичь желаемой концентрации (300 000 клеток/мл, см. также следующий шаг).

3. Посев нейронов на подготовленные планшеты (День 0)

  1. Чтобы посеять нейроны на подготовленные планшеты на день 0, достаньте планшеты с покрытием из холодильника, поместите их под колпак для клеточных культур и дайте им уравновеситься до RT примерно на 30 минут.
  2. Непосредственно перед посевом аспирируйте 15 мкл раствора для покрытия с помощью автоматического манипулятора жидкостями или 16-канальной пипетки. Оставьте примерно 10 мкл на лунку, чтобы предотвратить повреждение покрытия.
  3. Затем дозируют 50 мкл клеточного раствора, содержащего 300 000 клеток/мл (приготовленного на этапе 2.6), на лунку с помощью 16-канальной пипетки, в результате чего получается 15 000 засеянных нейронов на лунку и конечный объем на лунку 60 мкл.
  4. В 384-луночном планшете избегайте использования столбцов 1, 2, 23, 24 и строк A, B, O и P, чтобы свести к минимуму возможные краевые эффекты, которые могут повлиять на фенотипические профили. Заполните неиспользуемые пустые лунки 80 мкл PBS. Инкубируют планшеты при температуре 37 °C и 5% CO2.

4. Средняя смена или комбинированная обработка (день 3)

  1. В зависимости от количества лунок предварительно нагрейте соответствующий объем Complete Maintenance Medium at RT. Беречь от света.
  2. Если требуется изменение среды, перейдите к шагу 4.4. Если требуется обработка соединения, проверьте концентрацию исходного соединения и используемый растворитель (вода, ДМСО, метанол и т. д.).
  3. Приготовьте 1,5-кратный концентрированный раствор соединения для всех требуемых концентраций. Приготовьте компаундные разводы, используя Complete Maintenance Medium.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве нейтрального контроля используйте соответствующий растворитель в той же концентрации, что и испытуемое соединение. Если используются несколько или неизвестных соединений в разных концентрациях, целесообразно провести отдельный эксперимент «доза-реакция» для измерения влияния растворителя на фенотипический профиль.
  4. Если используется автоматическая система дозирования, добавьте 60 мкл 1,5-кратного раствора компаунда в 384-луночный накопительный планшет. В качестве альтернативы можно использовать 16-канальную пипетку. Если требуется смена среды, добавьте вместо этого 60 мкл Complete Maintenance Medium.
  5. Используя автоматическую систему дозирования, отсасывайте и выбрасывайте 40 мкл среды на лунку из нейронсодержащей пластины, чтобы сохранить 20 мкл/лунку. Затем добавьте 40 мкл/лунку 1,5-кратного раствора соединения из 384-луночного накопителя в каждую лунку для получения желаемой конечной концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно не выполнять полную смену среды, а всегда оставлять остаточную среду в лунке, чтобы предотвратить повреждение нейронального ковра или покрытия.
  6. В случае, если культивирование нейронов проводится более 6 дней, описанных в данном протоколе, следует менять среду каждые 2-3 дня.

5. Фиксация и окрашивание нейронов (6-7 дни)

  1. Чтобы зафиксировать и окрасить нейроны на 6-й и 7-й день, используйте автоматизированный манипулятор жидкости для всех этапов дозирования и промывки. В качестве альтернативы можно использовать 16-канальную пипетку.
  2. Приготовьте 10% раствор Triton X-100, разбавив Triton X-100 в 1x PBS. Встряхивайте до тех пор, пока раствор не станет однородным. Хранить при температуре 4 °C.
  3. Чтобы зафиксировать нейроны, дозируйте 20 мкл/лунку 16% PFA, в результате чего конечная концентрация составляет 4%. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при RT и промойте его три раза с помощью 1x PBS. Оставьте 20 мкл/лунку PBS после последней стирки.
    ВНИМАНИЕ: PFA признан опасным веществом, которое, как известно, вызывает пероральную, кожную и респираторную токсичность. Он также представляет угрозу для глаз и может привести к генетическим мутациям и раку. Правильное обращение с PFA требует использования соответствующих средств индивидуальной защиты, таких как защита глаз и лица, а также обеспечения надлежащей вентиляции. Важно не допустить попадания PFA в окружающую среду.
  4. Для пермеабилизации и блокировки приготовьте 2-кратный раствор для блокировки (табл. 2).
  5. Добавьте 20 мкл/лунку 2-кратного блокирующего раствора (1-кратная конечная концентрация), инкубируйте в течение 1 ч при RT и промойте один раз PBS. Храните 20 мкл/лунку PBS после стирки.
  6. Для окрашивания первичными антителами (см. Таблицу материалов) приготовьте 2-кратный первичный окрашивающий буфер (Таблица 3).
  7. Добавьте 20 мкл/лунку 2-кратного первичного окрашивающего буфера (1-кратная конечная концентрация) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. На следующее утро на 7-й день трижды умойтесь PBS. После промывки оставьте 20 мкл/лунку PBS.
  8. Для окрашивания вторичными антителами (см. Таблицу материалов) приготовьте 2-кратный буфер для вторичного окрашивания (Таблица 4).
  9. Добавьте 20 мкл/лунку 2-кратного вторичного окрашивающего буфера (1-кратная конечная концентрация), инкубируйте в течение 2 ч при RT вдали от света и трижды промойте PBS. Оставьте 100 мкл PBS/хорошо после последней стирки.
    1. Добавьте алюминиевое уплотнение на пластину, чтобы свести к минимуму испарение. Как вариант, накройте тарелку полиэтиленовой пленкой и алюминиевой фольгой. Перейдите к получению изображения или храните пластину при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на срок до одной недели. Если наблюдается фоновая флуоресценция, рассмотрите возможность увеличения времени блокировки. Если окрашивания недостаточно, попробуйте увеличить концентрацию первичных антител или время инкубации.

6. Визуализация флуоресцентно окрашенных нейронов (7-й день)

  1. Получите изображения покрытых, культивируемых и окрашенных нейронов на 7-й день. В идеале следует использовать автоматизированный конфокальный флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалов). Кроме того, можно получить изображения вручную.
  2. Для получения каналов Хёхста, TH, α-синуклеина и MAP2 используются лазеры с длиной волны 405 нм, 488 нм, 561 нм и 647 нм соответственно (рис. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество подробных данных для фенотипического профилирования, используйте 40-кратный объектив и получите 16 полей/лунку с помощью Z-стеков, состоящих из 3 Z-срезов, разделенных 2 мкм. В случае повреждений нейронного ковра, связанных с пипетированием, старайтесь избегать визуализации этих областей.
  3. В зависимости от микроскопа и камеры отрегулируйте время экспозиции и интенсивность возбуждения для каждого из четырех флуоресцентных каналов отдельно, чтобы получить оптимальный динамический диапазон интенсивностей флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для обработки изображений часто предоставляет гистограмму для определения идеального времени экспозиции. Если гистограмма слишком сильно смещена влево в низком диапазоне сигнала, значит, время экспозиции слишком короткое или интенсивность возбуждения слишком мала. Если на максимальном уровне сигнала справа есть резкий обрыв, то значение сигнала насыщено. В этом случае уменьшите интенсивность возбуждения или сократите время экспозиции.
  4. Храните изображения в открытом формате без потерь, таком как .tif.

7. Обработка изображений (День 8)

  1. Сегментация изображений и выделение фенотипических признаков необходимы для создания количественных фенотипических профилей. Используйте программное обеспечение PhenoLink для сегментации изображений и извлечения признаков (Таблица материалов). Инструкцию по установке PhenoLink можно найти в репозитории GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация изображения используется для идентификации и разделения различных объектов или областей на изображении, в то время как извлечение фенотипических признаков используется для анализа и извлечения релевантной информации из этих областей. Существует несколько альтернативных программных решений, таких как CellProfiler10, ImageJ/FIJI 11, Napari 12 или Knime Analytics Platform13, для извлечения количественной информации из многоканальных флуоресцентных изображений.
  2. Выполняйте сегментацию изображений на необработанных изображениях с коррекцией освещенности. Определите соответствующие пороги интенсивности флуоресцентного канала опытным путем для каждой пластины, чтобы фоновый сигнал был минимальным, а требуемый сегментированный сигнал соответствовал сигналу в необработанном изображении. Пластины, обработанные и окрашенные в один и тот же день, обычно требуют сопоставимых пороговых значений интенсивности канала для сегментации.
  3. Определите размер и интенсивность ядра, чтобы отделить живые клетки от мертвых. При использовании 40-кратных изображений сохраните все остальные параметры по умолчанию и запустите программное обеспечение. На одну скважину будет рассчитано сто двадцать шесть количественных характеристик изображения (Дополнительная таблица 1).
  4. Используйте полученные табличные количественные данные для построения фенотипических профилей и сравнения фенотипических профилей из различных клеточных линий или условий лечения. Каждая строка соответствует биологическому состоянию (колодцу), а каждый столбец соответствует определенному фенотипическому признаку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы приводим пример выходного файла вместе с конвейером анализа данных, чтобы проиллюстрировать его использование (см. Таблицу материалов). Кроме того, на рисунке 3 показан состав фенотипического профиля.

8. Генерация и визуализация фенотипического профиля (День 8)

  1. Если на вашем компьютере не установлены Python и Jupyter, установите дистрибутив Anaconda и откройте программное обеспечение Jupyter. Загрузите прилагаемую записную книжку Jupyter и все остальные предоставленные файлы и сохраните их в том же каталоге (см. Таблицу материалов). Откройте файл записной книжки Jupyter с помощью программного обеспечения Jupyter.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Anaconda — это бесплатная платформа с открытым исходным кодом для языков программирования, таких как Python. Эта платформа поставляется с интерпретатором Python Jupyter, который может выполнять предоставленную записную книжку Jupyter для создания и анализа фенотипических профилей (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
  2. Выполните ячейку за ячейкой записной книжки Jupyter с помощью программного обеспечения Jupyter. Предоставленные примеры данных в формате FTH и файлы .txt требований должны находиться в том же каталоге, что и записная книжка Jupyter. Каждая ячейка записной книжки Jupyter снабжена аннотациями, поясняющими ее функциональные возможности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно использовать записную книжку Jupyter в правильном порядке, начиная с загрузки и масштабирования данных, и продолжая ячейку за ячейкой до конца. Все выходные данные и графика будут храниться во вновь созданной папке в исходном каталоге записной книжки Jupyter. На рисунке 4 показан рабочий процесс и выходные данные рабочего процесса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Фенотипическое профилирование нейронов мДА является эффективным способом количественной оценки различных аспектов клеточной биологии и их изменений во время экспериментальной модуляции. Чтобы проиллюстрировать эту методологию, в этом исследовании использовались криоконсервированные нейроны LRRK2 G2019S и здоровые донорские нейроны mDA. Эти нейроны дифференцированы в течение примерно 37 дней, являются постмитотическими и экспресс-маркерами нейронов (TUBB3 и MAP2) и маркерами дофаминергических нейронов, включая тирозингидроксилазу (TH) в комбинации с FOXA2, в то время как глиальный маркер глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) отсутствует14. В соответствии с описанным протоколом обе клеточные линии культивировали в течение 6 дней и обрабатывали 0,1 мкМ PFE-360, ингибитором киназы LRRK2. Нейроны окрашивали с помощью ядерного красителя Хёхста и антител к α-синуклеину, TH и MAP2 (рис. 2).

Затем изображения были сегментированы, и были извлечены фенотипические признаки. Мы определили 126 количественных признаков, которые могут быть агрегированы в хорошо обоснованные фенотипические профили (рис. 3А,Б). Можно получить доступ к каждому признаку и его значению в соответствии с экспериментальным условием. Некоторые особенности показали изменения при комплексной обработке. Например, интенсивность флуоресценции α-синуклеина в TH-положительных клетках снизилась при обработке PFE-360 (рис. 3C, левая панель). Другие признаки были представлены только различиями между испытуемыми клеточными линиями, но не при комплексной обработке. Так было, например, в случае длины нейронной сети MAP2 или соотношения TH-положительных нейронов (рис. 3C, средняя и правая панели). Важно учитывать полный фенотипический профиль, чтобы анализировать фенотипические вариации в различных клеточных линиях или комплексных методах лечения менее селективным и всесторонним образом.

На этапе анализа изображения всегда вычисляются все 126 объектов. Точно так же при анализе данных учитываются все признаки, но алгоритм машинного обучения присваивает веса отдельным признакам для разделения биологических классов. Рабочий процесс анализа данных начинается с загрузки данных и масштабирования признаков (Рисунок 4А). Масштабирование важно для машинного обучения, так как оно помогает нормализовать данные и гарантирует, что каждый объект находится в одинаковом масштабе. Это может помочь повысить производительность алгоритмов машинного обучения, сделав их менее чувствительными к масштабу входных объектов. Кроме того, масштабирование может помочь улучшить интерпретируемость моделей машинного обучения, упрощая сравнение относительной важности различных признаков. На следующем шаге выполняется кластеризующий анализ (Рисунок 4Б). Кластеризация может быть полезна для изучения структуры наборов данных высокой размерности и выявления закономерностей в данных, которые могут быть не сразу очевидны при рассмотрении отдельных объектов. Иерархическая кластеризация, основанная на косинусном расстоянии между хорошо обоснованными фенотипическими профилями, показала сильные различия между клеточными линиями, но в меньшей степени для медикаментозного лечения. Данные по скважинам, обработанным PFE-360, сгруппированы в контрольной группе, обработанной ДМСО, что указывает на отсутствие сильных различий при использовании этой сравнительной метрики. Наряду с кластеризацией, подходы к уменьшению размерности также являются полезными инструментами для визуализации сходств и различий данных многомерного фенотипического профилирования. Здесь мы использовали аппроксимацию попарно управляемого многообразия (PaCMAP)15 (Рисунок 4C). Подобно предыдущему подходу, основанному на косинусном расстоянии, PaCMAP показал в основном различия между двумя клеточными линиями и, в меньшей степени, между контрольными лунками PFE-360 или DMSO. Как кластеризация косинусных расстояний, так и PaCMAP являются неконтролируемыми методами и вряд ли выявят небольшие различия, которые присутствуют только в выбранных фенотипических признаках, например, потому что соединение изменяет только несколько фенотипов (т.е. только признаки, связанные с нейритами). Чтобы устранить это ограничение анализа фенотипического профиля, мы провели классификацию с учителем на основе машинного обучения. В частности, мы использовали машину для усиления градиента света (LightGBM) (Рисунок 4D). LightGBM — это алгоритм машинного обучения с учителем, который использует алгоритмы дерева решений для создания модели, которую можно использовать для ранжирования или классификации16. LightGBM был разработан, чтобы быть более быстрым и эффективным, чем традиционные алгоритмы на основе дерева, такие как алгоритм случайного леса. Алгоритм был обучен на данных фенотипического профиля с одной пластины и протестирован на данных со второй независимой пластины. Модель LightGBM имела общую точность 85% и правильно предсказывала экспериментальную категорию (клеточная линия или соединение) большинства скважин. Точность предсказания клеточных линий была выше, чем для комбинированного прогнозирования, но также 60% скважин, обработанных компаундом, были предсказаны правильно, что превосходит классические неконтролируемые методы. LightGBM позволяет получить доступ к важности соответствующих фенотипических признаков для классификации четырех классов (Рисунок 4D). Важные фенотипические признаки, отличающие клеточные линии и лекарственные препараты, связаны, например, с площадью клеточной поверхности или интенсивностью клеток окрашивания MAP2 и TH. Поверхность двойной положительной цитоплазмы TH и α-синуклеина была наиболее важным признаком, который отличал клеточные линии и комплексные методы лечения, за которой следовало соотношение мертвых клеток. Мы предоставляем записную книжку Jupyter, которая выполняет построение графиков данных и все методы анализа без учителя и с учителем, описанные здесь (см. Содержание материалов). Полученные результаты иллюстрируют потенциал фенотипического профилирования для различения клеточных линий и эффектов комплексной терапии в нейронах мДА человека.

Figure 2
Рисунок 2: Иммуноокрашивание нейронов мДА человека, полученных из ИПСК. Показаны репрезентативные изображения всех полученных флуоресцентных каналов. Здоровые донорские или несущие мутацию нейроны mDA LRRK2 G2019S обрабатывали либо ДМСО, либо 0,1 мкМ ингибитора киназы LRRK2 PFE-360. Лечение проводили на 3-й день, а клетки фиксировали на 6-й день, как описано в протоколе. Масштабные линейки: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Создание фенотипического профиля из отдельных фенотипических признаков. (A) Показаны отдельные фенотипические признаки, которые могут быть извлечены из отдельных флуоресцентных каналов. (В) Фенотипические признаки могут быть объединены в фенотипический профиль. Несколько фенотипических профилей могут быть сгенерированы в различных экспериментальных условиях, присутствующих на 384-луночном планшете. (C) Примеры фенотипических признаков и соответствующие им значения для каждого условия эксперимента. Каждая точка данных соответствует измерению из одной скважины. t-критерий неравных дисперсий Уэлча был использован для проверки значимости. Статистическая значимость представлена в виде * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 и не значима (ns = p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фенотипические профили нейронов мДА содержат количественную информацию и могут быть использованы для классификации фенотипов . (A) Схематическое изображение рабочего процесса анализа данных. (B) Агрегированные фенотипические профили нейронов мДА, получавших контрольную и медикаментозную терапию. (C) Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP) — неконтролируемое уменьшение размерности данных фенотипического профиля. (D) Машина для усиления градиента света (LightGBM) контролируемая классификация данных фенотипического профиля. Алгоритм классификации был обучен на данных фенотипического профиля с одной пластины и применен для предсказания экспериментальных классов на второй пластине. Левая панель: матрица несоответствий показывает связь между четырьмя истинными классами данных и четырьмя классами, прогнозируемыми моделью. В целом, модель корректно предсказывает класс данных в 85% случаев. Правая панель: 10 наиболее важных фенотипических признаков для классификатора LightGBM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Реагентов На 100 мл
Базовая база iCell Medium 1 100 мл
Нейродобавка iCell B 2 мл
Добавка для нервной системы iCell 1 мл

Таблица 1: Состав полных сред для технического обслуживания.

Реагент 2x решение Конечная концентрация На 100 мл
ПБС 1x 1 1 78 мл
Тритон 10% 0.20% 0.10% 2 мл
Стандартное решение FBS 20% 10% 20 мл

Таблица 2: Состав 2х блокирующего раствора.

Реагент В 2 раза больше концентрации Конечная концентрация На 100 мл
ПБС 1x 1 1 87,36 мл
Тритон 10% 0.20% 0.10% 2 мл
Стандартное решение FBS 10% 5% 10 мл
Анти-ТН 1/500 1/1000 0,2 мл
Анти-α-синуклеин 1/250 1/500 0,4 мл
Анти-MAP2 1/2500 1/5000 0,04 мл

Таблица 3: Состав первичного окрашивающего буфера.

Реагент В 2 раза больше концентрации Конечная концентрация На 100 мл
ПБС 1x 1 1 86,7 мл
Тритон 10% 0.20% 0.10% 2 мл
Стандартное решение FBS 10% 5% 10 мл
Антимышь A488 1/500 1/1000 0,2 мл
Антикроличий A555 1/500 1/1000 0,2 мл
Антикуриный A647 1/125 1/250 0,8 мл
Хёхст 1/1000 1/2000 0,1 мл

Таблица 4: Состав 2х вторичного окрашивающего буфера.

Дополнительная таблица 1: Обзор всех извлеченных фенотипических признаков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фенотипическое профилирование — это метод измерения большого числа фенотипов в клетках с помощью флуоресцентного окрашивания, микроскопии и анализа изображений3. Фенотипические профили могут быть получены и сравнены между клеточными линиями или другими экспериментальными условиями, чтобы понять сложные изменения в клеточной биологии, которые могут остаться незамеченными при использовании одного считывания. В данной статье мы опишем применение фенотипического профилирования к нейронам мДА человека, полученным из ИПСК, типу клеток, часто используемому для моделирования клеточной биологии БП17,18,19. Фенотипическое профилирование нейронов мДА имеет ряд преимуществ по сравнению с ранее использовавшимися подходами к профилированию, в которых используются дженерики флуоресцентных красителей4, ненейрональные типы клеток5,6 или немасштабируемые 7,8. Представленный здесь метод позволяет проводить фенотипическое профилирование в физиологически значимых постмитотических нейронах mDA. Во-вторых, использование криоконсервированных нейронов мДА, полученных из ИПСК, значительно снижает вариабельность дифференцировки от партии к партии. В-третьих, используя четко определенный план эксперимента, автоматизированную обработку жидкостей и автоматизированную микроскопию, можно еще больше снизить техническую вариативность, что делает протокол высоко масштабируемым и открывает возможность использования нейронов mDA для кампаний фенотипического скрининга. Наконец, контролируемая классификация дает пользователям возможность группировать и понимать ключевые особенности фенотипических профилей и, следовательно, может помочь открыть новую биологию.

Фенотипическое профилирование позволяет исследовать отдельные признаки для разработки последующих гипотез, ведущих к последующим механистическим исследованиям. Например, мы показали, что нейроны мДА LRRK2 G2019S отличаются от контрольных нейронов mDA по содержанию α-синуклеина, длине нейрита MAP2 и соотношению TH-положительных клеток (рис. 3C). Однако комплексная обработка ингибитором киназы LRRK2 PFE-360 изменяет только содержание α-синуклеина и не влияет на длину нейрита MAP2 или соотношение TH-положительных клеток. Желательное химическое соединение должно спасать ансамбль фенотипов. Фенотипический профиль содержит необходимую информацию и может быть исследован с помощью методов кластеризации или уменьшения размерности, которые могут помочь визуализировать сложные взаимодействия признаков на 2-мерных графиках. Кластеризация на основе косинусных расстояний позволяет точно разделять обе клеточные линии (рис. 4B). Уменьшение размерности с помощью PaCMAP также иллюстрирует, как обе клеточные линии образуют различные кластеры, и что обработка PFE-360 приводит к различимым, но все же схожим общим фенотипам, вероятно, из-за влияния только на несколько измеряемых признаков, таких как содержание α-синуклеина (рис. 4C). В отличие от этого, контролируемое машинное обучение может помочь прогнозировать интересующие профили на основе их особенностей. Модель LightGBM, обученная на данных, точно предсказывала здоровые донорские и LRRK2-мутировавшие нейроны mDA в тестовых данных. Идентификация нейронов, обработанных PFE-360, была менее точной, по-видимому, потому, что влияние химических соединений на фенотипы слабее, чем генетические эффекты (рис. 4C). Поверхность двойной положительной цитоплазмы TH и α-синуклеина была наиболее важной характеристикой, которая отличала клеточные линии и комплексные методы лечения, за которой следовало соотношение мертвых клеток. Несколько других ключевых характеристик были связаны с площадью клеточной поверхности. Таким образом, размер клеток, по-видимому, является общей отличительной чертой между здоровыми контрольными и мутировавшими LRRK2 нейронами mDA (рис. 4D). Таким образом, этот подход демонстрирует, как машинное обучение может идентифицировать наиболее определяющие фенотипические признаки в сложном наборе данных, которые затем могут быть использованы для разработки новых гипотез и проверки этих гипотез во вторичных анализах.

CellPainting стал популярным подходом к созданию фенотипических профилей и использует стандартизированный набор флуоресцентных зондов и определенный протокол 3,4,20,21,22,23. Здесь было решено использовать более специфичную для нейронов панель окрашивания, состоящую из ядерного красителя Хёхста и антител против α-синуклеина, ТГ и MAP2. Другие флуоресцентные окрашивания с использованием лизосом-ассоциированного антитела LAMP1 или митохондриальных красителей TMRM или MitoTracker применялись нами в прошлом и сосредоточены на более специфических аспектах клеточной биологии БП9. Стандартная световая микроскопия ограничена в том смысле, что может быть разрешена только четыре длины волны флуоресценции. Таким образом, добавление лизосомных или митохондриальных красителей к существующей панели окрашивания не является возможным. В зависимости от биологического вопроса, окрашивание может быть заменено. В качестве альтернативы две биологические структуры могут быть окрашены с использованием одной и той же длины волны при условии, что их морфология различима и что они локализованы в разных клеточных компартментах.

Чтобы повысить совместимость протокола со скринингом, он был разработан таким образом, чтобы требовать минимального количества этапов пипетирования и короткой продолжительности культивирования. Критически важными для метода являются все этапы работы с жидкостью, поскольку они могут повлиять на покрытие или привести к отслоению нейронов. Как указано в протоколе, рекомендуется, чтобы в скважине всегда оставалось остаточное количество среды. Также очень важно осторожно обращаться с нейронами mDA, поскольку они являются очень хрупким типом клеток. Выполняйте размораживание точно так, как показано, чтобы предотвратить чрезмерную гибель клеток из-за осмотического разрыва клеточной мембраны. Плотность посева была оптимизирована для получения достаточного количества данных на скважину при одновременном предотвращении чрезмерного перекрытия структур, таких как нейриты или ядра на изображениях. Фенотипические профили очень чувствительны к позиционным эффектам в пластинах 2,4,23. Как указано в протоколе, не используйте краевые колодцы. Кроме того, при планировании эксперимента рекомендуется использовать не менее пяти технических реплик для каждого экспериментального условия. В идеале реплики распределить случайным образом по тарелке.

Как и любой другой метод, фенотипическое профилирование нейронов имеет ограничения. Наборы данных фенотипического профилирования могут быть очень большими, особенно при расчете для отдельных клеток. Несмотря на то, что наличие большего количества фенотипических признаков может быть полезным, например, для выявления ранее неизвестного механизма или обеспечения стабильности системы анализа, оно также может вносить нежелательный шум и быть более сложным для интерпретации, чем тщательно отобранные отдельные признаки. Например, переобучение модели или ложные корреляции — это проблемы, которые чаще всего возникают в больших наборах данных 4,24. Таким образом, фенотипическое профилирование предназначено не для замены экспериментального планирования, основанного на гипотезах, а скорее для того, чтобы служить отправной точкой для новых гипотез, которые затем могут быть проверены. Болезнь Паркинсона является нейродегенеративным заболеванием и часто проявляется только в позднем возрасте. Таким образом, изучение биологии заболевания, связанного с болезнью Паркинсона, в нейронах, полученных из ИПСК, может быть ограничением, особенно когда основное внимание уделяется классическим признакам болезни Паркинсона на поздних стадиях, таким как агрегация α-синуклеина 17,25,26. Напротив, из-за относительно позднего начала болезни Паркинсона досимптоматическая фаза оценивается как длительная. Таким образом, значительные патологии могут быть обнаружены уже на клеточной основе в нейрональных моделях iPSC mDA, в то время как на системном уровне мозг способен компенсировать нейронную и функциональную потерю в течение многих лет27,28.

В будущем этот протокол может быть адаптирован к другим типам нейронов, полученных из ИПСК, таким как корковые или моторные нейроны, путем замены окрашивания, связанного с нейронами mDA, окрашиванием, ориентированным, например, на синаптическую биологию или внутриклеточные агрегаты. Кортикальные нейроны могут быть охарактеризованы, например, с помощью паннейритного окрашивания против β-тубулина III и пре- и постсинаптических белков, таких как Synapsin1 и Homer, для которых были описаны высококачественные антитела29. Мотонейроны могут быть фенотипированы с использованием антител к холинацетилтрансферазе (ChAT), TAR-ДНК-связывающему белку 43 (TDP-43) и РНК-гранулярным маркерам30. Таким образом, ожидается, что представленный протокол для создания фенотипических профилей нейронов будет полезен исследовательскому сообществу для изучения влияния химических или генетических возмущений на широкий спектр фенотипов нейронов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы являются сотрудниками компании «Ксилинк».

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить всех коллег из «Ксилинк» за их ценную помощь и обсуждения, которые привели к разработке представленного протокола.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti- chicken – Alexa 647 Jackson ImmunoRearch 703-605-155 Immunofluorescence
Anaconda https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2 Novus NB300-213 Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488 Thermo Fisher A11001 Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555 Thermo Fisher A21429 Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase Merck T2928 Immunofluorescence
Anti-α-synuclein Abcam 138501 Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head Agilent If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope  Yokogawa CV7000 The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter Invitrogen Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+ Gibco 14040-133 Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser  BioTek (Agilent)  If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %) Euromedex EM-15710-S Fixation before staining
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
iCell Base Medium 1 Fujifilm M1010 Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M Fujifilm C1087 Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 Fujifilm C1149 Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell Nervous System Supplement Fujifilm M1031 Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B Fujifilm M1029 Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook In-house development https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin Biolamina LN521 Plate coating
PFE-360 MedChemExpress HY-120085 LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink In-house development https://github.com/Ksilink/PhenoLink Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated Perkin Elmer 6057500 Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL Thermo Scientific AB-0781 Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton Sigma T9284 Permeabilization before lysis
Trypan Blue Sigma T8154-20ML Determination of living cells
Vprep Pipetting System  Agilent Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
  3. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  4. Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  5. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
  6. Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
  7. Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
  8. Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
  9. Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
  10. Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
  13. Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
  14. Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
  15. Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
  16. Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
  17. Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
  18. Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
  19. Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
  20. Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
  21. Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
  22. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
  23. Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
  24. Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
  25. Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
  26. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  27. Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
  28. Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
  29. Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
  30. Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).

Tags

Фенотипическое профилирование стволовые клетки человека дофаминергические нейроны среднего мозга болезнь Паркинсона клеточные модели ФД in vitro индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) фенотипы нейронов флуоресцентная панель окрашивания ядерное окрашивание О±-синуклеин тирозингидроксилаза (TH) микротрубообразный белок 2 (MAP2) протокол фенотипического профилирования масштабируемые 384-луночные планшеты автоматическая обработка жидкостей высокопроизводительная микроскопия мутация G2019S ген лейцин-богатой повторной киназы 2 (LRRK2) Ингибитор киназы LRRK2 PFE-360 фенотипические изменения многомерные фенотипические профили кластерный анализ контролируемая классификация на основе машинного обучения
Фенотипическое профилирование дофаминергических нейронов среднего мозга человека, полученных из стволовых клеток человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J.… More

Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J. H. Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (197), e65570, doi:10.3791/65570 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter