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Neuroscience

मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न मिडब्रेन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ksilink

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव मिडब्रेन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के सेल संवर्धन का वर्णन करता है, इसके बाद इम्यूनोलॉजिकल धुंधलापन और अधिग्रहित सूक्ष्म उच्च-सामग्री छवियों से न्यूरोनल फेनोटाइपिक प्रोफाइल की पीढ़ी आनुवंशिक या रासायनिक मॉड्यूलेशन के कारण फेनोटाइपिक विविधताओं की पहचान की अनुमति देती है।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला से जुड़ा हुआ है जो मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन हानि का कारण बनता है। कई वर्तमान इन विट्रो पीडी सेलुलर मॉडल में जटिलता की कमी होती है और कई फेनोटाइप को ध्यान में नहीं रखते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग समानांतर में पीडी-प्रासंगिक सेल प्रकार में न्यूरोनल फेनोटाइप ्स की एक श्रृंखला को एक साथ मापकर इन कमियों को संबोधित कर सकती है। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव एमडीए न्यूरॉन्स से फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक न्यूरॉन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट स्टेनिंग पैनल का उपयोग परमाणु, α-सिन्यूक्लिन, टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच), और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) से संबंधित फेनोटाइप की कल्पना करने के लिए किया जाता है। वर्णित फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग प्रोटोकॉल स्केलेबल है क्योंकि यह 384-वेल प्लेट्स, स्वचालित तरल हैंडलिंग और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल की उपयोगिता को स्वस्थ दाता एमडीए न्यूरॉन्स और एमडीए न्यूरॉन्स का उपयोग करके उदाहरण दिया जाता है जो ल्यूसीन-समृद्ध रिपीट काइनेज 2 (एलआरआरके 2) जीन में पीडी-लिंक्ड जी 2019 एस उत्परिवर्तन ले जाते हैं। दोनों सेल लाइनों को एलआरआरके 2 किनेज अवरोधक पीएफई -360 के साथ इलाज किया गया था और फेनोटाइपिक परिवर्तनों को मापा गया था। इसके अतिरिक्त, हम प्रदर्शित करते हैं कि क्लस्टरिंग या मशीन लर्निंग-संचालित पर्यवेक्षित वर्गीकरण विधियों का उपयोग करके बहुआयामी फेनोटाइपिक प्रोफाइल का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से न्यूरोनल रोग मॉडलिंग पर काम करने वाले शोधकर्ताओं या मानव न्यूरॉन्स में रासायनिक यौगिक प्रभावों का अध्ययन करने में रुचि रखेगा।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) में विभिन्न प्रकार की कोशिका जैविक प्रक्रियाएं परेशान होती हैं। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ऑक्सीडेटिव तनाव, प्रोटीन क्षरण दोष, वेसिकुलर तस्करी का विघटन और एंडोलाइसोसोमल फ़ंक्शन मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन हानि से जुड़े हुए हैं, आमतौर पर पीडी1 में देखे जाते हैं। इसलिए, पीडी में कई रोग तंत्र शामिल होते हैं जो एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं और खराब कर सकते हैं। इस यंत्रवत अंतःक्रिया की जांच करने का एक उपयोगी तरीका एक व्यापक फेनोटाइपिक फिंगरप्रिंट या मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स की प्रोफ़ाइल का निर्माण है।

फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग एक दृष्टिकोण है जिसमें मापने योग्य विशेषताओं के संग्रह के आधार पर एक नमूने की प्रोफ़ाइल बनाना शामिल है, और दूसरा, इसमें इस प्रोफ़ाइल 2,3 के आधार पर एक नमूने के बारे में भविष्यवाणियां करना शामिल है। प्रोफाइलिंग का लक्ष्य सुविधाओं की एक विविध श्रृंखला को पकड़ना है, जिनमें से कुछ पहले किसी बीमारी या उपचार से जुड़े नहीं हो सकतेहैं। नतीजतन, प्रोफाइलिंग अप्रत्याशित जैविक प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकती है। फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग आमतौर पर फ्लोरोसेंटली दाग वाली कोशिकाओं पर निर्भर करती है, और फेनोटाइपिक प्रोफाइल4 बनाने के लिए सेल पेंटिंग जैसे मानकीकृत परख विकसित किए गए हैं। हाल ही में, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग, उदाहरण के लिए, छोटे अणुओं के लक्षण वर्णन या पीडी-उपप्रकारों की सटीक भविष्यवाणी के लिए पूरी तरह से रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट 5,6 के आधार पर लागू किया गया है। इन प्रगति के बावजूद, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग शायद ही कभी पोस्ट-माइटोटिक विभेदित कोशिकाओं पर लागू की गई है, जैसे कि मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स जो पीडी-लिंक्ड म्यूटेशन जैसे एलआरआरके 2 जी 2019 एस को व्यक्त करते हैं। आईपीएससी-व्युत्पन्न मॉडल की महत्वपूर्ण चुनौतियों में भेदभाव बैचों या जीनोटाइप में सूक्ष्म या परिवर्तनीय पैथोलॉजिकल विशेषताओं की उपस्थिति शामिल है, और यह तथ्य कि पृथक पीडी फेनोटाइप रोग की पूरी जटिलता को कैप्चर नहीं करते हैं। इसके अलावा, जबकि आईपीएससी न्यूरोनल मॉडल शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, तकनीकी जटिलता 7,8 के बारे में चिंताओं के कारण पीडी दवा खोज प्रक्रियाओं में उनका उपयोग शायद ही कभी किया जाता है।

हमने पहले मानव एमडीए न्यूरॉन्स में कई पीडी-संबंधित पैथोफिजियोलॉजिकल फेनोटाइप ्स को मापने के लिए एक मजबूत पद्धति विकसित की थी जो आनुवंशिक और रासायनिक यौगिक-प्रेरित फेनोटाइपिकपरिवर्तनों के प्रति संवेदनशील हैं। यह लेख एमडीए न्यूरॉन्स (चित्रा 1) से फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने के लिए इस पद्धति के एक और अनुकूलित संस्करण का विस्तार से वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में पहले वर्णित फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों पर कई फायदे हैं, जैसे कि उच्च गुणवत्ता वाले एमडीए न्यूरॉन्स और तकनीकी प्रजनन क्षमता का उपयोग। पहली बार, यह प्रोटोकॉल अत्यधिक स्केलेबल फैशन में रासायनिक गड़बड़ी के बाद शारीरिक रूप से प्रासंगिक पोस्ट-माइटोटिक एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है। पूरी तरह से विभेदित और क्रायोसंरक्षित एमडीए न्यूरॉन्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो बैच-टू-बैच भेदभाव परिवर्तनशीलता को काफी कम करते हैं। दूसरे, तकनीकी परिवर्तनशीलता को एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रयोगात्मक डिजाइन (यानी, संस्कृति अवधि या किनारे के कुओं से बचने), स्वचालित तरल हैंडलिंग और स्वचालित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और कम किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, असुरक्षित क्लस्टरिंग या पर्यवेक्षित वर्गीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करके फेनोटाइपिक प्रोफाइल विश्लेषण के प्रारंभिक चरणों को यहां उल्लिखित किया गया है, यह दर्शाता है कि फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग डेटा का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक या रासायनिक गड़बड़ी से प्रेरित एमडीए न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक परिवर्तनों में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोग का होगा, विशेष रूप से जब एक अत्यधिक स्केलेबल अध्ययन सेटअप की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, स्क्रीनिंग अभियानों के दौरान या जब कम संख्या में यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन किया जाना है, उदाहरण के लिए, विषाक्त प्रभाव निर्धारित करने के लिए। सारांश में, यह अनुमान लगाया गया है कि मानव न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग का आवेदन जटिल रोग से संबंधित फेनोटाइप का अध्ययन करने और दवा उम्मीदवारों के सेलुलर प्रभावों को चिह्नित करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक है।

Figure 1
चित्रा 1: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स से छवि-आधारित फेनोटाइपिक प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. न्यूरॉन सीडिंग के लिए मध्यम और प्लेटों की तैयारी (दिन 1)

  1. पहले दिन न्यूरॉन सीडिंग के लिए प्लेटों को तैयार करने के लिए, उपयोग से ठीक पहले लैमिनिन को कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म करें। ठंडे पीबीएस +/+ (सीए2+ और एमजी2+ के साथ) में लैमिनिन स्टॉक समाधान (0.1 मिलीग्राम / एमएल) 1/10 को पतला करके लैमिनिन समाधान तैयार करें।
    नोट: सभी अभिकर्मकों सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। समाधान और बफर की रचनाओं को तालिका 1-4 में वर्णित किया गया है।
  2. फिर, पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) प्रीकोटेड 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में लैमिनिन समाधान के 25 μL जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। लेपित प्लेटों को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां एक सप्ताह तक रोका जा सकता है। प्लास्टिक फिल्म का उपयोग करके प्लेटों को सील करें।
  3. पूर्ण रखरखाव मीडिया तैयार करें और एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (तालिका 1)।

2. न्यूरॉन्स का पिघलना (दिन 0)

  1. दिन 0 पर न्यूरॉन्स को पिघलाने के लिए, पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, और प्रकाश से संरक्षित आरटी के लिए पूर्ण रखरखाव मीडिया को समतुल्य करें।
  2. व्यावसायिक रूप से प्राप्त जमे हुए न्यूरॉन्स ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त शीशी को तरल नाइट्रोजन टैंक से बाहर निकालें और इसे सूखी बर्फ पर रखें। फिर शीशी को 2 मिनट के लिए पानी के स्नान में रखें। एक बार तरल पूरी तरह से पिघल जाने के बाद, शीशी को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
  3. पिघले हुए न्यूरॉन्स को पी 1000 पिपेट (लगभग 370 μL) के साथ एस्पिरेट करें और उन्हें ऊपर-नीचे पाइपिंग के बिना 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसके बाद, शीशी को 630 μL पूर्ण रखरखाव माध्यम से कुल्ला करें, 50 एमएल ट्यूब में ड्रॉप बाय ड्रॉप (45 ° कोण) दें। डिस्पेंसर करते समय धीरे-धीरे हिलाएं।
    नोट: कोशिकाओं के आसमाटिक टूटने से बचने के लिए, माध्यम को धीरे-धीरे, बूंद से बूंद करना महत्वपूर्ण है। एक 45 ° कोण और प्रकाश आंदोलन पाइपिंग के दौरान उच्च स्थानीय आसमाटिक दबाव को कम करता है।
  4. इसी तरह, पी 1000 पिपेट के साथ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल पूर्ण रखरखाव माध्यम जोड़ें। फिर, धीरे-धीरे पूर्ण रखरखाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। डिस्पेंसर करते समय सावधानी से आंदोलन करें।
  5. कोशिकाओं की गिनती करें। 10 μL Tripan Blue और 10 μL सेल सस्पेंशन के साथ एक माइक्रोट्यूब तैयार करें और एक काउंटिंग चैंबर स्लाइड (10 μL) में जोड़ें। एक स्वचालित सेल काउंटर ( सामग्री की तालिका देखें) या मैन्युअल रूप से का उपयोग करके गिनती करें।
  6. गिनती के बाद, आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर न्यूरॉन्स युक्त 50 एमएल ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को हटा दें। पी 1000 पिपेट और 1 एमएल पूर्ण रखरखाव माध्यम का उपयोग करके गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें। फिर वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक मात्रा जोड़ें (300,000 कोशिकाएं / एमएल, अगला चरण भी देखें)।

3. तैयार प्लेटों पर न्यूरॉन्स का सीडिंग (दिन 0)

  1. दिन 0 पर तैयार प्लेटों पर न्यूरॉन्स को बीज देने के लिए, लेपित प्लेटों को रेफ्रिजरेटर से बाहर निकालें, उन्हें सेल कल्चर हुड के नीचे रखें और उन्हें लगभग 30 मिनट के लिए आरटी के बराबर होने दें।
  2. बीज बोने से ठीक पहले, एक स्वचालित तरल हैंडलर या 16-चैनल पिपेट के साथ 15 μL कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें। कोटिंग को नुकसान को रोकने के लिए प्रति कुएं लगभग 10 μL छोड़ दें।
  3. इसके बाद, 16-चैनल पिपेट के साथ प्रति कुएं 300,000 कोशिकाओं / एमएल (चरण 2.6 में तैयार) वाले सेल समाधान के 50 μL वितरित करें, जिसके परिणामस्वरूप प्रति कुएं 15,000 बीज वाले न्यूरॉन्स और 60 μL के प्रति कुएं की अंतिम मात्रा होती है।
  4. 384-वेल प्लेट में, कॉलम 1, 2, 23, 24 और पंक्तियों ए, बी, ओ और पी का उपयोग करने से बचें ताकि संभावित किनारे के प्रभावों को कम किया जा सके जो फेनोटाइपिक प्रोफाइल को प्रभावित कर सकते हैं। अप्रयुक्त खाली कुओं को पीबीएस के 80 μL से भरें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।

4. मध्यम परिवर्तन या यौगिक उपचार (दिन 3)

  1. कुओं की संख्या के आधार पर, आरटी पर पूर्ण रखरखाव माध्यम की उचित मात्रा को पूर्व-गर्म करें।
  2. यदि कोई मध्यम परिवर्तन आवश्यक है, तो चरण 4.4 पर आगे बढ़ें। यदि यौगिक उपचार वांछित है, तो यौगिक स्टॉक एकाग्रता और उपयोग किए गए विलायक (पानी, डीएमएसओ, मेथनॉल, आदि) को सत्यापित करें।
  3. परीक्षण किए जाने वाले सभी वांछित सांद्रता के लिए 1.5x केंद्रित यौगिक समाधान तैयार करें। पूर्ण रखरखाव माध्यम का उपयोग करके यौगिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
    नोट: एक तटस्थ नियंत्रण के रूप में, परीक्षण किए गए यौगिक के समान एकाग्रता पर संबंधित विलायक का उपयोग करें। यदि विभिन्न सांद्रता में कई या अज्ञात यौगिकों का उपयोग किया जाता है, तो फेनोटाइपिक प्रोफाइल पर विलायक प्रभाव ों को मापने के लिए एक अलग खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग करने की सलाह दी जाती है।
  4. यदि एक स्वचालित पाइपिंग सिस्टम का उपयोग किया जाता है, तो 384-वेल स्टोरेज प्लेट में 1.5x यौगिक समाधान के 60 μL जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, 16-चैनल पिपेट का उपयोग करें। यदि एक मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता है, तो इसके बजाय 60 μL पूर्ण रखरखाव माध्यम जोड़ें।
  5. स्वचालित पाइपिंग प्रणाली का उपयोग करके, न्यूरॉन युक्त प्लेट से प्रति कुएं 40 μL मध्यम को 20 μL / अच्छी तरह से रखने के लिए एस्पिरेट और फेंक दें। फिर वांछित अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में 384-वेल स्टोरेज प्लेट से 1.5x यौगिक घोल के 40 μL / वेल जोड़ें।
    नोट: पूर्ण मध्यम परिवर्तन नहीं करना महत्वपूर्ण है, लेकिन न्यूरोनल कालीन या कोटिंग को नुकसान को रोकने के लिए हमेशा कुएं में अवशिष्ट माध्यम छोड़ना है।
  6. यदि न्यूरोनल कल्चर इस प्रोटोकॉल में वर्णित 6 दिनों से अधिक समय तक किया जाता है, तो हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें।

5. न्यूरॉन निर्धारण और धुंधलापन (दिन 6 से 7)

  1. दिन 6 और 7 पर न्यूरॉन्स को ठीक करने और दाग ने के लिए, सभी वितरण और धोने के चरणों के लिए एक स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, 16-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
  2. 1x PBS में ट्राइटन X-100 को पतला करके 10% ट्राइटन X-100 समाधान तैयार करें। जब तक समाधान सजातीय न हो तब तक भंवर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. न्यूरॉन्स को ठीक करने के लिए, 16% पीएफए के 20 μL / वेल को वितरित करें जिसके परिणामस्वरूप 4% अंतिम एकाग्रता होती है। आरटी पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें, और इसे 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद पीबीएस के 20 μL / कुएं छोड़ दें।
    सावधानी: पीएफए को एक खतरनाक पदार्थ के रूप में पहचाना जाता है जो मौखिक, त्वचीय और श्वसन विषाक्तता का कारण बनता है। यह आंखों के लिए भी खतरा पैदा करता है और आनुवंशिक उत्परिवर्तन और कैंसर का कारण बन सकता है। पीएफए की उचित हैंडलिंग के लिए उचित वेंटिलेशन सुनिश्चित करने के अलावा, उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, जैसे आंख और चेहरे की सुरक्षा के उपयोग की आवश्यकता होती है। पर्यावरण में पीएफए की रिहाई को रोकना महत्वपूर्ण है।
  4. परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग के लिए, एक 2x ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें (तालिका 2)।
  5. 2x ब्लॉकिंग समाधान (1x अंतिम एकाग्रता) के 20 μL / कुएं जोड़ें, RT पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, और पीबीएस के साथ एक बार धो लें। धोने के बाद पीबीएस के 20 μL/well रखें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) धुंधला होने के लिए, 2x प्राथमिक धुंधला बफर तैयार करें (तालिका 3)।
  7. 2x प्राथमिक धुंधला बफर (1x अंतिम सांद्रता) का 20 μL / अच्छी तरह जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगली सुबह 7 वें दिन, पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। धोने के बाद पीबीएस के 20 μL / कुएं छोड़ दें।
  8. द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) धुंधला होने के लिए, 2x द्वितीयक धुंधला बफर तैयार करें (तालिका 4)।
  9. 2x द्वितीयक धुंधला बफर (1x अंतिम एकाग्रता) के 20 μL / कुएं जोड़ें, प्रकाश से दूर RT पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद 100 μL PBS /
    1. वाष्पीकरण को कम करने के लिए प्लेट पर एल्यूमीनियम सीलिंग जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, प्लास्टिक फिल्म और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्लेट को कवर करें। छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें, या प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां एक सप्ताह तक रोका जा सकता है। यदि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति देखी जाती है, तो ब्लॉकिंग समय बढ़ाने पर विचार करें। यदि धुंधलापन अपर्याप्त है, तो प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता या इनक्यूबेशन समय बढ़ाने का प्रयास करें।

6. फ्लोरोसेंटली सना हुआ न्यूरॉन्स की इमेजिंग (दिन 7)

  1. दिन 7 पर प्लेटेड, सुसंस्कृत और दाग वाले न्यूरॉन्स की छवियां प्राप्त करें। आदर्श रूप से, एक स्वचालित कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से, छवियों को मैन्युअल रूप से प्राप्त करें।
  2. क्रमशः 405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम और 647 एनएम लेजर का उपयोग करके होचस्ट, टीएच, α-सिन्यूक्लिन और एमएपी 2 चैनल प्राप्त करें (चित्रा 2)।
    नोट: फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग के लिए पर्याप्त मात्रा में विस्तृत डेटा उत्पन्न करने के लिए, 40x उद्देश्य का उपयोग करें और 2 μm द्वारा अलग किए गए 3 Z-स्लाइस से युक्त Z-स्टैक्स का उपयोग करके 16 फ़ील्ड / अच्छी तरह से प्राप्त करें। यदि न्यूरोनल कालीन में पाइपटिंग से संबंधित नुकसान होते हैं, तो इन क्षेत्रों की इमेजिंग से बचने की कोशिश करें।
  3. माइक्रोस्कोप और कैमरे के आधार पर, फ्लोरोसेंट तीव्रता की इष्टतम गतिशील सीमा प्राप्त करने के लिए चार फ्लोरोसेंट चैनलों में से प्रत्येक के लिए एक्सपोज़र समय और उत्तेजना तीव्रता को अलग से समायोजित करें।
    नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर अक्सर आदर्श एक्सपोजर समय निर्धारित करने के लिए एक हिस्टोग्राम प्रदान करता है। यदि हिस्टोग्राम को कम सिग्नल रेंज में बाईं ओर बहुत अधिक स्थानांतरित किया जाता है, तो एक्सपोज़र समय बहुत कम होता है या उत्तेजना तीव्रता बहुत कम होती है। यदि दाईं ओर अधिकतम सिग्नल स्तर पर एक तेज चट्टान है, तो सिग्नल मान संतृप्त है। इस मामले में, उत्तेजना की तीव्रता को कम करें या एक्सपोजर समय को कम करें।
  4. छवियों को हानि-मुक्त और खुले प्रारूप जैसे .tif में संग्रहीत करें।

7. छवि प्रसंस्करण (दिन 8)

  1. मात्रात्मक फेनोटाइपिक प्रोफाइल के निर्माण के लिए छवि विभाजन और फेनोटाइपिक फीचर निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। छवि विभाजन और सुविधा निष्कर्षण (सामग्री की तालिका) के लिए फेनोलिंक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। फेनोलिंक स्थापित करने के निर्देश GitHub रिपॉजिटरी (https://github.com/Ksilink/PhenoLink) में पाया जा सकता है।
    नोट: छवि विभाजन का उपयोग एक छवि में विभिन्न वस्तुओं या क्षेत्रों को पहचानने और अलग करने के लिए किया जाता है, जबकि फेनोटाइपिक सुविधा निष्कर्षण का उपयोग उन क्षेत्रों से प्रासंगिक जानकारी का विश्लेषण और निकालने के लिए किया जाता है। कई वैकल्पिक सॉफ्टवेयर समाधान, जैसे सेलप्रोफाइलर 10, इमेजजे / फिजी 11, नापारी12, या निम एनालिटिक्स प्लेटफॉर्म13 मल्टीचैनल फ्लोरेसेंस छवियों से मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए उपलब्ध हैं।
  2. रोशनी-सही कच्ची छवियों पर छवि विभाजन करें। संबंधित फ्लोरोसेंट चैनल तीव्रता थ्रेसहोल्ड को प्रति प्लेट अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करें ताकि पृष्ठभूमि संकेत न्यूनतम हो, और वांछित खंडित संकेत कच्ची छवि में सिग्नल से मेल खाता है। एक ही दिन में संसाधित और दाग वाली प्लेटों को आमतौर पर विभाजन के लिए तुलनीय चैनल तीव्रता सीमा की आवश्यकता होती है।
  3. मृत कोशिकाओं से जीवित रहने को अलग करने के लिए नाभिक के आकार और तीव्रता को परिभाषित करें। 40x छवियों का उपयोग करते समय, अन्य सभी डिफ़ॉल्ट पैरामीटर रखें और सॉफ़्टवेयर चलाएं। एक सौ छब्बीस मात्रात्मक छवि सुविधाओं की गणना प्रति अच्छी तरह से की जाएगी (पूरक तालिका 1)।
  4. फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने और विभिन्न सेल लाइनों या उपचार स्थितियों से फेनोटाइपिक प्रोफाइल की तुलना करने के लिए परिणामी सारणीबद्ध मात्रात्मक डेटा का उपयोग करें। प्रत्येक पंक्ति एक जैविक स्थिति (अच्छी तरह से) से मेल खाती है और प्रत्येक कॉलम एक निर्धारित फेनोटाइपिक विशेषता से मेल खाती है।
    नोट: हम इसके उपयोग को चित्रित करने के लिए डेटा विश्लेषण पाइपलाइन के साथ एक उदाहरण आउटपुट फ़ाइल प्रदान करते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। इसके अतिरिक्त, चित्रा 3 एक फेनोटाइपिक प्रोफ़ाइल की संरचना को दर्शाता है।

8. फेनोटाइपिक प्रोफाइल पीढ़ी और विज़ुअलाइज़ेशन (दिन 8)

  1. यदि आपके कंप्यूटर पर पायथन और जुपिटर स्थापित नहीं है, तो एनाकोंडा वितरण स्थापित करें और जुपिटर सॉफ़्टवेयर खोलें। प्रदान की गई जुपिटर नोटबुक और अन्य सभी प्रदान की गई फ़ाइलों को डाउनलोड करें और उन्हें एक ही निर्देशिका में सहेजें (सामग्री की तालिका देखें)। Jupyter सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर के Jupyter नोटबुक फ़ाइल खोलें।
    नोट: एनाकोंडा पायथन जैसी प्रोग्रामिंग भाषाओं के लिए एक स्वतंत्र और ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म है। यह प्लेटफ़ॉर्म पायथन दुभाषिया जुपिटर के साथ आता है जो फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने और विश्लेषण करने के लिए प्रदान की गई जुपिटर नोटबुक को निष्पादित कर सकता है (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
  2. Jupyter सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर सेल द्वारा Jupyter नोटबुक सेल निष्पादित करें। प्रदान किया गया नमूना डेटा .fth और फ़ाइलों .txt आवश्यकताएँ Jupyter नोटबुक के समान निर्देशिका में स्थित होने की आवश्यकता है। प्रत्येक जुपिटर नोटबुक सेल को इसकी कार्यक्षमता को समझाने के लिए एनोटेट किया गया है।
    नोट: डेटा लोडिंग और स्केलिंग से शुरू होने वाले सही क्रम में जुपिटर नोटबुक का उपयोग करना और सेल द्वारा अंत तक आगे बढ़ना महत्वपूर्ण है। सभी डेटा और ग्राफ़िक्स आउटपुट Jupyter नोटबुक स्रोत निर्देशिका में एक नए बनाए गए फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाएगा। चित्र 4 वर्कफ़्लो और वर्कफ़्लो आउटपुट को दर्शाता है.

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Representative Results

एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग प्रयोगात्मक मॉड्यूलेशन के दौरान सेलुलर जीव विज्ञान और उनके परिवर्तनों के कई पहलुओं को निर्धारित करने का एक कुशल तरीका है। इस पद्धति का उदाहरण देने के लिए, इस अध्ययन ने क्रायोप्रिजर्व्ड एलआरआरके 2 जी 2019 एस और स्वस्थ दाता एमडीए न्यूरॉन्स का उपयोग किया। इन न्यूरॉन्स को लगभग 37 दिनों के लिए विभेदित किया गया है, पोस्ट-माइटोटिक हैं और न्यूरोनल मार्कर (टीयूबीबी 3 और एमएपी 2) और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन मार्कर हैं, जिनमें फॉक्सए 2 के साथ संयोजन में टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) शामिल हैं, जबकि ग्लियल मार्कर ग्लियाल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन (जीएफएपी) अनुपस्थितहै। वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, दोनों सेल लाइनों को 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया और 0.1 μM PFE-360, एक LRRK2 काइनेज अवरोधक के साथ इलाज किया गया। न्यूरॉन्स को परमाणु दाग होचस्ट का उपयोग करके दाग दिया गया था, और α-सिन्यूक्लिन, टीएच और एमएपी 2 के खिलाफ एंटीबॉडी (चित्रा 2)।

इसके बाद, छवियों को खंडित किया गया था, और फेनोटाइपिक विशेषताओं को निकाला गया था। हमने 126 मात्रात्मक विशेषताओं को निर्धारित किया जिन्हें अच्छी तरह से आधारित फेनोटाइपिक प्रोफाइल (चित्रा 3 ए, बी) में एकत्रित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक स्थिति के अनुसार प्रत्येक सुविधा और इसके मूल्य तक पहुंचा जा सकता है। कुछ विशेषताओं ने यौगिक उपचार पर परिवर्तन दिखाए। उदाहरण के लिए, टीएच-पॉजिटिव कोशिकाओं में α-सिन्यूक्लिन फ्लोरेसेंस तीव्रता पीएफई -360 उपचार (चित्रा 3 सी, बाएं पैनल) पर कम हो गई। अन्य विशेषताओं ने परीक्षण किए गए सेल लाइनों के बीच केवल अंतर प्रस्तुत किया, लेकिन यौगिक उपचार पर नहीं। यह, उदाहरण के लिए, एमएपी 2 न्यूराइट नेटवर्क लंबाई या टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स (चित्रा 3 सी, मध्य और दाएं पैनल) के अनुपात के लिए मामला था। कम चयनात्मक और व्यापक तरीके से विभिन्न सेल लाइनों या यौगिक उपचारों में फेनोटाइपिक विविधताओं का विश्लेषण करने के लिए पूर्ण फेनोटाइपिक प्रोफ़ाइल पर विचार करना आवश्यक है।

छवि विश्लेषण चरण के दौरान, सभी 126 सुविधाओं की हमेशा गणना की जाती है। इसी तरह, डेटा विश्लेषण के दौरान, सभी विशेषताओं पर विचार किया जाता है, लेकिन मशीन लर्निंग एल्गोरिदम जैविक वर्गों को अलग करने के लिए व्यक्तिगत विशेषताओं को वजन प्रदान करता है। डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो डेटा लोडिंग और सुविधा स्केलिंग (चित्र 4A). मशीन लर्निंग के लिए स्केलिंग महत्वपूर्ण है क्योंकि यह डेटा को सामान्य करने में मदद करता है और यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक सुविधा समान पैमाने पर है। यह मशीन लर्निंग एल्गोरिदम के प्रदर्शन को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है जिससे उन्हें इनपुट सुविधाओं के पैमाने के प्रति कम संवेदनशील बनाया जा सकता है। इसके अलावा, स्केलिंग विभिन्न विशेषताओं के सापेक्ष महत्व की तुलना करना आसान बनाकर मशीन लर्निंग मॉडल की व्याख्या में सुधार करने में मदद कर सकती है। अगले चरण में, क्लस्टरिंग विश्लेषण किया जाता है (चित्र 4B). क्लस्टरिंग उच्च-आयामी डेटासेट की संरचना की खोज करने और डेटा में पैटर्न की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है जो व्यक्तिगत विशेषताओं को देखने से तुरंत स्पष्ट नहीं हो सकता है। अच्छी तरह से आधारित फेनोटाइपिक प्रोफाइल के बीच कोसाइन दूरी के आधार पर पदानुक्रमित क्लस्टरिंग ने सेल लाइनों के बीच मजबूत अंतर दिखाया, लेकिन दवा उपचार के लिए कम। पीएफई -360 के डेटा ने डीएमएसओ-उपचारित नियंत्रण के भीतर क्लस्टर किए गए कुओं का इलाज किया, जो इस तुलना मीट्रिक का उपयोग करके कोई मजबूत अंतर नहीं दर्शाता है। क्लस्टरिंग के बगल में, आयाम कमी दृष्टिकोण बहुआयामी फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग डेटा की समानता और अंतर की कल्पना करने के लिए भी उपयोगी उपकरण हैं। यहां हमने पेयरवाइज कंट्रोल्ड मैनिफोल्ड सन्निकटन (पीएसीएमएपी) का उपयोग किया।15 (चित्र 4C). पिछले कोसाइन दूरी-आधारित दृष्टिकोण के समान, पीएसीएमएपी ने मुख्य रूप से दो सेल लाइनों के बीच और कुछ हद तक, पीएफई -360 या डीएमएसओ नियंत्रण उपचारित कुओं के बीच अंतर दिखाया। कोसाइन दूरी क्लस्टरिंग और पीएसीएमएपी दोनों असुरक्षित तरीके हैं और छोटे अंतरों को उठाने की संभावना नहीं है जो केवल चयनित फेनोटाइपिक विशेषताओं में मौजूद हैं, उदाहरण के लिए, क्योंकि एक यौगिक केवल कुछ फेनोटाइप्स (यानी, न्यूराइट-संबंधित विशेषताओं) को बदलता है। फेनोटाइपिक प्रोफाइल विश्लेषण की इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने मशीन लर्निंग-संचालित पर्यवेक्षित वर्गीकरण किया। विशेष रूप से, हमने लाइट ग्रेडिएंट-बूस्टिंग मशीन (लाइटजीबीएम) (चित्र 4D). लाइटजीबीएम एक पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग एल्गोरिदम है जो एक मॉडल बनाने के लिए डिसीजन ट्री एल्गोरिदम का उपयोग करता है जिसका उपयोग रैंकिंग या वर्गीकरण के लिए किया जा सकता है।16. लाइटजीबीएम को पारंपरिक पेड़-आधारित एल्गोरिदम जैसे रैंडम फॉरेस्ट एल्गोरिदम की तुलना में तेज और अधिक कुशल होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एल्गोरिथ्म को एक प्लेट से फेनोटाइपिक प्रोफाइल डेटा के साथ प्रशिक्षित किया गया था और दूसरी स्वतंत्र प्लेट से डेटा पर प्रशिक्षित मॉडल का परीक्षण किया गया था। लाइटजीबीएम मॉडल में 85% की समग्र सटीकता थी और अधिकांश कुओं की प्रयोगात्मक श्रेणी (सेल लाइन या यौगिक) की सही भविष्यवाणी की गई थी। सेल लाइन भविष्यवाणी के लिए सटीकता यौगिक भविष्यवाणी की तुलना में अधिक थी, लेकिन 60% यौगिक-उपचारित कुओं की भी सही भविष्यवाणी की गई थी, जो शास्त्रीय असुरक्षित तरीकों से बेहतर है। लाइटजीबीएम चार वर्गों (चित्र 4D). सेल लाइनों और दवा उपचार को अलग करने वाली महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक विशेषताएं, उदाहरण के लिए, सेलुलर सतह क्षेत्र या एमएपी 2 और टीएच धुंधला की सेलुलर तीव्रता से संबंधित हैं। टीएच और α-सिन्यूक्लिन डबल पॉजिटिव साइटोप्लाज्म की सतह सबसे महत्वपूर्ण विशेषता थी जो सेल लाइनों और यौगिक उपचारों को अलग करती थी, इसके बाद मृत कोशिकाओं का अनुपात होता था। हम एक जुपिटर नोटबुक प्रदान करते हैं जो डेटा प्लॉटिंग और यहां वर्णित सभी असुरक्षित और पर्यवेक्षित विश्लेषण विधियों का प्रदर्शन करता है (देखें सामग्री की तालिका). प्राप्त परिणाम मानव एमडीए न्यूरॉन्स में सेल लाइनों और यौगिक उपचार प्रभावों को अलग करने के लिए फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग की क्षमता को दर्शाते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स का इम्यूनोस्टेनिंग। सभी अधिग्रहित फ्लोरोसेंट चैनलों की प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। स्वस्थ दाता या एलआरआरके 2 जी 2019 एस उत्परिवर्तन-वाहक एमडीए न्यूरॉन्स का इलाज या तो डीएमएसओ के साथ या एलआरआरके 2 किनेज अवरोधक पीएफई -360 के 0.1 μM के साथ किया गया था। उपचार तीसरे दिन किया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित के अनुसार कोशिकाओं को 6 वें दिन तय किया गया था। स्केल सलाखों: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: व्यक्तिगत फेनोटाइपिक विशेषताओं से एक फेनोटाइपिक प्रोफ़ाइल का निर्माण। (ए) चयनित फेनोटाइपिक विशेषताएं जिन्हें व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति चैनलों से निकाला जा सकता है, उन्हें दिखाया गया है। (बी) फेनोटाइपिक विशेषताओं को एक फेनोटाइपिक प्रोफ़ाइल में एकत्रित किया जा सकता है। 384-वेल प्लेट पर मौजूद विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों में कई फेनोटाइपिक प्रोफाइल उत्पन्न किए जा सकते हैं। (सी) फेनोटाइपिक विशेषताओं के उदाहरण और प्रयोगात्मक स्थिति के अनुसार उनके संबंधित मान। प्रत्येक डेटा बिंदु एक कुएं से माप से मेल खाता है। वेल्च के असमान विचरण टी-टेस्ट का उपयोग महत्व परीक्षण के लिए किया गया था। सांख्यिकीय महत्व को * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001 के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और महत्वपूर्ण नहीं है (ns = p > 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एमडीए न्यूरॉन फेनोटाइपिक प्रोफाइल में मात्रात्मक जानकारी होती है और इसका उपयोग फेनोटाइप को वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है । (ए) डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध अवलोकन। (बी) नियंत्रण- और दवा-उपचारित एमडीए न्यूरॉन्स के समेकित फेनोटाइपिक प्रोफाइल। (ग) जोड़ीवार नियंत्रित मैनिफोल्ड सन्निकटन (पीएसीएमएपी) फेनोटाइपिक प्रोफाइल डेटा के असुरक्षित आयाम में कमी। (डी) लाइट ग्रेडिएंट-बूस्टिंग मशीन (लाइटजीबीएम) फेनोटाइपिक प्रोफाइल डेटा का पर्यवेक्षित वर्गीकरण। वर्गीकरण एल्गोरिथ्म को एक प्लेट से फेनोटाइपिक प्रोफाइल डेटा पर प्रशिक्षित किया गया था और दूसरी प्लेट में प्रयोगात्मक कक्षाओं की भविष्यवाणी करने के लिए लागू किया गया था। बाएं पैनल: भ्रम मैट्रिक्स मॉडल द्वारा चार सच्चे डेटा वर्गों और चार अनुमानित वर्गों के बीच संबंध दिखाता है। कुल मिलाकर, मॉडल 85% मामलों में डेटा वर्ग की सही भविष्यवाणी करता है। राइट पैनल: लाइटजीबीएम क्लासिफायर के लिए 10 सबसे महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक विशेषताएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मकों 100 मिलीलीटर के लिए
आईसेल बेस मीडियम 1 100 एमएल
आईसेल न्यूरल सप्लीमेंट बी 2 एमएल
आईसेल तंत्रिका तंत्र पूरक 1 mL

तालिका 1: पूर्ण रखरखाव मीडिया की संरचना।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 2x समाधान अंतिम एकाग्रता 100 मिलीलीटर के लिए
पीबीएस 1x 1 1 78 एमएल
ट्राइटन 10% 0.20% 0.10% 2 एमएल
एफबीएस स्टॉक समाधान 20% 10% 20 एमएल

तालिका 2: 2x ब्लॉकिंग समाधान की संरचना।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 2x एकाग्रता अंतिम एकाग्रता 100 मिलीलीटर के लिए
पीबीएस 1x 1 1 87.36 एमएल
ट्राइटन 10% 0.20% 0.10% 2 एमएल
एफबीएस स्टॉक समाधान 10% 5% 10 एमएल
एंटी-टीएच 1/500 1/1000 0.2 एमएल
एंटी-α-सिन्यूक्लिन 1/250 1/500 0.4 एमएल
एंटी-एमएपी 2 1/2500 1/5000 0.04 एमएल

तालिका 3: प्राथमिक धुंधला बफर की संरचना।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 2x एकाग्रता अंतिम एकाग्रता 100 मिलीलीटर के लिए
पीबीएस 1x 1 1 86.7 mL
ट्राइटन 10% 0.20% 0.10% 2 एमएल
एफबीएस स्टॉक समाधान 10% 5% 10 एमएल
एंटी-माउस A488 1/500 1/1000 0.2 एमएल
एंटी-खरगोश A555 1/500 1/1000 0.2 एमएल
एंटी-चिकन A647 1/125 1/250 0.8 एमएल
Hoechst 1/1000 1/2000 0.1 एमएल

तालिका 4: 2x द्वितीयक धुंधला बफर की संरचना।

पूरक तालिका 1: सभी निकाले गए फेनोटाइपिक विशेषताओं का अवलोकन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग फ्लोरोसेंट स्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण3 को लागू करके कोशिकाओं में बड़ी संख्या में फेनोटाइप को मापने की एक तकनीक है। फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्राप्त किए जा सकते हैं और सेलुलर जीव विज्ञान में जटिल परिवर्तनों को समझने के लिए सेल लाइनों या अन्य प्रयोगात्मक स्थितियों में तुलना की जा सकती है जो एकल रीडआउट का उपयोग करते समय किसी का ध्यान नहीं जा सकता है। यहां हम मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स के लिए फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग के आवेदन का वर्णन करते हैं, एक सेल प्रकार जो अक्सर पीडी सेलुलर जीव विज्ञान17,18,19 को मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है। एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग में पहले से इस्तेमाल किए गए प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों पर कई फायदे हैं जो जेनेरिक फ्लोरोसेंट स्टेनिंग4, गैर-न्यूरोनल सेल प्रकार5,6 का उपयोग करते हैं या स्केलेबल 7,8 नहीं हैं। यहां प्रस्तुत विधि शारीरिक रूप से प्रासंगिक पोस्ट-माइटोटिक एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाती है। दूसरे, आईपीएससी-व्युत्पन्न क्रायोसंरक्षित एमडीए न्यूरॉन्स का उपयोग बैच-टू-बैच भेदभाव परिवर्तनशीलता को काफी कम कर देता है। तीसरा, एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रयोगात्मक डिजाइन, स्वचालित तरल हैंडलिंग और स्वचालित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, तकनीकी परिवर्तनशीलता को और कम किया जा सकता है और प्रोटोकॉल को अत्यधिक स्केलेबल बनाता है और फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग अभियानों के लिए एमडीए न्यूरॉन्स का उपयोग करने की संभावना खोलता है। अंत में, पर्यवेक्षित वर्गीकरण उपयोगकर्ताओं को फेनोटाइपिक प्रोफाइल की प्रमुख विशेषताओं को समूहीकृत करने और समझने की संभावना देता है और इसलिए नए जीव विज्ञान को उजागर करने में मदद कर सकता है।

फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग व्यक्तिगत विशेषताओं की खोज को अनुवर्ती परिकल्पनाओं को विकसित करने की अनुमति देती है जिससे अनुवर्ती यांत्रिक अध्ययन होते हैं। उदाहरण के लिए, हमने दिखाया कि एलआरआरके 2 जी 2019 एस एमडीए न्यूरॉन्स उनके α-सिन्यूक्लिन सामग्री, एमएपी 2 न्यूराइट लंबाई और टीएच-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात (चित्रा 3 सी) के आधार पर नियंत्रण एमडीए न्यूरॉन्स से भिन्न होते हैं। एलआरआरके 2 काइनेज अवरोधक पीएफई -360 के साथ यौगिक उपचार, हालांकि, केवल α-सिंक्यूक्लिन सामग्री को बदल देता है और एमएपी 2 न्यूराइट लंबाई या टीएच-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। एक वांछनीय रासायनिक यौगिक को फेनोटाइप्स के एक समूह को बचाना चाहिए। एक फेनोटाइपिक प्रोफ़ाइल में आवश्यक जानकारी होती है और क्लस्टरिंग या आयामीता कमी तकनीकों का उपयोग करके इसका पता लगाया जा सकता है, जो 2-आयामी भूखंडों में जटिल फीचर इंटरैक्शन की कल्पना करने में मदद कर सकता है। कोसाइन दूरी-आधारित क्लस्टरिंग दोनों सेल लाइनों (चित्रा 4 बी) के सटीक पृथक्करण की अनुमति देता है। पीएसीएमएपी का उपयोग करके आयाम में कमी आगे बताती है कि दोनों सेल लाइनें अलग-अलग क्लस्टर कैसे बनाती हैं, और पीएफई -360 उपचार अलग-अलग, लेकिन अभी भी समान समग्र फेनोटाइप की ओर जाता है, संभवतः केवल कुछ मापा विशेषताओं जैसे α-सिन्यूक्लिन सामग्री (चित्रा 4 सी) पर प्रभाव के कारण। इसके विपरीत, पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग उनकी विशेषताओं के आधार पर रुचि के प्रोफाइल की भविष्यवाणी करने में मदद कर सकती है। डेटा पर प्रशिक्षित लाइटजीबीएम मॉडल ने परीक्षण डेटा में स्वस्थ दाता और एलआरआरके 2-उत्परिवर्तित एमडीए न्यूरॉन्स की सटीक भविष्यवाणी की। पीएफई -360-उपचारित न्यूरॉन्स की पहचान कम सटीक थी, संभवतः क्योंकि फेनोटाइप्स पर रासायनिक यौगिक प्रभाव आनुवंशिक प्रभावों (चित्रा 4 सी) की तुलना में कमजोर हैं। टीएच और α-सिन्यूक्लिन डबल पॉजिटिव साइटोप्लाज्म की सतह सबसे महत्वपूर्ण विशेषता थी जो सेल लाइनों और यौगिक उपचारों को अलग करती थी, इसके बाद मृत कोशिकाओं का अनुपात होता था। कई अन्य शीर्ष विशेषताएं सेलुलर सतह क्षेत्र से संबंधित थीं। इसलिए, सेल का आकार स्वस्थ नियंत्रण और एलआरआरके 2-उत्परिवर्तित एमडीए न्यूरॉन्स (चित्रा 4 डी) के बीच एक समग्र विशिष्ट विशेषता प्रतीत होता है। इसलिए यह दृष्टिकोण दर्शाता है कि मशीन लर्निंग एक जटिल डेटा सेट में सबसे परिभाषित फेनोटाइपिक विशेषताओं की पहचान कैसे कर सकती है, जिसका उपयोग तब नई परिकल्पनाओं को विकसित करने और माध्यमिक परख में उन परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

सेलपेंटिंग फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने के लिए एक लोकप्रिय दृष्टिकोण बन गया है और फ्लोरोसेंट जांच के एक मानकीकृत सेट और एक परिभाषित प्रोटोकॉल 3,4,20,21,22,23 का उपयोग करता है। यहां एक अधिक एमडीए न्यूरॉन-विशिष्ट धुंधला पैनल का उपयोग करने का निर्णय लिया गया था जिसमें होचस्ट परमाणु दाग और α-सिन्यूक्लिन, टीएच और एमएपी 2 के खिलाफ एंटीबॉडी शामिल थे। लाइसोसोम से जुड़े एलएएमपी 1 एंटीबॉडी या माइटोकॉन्ड्रिया-लक्ष्यीकरण रंजक टीएमआरएम या मिटोट्रैकर का उपयोग करके अन्य फ्लोरोसेंट स्टेनिंग अतीत में हमारे द्वारा लागू किए गए हैं और पीडी सेलुलर जीव विज्ञान9 के अधिक विशिष्ट पहलुओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं। मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी इस अर्थ में सीमित है कि केवल चार फ्लोरोसेंट तरंग दैर्ध्य को हल किया जा सकता है। इसलिए, वर्तमान धुंधला पैनल में लाइसोसोमल या माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला जोड़ना आसानी से संभव नहीं है। जैविक प्रश्न के आधार पर, धुंधलापन का आदान-प्रदान किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, दो जैविक संरचनाओं को एक ही तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके इस शर्त के तहत दाग दिया जा सकता है कि उनकी आकृति विज्ञान अलग-अलग है और वे विभिन्न सेल डिब्बों में स्थानीयकृत हैं।

प्रोटोकॉल की स्क्रीनिंग संगतता बढ़ाने के लिए, इसे न्यूनतम संख्या में पाइपिंग चरणों और एक छोटी संस्कृति अवधि की आवश्यकता के लिए डिज़ाइन किया गया था। विधि के लिए महत्वपूर्ण सभी तरल हैंडलिंग चरण हैं क्योंकि वे कोटिंग को प्रभावित कर सकते हैं या न्यूरॉन्स की टुकड़ी में परिणाम कर सकते हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल में संकेत दिया गया है, यह अनुशंसा की जाती है कि माध्यम की अवशिष्ट मात्रा हमेशा कुएं में रहती है। एमडीए न्यूरॉन्स को देखभाल के साथ संभालना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि वे एक बहुत ही नाजुक सेल प्रकार हैं। कोशिका झिल्ली के आसमाटिक टूटने के कारण अत्यधिक कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए संकेत के अनुसार पिघलना करें। छवियों में न्यूरॉइट्स या नाभिक जैसे अत्यधिक अतिव्यापी संरचनाओं को रोकते हुए प्रति अच्छी तरह से पर्याप्त डेटा उत्पन्न करने के लिए सीडिंग घनत्व को अनुकूलित किया गया था। फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्लेट 2,4,23 में स्थितिगत प्रभावों के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल में बताया गया है, किनारे के कुओं का उपयोग न करें। इसके अतिरिक्त, प्रयोग की योजना बनाते समय प्रति प्रयोगात्मक स्थिति में कम से कम पांच तकनीकी प्रतिकृतियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। आदर्श रूप से, प्रतिकृति को प्लेट पर यादृच्छिक रूप से वितरित करें।

किसी भी विधि के साथ, न्यूरोनल फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग की सीमाएं हैं। फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग डेटासेट बहुत बड़े हो सकते हैं, खासकर जब एकल कोशिकाओं के लिए गणना की जाती है। यद्यपि अधिक फेनोटाइपिक विशेषताएं होना फायदेमंद हो सकता है, जैसे कि पहले से अज्ञात तंत्र का खुलासा करना या परख प्रणाली स्थिरता सुनिश्चित करना, यह अवांछित शोर भी पेश कर सकता है और सावधानीपूर्वक चयनित व्यक्तिगत विशेषताओं की तुलना में व्याख्या करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, मॉडल ओवरफिटिंग या नकली सहसंबंध चुनौतियां हैं जो बड़े डेटासेट 4,24 में अधिक बार होती हैं। इसलिए, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग का उद्देश्य परिकल्पना-संचालित प्रयोगात्मक डिजाइन को प्रतिस्थापित करना नहीं है, बल्कि नई परिकल्पनाओं के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करना है जिन्हें तब परीक्षण किया जा सकता है। पीडी एक न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है और अक्सर जीवन में देर से प्रकट होती है। आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में पीडी-लिंक्ड रोग जीव विज्ञान का अध्ययन करना इसलिए एक सीमा हो सकती है, खासकर जब ध्यान पीडी के शास्त्रीय लेट-स्टेज हॉलमार्क पर होता है, जैसे कि α-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण 17,25,26। इसके विपरीत, पीडी की अपेक्षाकृत देर से शुरुआत के कारण, पूर्व-रोगसूचक चरण लंबा होने का अनुमान है। इसलिए, महत्वपूर्ण विकृति पहले से ही आईपीएससी एमडीए न्यूरोनल मॉडल में सेलुलर आधार पर पता लगाने योग्य हो सकती है, जबकि प्रणालीगत स्तर पर, मस्तिष्क कई वर्षों तक न्यूरोनल और कार्यात्मक नुकसान की भरपाई करने में सक्षमहै27,28।

भविष्य में, इस प्रोटोकॉल को अन्य आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कॉर्टिकल या मोटर न्यूरॉन्स, उदाहरण के लिए, सिनैप्टिक जीव विज्ञान या इंट्रासेल्युलर समुच्चय पर ध्यान केंद्रित करने वाले धुंधलापन के साथ एमडीए न्यूरॉन-प्रासंगिक धुंधलापन को प्रतिस्थापित करके। उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को β-ट्यूबुलिन III और पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक प्रोटीन जैसे सिनैप्सिन 1 और होमर के खिलाफ पैन-न्यूराइट स्टेनिंग का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है, जिसके लिए उच्च गुणवत्ता वालेएंटीबॉडी का वर्णन किया गया है। मोटर न्यूरॉन्स को कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (सीएचएटी), टीएआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन 43 (टीडीपी -43) और आरएनए ग्रेन्युल मार्कर30 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके फेनोटाइप किया जा सकता है। सारांश में, यह अनुमान लगाया गया है कि न्यूरोनल फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनुसंधान समुदाय के लिए न्यूरोनल फेनोटाइप्स की एक विस्तृत श्रृंखला पर रासायनिक या आनुवंशिक गड़बड़ी के प्रभावों का पता लगाने के लिए उपयोगी होगा।

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Disclosures

सभी लेखक Ksilink द्वारा नियोजित हैं।

Acknowledgments

लेखक Ksilink में सभी सहयोगियों को उनकी मूल्यवान मदद और चर्चाओं के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं जो प्रस्तुत प्रोटोकॉल के डिजाइन की ओर ले जाते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti- chicken – Alexa 647 Jackson ImmunoRearch 703-605-155 Immunofluorescence
Anaconda https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2 Novus NB300-213 Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488 Thermo Fisher A11001 Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555 Thermo Fisher A21429 Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase Merck T2928 Immunofluorescence
Anti-α-synuclein Abcam 138501 Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head Agilent If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope  Yokogawa CV7000 The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter Invitrogen Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+ Gibco 14040-133 Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser  BioTek (Agilent)  If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %) Euromedex EM-15710-S Fixation before staining
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
iCell Base Medium 1 Fujifilm M1010 Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M Fujifilm C1087 Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 Fujifilm C1149 Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell Nervous System Supplement Fujifilm M1031 Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B Fujifilm M1029 Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook In-house development https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin Biolamina LN521 Plate coating
PFE-360 MedChemExpress HY-120085 LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink In-house development https://github.com/Ksilink/PhenoLink Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated Perkin Elmer 6057500 Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL Thermo Scientific AB-0781 Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton Sigma T9284 Permeabilization before lysis
Trypan Blue Sigma T8154-20ML Determination of living cells
Vprep Pipetting System  Agilent Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J. H. Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (197), e65570, doi:10.3791/65570 (2023).

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