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Neuroscience

Perfil fenotípico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo derivadas de células madre humanas

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ksilink

Summary

Este protocolo describe el cultivo celular de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo humano, seguido de la tinción inmunológica y la generación de perfiles fenotípicos neuronales a partir de imágenes microscópicas adquiridas de alto contenido que permiten la identificación de variaciones fenotípicas debidas a modulaciones genéticas o químicas.

Abstract

La enfermedad de Parkinson (EP) está relacionada con una serie de procesos biológicos celulares que causan la pérdida de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA). Muchos modelos celulares actuales de EP in vitro carecen de complejidad y no tienen en cuenta múltiples fenotipos. El perfil fenotípico en neuronas mDA derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) puede abordar estas deficiencias midiendo simultáneamente una serie de fenotipos neuronales en un tipo de célula relevante para la EP en paralelo. Aquí, describimos un protocolo para obtener y analizar perfiles fenotípicos de neuronas mDA humanas disponibles comercialmente. Se utiliza un panel de tinción fluorescente específico de neurona para visualizar los fenotipos relacionados con la proteína nuclear, la α-sinucleína, la tirosina hidroxilasa (TH) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2). El protocolo de perfil fenotípico descrito es escalable, ya que utiliza placas de 384 pocillos, manipulación automática de líquidos y microscopía de alto rendimiento. La utilidad del protocolo se ejemplifica utilizando neuronas mDA de donantes sanos y neuronas mDA portadoras de la mutación G2019S ligada a PD en el gen de la quinasa repetida 2 rica en leucina (LRRK2). Ambas líneas celulares fueron tratadas con el inhibidor de la quinasa LRRK2 PFE-360 y se midieron los cambios fenotípicos. Además, demostramos cómo se pueden analizar los perfiles fenotípicos multidimensionales utilizando métodos de clasificación supervisada basados en clústeres o aprendizaje automático. El protocolo descrito interesará especialmente a los investigadores que trabajan en el modelado de enfermedades neuronales o en el estudio de los efectos de los compuestos químicos en las neuronas humanas.

Introduction

En la enfermedad de Parkinson (EP) se alteran diversos procesos biológicos celulares. Por ejemplo, la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, los defectos de degradación de proteínas, la interrupción del tráfico vesicular y la función endolisosomal se han asociado con la pérdida de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA), se observan comúnmente en la EP1. Por lo tanto, la EP parece implicar múltiples mecanismos de enfermedad que pueden interactuar y empeorarse entre sí. Una forma útil de investigar esta interacción mecanicista es la creación de una huella dactilar fenotípica completa o un perfil de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA).

El perfil fenotípico es un enfoque que implica la creación de un perfil de una muestra basado en una colección de características medibles y, en segundo lugar, implica hacer predicciones sobre una muestra basada en este perfil 2,3. El objetivo de la elaboración de perfiles es capturar una amplia gama de características, algunas de las cuales pueden no haberse asociado previamente con una enfermedad o tratamiento3. Como resultado, la elaboración de perfiles puede revelar procesos biológicos inesperados. El perfil fenotípico generalmente se basa en células teñidas con fluorescencia, y se han desarrollado ensayos estandarizados, como Cell Painting, para crear perfiles fenotípicos4. Recientemente, el perfil fenotípico se ha aplicado, por ejemplo, para la caracterización de moléculas pequeñas o la predicción precisa de subtipos de EP basados únicamente en fibroblastos derivados del paciente 5,6. A pesar de estos avances, el perfil fenotípico rara vez se ha aplicado a células diferenciadas postmitóticas, como las neuronas mDA derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) que expresan mutaciones ligadas a la enfermedad de Parkinson, como LRRK2 G2019S. Los desafíos significativos de los modelos derivados de iPSC incluyen la presencia de características patológicas sutiles o variables en lotes de diferenciación o genotipos, y el hecho de que los fenotipos aislados de EP no capturan toda la complejidad de la enfermedad. Además, aunque los modelos neuronales de iPSC son fisiológicamente relevantes, rara vez se utilizan en los procesos de descubrimiento de fármacos en la EP debido a las preocupaciones sobre la complejidad técnica 7,8.

Previamente desarrollamos una metodología robusta para medir múltiples fenotipos fisiopatológicos relacionados con la EP en neuronas mDA humanas que son sensiblesa los cambios fenotípicos inducidos por compuestos genéticos y químicos. Este artículo describe en detalle una versión optimizada de esta metodología para crear perfiles fenotípicos a partir de neuronas mDA (Figura 1). Este protocolo tiene varias ventajas sobre los enfoques de perfiles fenotípicos descritos anteriormente, como el uso de neuronas mDA de alta calidad y la reproducibilidad técnica. Por primera vez, este protocolo permite el perfil fenotípico en neuronas mDA postmitóticas fisiológicamente relevantes después de perturbaciones químicas de una manera altamente escalable. Las neuronas mDA totalmente diferenciadas y criopreservadas están disponibles comercialmente, lo que disminuye significativamente la variabilidad de la diferenciación de un lote a otro. En segundo lugar, la variabilidad técnica puede reducirse aún más mediante el uso de un diseño experimental bien definido (es decir, la duración del cultivo o evitar los pozos de borde), la manipulación automatizada de líquidos y la microscopía automatizada. Además, aquí se describen los pasos iniciales del análisis del perfil fenotípico mediante enfoques de agrupamiento no supervisado o clasificación supervisada, lo que indica cómo se pueden analizar los datos del perfil fenotípico. Este protocolo será de utilidad para los investigadores interesados en los cambios fenotípicos de las neuronas mDA inducidos por perturbaciones genéticas o químicas, específicamente cuando se requiere una configuración de estudio altamente escalable, por ejemplo, durante las campañas de cribado o cuando se van a estudiar los efectos de un número menor de compuestos, por ejemplo, para determinar los efectos tóxicos. En resumen, se anticipa que la aplicación del perfil fenotípico de las neuronas humanas es una técnica valiosa para estudiar fenotipos complejos relacionados con enfermedades y caracterizar los efectos celulares de los candidatos a fármacos.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del protocolo experimental para generar perfiles fenotípicos basados en imágenes a partir de neuronas mDA derivadas de iPSC humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Preparación del medio y placas para la siembra de neuronas (Día 1)

  1. Para preparar las placas para la siembra de neuronas en el día 1, caliente Laminin a temperatura ambiente (RT) justo antes de usarlo. Prepare la solución de laminina diluyendo la solución madre de laminina (0,1 mg/ml) 1/10 en PBS+/+ frío (con Ca 2+ y Mg2+).
    NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales. Las composiciones de las soluciones y los tampones se describen en las Tablas 1-4.
  2. A continuación, añadir 25 μL de la solución de laminina a cada pocillo de una placa de 384 pocillos prerrecubierta de poli-D-lisina (PDL) e incubar durante la noche a 4 °C. Las placas recubiertas pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de una semana.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí hasta por una semana. Selle las placas con una película de plástico.
  3. Prepare los medios de mantenimiento completos y guárdelos a 4 °C durante un máximo de un mes (Tabla 1).

2. Descongelación de neuronas (Día 0)

  1. Para descongelar las neuronas en el día 0, precalentar un baño de agua a 37 °C y equilibrar el medio de mantenimiento completo a RT, protegido de la luz.
  2. Saque el vial que contiene las neuronas congeladas obtenidas comercialmente (consulte la Tabla de materiales) del tanque de nitrógeno líquido y colóquelo sobre hielo seco. A continuación, coloque el vial en el baño de agua durante 2 min. Una vez que el líquido esté completamente descongelado, desinfecte el vial con etanol al 70%.
  3. Aspirar las neuronas descongeladas con una pipeta P1000 (alrededor de 370 μL) y transferirlas en un tubo de centrífuga de 50 ml sin pipeteo ascendente y descendente. A continuación, enjuague el vial con 630 μL de medio de mantenimiento completo, dispense gota a gota (ángulo de 45°) en el tubo de 50 ml. Agite lentamente mientras dispensa.
    NOTA: Es fundamental dispensar el medio lentamente, gota a gota, para evitar la ruptura osmótica de las células. Un ángulo de 45° y una ligera agitación minimizan la alta presión osmótica local durante el pipeteo.
  4. Del mismo modo, agregue 1 ml de medio de mantenimiento completo en el tubo de centrífuga de 50 ml con una pipeta P1000. Luego, agregue lentamente 2 ml de medio de mantenimiento completo. Agite con cuidado mientras dispensa.
  5. Cuenta las celdas. Prepare un microtubo con 10 μL de Azul de Tripán y 10 μL de suspensión celular y agréguelo a un portaobjetos de la cámara de recuento (10 μL). Realice el recuento utilizando un contador de celdas automatizado (consulte Tabla de materiales) o manualmente.
  6. Después de contar, centrifugar el tubo de 50 ml que contiene las neuronas a 400 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el gránulo con una pipeta P1000 y 1 ml de medio de mantenimiento completo. A continuación, añada el volumen necesario para alcanzar la concentración deseada (300.000 células/ml, véase también el siguiente paso).

3. Siembra de neuronas en platos preparados (Día 0)

  1. Para sembrar neuronas en las placas preparadas el día 0, saque las placas recubiertas del refrigerador, colóquelas debajo de la campana de cultivo celular y déjelas equilibrarse a RT durante unos 30 minutos.
  2. Justo antes de la siembra, aspire 15 μL de solución de recubrimiento con un manipulador de líquidos automatizado o una pipeta de 16 canales. Deje aproximadamente 10 μL por pocillo para evitar daños en el recubrimiento.
  3. A continuación, dispense 50 μL de la solución celular que contiene 300.000 células/ml (preparada en el paso 2.6) por pocillo con una pipeta de 16 canales, lo que da como resultado 15.000 neuronas sembradas por pocillo y un volumen final por pocillo de 60 μL.
  4. En una placa de 384 pocillos, evite usar las columnas 1, 2, 23, 24 y las filas A, B, O y P para minimizar los posibles efectos de borde que pueden afectar los perfiles fenotípicos. Llene los pocillos vacíos no utilizados con 80 μL de PBS. Incubar las placas a 37 °C y 5% de CO2.

4. Cambio medio o tratamiento compuesto (Día 3)

  1. Dependiendo del número de pocillos, precaliente un volumen apropiado de medio de mantenimiento completo en RT. Proteja de la luz.
  2. Si se requiere un cambio de medio, continúe con el paso 4.4. Si se desea un tratamiento compuesto, verifique la concentración de material compuesto y el disolvente utilizado (agua, DMSO, metanol, etc.).
  3. Prepare una solución compuesta concentrada 1,5x para todas las concentraciones deseadas que se van a probar. Prepare las diluciones compuestas utilizando un medio de mantenimiento completo.
    NOTA: Como control neutro, utilice el disolvente respectivo a la misma concentración que el compuesto probado. Si se utilizan compuestos múltiples o desconocidos a diferentes concentraciones, es aconsejable realizar un experimento dosis-respuesta por separado para medir los efectos del disolvente en el perfil fenotípico.
  4. Si se utiliza un sistema de pipeteo automático, agregue 60 μL de la solución compuesta 1.5x a una placa de almacenamiento de 384 pocillos. También puede utilizar una pipeta de 16 canales. Si se requiere un cambio de medio, agregue 60 μL de medio de mantenimiento completo en su lugar.
  5. Utilizando el sistema de pipeteo automático, aspire y deseche 40 μL de medio por pocillo de la placa que contiene neuronas para mantener 20 μL/pocillo. A continuación, añada 40 μL/pocillo de solución compuesta 1,5x de la placa de almacenamiento de 384 pocillos a cada pocillo para obtener la concentración final deseada.
    NOTA: Es fundamental no realizar cambios completos de medio, sino dejar siempre el medio residual en el pocillo para evitar daños en la alfombra neuronal o en el revestimiento.
  6. En caso de que el cultivo neuronal se realice durante más de los 6 días descritos en este protocolo, cambiar el medio cada 2-3 días.

5. Fijación y tinción de neuronas (días 6 y 7)

  1. Para fijar y teñir las neuronas en los días 6 y 7, utilice un manipulador de líquidos automatizado para todos los pasos de dispensación y lavado. También puede utilizar una pipeta de 16 canales.
  2. Prepare una solución de Triton X-100 al 10 % diluyendo Triton X-100 en 1x PBS. Vórtice hasta que la solución sea homogénea. Conservar a 4 °C.
  3. Para fijar las neuronas, dispense 20 μL/pocillo de PFA al 16%, lo que da como resultado una concentración final del 4%. Incubar la placa durante 30 minutos a temperatura media y lavarla tres veces con 1x PBS. Deje 20 μL/pocillo de PBS después del último lavado.
    PRECAUCIÓN: El PFA es reconocido como una sustancia peligrosa que se sabe que causa toxicidad oral, dérmica y respiratoria. También representa una amenaza para los ojos y puede provocar mutaciones genéticas y cáncer. El manejo adecuado de PFA requiere el uso de equipos de protección personal adecuados, como protección para los ojos y la cara, además de garantizar una ventilación adecuada. Es importante evitar la liberación de PFA en el medio ambiente.
  4. Para la permeabilización y el bloqueo, prepare una solución de bloqueo 2x (Tabla 2).
  5. Añadir 20 μL/pocillo de 2x solución de bloqueo (1x concentración final), incubar durante 1 h a RT y lavar una vez con PBS. Conserve 20 μL/pocillo de PBS después del lavado.
  6. Para la tinción de anticuerpos primarios (ver Tabla de materiales), prepare un tampón de tinción primaria 2x (Tabla 3).
  7. Añadir 20 μL/pocillo de tampón de tinción primario 2x (1x concentración final) e incubar durante la noche a 4 °C. A la mañana siguiente, el día 7, lávese tres veces con PBS. Deje 20 μL/pocillo de PBS después del lavado.
  8. Para la tinción de anticuerpos secundarios (ver Tabla de Materiales), prepare un tampón de tinción secundaria 2x (Tabla 4).
  9. Añadir 20 μL/pocillo de tampón de tinción secundario 2x (1x concentración final), incubar durante 2 h a RT lejos de la luz y lavar tres veces con PBS. Deje 100 μL de PBS/pocillo después del último lavado.
    1. Agregue un sello de aluminio en la placa para minimizar la evaporación. Alternativamente, cubra el plato con una película de plástico y papel de aluminio. Proceda a la adquisición de imágenes o guarde la placa a 4 °C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí hasta por una semana. Si se observa fluorescencia de fondo, considere aumentar el tiempo de bloqueo. Si la tinción es insuficiente, intente aumentar la concentración de anticuerpos primarios o el tiempo de incubación.

6. Obtención de imágenes de neuronas teñidas con fluorescencia (Día 7)

  1. Adquirir imágenes de las neuronas plateadas, cultivadas y teñidas en el día 7. Lo ideal es utilizar un microscopio de fluorescencia confocal automatizado (véase la tabla de materiales). También puede adquirir imágenes manualmente.
  2. Adquiera los canales Hoechst, TH, α-sinucleína y MAP2 utilizando láseres de 405 nm, 488 nm, 561 nm y 647 nm, respectivamente (Figura 2).
    NOTA: Para generar una cantidad suficiente de datos detallados para el perfil fenotípico, utilice un objetivo de 40x y adquiera 16 campos/pocillo utilizando pilas Z que constan de 3 cortes en Z separados por 2 μm. En caso de que haya daños relacionados con el pipeteo en la alfombra neuronal, trate de evitar obtener imágenes de estas áreas.
  3. Dependiendo del microscopio y la cámara, ajuste los tiempos de exposición y las intensidades de excitación para cada uno de los cuatro canales fluorescentes por separado para obtener un rango dinámico óptimo de las intensidades fluorescentes.
    NOTA: El software de imágenes a menudo proporciona un histograma para determinar el tiempo de exposición ideal. Si el histograma se desplaza demasiado hacia la izquierda en el rango de señal baja, entonces el tiempo de exposición es demasiado corto o la intensidad de excitación es demasiado baja. Si hay un acantilado agudo en el nivel máximo de señal a la derecha, entonces el valor de la señal está saturado. En este caso, reduzca la intensidad de excitación o acorte el tiempo de exposición.
  4. Almacene imágenes en un formato abierto y sin pérdidas, como .tif.

7. Procesamiento de imágenes (Día 8)

  1. La segmentación de imágenes y la extracción de características fenotípicas son necesarias para la creación de perfiles fenotípicos cuantitativos. Utilice el software PhenoLink para la segmentación de imágenes y la extracción de características (Tabla de materiales). Las instrucciones para instalar PhenoLink se pueden encontrar en el repositorio de GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
    NOTA: La segmentación de imágenes se utiliza para identificar y separar diferentes objetos o regiones de una imagen, mientras que la extracción de características fenotípicas se utiliza para analizar y extraer información relevante de esas regiones. Varias soluciones de software alternativas, como CellProfiler 10, ImageJ/FIJI11, Napari 12 o Knime Analytics Platform13 están disponibles para extraer información cuantitativa de imágenes de fluorescencia multicanal.
  2. Realice la segmentación de imágenes en imágenes RAW con corrección de iluminación. Determine empíricamente los respectivos umbrales de intensidad del canal fluorescente por placa para que la señal de fondo sea mínima y la señal segmentada deseada corresponda a la señal de la imagen sin procesar. Las placas procesadas y teñidas en el mismo día suelen requerir umbrales de intensidad de canal comparables para la segmentación.
  3. Definir el tamaño y la intensidad del núcleo para separar las células vivas de las muertas. Cuando utilice imágenes de 40x, mantenga todos los demás parámetros predeterminados y ejecute el software. Se calcularán ciento veintiséis características cuantitativas de la imagen por pocillo (Tabla suplementaria 1).
  4. Utilice los datos cuantitativos tabulares resultantes para construir perfiles fenotípicos y comparar perfiles fenotípicos de diferentes líneas celulares o condiciones de tratamiento. Cada fila corresponde a una condición biológica (pozo) y cada columna corresponde a una característica fenotípica determinada.
    NOTA: Proporcionamos un archivo de salida de ejemplo junto con la canalización de análisis de datos para ilustrar su uso (consulte la Tabla de materiales). Además, en la Figura 3 se muestra la composición de un perfil fenotípico.

8. Generación y visualización del perfil fenotípico (Día 8)

  1. Si no tiene Python y Jupyter instalados en su computadora, instale Anaconda Distribution y abra el software Jupyter. Descargue el cuaderno de Jupyter Notebook proporcionado y todos los demás archivos proporcionados y guárdelos en el mismo directorio (consulte Tabla de materiales). Abra el archivo de Jupyter Notebook con el software Jupyter.
    NOTA: Anaconda es una plataforma gratuita y de código abierto para lenguajes de programación como Python. Esta plataforma viene con el intérprete de Python Jupyter que puede ejecutar el cuaderno de Jupyter proporcionado para crear y analizar perfiles fenotípicos (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
  2. Ejecute el cuaderno de Jupyter Notebook celda por celda con el software de Jupyter. Los archivos .txt de datos de ejemplo y requisitos proporcionados deben ubicarse en el mismo directorio que Jupyter Notebook. Cada celda de Jupyter Notebook está anotada para explicar su funcionalidad.
    NOTA: Es fundamental utilizar Jupyter Notebook en el orden correcto, empezando por la carga y el escalado de datos, y continuar celda por celda hasta el final. Todos los datos y gráficos de salida se almacenarán en una carpeta recién creada en el directorio de origen de Jupyter Notebook. En la figura 4 se muestra el flujo de trabajo y el resultado del flujo de trabajo.

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Representative Results

El perfil fenotípico en neuronas mDA es una forma eficiente de cuantificar múltiples aspectos de la biología celular y sus cambios durante la modulación experimental. Para ejemplificar esta metodología, este estudio hizo uso de LRRK2 G2019S criopreservado y neuronas mDA sanas de donantes. Estas neuronas han sido diferenciadas durante aproximadamente 37 días, son marcadores neuronales postmitóticos y expresos (TUBB3 y MAP2) y marcadores neuronales dopaminérgicos, incluyendo tirosina hidroxilasa (TH) en combinación con FOXA2, mientras que el marcador glial Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP) está ausente14. Siguiendo el protocolo descrito, ambas líneas celulares se cultivaron durante 6 días y se trataron con 0,1 μM de PFE-360, un inhibidor de la quinasa LRRK2. Las neuronas se tiñeron con la tinción nuclear de Hoechst y anticuerpos contra α-sinucleína, TH y MAP2 (Figura 2).

A continuación, se segmentaron las imágenes y se extrajeron las características fenotípicas. Determinamos 126 características cuantitativas que se pueden agregar en perfiles fenotípicos bien basados (Figura 3A, B). Se puede acceder a cada característica y su valor según la condición experimental. Algunas características mostraron cambios durante el tratamiento con compuestos. Por ejemplo, la intensidad de la fluorescencia de α-sinucleína en las células TH-positivas disminuyó tras el tratamiento con PFE-360 (Figura 3C, panel izquierdo). Otras características presentaron solo diferencias entre las líneas celulares probadas, pero no con el tratamiento compuesto. Este fue, por ejemplo, el caso de la longitud de la red de neuritas MAP2 o la proporción de neuronas TH-positivas (Figura 3C, panel central y derecho). Es fundamental considerar el perfil fenotípico completo para analizar las variaciones fenotípicas en diferentes líneas celulares o tratamientos compuestos de una manera menos selectiva y completa.

Durante el paso de análisis de imágenes, siempre se calculan las 126 entidades. Del mismo modo, durante el análisis de datos, se tienen en cuenta todas las características, pero el algoritmo de aprendizaje automático asigna pesos a las características individuales para separar las clases biológicas. El flujo de trabajo de análisis de datos comienza con la carga de datos y el escalado de entidades (Figura 4A). El escalado es importante para el aprendizaje automático, ya que ayuda a normalizar los datos y garantiza que cada característica esté en una escala similar. Esto puede ayudar a mejorar el rendimiento de los algoritmos de aprendizaje automático al hacerlos menos sensibles a la escala de las características de entrada. Además, el escalado puede ayudar a mejorar la interpretabilidad de los modelos de aprendizaje automático al facilitar la comparación de la importancia relativa de diferentes características. En el siguiente paso, se realiza un análisis de agrupamiento (Figura 4B). La agrupación en clústeres puede ser útil para explorar la estructura de conjuntos de datos de alta dimensión e identificar patrones en los datos que podrían no ser evidentes de inmediato al observar características individuales. El agrupamiento jerárquico basado en la distancia del coseno entre los perfiles fenotípicos bien basados mostró fuertes diferencias entre las líneas celulares, pero menos para el tratamiento farmacológico. Los datos de los pozos tratados con PFE-360 se agruparon dentro del control tratado con DMSO, lo que indica que no hay diferencias fuertes utilizando esta métrica de comparación. Además de la agrupación, los enfoques de reducción de dimensiones también son herramientas útiles para visualizar las similitudes y diferencias de los datos de perfiles fenotípicos multidimensionales. Aquí hicimos uso de la Aproximación de Colector Controlada por Pares (PaCMAP)15 (Figura 4C). Al igual que el enfoque anterior basado en la distancia del coseno, PaCMAP mostró principalmente diferencias entre las dos líneas celulares y, en menor medida, entre los pocillos tratados con PFE-360 o DMSO control. Tanto el agrupamiento de distancia de coseno como el PaCMAP son métodos no supervisados y es poco probable que detecten pequeñas diferencias que solo están presentes en características fenotípicas seleccionadas, por ejemplo, porque un compuesto cambia solo unos pocos fenotipos (es decir, solo características relacionadas con la neurita). Para abordar esta limitación del análisis del perfil fenotípico, realizamos una clasificación supervisada basada en el aprendizaje automático. En concreto, se utilizó la máquina potenciadora del gradiente de luz (LightGBM) (Figura 4D). LightGBM es un algoritmo de aprendizaje automático supervisado que utiliza algoritmos de árbol de decisión para crear un modelo que se puede utilizar para la clasificación16. LightGBM ha sido diseñado para ser más rápido y eficiente que los algoritmos tradicionales basados en árboles, como el algoritmo de bosque aleatorio. El algoritmo se entrenó con datos de perfil fenotípico de una placa y probó el modelo entrenado con datos de una segunda placa independiente. El modelo LightGBM tuvo una precisión global del 85% y predijo correctamente la categoría experimental (línea celular o compuesto) de la mayoría de los pocillos. La precisión de la predicción de líneas celulares fue mayor que la de la predicción de compuestos, pero también el 60% de los pocillos tratados con compuestos se predijeron correctamente, lo que es superior a los métodos clásicos no supervisados. LightGBM permite acceder a la importancia de las características fenotípicas respectivas para la clasificación de las cuatro clases (Figura 4D). Las características fenotípicas importantes que distinguen las líneas celulares y los tratamientos farmacológicos están, por ejemplo, relacionadas con el área de superficie celular o las intensidades celulares de las tinciones MAP2 y TH. La superficie del citoplasma doble positivo de TH y α-sinucleína fue la característica más importante que distinguió las líneas celulares y los tratamientos compuestos, seguida de la proporción de células muertas. Proporcionamos un cuaderno de Jupyter Notebook que realiza el trazado de datos y todos los métodos de análisis supervisados y no supervisados que se describen aquí (consulte Tabla de materiales). Los resultados obtenidos ilustran el potencial del perfil fenotípico para distinguir las líneas celulares y los efectos del tratamiento con compuestos en neuronas mDA humanas.

Figure 2
Figura 2: Inmunotinción de neuronas mDA derivadas de iPSC humanas. Se muestran imágenes representativas de todos los canales fluorescentes adquiridos. Las neuronas mDA donantes sanas o portadoras de la mutación LRRK2 G2019S se trataron con DMSO o con 0,1 μM del inhibidor de la quinasa LRRK2 PFE-360. El tratamiento se realizó el día 3 y las células se fijaron el día 6 como se describe en el protocolo. Barras de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Creación de un perfil fenotípico a partir de características fenotípicas individuales. (A) Se muestran las características fenotípicas seleccionadas que se pueden extraer de los canales de fluorescencia individuales. (B) Las características fenotípicas se pueden agregar en un perfil fenotípico. Se pueden generar múltiples perfiles fenotípicos en diferentes condiciones experimentales presentes en la placa de 384 pocillos. (C) Ejemplos de características fenotípicas y sus correspondientes valores por condición experimental. Cada punto de datos corresponde a una medición de un pozo. Para la prueba de significación se utilizó la prueba t de varianzas desiguales de Welch. La significación estadística se presenta como * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 y no significativa (ns = p > 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Los perfiles fenotípicos de las neuronas mDA contienen información cuantitativa y se pueden utilizar para clasificar fenotipos . (A) Descripción general esquemática del flujo de trabajo de análisis de datos. (B) Perfiles fenotípicos agregados de neuronas mDA tratadas con control y fármacos. (C) Aproximación de colectores controlados por pares (PaCMAP) reducción de la dimensión no supervisada de los datos del perfil fenotípico. (D) Clasificación supervisada de los datos del perfil fenotípico por la máquina potenciadora del gradiente de luz (LightGBM). El algoritmo de clasificación se entrenó con datos de perfil fenotípico de una placa y se aplicó para predecir clases experimentales en una segunda placa. Panel izquierdo: La matriz de confusión muestra la relación entre las cuatro clases de datos verdaderas y las cuatro clases predichas por el modelo. En general, el modelo predice correctamente la clase de datos en el 85% de los casos. Panel derecho: Las 10 características fenotípicas más importantes para el clasificador LightGBM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivos Para 100 mL
Medio base iCell 1 100 ml
iCell Suplemento Neural B 2 ml
Suplemento para el sistema nervioso iCell 1 ml

Tabla 1: Composición de los medios de mantenimiento completos.

Reactivo Solución 2x Concentración final Para 100 mL
PBS 1x 1 1 78 mL
Tritón 10% 0.20% 0.10% 2 ml
Solución de stock de FBS 20% 10% 20 mL

Tabla 2: Composición de la solución de bloqueo 2x.

Reactivo Concentración 2x Concentración final Para 100 mL
PBS 1x 1 1 87.36 mL
Tritón 10% 0.20% 0.10% 2 ml
Solución de stock de FBS 10% 5% 10 mL
Anti-TH 1/500 1/1000 0,2 ml
Anti-α-sinucleína 1/250 1/500 0,4 ml
Anti-MAP2 1/2500 1/5000 0,04 ml

Tabla 3: Composición del tampón de tinción primario.

Reactivo Concentración 2x Concentración final Para 100 mL
PBS 1x 1 1 86.7mL
Tritón 10% 0.20% 0.10% 2 ml
Solución de stock de FBS 10% 5% 10 mL
Anti-ratón A488 1/500 1/1000 0,2 ml
Anti-conejo A555 1/500 1/1000 0,2 ml
Anti-pollo A647 1/125 1/250 0,8 ml
Hoechst 1/1000 1/2000 0,1 ml

Tabla 4: Composición del tampón de tinción secundaria 2x.

Tabla complementaria 1: Resumen de todas las características fenotípicas extraídas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El perfil fenotípico es una técnica para medir un gran número de fenotipos en las células mediante la aplicación de tinciones fluorescentes, microscopía y análisis de imágenes3. Los perfiles fenotípicos se pueden obtener y comparar a través de líneas celulares u otras condiciones experimentales para comprender cambios complejos en la biología celular que podrían pasar desapercibidos cuando se usa una sola lectura. En este trabajo describimos la aplicación del perfil fenotípico a las neuronas mDA derivadas de iPSC humanas, un tipo de célula utilizado con frecuencia para modelar la biología celular de la EP17,18,19. El perfil fenotípico en las neuronas mDA tiene varias ventajas sobre los enfoques de perfil utilizados anteriormente que utilizan tinciones fluorescentes genéricas4, tipos de células no neuronales5,6 o no son escalables 7,8. El método presentado aquí permite el perfil fenotípico en neuronas mDA postmitóticas fisiológicamente relevantes. En segundo lugar, el uso de neuronas mDA criopreservadas derivadas de iPSC disminuye significativamente la variabilidad de la diferenciación de lote a lote. En tercer lugar, haciendo uso de un diseño experimental bien definido, la manipulación automatizada de líquidos y la microscopía automatizada, se puede reducir aún más la variabilidad técnica y hacer que el protocolo sea altamente escalable y abre la posibilidad de utilizar neuronas mDA para campañas de cribado fenotípico. Por último, la clasificación supervisada ofrece a los usuarios la posibilidad de agrupar y comprender las características clave de los perfiles fenotípicos y, por lo tanto, podría ayudar a descubrir nueva biología.

El perfil fenotípico permite la exploración de características individuales para desarrollar hipótesis de seguimiento que conduzcan a estudios mecanicistas de seguimiento. Por ejemplo, demostramos que las neuronas mDA LRRK2 G2019S difieren de las neuronas mDA de control en función de su contenido de α-sinucleína, la longitud de la neurita MAP2 y la proporción de células TH positivas (Figura 3C). Sin embargo, el tratamiento compuesto con el inhibidor de la quinasa LRRK2 PFE-360 solo altera el contenido de α-sinucleína y no tiene ningún efecto sobre la longitud de la neurita MAP2 ni sobre la proporción de células TH positivas. Un compuesto químico deseable debe rescatar un conjunto de fenotipos. Un perfil fenotípico contiene la información requerida y se puede explorar mediante técnicas de agrupamiento o reducción de dimensionalidad, que pueden ayudar a visualizar interacciones de características complejas en gráficos bidimensionales. La agrupación basada en la distancia del coseno permite la separación precisa de ambas líneas celulares (Figura 4B). La reducción de dimensiones mediante PaCMAP ilustra aún más cómo ambas líneas celulares forman grupos distintos, y que el tratamiento con PFE-360 conduce a fenotipos generales distinguibles, pero aún similares, probablemente debido al impacto en solo unas pocas características medidas, como el contenido de α-sinucleína (Figura 4C). Por el contrario, el aprendizaje automático supervisado puede ayudar a predecir perfiles de interés en función de sus características. El modelo LightGBM entrenado con los datos predijo con precisión el donante sano y las neuronas mDA mutadas en LRRK2 en los datos de prueba. La identificación de las neuronas tratadas con PFE-360 fue menos precisa, presumiblemente porque los efectos de los compuestos químicos sobre los fenotipos son más débiles que los efectos genéticos (Figura 4C). La superficie del citoplasma doble positivo de TH y α-sinucleína fue la característica más importante que distinguió las líneas celulares y los tratamientos compuestos, seguida de la proporción de células muertas. Varias otras características principales estaban relacionadas con el área de la superficie celular. Por lo tanto, el tamaño de la célula parece ser una característica distintiva general entre las neuronas mDA sanas de control y las neuronas mDA mutadas en LRRK2 (Figura 4D). Por lo tanto, este enfoque demuestra cómo el aprendizaje automático puede identificar las características fenotípicas más definitorias en un conjunto de datos complejo, que luego se puede utilizar para desarrollar nuevas hipótesis y probar esas hipótesis en ensayos secundarios.

CellPainting se ha convertido en un enfoque popular para crear perfiles fenotípicos y utiliza un conjunto estandarizado de sondas fluorescentes y un protocolo definido 3,4,20,21,22,23. En este caso, se decidió utilizar un panel de tinción más específico para neuronas mDA que consistía en la tinción nuclear de Hoechst y anticuerpos contra la α-sinucleína, TH y MAP2. En el pasado hemos aplicado otras tinciones fluorescentes que utilizan un anticuerpo LAMP1 asociado a lisosomas o colorantes dirigidos a las mitocondrias TMRM o MitoTracker y se centran en aspectos más específicos de la biología celular de la EP9. La microscopía óptica estándar está limitada en el sentido de que solo se pueden resolver cuatro longitudes de onda fluorescentes. Por lo tanto, no es fácil añadir tinciones lisosomales o mitocondriales al panel de tinción actual. Dependiendo de la cuestión biológica, las tinciones podrían intercambiarse. Alternativamente, dos estructuras biológicas podrían teñirse utilizando la misma longitud de onda bajo la condición de que su morfología sea distinguible y que estén localizadas en diferentes compartimentos celulares.

Para aumentar la compatibilidad del protocolo con el cribado, se diseñó para requerir un número mínimo de pasos de pipeteo y una corta duración del cultivo. Para el método son fundamentales todos los pasos de manipulación de líquidos, ya que pueden afectar al recubrimiento o provocar el desprendimiento de neuronas. Como se indica en el protocolo, se recomienda que siempre quede una cantidad residual de medio en el pocillo. También es fundamental manejar las neuronas mDA con cuidado, ya que son un tipo de célula muy frágil. Realice la descongelación exactamente como se indica para evitar la muerte celular excesiva debido a la ruptura osmótica de la membrana celular. La densidad de siembra se optimizó para generar suficientes datos por pocillo y, al mismo tiempo, evitar la superposición excesiva de estructuras, como neuritas o núcleos en las imágenes. Los perfiles fenotípicos son muy sensibles a los efectos posicionales en la placa 2,4,23. Como se indica en el protocolo, no utilice pozos de borde. Además, se recomienda utilizar al menos cinco réplicas técnicas por condición experimental al planificar un experimento. Lo ideal es distribuir las réplicas al azar sobre el plato.

Al igual que con cualquier método, el perfil fenotípico neuronal tiene limitaciones. Los conjuntos de datos de perfiles fenotípicos pueden ser muy grandes, especialmente cuando se calculan para células individuales. Aunque tener más características fenotípicas puede ser ventajoso, como revelar un mecanismo previamente desconocido o garantizar la estabilidad del sistema de ensayo, también puede introducir ruido no deseado y ser más difícil de interpretar que las características individuales cuidadosamente seleccionadas. Por ejemplo, el sobreajuste del modelo o las correlaciones espurias son desafíos que ocurren con mayor frecuencia en grandes conjuntos de datos 4,24. Por lo tanto, el perfil fenotípico no pretende reemplazar el diseño experimental basado en hipótesis, sino más bien servir como punto de partida para nuevas hipótesis que luego pueden ser probadas. La EP es una enfermedad neurodegenerativa y, a menudo, se manifiesta solo tarde en la vida. Por lo tanto, el estudio de la biología de la enfermedad ligada a la EP en neuronas derivadas de iPSC puede ser una limitación, especialmente cuando la atención se centra en las características clásicas de la EP en etapas tardías, como la agregación de α-sinucleína 17,25,26. Por el contrario, debido al inicio relativamente tardío de la EP, se estima que la fase presintomática es larga. Por lo tanto, patologías significativas podrían ser ya detectables de forma celular en modelos neuronales de iPSC mDA, mientras que a nivel sistémico, el cerebro es capaz de compensar la pérdida neuronal y funcional durante muchos años27,28.

En el futuro, este protocolo se puede adaptar a otros tipos de neuronas derivadas de iPSC, como las neuronas corticales o motoras, sustituyendo las tinciones relevantes para las neuronas mDA por tinciones centradas, por ejemplo, en la biología sináptica o los agregados intracelulares. Las neuronas corticales podrían, por ejemplo, caracterizarse mediante tinción de panneuritas contra β-tubulina III y proteínas pre y postsinápticas como Synapsin1 y Homer, para las que se han descrito anticuerpos de alta calidad29. Las neuronas motoras podrían ser fenotipadas utilizando anticuerpos contra la colina acetiltransferasa (ChAT), la proteína de unión al ADN TAR 43 (TDP-43) y los marcadores de gránulos de ARN30. En resumen, se anticipa que el protocolo presentado para crear perfiles fenotípicos neuronales será útil para que la comunidad investigadora explore los efectos de las perturbaciones químicas o genéticas en una amplia gama de fenotipos neuronales.

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Disclosures

Todos los autores son empleados de Ksilink.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a todos los colegas de Ksilink por su valiosa ayuda y discusiones que condujeron al diseño del protocolo presentado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti- chicken – Alexa 647 Jackson ImmunoRearch 703-605-155 Immunofluorescence
Anaconda https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2 Novus NB300-213 Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488 Thermo Fisher A11001 Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555 Thermo Fisher A21429 Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase Merck T2928 Immunofluorescence
Anti-α-synuclein Abcam 138501 Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head Agilent If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope  Yokogawa CV7000 The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter Invitrogen Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+ Gibco 14040-133 Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser  BioTek (Agilent)  If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %) Euromedex EM-15710-S Fixation before staining
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
iCell Base Medium 1 Fujifilm M1010 Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M Fujifilm C1087 Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 Fujifilm C1149 Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell Nervous System Supplement Fujifilm M1031 Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B Fujifilm M1029 Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook In-house development https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin Biolamina LN521 Plate coating
PFE-360 MedChemExpress HY-120085 LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink In-house development https://github.com/Ksilink/PhenoLink Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated Perkin Elmer 6057500 Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL Thermo Scientific AB-0781 Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton Sigma T9284 Permeabilization before lysis
Trypan Blue Sigma T8154-20ML Determination of living cells
Vprep Pipetting System  Agilent Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.

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References

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Perfiles Fenotípicos Células Madre Humanas Neuronas Dopaminérgicas del Mencéfalo Enfermedad de Parkinson Modelos Celulares de PD In Vitro Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSC) Fenotipos Neuronales Panel de Tinción Fluorescente Tinción Nuclear α-Sinucleína Tirosina Hidroxilasa (TH) Proteína 2 Asociada a Microtúbulos (MAP2) Protocolo de Perfil Fenotípico Escalable Placas de 384 Pocillos Manejo Automático de Líquidos Microscopía de Alto Rendimiento Mutación G2019S Gen de la Quinasa Repetida 2 Rica en Leucina (LRRK2) Inhibidor de la quinasa LRRK2 PFE-360 Cambios fenotípicos Perfiles fenotípicos multidimensionales Análisis de agrupamiento Clasificación supervisada basada en aprendizaje automático
Perfil fenotípico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo derivadas de células madre humanas
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Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J. H. Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (197), e65570, doi:10.3791/65570 (2023).

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