Summary
该方案描述了人中脑多巴胺能神经元的细胞培养，然后进行免疫染色和从获得的微观高内涵图像生成神经元表型图谱，从而可以识别由于遗传或化学调节引起的表型变异。
Abstract
帕金森病 （PD） 与一系列导致中脑多巴胺能 （mDA） 神经元丢失的细胞生物学过程有关。许多目前的 体外 PD细胞模型缺乏复杂性，没有考虑多种表型。人诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的 mDA 神经元的表型分析可以通过同时测量 PD 相关细胞类型中的一系列神经元表型来解决这些缺点。在这里，我们描述了一种从市售的人类mDA神经元中获取和分析表型谱的协议。神经元特异性荧光染色面板用于可视化细胞核、α-突触核蛋白、酪氨酸羟化酶 （TH） 和微管相关蛋白 2 （MAP2） 相关表型。所描述的表型分析方案具有可扩展性，因为它使用 384 孔板、自动液体处理和高通量显微镜。使用健康供体 mDA 神经元和携带富含亮氨酸的重复激酶 2 （LRRK2） 基因中 PD 连接的 G2019S 突变的 mDA 神经元来举例说明该协议的效用。两种细胞系均用LRRK2激酶抑制剂PFE-360处理，并测量表型变化。此外，我们还演示了如何使用聚类或机器学习驱动的监督分类方法分析多维表型图谱。所描述的协议将特别引起从事神经元疾病建模或研究人类神经元中化合物效应的研究人员的兴趣。
Introduction
帕金森病 （PD） 中的多种细胞生物过程受到干扰。例如，线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质降解缺陷、囊泡运输和内溶酶体功能的破坏与中脑多巴胺能 （mDA） 神经元丢失有关，常见于 PD1。因此，帕金森病似乎涉及多种疾病机制，这些机制可以相互作用并相互恶化。研究这种机制相互作用的一种有用方法是创建中脑多巴胺能 （mDA） 神经元的综合表型指纹或图谱。
表型分析是一种方法，涉及根据一组可测量的特征创建样本的图谱，其次，它涉及根据该图谱对样本进行预测 2,3。分析的目标是捕获各种特征，其中一些特征以前可能与疾病或治疗无关3.因此，分析可以揭示意想不到的生物过程。表型分析通常依赖于荧光染色的细胞，并且已经开发了标准化检测方法，例如细胞绘画，以创建表型图谱 4。例如，最近，表型分析已被应用于小分子的表征或仅基于患者来源的成纤维细胞 5,6 的 PD 亚型的准确预测。尽管取得了这些进展，但表型分析很少应用于有丝分裂后分化细胞，例如表达PD相关突变（如LRRK2 G2019S）的人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的mDA神经元。iPSC衍生模型的重大挑战包括分化批次或基因型之间存在细微或可变的病理特征，以及孤立的PD表型不能捕捉到疾病的全部复杂性。此外，虽然 iPSC 神经元模型具有生理相关性，但由于担心技术复杂性，它们很少用于 PD 药物发现过程 7,8。
我们之前开发了一种强大的方法来测量人类 mDA 神经元中多种与 PD 相关的病理生理表型表型，这些神经元对遗传和化合物诱导的表型变化都很敏感9。本文详细描述了该方法的进一步优化版本，以从mDA神经元创建表型图谱（图1）。与先前描述的表型分析方法相比，该协议具有几个优点，例如使用高质量的mDA神经元和技术可重复性。该协议首次以高度可扩展的方式在化学扰动后实现生理相关的有丝分裂后mDA神经元的表型分析。完全分化和冷冻保存的 mDA 神经元是市售的，可显著降低批次间的分化变异性。其次，通过使用明确定义的实验设计（即培养持续时间或避免边缘孔）、自动液体处理和自动显微镜，可以进一步减少技术变异性。此外，本文还概述了使用无监督聚类或监督分类方法进行表型谱分析的初始步骤，指出了如何分析表型谱数据。该协议将用于对遗传或化学扰动诱导的mDA神经元的表型变化感兴趣的研究人员，特别是当需要高度可扩展的研究设置时，例如，在筛选活动期间或当要研究较少数量的化合物的影响时，例如，确定毒性作用。总之，预计人类神经元表型分析的应用是研究复杂疾病相关表型和表征候选药物细胞效应的宝贵技术。
图 1：从人类 iPSC 衍生的 mDA 神经元生成基于图像的表型图谱的实验方案示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
1. 准备用于神经元接种的培养基和培养板（第 1 天）
- 为了在第 1 天准备用于神经元接种的板，请在使用前将层粘连蛋白加热至室温 （RT）。通过将层粘连蛋白储备溶液（0.1mg / mL）稀释在冷PBS + / +（含Ca2+ 和Mg2 +）中1/10来制备层粘连蛋白溶液。
注：所有试剂均列在 材料表中。溶液和缓冲液的组成见 表1-4。 - 然后，向聚-D-赖氨酸（PDL）预涂384孔板的每个孔中加入25μL层粘连蛋白溶液，并在4°C下孵育过夜。 包被的板可以在4°C下储存长达一周。
注意：该协议可以在此处暂停长达一周。使用塑料薄膜密封板。 - 准备完整的维持培养基并在4°C下储存长达一个月（表1）。
2. 神经元解冻（第 0 天）
- 为了在第0天解冻神经元，将水浴预热至37°C，并将完全维持培养基平衡至RT，避光。
- 将装有商业获得的冷冻神经元（见 材料表）的小瓶从液氮罐中取出，并将其放在干冰上。然后将小瓶放入水浴中2分钟。液体完全解冻后，用70%乙醇对小瓶进行消毒。
- 用P1000移液管（约370μL）吸出解冻的神经元，并将它们转移到50mL离心管中，无需上下移液。接下来，用 630 μL 完全维持培养基冲洗小瓶，在 50 mL 试管中逐滴（45° 角）分配。分配时缓慢搅拌。
注意：至关重要的是要逐滴缓慢分配培养基，以避免细胞渗透破裂。45°角和轻微搅拌可最大限度地减少移液过程中的高局部渗透压。 - 同样，用 P1000 移液器在 50 mL 离心管中加入 1 mL 完全维持培养基。然后，缓慢加入 2 mL 完全维持培养基。分配时小心搅拌。
- 对细胞进行计数。制备含有 10 μL 台盼蓝和 10 μL 细胞悬浮液的微管，并加入计数室载玻片 （10 μL）。使用自动细胞计数仪（参见 材料表）或手动进行计数。
- 计数后，在室温下以400× g 离心含有神经元的50mL管5分钟，并除去上清液。使用 P1000 移液器和 1 mL 完全维持培养基小心地重悬沉淀。然后添加必要的体积以达到所需浓度（300,000 个细胞/mL，另请参阅下一步）。
3. 在准备好的平板上接种神经元（第 0 天）
- 为了在第0天将神经元接种到准备好的平板上，将包被的平板从冰箱中取出，将它们放在细胞培养罩下，让它们平衡至室温约30分钟。
- 在接种前，用自动液体处理器或 16 通道移液器吸出 15 μL 包衣溶液。每孔留出约 10 μL，以防止损坏涂层。
- 接下来，用 16 通道移液管每孔分配 50 μL 含有 300,000 个细胞/mL（在步骤 2.6 中制备）的细胞溶液，每孔产生 15,000 个接种神经元，每孔最终体积为 60 μL。
- 在 384 孔板中，避免使用第 1、2、23、24 列和 A、B、O 和 P 行，以尽量减少可能影响表型谱的边缘效应。用 80 μL PBS 填充未使用的空孔。将板在37°C和5%CO2下孵育。
4. 介质变化或复方处理（第 3 天）
- 根据孔数，在室温下预热适当体积的完全维持培养基。
- 如果需要更改介质，请继续执行步骤 4.4。如果需要复合处理，请验证化合物原液浓度和使用的溶剂（水、DMSO、甲醇等）。
- 制备1.5倍浓缩化合物溶液，以测试所有所需浓度。使用完全维持培养基制备化合物稀释液。
注意：作为中性对照，使用与被测化合物浓度相同的相应溶剂。如果使用不同浓度的多种或未知化合物，建议进行单独的剂量反应实验，以测量溶剂对表型特征的影响。 - 如果使用自动移液系统，则将 60 μL 的 1.5x 化合物溶液加入 384 孔储存板中。或者，使用 16 通道移液器。如果需要更换培养基，请添加 60 μL 完全维持培养基。
- 使用自动移液系统，从含神经元的板中每孔吸出并弃去 40 μL 培养基，以保持 20 μL/孔。然后将 40 μL/孔的 1.5x 化合物溶液从 384 孔储存板添加到每个孔中以获得所需的最终浓度。
注意：关键是不要进行完全的培养基更换，而是始终将残留培养基留在孔中，以防止损坏神经元地毯或涂层。 - 如果神经元培养超过本协议中描述的6天，则每2-3天更换一次培养基。
5. 神经元固定和染色（第 6 至 7 天）
- 为了在第 6 天和第 7 天固定和染色神经元，请使用自动液体处理器进行所有分配和洗涤步骤。或者，使用 16 通道移液器。
- 通过在1x PBS中稀释Triton X-100来制备10%Triton X-100溶液。涡旋直到溶液均匀。储存在4°C。
- 为了固定神经元，分配 20 μL/孔的 16% PFA，最终浓度为 4%。将板在室温下孵育30分钟，并用1x PBS洗涤3次。最后一次洗涤后留下 20 μL/孔的 PBS。
注意：PFA 被认为是一种已知会引起口腔、皮肤和呼吸道毒性的有害物质。它还对眼睛构成威胁，并可能导致基因突变和癌症。正确处理PFA除了确保适当的通风外，还需要使用合适的个人防护设备，例如眼睛和面部防护装置。防止PFA释放到环境中是很重要的。 - 对于透化和封闭，准备2x封闭溶液（表2）。
- 加入 20 μL/孔的 2x 封闭溶液（1x 终浓度），在室温下孵育 1 小时，并用 PBS 洗涤一次。洗涤后保留 20 μL/孔的 PBS。
- 对于一抗（参见 材料表）染色，制备2x一抗染色缓冲液（表3）。
- 加入20μL/孔的2x原染色缓冲液（1x终浓度），并在4°C下孵育过夜。 第二天早上，用PBS清洗3次。洗涤后留下 20 μL/孔的 PBS。
- 对于二抗（参见 材料表）染色，制备2x二抗染色缓冲液（表4）。
- 加入 20 μL/孔的 2x 二染色缓冲液（1 x 终浓度），在室温下避光孵育 2 小时，并用 PBS 洗涤 3 次。最后一次洗涤后留下 100 μL PBS/孔。
- 在板上添加铝密封，以尽量减少蒸发。或者，用塑料薄膜和铝箔盖住板。继续进行图像采集，或将板储存在4°C。
注意：该协议可以在此处暂停长达一周。如果观察到背景荧光，请考虑增加阻断时间。如果染色不足，请尝试增加一抗浓度或孵育时间。
- 在板上添加铝密封，以尽量减少蒸发。或者，用塑料薄膜和铝箔盖住板。继续进行图像采集，或将板储存在4°C。
6. 荧光染色神经元成像（第 7 天）
- 在第 7 天获取铺板、培养和染色神经元的图像。理想情况下，使用自动共聚焦荧光显微镜（参见 材料表）。或者，手动获取图像。
- 分别使用 405 nm、488 nm、561 nm 和 647 nm 激光获取 Hoechst、TH、α-突触核蛋白和 MAP2 通道（图 2）。
注：要生成足够数量的详细数据用于表型分析，请使用 40 倍物镜并使用由 3 个相隔 2 μm 的 Z 切片组成的 Z 堆栈采集 16 个田/孔。如果神经元地毯中存在与移液相关的损伤，请尽量避免对这些区域进行成像。 - 根据显微镜和相机的不同，分别调整四个荧光通道中每个通道的曝光时间和激发强度，以获得荧光强度的最佳动态范围。
注意：成像软件通常提供直方图来确定理想的曝光时间。如果直方图在低信号范围内向左偏移太多，则曝光时间太短或激发强度太低。如果右侧最大信号电平处出现急断，则信号值饱和。在这种情况下，请降低激发强度或缩短曝光时间。 - 以无损和开放的格式存储图像，例如 .tif。
7. 图像处理（第 8 天）
- 创建定量表型图谱需要图像分割和表型特征提取。使用PhenoLink软件进行图像分割和特征提取（材料表）。PhenoLink的安装说明可以在GitHub存储库（https://github.com/Ksilink/PhenoLink）中找到。
注意：图像分割用于识别和分离图像中的不同对象或区域，而表型特征提取用于分析和提取这些区域的相关信息。CellProfiler 10、ImageJ/FIJI11、Napari 12 或 Knime Analytics Platform13 等多种替代软件解决方案可用于从多通道荧光图像中提取定量信息。 - 对经过照明校正的原始图像执行图像分割。根据经验确定每个板的相应荧光通道强度阈值，使背景信号最小，并且所需的分段信号对应于原始图像中的信号。在同一天处理和染色的板通常需要相当的通道强度阈值才能进行分割。
- 定义细胞核大小和强度，将活细胞与死细胞分开。使用 40 倍图像时，请保留所有其他默认参数并运行软件。每孔将计算 126 个定量图像特征（补充表 1）。
- 使用得到的表格定量数据来构建表型图谱，并比较来自不同细胞系或处理条件的表型图谱。每行对应一个生物学条件（井），每列对应一个确定的表型特征。
注意：我们提供了一个示例输出文件以及数据分析管道来说明其用法（请参阅 材料表）。此外，图 3 显示了表型 图 谱的组成。
8. 表型图谱生成和可视化（第 8 天）
- 如果您的计算机上没有安装 Python 和 Jupyter，请安装 Anaconda 发行版并打开 Jupyter 软件。下载提供的 Jupyter 笔记本和所有其他提供的文件，并将它们保存在同一目录中（请参阅 材料表）。使用 Jupyter 软件打开 Jupyter 笔记本文件。
注意：Anaconda 是一个免费的开源平台，用于编程语言（如 Python）。该平台附带了 Python 解释器 Jupyter，它可以执行提供的 Jupyter 笔记本来创建和分析表型图谱 （https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling）。 - 使用 Jupyter 软件逐个单元执行 Jupyter 笔记本。提供的示例数据 .fth 和要求 .txt 文件需要与 Jupyter 笔记本位于同一目录中。每个 Jupyter 笔记本单元都带有注释，以解释其功能。
注意：从数据加载和缩放开始，以正确的顺序使用 Jupyter 笔记本，并逐个单元格地进行到最后，这一点至关重要。所有数据和图形输出都将存储在 Jupyter 笔记本源目录中新创建的文件夹中。 图 4 描述了工作流和工作流输出。
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Representative Results
mDA神经元中的表型分析是量化细胞生物学的多个方面及其在实验调节过程中的变化的有效方法。为了举例说明这种方法，本研究使用了冷冻保存的 LRRK2 G2019S 和健康的供体 mDA 神经元。这些神经元已经分化了大约 37 天，是有丝分裂后和表达神经元标志物（TUBB3 和 MAP2）和多巴胺能神经元标志物，包括酪氨酸羟化酶 （TH） 与 FOXA2 联合使用，而神经胶质标志物胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 缺失14。按照所述方案，将两种细胞系培养6天，并用LRRK2激酶抑制剂0.1μM PFE-360处理。使用核染色剂Hoechst和针对α-突触核蛋白，TH和MAP2的抗体对神经元进行染色（图2）。
接下来，对图像进行分割，并提取表型特征。我们确定了 126 个定量特征，这些特征可以聚合到基于良好的表型图谱中（图 3A、B）。可以访问每个特征及其在实验条件下的值。一些特征在复方处理后表现出变化。例如，TH阳性细胞中的α-突触核蛋白荧光强度在PFE-360处理后降低（图3C，左图）。其他特征仅在测试细胞系之间表现出差异，但在化合物处理时没有差异。例如，MAP2神经突网络长度或TH阳性神经元的比率就是这种情况（图3C，中间和右图）。必须考虑完整的表型谱，以较少的选择性和全面性的方式分析不同细胞系或化合物处理的表型变异。
在影像分析步骤中，将始终计算所有 126 个要素。同样，在数据分析过程中，所有特征都会被考虑在内，但机器学习算法会为各个特征分配权重以分离生物类别。数据分析工作流从数据加载和特征缩放 （图4A).缩放对于机器学习很重要，因为它有助于规范化数据并确保每个特征都具有相似的规模。这有助于提高机器学习算法的性能，使其对输入特征的比例不那么敏感。此外，缩放可以更轻松地比较不同特征的相对重要性，从而帮助提高机器学习模型的可解释性。在下一步中，执行聚类分析（图4B).聚类可用于探索高维数据集的结构，并识别数据中的模式，这些模式在查看单个特征时可能不会立即显现出来。基于基于良好表型谱之间的余弦距离的分层聚类显示细胞系之间的差异很大，但药物治疗的差异较小。来自PFE-360处理孔的数据聚集在DMSO处理的对照中，表明使用此比较指标没有明显的差异。除了聚类之外，降维方法也是可视化多维表型分析数据的异同的有用工具。在这里，我们使用了成对控制流形近似 （PaCMAP）15 (图4C).与之前基于余弦距离的方法类似，PaCMAP主要在两种细胞系之间显示出差异，并且在较小程度上显示出PFE-360或DMSO对照处理孔之间的差异。余弦距离聚类和PaCMAP都是无监督方法，不太可能发现仅存在于选定表型特征中的微小差异，例如，因为化合物仅改变少数表型（即仅与神经突相关的特征）。为了解决表型谱分析的这一局限性，我们进行了机器学习驱动的监督分类。具体来说，我们使用了光梯度提升机（LightGBM）（图4D).LightGBM 是一种监督式机器学习算法，它使用决策树算法创建可用于排名或分类的模型16.LightGBM 被设计为比传统的基于树的算法（如随机森林算法）更快、更高效。该算法使用来自一个板的表型图谱数据进行训练，并在来自第二个独立板的数据上测试了经过训练的模型。LightGBM模型的总体准确率为85%，正确预测了大多数孔的实验类别（细胞系或化合物）。细胞系预测的准确率高于化合物预测，但60%的复合处理孔被正确预测，优于经典的无监督方法。LightGBM 允许访问各自表型特征对四个类别分类的重要性 （图4D).区分细胞系和药物治疗的重要表型特征，例如，与细胞表面积或MAP2和TH染色的细胞强度有关。TH和α-突触核蛋白双阳性细胞质的表面是区分细胞系和复方处理的最重要特征，其次是死细胞的比例。我们提供了一个 Jupyter 笔记本，用于执行数据绘图以及此处描述的所有无监督和监督分析方法（请参阅 材料清单).获得的结果说明了表型分析在区分人mDA神经元细胞系和化合物处理效果方面的潜力。
图 2：人 iPSC 来源的 mDA 神经元的免疫染色。 显示了所有采集的荧光通道的代表性图像。健康供体或携带 LRRK2 G2019S 突变的 mDA 神经元用 DMSO 或 0.1 μM 的 LRRK2 激酶抑制剂 PFE-360 处理。在第 3 天进行治疗，并在第 6 天按照方案中所述固定细胞。比例尺：20 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：根据单个表型特征创建表型图谱。 （A） 显示了可以从各个荧光通道中提取的选定表型特征。（B）表型特征可以聚合为表型图谱。在 384 孔板上存在的不同实验条件下，可以生成多种表型图谱。（C）每个实验条件的表型特征及其相应值的示例。每个数据点对应于一个孔的测量值。Welch的不等方差t检验用于显著性检验。统计显著性表示为 * = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001，**** = p < 0.0001，不显著 （ns = p > 0.05）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：mDA 神经元表型图谱包含定量信息，可用于对表型进行分类。 （A） 数据分析工作流程的示意图概述。（B） 对照和药物处理的 mDA 神经元的聚集表型谱。（C）表型剖面数据的成对控制流形近似（PaCMAP）无监督降维。（D）光梯度提升机（LightGBM）监督分类表型剖面数据。该分类算法基于一个板的表型图谱数据进行训练，并应用于预测第二个板中的实验类别。左图：混淆矩阵显示了模型的四个真实数据类和四个预测类之间的关系。总体而言，该模型在 85% 的情况下正确预测了数据类。右图：LightGBM 分类器的 10 个最重要的表型特征。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 对于 100 mL |
| iCell 基础培养基 1 | 100毫升 |
| iCell 神经补充剂 B | 2毫升 |
| iCell神经系统补充剂 | 1毫升 |
表 1：完整维护介质的组成。
| 试剂 | 2x 解决方案 | 最终浓度 | 对于 100 mL |
| PBS 1x | 1 | 1 | 78毫升 |
| 海卫一 10% | 0.20% | 0.10% | 2毫升 |
| FBS储备液 | 20% | 10% | 20毫升 |
表2：2x封闭液的组成。
| 试剂 | 2倍浓度 | 最终浓度 | 对于 100 mL |
| PBS 1x | 1 | 1 | 87.36毫升 |
| 海卫一 10% | 0.20% | 0.10% | 2毫升 |
| FBS储备液 | 10% | 5% | 10毫升 |
| 抗TH | 1/500 | 1/1000 | 0.2毫升 |
| 抗α突触核蛋白 | 1/250 | 1/500 | 0.4毫升 |
| 抗MAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0.04毫升 |
表3：原染色缓冲液的组成。
| 试剂 | 2倍浓度 | 最终浓度 | 对于 100 mL |
| PBS 1x | 1 | 1 | 86.7毫升 |
| 海卫一 10% | 0.20% | 0.10% | 2毫升 |
| FBS储备液 | 10% | 5% | 10毫升 |
| 抗小鼠A488 | 1/500 | 1/1000 | 0.2毫升 |
| 抗兔 A555 | 1/500 | 1/1000 | 0.2毫升 |
| 抗鸡A647 | 1/125 | 1/250 | 0.8毫升 |
| 赫斯特 | 1/1000 | 1/2000 | 0.1毫升 |
表4：2x二染色缓冲液的组成。
补充表1：所有提取的表型特征概述。请点击这里下载此文件。
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Discussion
表型分析是一种通过应用荧光染色、显微镜和图像分析来测量细胞中大量表型的技术3。可以跨细胞系或其他实验条件获得和比较表型图谱，以了解细胞生物学中的复杂变化，这些变化在使用单次读数时可能会被忽视。在这里，我们描述了表型分析在人类 iPSC 衍生的 mDA 神经元中的应用，这是一种经常用于模拟 PD 细胞生物学的细胞类型17,18,19。与以前使用通用荧光染色4、非神经元细胞类型 5,6 或不可扩展 7,8 的分析方法相比，mDA 神经元中的表型分析具有几个优势。这里介绍的方法能够在生理相关的有丝分裂后 mDA 神经元中进行表型分析。其次，使用iPSC来源的冷冻保存的mDA神经元可显著降低批次间的分化变异性。第三，通过利用定义明确的实验设计、自动液体处理和自动显微镜，可以进一步减少技术变异性，使方案具有高度可扩展性，并为使用 mDA 神经元进行表型筛选活动提供了可能性。最后，监督分类使用户能够对表型谱的关键特征进行分组和理解，因此可能有助于发现新的生物学。
表型分析允许探索单个特征以制定后续假设，从而进行后续机理研究。例如，我们发现LRRK2 G2019S mDA神经元与对照mDA神经元的区别在于其α突触核蛋白含量，MAP2神经突长度和TH阳性细胞的比例（图3C）。然而，用LRRK2激酶抑制剂PFE-360进行复方治疗仅改变α-突触核蛋白含量，对MAP2神经突长度或TH阳性细胞的比例没有影响。理想的化合物应该可以挽救一组表型。表型图包含所需的信息，可以使用聚类或降维技术进行探索，这有助于可视化二维图中的复杂特征相互作用。基于余弦距离的聚类可以准确分离两种细胞系（图4B）。使用PaCMAP的降维进一步说明了两种细胞系如何形成不同的簇，并且PFE-360处理导致可区分但仍然相似的整体表型，这可能是由于仅对少数测量特征的影响，例如α-突触核蛋白含量（图4C）。相比之下，监督式机器学习可以帮助根据其特征预测感兴趣的配置文件。在数据上训练的 LightGBM 模型准确预测了测试数据中的健康供体和 LRRK2 突变的 mDA 神经元。PFE-360处理的神经元的鉴定不太准确，可能是因为化合物对表型的影响弱于遗传效应（图4C）。TH和α-突触核蛋白双阳性细胞质的表面是区分细胞系和复方处理的最重要特征，其次是死细胞的比例。其他几个主要特征与细胞表面积有关。因此，细胞大小似乎是健康对照和LRRK2突变的mDA神经元之间的整体区别特征（图4D）。因此，这种方法展示了机器学习如何识别复杂数据集中最具定义的表型特征，然后可用于开发新的假设并在二次分析中测试这些假设。
CellPainting 已成为创建表型图谱的流行方法，并使用一组标准化的荧光探针和定义的方案3、4、20、21、22、23。这里决定使用更 mDA 神经元特异性染色组合，包括 Hoechst 核染色剂和针对 α-突触核蛋白、TH 和 MAP2 的抗体。我们过去曾应用过使用溶酶体相关 LAMP1 抗体或线粒体靶向染料 TMRM 或 MitoTracker 的其他荧光染色，并专注于 PD 细胞生物学的更具体方面9。标准光学显微镜的局限性在于只能分辨四种荧光波长。因此，在当前的染色组合中添加溶酶体或线粒体染色并不容易。根据生物学问题，可以交换染色。或者，可以使用相同的波长对两种生物结构进行染色，前提是它们的形态是可区分的，并且它们位于不同的细胞区室中。
为了提高实验方案的筛选兼容性，设计为需要最少的移液步骤和较短的培养时间。该方法的关键是所有液体处理步骤，因为它们会影响涂层或导致神经元脱离。如方案中所示，建议始终将残留量的培养基保留在孔中。小心处理mDA神经元也很重要，因为它们是一种非常脆弱的细胞类型。完全按照指示进行解冻，以防止由于细胞膜渗透破裂而导致的细胞过度死亡。优化了接种密度，以每孔生成足够的数据，同时防止图像中的神经突或细胞核等结构过度重叠。表型图谱对板中的位置效应非常敏感 2,4,23。如协议中所示，不要使用边缘孔。此外，在计划实验时，建议每个实验条件至少使用五次技术重复。理想情况下，将重复物随机分布在平板上。
与任何方法一样，神经元表型分析也有局限性。表型分析数据集可能非常大，尤其是在针对单个细胞进行计算时。尽管具有更多的表型特征可能是有利的，例如揭示以前未知的机制或确保检测系统的稳定性，但它也可能引入不需要的噪声，并且比精心选择的单个特征更具解释性。例如，模型过拟合或虚假相关性是大型数据集中更频繁出现的挑战 4,24。因此，表型分析并非旨在取代假设驱动的实验设计，而是作为新假设的起点，然后可以对其进行测试。帕金森病是一种神经退行性疾病，通常仅在生命晚期才出现。因此，在 iPSC 衍生的神经元中研究 PD 相关疾病生物学可能是一个局限性，尤其是当重点是 PD 的经典晚期标志时，例如 α-突触核蛋白聚集 17,25,26。相反，由于帕金森病发病相对较晚，症状前阶段估计较长。因此，在 iPSC mDA 神经元模型中，可能已经可以在细胞基础上检测到显着的病理，而在系统水平上，大脑能够补偿神经元和功能损失多年27,28。
将来，该协议可以适用于其他iPSC衍生的神经元类型，例如皮质或运动神经元，方法是用专注于突触生物学或细胞内聚集体的染色代替mDA神经元相关染色。例如，可以使用针对 β-微管蛋白 III 和突触前后蛋白（如 Synapsin1 和 Homer）的泛神经突染色来表征皮质神经元，这些蛋白的高质量抗体已被描述29。可以使用抗胆碱乙酰转移酶 （ChAT）、TAR DNA 结合蛋白 43 （TDP-43） 和 RNA 颗粒标记物30 的抗体对运动神经元进行表型分析。总之，预计所提出的创建神经元表型图谱的方案将有助于研究界探索化学或遗传扰动对各种神经元表型的影响。
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Disclosures
所有作者均受雇于Ksilink。
Acknowledgments
作者要感谢Ksilink的所有同事，感谢他们为所提出的方案设计提供的宝贵帮助和讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
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