Summary
Denne protokol beskriver celledyrkning af humane dopaminerge neuroner i midthjernen, efterfulgt af immunologisk farvning og generering af neuronale fænotypiske profiler fra erhvervede mikroskopiske billeder med højt indhold, der muliggør identifikation af fænotypiske variationer på grund af genetiske eller kemiske modulationer.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er forbundet med en række cellebiologiske processer, der forårsager dopaminerge (mDA) neurontab i midthjernen. Mange nuværende in vitro PD-cellulære modeller mangler kompleksitet og tager ikke højde for flere fænotyper. Fænotypisk profilering i humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte mDA-neuroner kan løse disse mangler ved samtidig at måle en række neuronale fænotyper i en PD-relevant celletype parallelt. Her beskriver vi en protokol til opnåelse og analyse af fænotypiske profiler fra kommercielt tilgængelige humane mDA-neuroner. Et neuronspecifikt fluorescerende farvningspanel bruges til at visualisere de nukleare, α-synuclein, tyrosinhydroxylase (TH) og mikrotubulusassocierede protein 2 (MAP2) relaterede fænotyper. Den beskrevne fænotypiske profileringsprotokol er skalerbar, da den bruger 384-brøndplader, automatisk væskehåndtering og højkapacitetsmikroskopi. Protokollens anvendelighed er eksemplificeret ved hjælp af sunde donor mDA-neuroner og mDA-neuroner, der bærer den PD-bundne G2019S-mutation i det leucinrige gentagelseskinase 2 (LRRK2) gen. Begge cellelinjer blev behandlet med LRRK2-kinasehæmmeren PFE-360, og fænotypiske ændringer blev målt. Derudover demonstrerer vi, hvordan multidimensionelle fænotypiske profiler kan analyseres ved hjælp af klynger eller maskinlæringsdrevne overvågede klassificeringsmetoder. Den beskrevne protokol vil især interessere forskere, der arbejder med neuronal sygdomsmodellering eller studerer kemiske sammensatte virkninger i humane neuroner.
Introduction
En række cellebiologiske processer forstyrres ved Parkinsons sygdom (PD). For eksempel er mitokondriel dysfunktion, oxidativ stress, proteinnedbrydningsdefekter, forstyrrelse af vesikulær handel og endolysosomal funktion blevet forbundet med dopaminerge (mDA) neurontab i midthjernen, almindeligt observeret i PD1. Derfor synes PD at involvere flere sygdomsmekanismer, der kan interagere med og forværre hinanden. En nyttig måde at undersøge dette mekanistiske samspil på er skabelsen af et omfattende fænotypisk fingeraftryk eller profil af dopaminerge (mDA) neuroner i midthjernen.
Fænotypisk profilering er en tilgang, der involverer oprettelse af en profil af en prøve baseret på en samling af målbare egenskaber, og for det andet involverer det at forudsige en prøve baseret på denne profil 2,3. Målet med profilering er at fange en bred vifte af funktioner, hvoraf nogle måske ikke tidligere har været forbundet med en sygdom eller behandling3. Som følge heraf kan profilering afsløre uventede biologiske processer. Fænotypisk profilering er typisk afhængig af fluorescerende farvede celler, og standardiserede assays, såsom cellemaleri, er blevet udviklet til at skabe fænotypiske profiler4. For nylig er fænotypisk profilering for eksempel blevet anvendt til karakterisering af små molekyler eller nøjagtig forudsigelse af PD-undertyper udelukkende baseret på patientafledte fibroblaster 5,6. På trods af disse fremskridt er fænotypisk profilering sjældent blevet anvendt på postmitotiske differentierede celler, såsom humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte mDA-neuroner, der udtrykker PD-bundne mutationer såsom LRRK2 G2019S. Væsentlige udfordringer ved iPSC-afledte modeller omfatter tilstedeværelsen af subtile eller variable patologiske træk på tværs af differentieringsbatcher eller genotyper og det faktum, at isolerede PD-fænotyper ikke fanger sygdommens fulde kompleksitet. Selvom iPSC neuronale modeller er fysiologisk relevante, anvendes de sjældent i PD-lægemiddelopdagelsesprocesser på grund af bekymringer om teknisk kompleksitet 7,8.
Vi har tidligere udviklet en robust metode til at måle flere PD-relaterede patofysiologiske fænotyper i humane mDA-neuroner, der både er følsomme over for genetiske og kemiske sammensætningsinducerede fænotypiske ændringer9. Denne artikel beskriver detaljeret en yderligere optimeret version af denne metode til at oprette fænotypiske profiler fra mDA-neuroner (figur 1). Denne protokol har flere fordele i forhold til de tidligere beskrevne fænotypiske profileringsmetoder, såsom brugen af mDA-neuroner af høj kvalitet og teknisk reproducerbarhed. For første gang muliggør denne protokol fænotypisk profilering i fysiologisk relevante postmitotiske mDA-neuroner efter kemiske forstyrrelser på en meget skalerbar måde. Fuldt differentierede og kryopræserverede mDA-neuroner er kommercielt tilgængelige, hvilket signifikant reducerer batch-til-batch-differentieringsvariabilitet. For det andet kan teknisk variabilitet reduceres yderligere ved at anvende et veldefineret eksperimentelt design (dvs. dyrkningsvarighed eller undgå kantbrønde), automatiseret væskehåndtering og automatiseret mikroskopi. Derudover er de indledende trin i fænotypisk profilanalyse ved hjælp af uovervåget klyngedannelse eller overvåget klassificeringsmetoder skitseret her, hvilket angiver, hvordan fænotypiske profileringsdata kan analyseres. Denne protokol vil være nyttig for forskere, der er interesseret i fænotypiske ændringer af mDA-neuroner induceret af genetiske eller kemiske forstyrrelser, specifikt når der kræves en meget skalerbar undersøgelsesopsætning, for eksempel under screeningskampagner, eller når virkningerne af et mindre antal forbindelser skal undersøges, for eksempel for at bestemme toksiske virkninger. Sammenfattende forventes det, at anvendelsen af fænotypisk profilering af humane neuroner er en værdifuld teknik til at studere komplekse sygdomsrelaterede fænotyper og karakterisere de cellulære virkninger af lægemiddelkandidater.
Figur 1: Skematisk skildring af den eksperimentelle protokol til generering af billedbaserede fænotypiske profiler fra humane iPSC-afledte mDA-neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af medium og plader til neuronsåning (dag 1)
- For at forberede pladerne til neuronsåning på dag-1, varm Laminin til stuetemperatur (RT) lige før brug. Lamininopløsningen fremstilles ved at fortynde Lamininstamopløsningen (0,1 mg/ml) 1/10 i kold PBS+/+ (med Ca 2+ og Mg2+).
BEMÆRK: Alle reagenser er angivet i materialetabellen. Sammensætningen af opløsninger og buffere er beskrevet i tabel 1-4. - Derefter tilsættes 25 μL af Lamininopløsningen til hvert hul i en poly-D-lysin (PDL) prælakeret 384-brøndplade, og inkuberes natten over ved 4 °C. De coatede plader kan opbevares ved 4 °C i op til en uge.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her i op til en uge. Forsegl plader ved hjælp af plastfilm. - Forbered komplette vedligeholdelsesmedier og opbevar ved 4 °C i op til en måned (tabel 1).
2. Optøning af neuroner (dag 0)
- For at optø neuronerne på dag 0 skal du forvarme et vandbad til 37 °C og afbalancere det komplette vedligeholdelsesmedie til RT, beskyttet mod lys.
- Tag hætteglasset med de kommercielt fremstillede frosne neuroner (se materialetabellen) ud af tanken med flydende nitrogen og læg det på tøris. Anbring derefter hætteglasset i vandbadet i 2 min. Når væsken er helt optøet, desinficeres hætteglasset med 70% ethanol.
- Opsug de optøede neuroner med en P1000-pipette (ca. 370 μL) og overfør dem i et 50 ml centrifugerør uden op-og-ned-pipettering. Skyl derefter hætteglasset med 630 μL komplet vedligeholdelsesmedium, og fordel dråbe for dråbe (45° vinkel) i 50 ml glasset. Omrør langsomt, mens du dispenserer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at dispensere mediet langsomt, dråbe for dråbe, for at undgå osmotisk brud på cellerne. En vinkel på 45° og let omrøring minimerer højt lokalt osmotisk tryk under pipettering. - På samme måde tilsættes 1 ml komplet vedligeholdelsesmedium i 50 ml centrifugerøret med en P1000-pipette. Tilsæt derefter langsomt 2 ml komplet vedligeholdelsesmedium. Omrør forsigtigt, mens du dispenserer.
- Tæl cellerne. Forbered et mikrorør med 10 μL trypanblå og 10 μL cellesuspension og tilsæt til et tællekammerglas (10 μL). Udfør optælling ved hjælp af en automatiseret celletæller (se materialetabel) eller manuelt.
- Efter tælling centrifugeres 50 ml røret indeholdende neuronerne ved 400 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten fjernes. Ophvæs forsigtigt pillen igen med en P1000-pipette og 1 ml komplet vedligeholdelsesmedium. Tilføj derefter det nødvendige volumen for at nå den ønskede koncentration (300.000 celler/ml, se også næste trin).
3. Såning af neuroner på forberedte plader (dag 0)
- For at frø neuroner på de forberedte plader på dag 0, tag de coatede plader ud af køleskabet, læg dem under cellekulturhætten og lad dem ekvilibrere til RT i ca. 30 minutter.
- Lige før såning aspireres 15 μL belægningsopløsning med en automatiseret væskehåndterer eller en 16-kanals pipette. Efterlad ca. 10 μL pr. hul for at forhindre beskadigelse af belægningen.
- Derefter dispenseres 50 μL af celleopløsningen indeholdende 300.000 celler/ml (fremstillet i trin 2.6) pr. hul med en 16-kanals pipette, hvilket resulterer i 15.000 seedede neuroner pr. brønd og et slutvolumen pr. hul på 60 μL.
- I en plade med 384 brønde skal du undgå at bruge kolonne 1, 2, 23, 24 og række A, B, O og P for at minimere mulige kanteffekter, der kan påvirke de fænotypiske profiler. De ubrugte tomme huller fyldes med 80 μL PBS. Pladerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
4. Medium ændring eller sammensat behandling (dag 3)
- Afhængigt af antallet af brønde forvarmes en passende mængde komplet vedligeholdelsesmedium ved RT. Beskyt mod lys.
- Hvis der kræves en medieændring, skal du fortsætte til trin 4.4. Hvis der ønskes blandingsbehandling, kontrolleres koncentrationen af stamforbindelsen og det anvendte opløsningsmiddel (vand, DMSO, methanol osv.).
- Der fremstilles en 1,5x koncentreret sammensat opløsning til alle ønskede koncentrationer, der skal testes. Forbered de sammensatte fortyndinger ved hjælp af komplet vedligeholdelsesmedium.
BEMÆRK: Som neutral kontrol anvendes det respektive opløsningsmiddel i samme koncentration som den testede forbindelse. Hvis der anvendes flere eller ukendte forbindelser i forskellige koncentrationer, anbefales det at udføre et separat dosis-respons-forsøg for at måle opløsningsmidlets virkning på fænotypisk profil. - Hvis der anvendes et automatisk pipetteringssystem, tilsættes 60 μL af 1,5x blandingsopløsningen til en opbevaringsplade med 384 huller. Alternativt kan du bruge en 16-kanals pipette. Hvis der kræves en medieændring, tilsættes i stedet 60 μL komplet vedligeholdelsesmedium.
- Ved hjælp af det automatiske pipetteringssystem aspirateres og kasseres 40 μL medium pr. brønd fra den neuronholdige plade for at holde 20 μL/brønd. Derefter tilsættes 40 μL/hul 1,5x sammensat opløsning fra 384-brøndens opbevaringsplade til hvert hul for at opnå den ønskede endelige koncentration.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at udføre fulde medieændringer, men altid at efterlade resterende medium i brønden for at forhindre beskadigelse af neuronalt tæppe eller belægningen. - Hvis neuronal kultur udføres i mere end de 6 dage, der er beskrevet i denne protokol, skal du ændre mediet hver 2-3 dage.
5. Neuronfiksering og farvning (dag 6 til 7)
- For at fikse og plette neuronerne på dag 6 og 7 skal du bruge en automatiseret væskehåndterer til alle dispenserings- og vasketrin. Alternativt kan du bruge en 16-kanals pipette.
- Forbered en 10% Triton X-100 opløsning ved at fortynde Triton X-100 i 1x PBS. Vortex, indtil opløsningen er homogen. Opbevares ved 4 °C.
- For at fiksere neuronerne dispenseres 20 μL / brønd med 16% PFA, hvilket resulterer i en slutkoncentration på 4%. Inkuber pladen i 30 minutter ved RT, og vask den tre gange med 1x PBS. Der efterlades 20 μL/hul PBS efter sidste vask.
FORSIGTIG: PFA er anerkendt som et farligt stof, der vides at forårsage oral, dermal og respiratorisk toksicitet. Det udgør også en trussel mod øjnene og kan føre til genetiske mutationer og kræft. Korrekt håndtering af PFA kræver brug af egnede personlige værnemidler, såsom øjen- og ansigtsværn, ud over at sikre korrekt ventilation. Det er vigtigt at forhindre udslip af PFA i miljøet. - Til permeabilisering og blokering fremstilles en 2x blokeringsopløsning (tabel 2).
- Der tilsættes 20 μL/hul 2x blokeringsopløsning (1x slutkoncentration), inkuberes i 1 time ved RT, og vaskes én gang med PBS. Opbevar 20 μL/hul PBS efter vask.
- For primær antistoffarvning (se materialetabel) fremstilles en 2x primær farvningsbuffer (tabel 3).
- Der tilsættes 20 μL/hul 2x primær farvningsbuffer (1x slutkoncentration) og inkuberes natten over ved 4 °C. Næste morgen på dag 7 vaskes tre gange med PBS. Efterlad 20 μL/hul PBS efter vask.
- For sekundær antistoffarvning (se materialetabel) fremstilles en 2x sekundær farvningsbuffer (tabel 4).
- Der tilsættes 20 μL/hul 2x sekundær farvningsbuffer (1x slutkoncentration), inkuberes i 2 timer ved RT væk fra lys, og der vaskes tre gange med PBS. Lad 100 μL PBS/brønd stå efter sidste vask.
- Tilsæt aluminiumsforsegling på pladen for at minimere fordampning. Alternativt kan du dække pladen med plastfilm og aluminiumsfolie. Fortsæt til billedoptagelse, eller opbevar pladen ved 4 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her i op til en uge. Hvis der observeres baggrundsfluorescens, skal du overveje at øge blokeringstiden. Hvis farvningen er utilstrækkelig, skal du prøve at øge den primære antistofkoncentration eller inkubationstid.
- Tilsæt aluminiumsforsegling på pladen for at minimere fordampning. Alternativt kan du dække pladen med plastfilm og aluminiumsfolie. Fortsæt til billedoptagelse, eller opbevar pladen ved 4 °C.
6. Billeddannelse af fluorescerende farvede neuroner (dag 7)
- Få billeder af de belagte, dyrkede og farvede neuroner på dag 7. Ideelt set skal du bruge et automatiseret konfokal fluorescensmikroskop (se materialetabel). Alternativt kan du hente billeder manuelt.
- Hoechst-, TH-, α-synuclein- og MAP2-kanalerne anskaffes ved hjælp af henholdsvis 405 nm-, 488 nm-, 561 nm- og 647 nm-lasere (figur 2).
BEMÆRK: For at generere tilstrækkelig mængde detaljerede data til fænotypisk profilering skal du bruge en 40x målsætning og erhverve 16 felter / brønd ved hjælp af Z-stakke bestående af 3 Z-skiver adskilt af 2 μm. Hvis der er pipetteringsrelaterede skader i neurontæppet, så prøv at undgå billeddannelse af disse områder. - Afhængigt af mikroskop og kamera skal du justere eksponeringstider og excitationsintensiteter for hver af de fire fluorescerende kanaler separat for at opnå et optimalt dynamisk område for fluorescerende intensiteter.
BEMÆRK: Billedbehandlingssoftware giver ofte et histogram til bestemmelse af den ideelle eksponeringstid. Hvis histogrammet forskydes for meget til venstre i det lave signalområde, er eksponeringstiden for kort, eller excitationsintensiteten er for lav. Hvis der er en skarp klippe ved det maksimale signalniveau til højre, er signalværdien mættet. I dette tilfælde reducere excitationsintensiteten eller forkorte eksponeringstiden. - Gem billeder i et tabsfrit og åbent format som f.eks. .tif.
7. Billedbehandling (dag 8)
- Billedsegmentering og fænotypisk funktionsekstraktion er nødvendig for oprettelse af kvantitative fænotypiske profiler. Brug PhenoLink-softwaren til billedsegmentering og funktionsekstraktion (materialefortegnelse). Instruktioner til installation af PhenoLink findes i GitHub-lageret (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
BEMÆRK: Billedsegmentering bruges til at identificere og adskille forskellige objekter eller regioner i et billede, mens fænotypisk funktionsekstraktion bruges til at analysere og udtrække relevant information fra disse regioner. Flere alternative softwareløsninger, såsom CellProfiler 10, ImageJ / FIJI 11, Napari12 eller Knime Analytics Platform13 er tilgængelige for at udtrække kvantitativ information fra multikanals fluorescensbilleder. - Udfør billedsegmentering på belysningskorrigerede raw-billeder. Bestem de respektive fluorescerende kanalintensitetstærskler empirisk pr. plade, så baggrundssignalet er minimalt, og det ønskede segmenterede signal svarer til signalet i det rå billede. Plader, der behandles og farves samme dag, kræver typisk sammenlignelige kanalintensitetstærskler for segmentering.
- Definer kernens størrelse og intensitet for at adskille levende fra døde celler. Når du bruger 40x billeder, skal du beholde alle andre standardparametre og køre softwaren. Et hundrede seksogtyve kvantitative billedtræk beregnes pr. brønd (supplerende tabel 1).
- Brug de resulterende tabelformede kvantitative data til at konstruere fænotypiske profiler og sammenligne fænotypiske profiler fra forskellige cellelinjer eller behandlingsbetingelser. Hver række svarer til en biologisk tilstand (brønd), og hver kolonne svarer til et bestemt fænotypisk træk.
BEMÆRK: Vi leverer et eksempel på en outputfil sammen med dataanalysepipelinen for at illustrere dens anvendelse (se materialetabel). Derudover viser figur 3 sammensætningen af en fænotypisk profil.
8. Fænotypisk profilgenerering og visualisering (dag 8)
- Hvis du ikke har Python og Jupyter installeret på din computer, skal du installere Anaconda Distribution og åbne Jupyter-softwaren. Download den medfølgende Jupyter-notesbog og alle andre medfølgende filer, og gem dem i samme mappe (se materialefortegnelsen). Åbn Jupyter-notesbogfilen ved hjælp af Jupyter-softwaren.
BEMÆRK: Anaconda er en gratis og open source-platform til programmeringssprog som Python. Denne platform leveres med Python-tolken Jupyter, som kan udføre den medfølgende Jupyter-notesbog for at oprette og analysere fænotypiske profiler (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling). - Udfør Jupyter-notesbogen celle for celle ved hjælp af Jupyter-softwaren. De medfølgende eksempeldata .fth og krav .txt filer skal være placeret i samme mappe som Jupyter-notesbogen. Hver Jupyter-notesbogcelle er kommenteret for at forklare dens funktionalitet.
BEMÆRK: Det er afgørende at bruge Jupyter-notesbogen i den rigtige rækkefølge startende med dataindlæsning og skalering og fortsætte celle for celle til slutningen. Alt data- og grafikoutput gemmes i en nyoprettet mappe i kildemappen Jupyter-notesbogen. Figur 4 viser arbejdsprocessen og arbejdsprocesoutputtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fænotypisk profilering i mDA-neuroner er en effektiv måde at kvantificere flere aspekter af cellulær biologi og deres ændringer under den eksperimentelle modulering. For at eksemplificere denne metode gjorde denne undersøgelse brug af kryopræserverede LRRK2 G2019S og raske donor mDA-neuroner. Disse neuroner er blevet differentieret i ca. 37 dage, er postmitotiske og ekspressive neuronale markører (TUBB3 og MAP2) og dopaminerge neuronmarkører, herunder tyrosinhydroxylase (TH) i kombination med FOXA2, mens gliamarkøren Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) er fraværende14. Efter den beskrevne protokol blev begge cellelinjer dyrket i 6 dage og behandlet med 0,1 μM PFE-360, en LRRK2-kinasehæmmer. Neuronerne blev farvet ved hjælp af den nukleare plet Hoechst og antistoffer mod α-synuclein, TH og MAP2 (figur 2).
Dernæst blev billeder segmenteret, og fænotypiske træk blev ekstraheret. Vi fastlagde 126 kvantitative egenskaber, der kan aggregeres i velbaserede fænotypiske profiler (figur 3A, B). Der er adgang til hver funktion og dens værdi i henhold til den eksperimentelle betingelse. Nogle funktioner viste ændringer ved sammensat behandling. For eksempel faldt α-synucleinfluorescensintensiteten i TH-positive celler ved PFE-360-behandling (figur 3C, venstre panel). Andre funktioner præsenterede kun forskelle mellem de testede cellelinjer, men ikke ved sammensat behandling. Dette var for eksempel tilfældet for MAP2 neuritnetværkslængden eller forholdet mellem TH-positive neuroner (figur 3C, midterste og højre panel). Det er vigtigt at overveje den komplette fænotypiske profil for at analysere fænotypiske variationer i forskellige cellelinjer eller sammensatte behandlinger på en mindre selektiv og omfattende måde.
Under billedanalysetrinnet beregnes alle 126 funktioner altid. På samme måde overvejes alle funktioner under dataanalyse, men maskinlæringsalgoritmen tildeler vægte til individuelle funktioner for at adskille de biologiske klasser. Arbejdsprocessen for dataanalyse starter med dataindlæsning og funktionsskalering (Figur 4A). Skalering er vigtig for maskinel indlæring, fordi det hjælper med at normalisere dataene og sikrer, at hver funktion er i samme skala. Dette kan hjælpe med at forbedre ydeevnen af algoritmer til maskinel indlæring ved at gøre dem mindre følsomme over for inputfunktionernes skala. Derudover kan skalering hjælpe med at forbedre fortolkningen af modeller til maskinel indlæring ved at gøre det nemmere at sammenligne den relative betydning af forskellige funktioner. I næste trin udføres klyngeanalyse (Figur 4B). Klynger kan være nyttige til at udforske strukturen af højdimensionelle datasæt og identificere mønstre i dataene, som måske ikke umiddelbart fremgår af de enkelte funktioner. Hierarkisk klyngedannelse baseret på Cosinus-afstanden mellem velbaserede fænotypiske profiler viste stærke forskelle mellem cellelinjer, men mindre for lægemiddelbehandling. Data fra PFE-360-behandlede brønde grupperet inden for den DMSO-behandlede kontrol, hvilket indikerer ingen stærke forskelle ved hjælp af denne sammenligningsmetrik. Ved siden af klyngedannelse er dimensionsreduktionsmetoder også nyttige værktøjer til at visualisere ligheder og forskelle i flerdimensionelle fænotypiske profileringsdata. Her gjorde vi brug af Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP)15 (Figur 4C). I lighed med den tidligere Cosinus-afstandsbaserede tilgang viste PaCMAP hovedsageligt forskelle mellem de to cellelinjer og i mindre grad mellem PFE-360 eller DMSO-kontrolbehandlede brønde. Både Cosinus-afstandsklynger og PaCMAP er uovervågede metoder og vil sandsynligvis ikke opfange små forskelle, der kun er til stede i udvalgte fænotypiske træk, for eksempel fordi en forbindelse kun ændrer nogle få fænotyper (dvs. kun neuritrelaterede træk). For at løse denne begrænsning af fænotypisk profilanalyse udførte vi maskinlæringsdrevet overvåget klassificering. Specifikt brugte vi maskinen til forstærkning af lysgradienter (LightGBM) (Figur 4D). LightGBM er en overvåget maskinlæringsalgoritme, der bruger beslutningstræalgoritmer til at oprette en model, der kan bruges til rangordning eller klassificering16. LightGBM er designet til at være hurtigere og mere effektiv end traditionelle træbaserede algoritmer såsom Random forest-algoritmen. Algoritmen blev trænet med fænotypiske profildata fra én plade og testet den trænede model på data fra en anden uafhængig plade. LightGBM-modellen havde en samlet nøjagtighed på 85% og forudsagde korrekt den eksperimentelle kategori (cellelinje eller forbindelse) for de fleste brønde. Nøjagtigheden for cellelinjeforudsigelse var højere end for sammensat forudsigelse, men også 60% af forbindelsesbehandlede brønde blev forudsagt korrekt, hvilket er bedre end klassiske uovervågede metoder. LightGBM giver adgang til betydningen af de respektive fænotypiske træk for klassificeringen af de fire klasser (Figur 4D). Vigtige fænotypiske træk, der adskiller cellelinjerne og lægemiddelbehandlingerne, er for eksempel relateret til det cellulære overfladeareal eller de cellulære intensiteter af MAP2- og TH-farvningerne. Overfladen af TH og α-synuclein dobbelt positiv cytoplasma var det vigtigste træk, der skelnet cellelinjer og sammensatte behandlinger, efterfulgt af forholdet mellem døde celler. Vi leverer en Jupyter-notesbog, der udfører dataplotning og alle uovervågede og overvågede analysemetoder, der er beskrevet her (se Tabel over materialer). De opnåede resultater illustrerer potentialet i fænotypisk profilering til at skelne cellelinjer og sammensatte behandlingseffekter i humane mDA-neuroner.
Figur 2: Immunfarvning af humane iPSC-afledte mDA-neuroner. Repræsentative billeder af alle erhvervede fluorescerende kanaler vises. Raske donor- eller LRRK2 G2019S-mutationsbærende mDA-neuroner blev enten behandlet med DMSO eller med 0,1 μM af LRRK2-kinasehæmmeren PFE-360. Behandlingen blev udført på dag 3, og cellerne blev fikseret på dag 6 som beskrevet i protokollen. Skalastænger: 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Oprettelse af en fænotypisk profil ud fra individuelle fænotypiske træk. (A) Udvalgte fænotypiske træk, der kan ekstraheres fra de enkelte fluorescenskanaler, vises. (B) Fænotypiske træk kan aggregeres til en fænotypisk profil. Flere fænotypiske profiler kan genereres på tværs af forskellige eksperimentelle betingelser, der findes på 384-brøndpladen. C) Eksempler på fænotypiske træk og deres tilsvarende værdier pr. forsøgsbetingelse. Hvert datapunkt svarer til en måling fra en brønd. Welchs ulige varians t-test blev brugt til signifikanstest. Statistisk signifikans præsenteres som * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 og ikke signifikant (ns = p > 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: mDA neuronfænotypiske profiler indeholder kvantitativ information og kan bruges til at klassificere fænotyper . (A) Skematisk oversigt over dataanalysearbejdsgangen. (B) Aggregerede fænotypiske profiler af kontrol- og lægemiddelbehandlede mDA-neuroner. c) Parvis kontrolleret manifoldtilnærmelse (PaCMAP) uovervåget dimensionsreduktion af fænotypiske profildata. (D) LightGBM (Light gradient-boosting machine) overvåget klassificering af fænotypiske profildata. Klassificeringsalgoritmen blev trænet på fænotypiske profildata fra en plade og blev anvendt til at forudsige eksperimentelle klasser i en anden plade. Venstre panel: Forvirringsmatrixen viser forholdet mellem de fire sande dataklasser og de fire forudsagte klasser efter modellen. Samlet set forudsiger modellen dataklassen korrekt i 85% af tilfældene. Højre panel: De 10 vigtigste fænotypiske funktioner for LightGBM-klassifikatoren. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagenser | Til 100 ml |
| iCell-basismedium 1 | 100 ml |
| iCell neuralt supplement B | 2 ml |
| iCell Nervesystem Supplement | 1 ml |
Tabel 1: Sammensætning af komplette vedligeholdelsesmedier.
| Reagens | 2x opløsning | Endelig koncentration | Til 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 78 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS lager løsning | 20% | 10% | 20 ml |
Tabel 2: Sammensætning af 2x blokeringsopløsning.
| Reagens | 2x koncentration | Endelig koncentration | Til 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 87,36 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS lager løsning | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-TH | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-α-synuclein | 1/250 | 1/500 | 0,4 ml |
| Anti-MAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0,04 ml |
Tabel 3: Sammensætning af primær farvningsbuffer.
| Reagens | 2x koncentration | Endelig koncentration | Til 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 86,7 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS lager løsning | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-mus A488 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-kanin A555 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-kylling A647 | 1/125 | 1/250 | 0,8 ml |
| Hoechst | 1/1000 | 1/2000 | 0,1 ml |
Tabel 4: Sammensætning af 2x sekundær farvningsbuffer.
Supplerende tabel 1: Oversigt over alle ekstraherede fænotypiske træk. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fænotypisk profilering er en teknik til at måle et stort antal fænotyper i celler ved at anvende fluorescerende farvninger, mikroskopi og billedanalyse3. Fænotypiske profiler kan opnås og sammenlignes på tværs af cellelinjer eller andre eksperimentelle betingelser for at forstå komplekse ændringer i cellulær biologi, der kan gå ubemærket hen, når man bruger en enkelt udlæsning. Her beskriver vi anvendelsen af fænotypisk profilering til humane iPSC-afledte mDA-neuroner, en celletype, der ofte bruges til at modellere PD-cellebiologi17,18,19. Fænotypisk profilering i mDA-neuroner har flere fordele i forhold til tidligere anvendte profileringsmetoder, der bruger generiske fluorescerende farvninger4, ikke-neuronale celletyper5,6 eller ikke er skalerbare 7,8. Metoden, der præsenteres her, muliggør fænotypisk profilering i fysiologisk relevante postmitotiske mDA-neuroner. For det andet reducerer brugen af iPSC-afledte kryopræserverede mDA-neuroner signifikant batch-til-batch-differentieringsvariabilitet. For det tredje kan teknisk variabilitet reduceres yderligere ved at gøre brug af et veldefineret eksperimentelt design, automatiseret væskehåndtering og automatiseret mikroskopi og gøre protokollen meget skalerbar og åbner mulighed for at bruge mDA-neuroner til fænotypiske screeningskampagner. Endelig giver overvåget klassificering brugerne mulighed for at gruppere og forstå de vigtigste træk ved fænotypiske profiler og kan derfor hjælpe med at afdække ny biologi.
Fænotypisk profilering gør det muligt at udforske individuelle træk for at udvikle opfølgningshypoteser, der fører til opfølgende mekanistiske undersøgelser. For eksempel viste vi, at LRRK2 G2019S mDA-neuroner adskiller sig fra kontrol-mDA-neuroner baseret på deres α-synucleinindhold, MAP2-neuritlængde og forholdet mellem TH-positive celler (figur 3C). Sammensat behandling med LRRK2-kinasehæmmeren PFE-360 ændrer imidlertid kun indholdet af α-synuclein og har ingen effekt på MAP2-neuritlængden eller forholdet mellem TH-positive celler. En ønskelig kemisk forbindelse bør redde et ensemble af fænotyper. En fænotypisk profil indeholder de nødvendige oplysninger og kan udforskes ved hjælp af klynger eller dimensionalitetsreduktionsteknikker, som kan hjælpe med at visualisere komplekse funktionsinteraktioner i 2-dimensionelle plots. Cosinusafstandsbaseret klyngedannelse muliggør nøjagtig adskillelse af begge cellelinjer (figur 4B). Dimensionsreduktion ved hjælp af PaCMAP illustrerer yderligere, hvordan begge cellelinjer danner forskellige klynger, og at PFE-360-behandling fører til skelnelige, men stadig ens overordnede fænotyper, sandsynligvis på grund af virkningen på kun få målte funktioner såsom α-synucleinindhold (figur 4C). I modsætning hertil kan overvåget maskinel indlæring hjælpe med at forudsige profiler af interesse baseret på deres funktioner. LightGBM-modellen, der blev trænet på dataene, forudsagde nøjagtigt de sunde donor- og LRRK2-muterede mDA-neuroner i testdataene. Identifikationen af PFE-360-behandlede neuroner var mindre nøjagtig, formodentlig fordi kemiske sammensatte virkninger på fænotyper er svagere end genetiske virkninger (figur 4C). Overfladen af TH og α-synuclein dobbelt positiv cytoplasma var det vigtigste træk, der skelnede cellelinjer og sammensatte behandlinger, efterfulgt af forholdet mellem døde celler. Flere andre topfunktioner var relateret til det cellulære overfladeareal. Derfor synes cellestørrelse at være et overordnet kendetegn mellem sund kontrol og LRRK2-muterede mDA-neuroner (figur 4D). Denne tilgang demonstrerer derfor, hvordan maskinlæring kan identificere de mest definerende fænotypiske træk i et komplekst datasæt, som derefter kan bruges til at udvikle nye hypoteser og teste disse hypoteser i sekundære assays.
CellPainting er blevet en populær tilgang til at skabe fænotypiske profiler og bruger et standardiseret sæt fluorescerende sonder og en defineret protokol 3,4,20,21,22,23. Det blev her besluttet at anvende et mere mDA-neuronspecifikt farvningspanel bestående af Hoechsts nukleare plet og antistoffer mod α-synuclein, TH og MAP2. Andre fluorescerende farvninger ved hjælp af et lysosomassocieret LAMP1-antistof eller mitokondrie-målrettede farvestoffer TMRM eller MitoTracker er tidligere blevet anvendt af os og fokuserer på mere specifikke aspekter af PD-cellulær biologi9. Standard lysmikroskopi er begrænset i den forstand, at kun fire fluorescerende bølgelængder kan løses. Det er derfor ikke let muligt at tilføje lysosomale eller mitokondrie farvninger til det nuværende farvningspanel. Afhængigt af det biologiske spørgsmål kan farvninger udveksles. Alternativt kan to biologiske strukturer farves ved hjælp af den samme bølgelængde under forudsætning af, at deres morfologi kan skelnes, og at de er lokaliseret i forskellige cellerum.
For at øge protokollens screeningskompatibilitet blev den designet til at kræve et minimum antal pipetteringstrin og en kort dyrkningsvarighed. Kritisk for metoden er alle væskehåndteringstrin, da de kan påvirke belægningen eller resultere i frigørelse af neuroner. Som angivet i protokollen anbefales det, at der altid forbliver en resterende mængde medium i brønden. Det er også vigtigt at håndtere mDA-neuronerne med omhu, da de er en meget skrøbelig celletype. Udfør optøning nøjagtigt som angivet for at forhindre overdreven celledød på grund af osmotisk brud på cellemembranen. Såtætheden blev optimeret til at generere tilstrækkelige data pr. brønd og samtidig forhindre overdreven overlappende strukturer, såsom neuritter eller kerner i billederne. Fænotypiske profiler er meget følsomme over for positionseffekter i pladen 2,4,23. Som angivet i protokollen må du ikke bruge kantbrønde. Derudover anbefales det at bruge mindst fem tekniske replikater pr. eksperimentel tilstand, når du planlægger et eksperiment. Ideelt set fordeles replikaterne tilfældigt over pladen.
Som med enhver metode har neuronal fænotypisk profilering begrænsninger. Fænotypiske profileringsdatasæt kan være meget store, især når de beregnes for enkelte celler. Selvom det kan være en fordel at have flere fænotypiske egenskaber, såsom at afsløre en hidtil ukendt mekanisme eller sikre assaysystemets stabilitet, kan det også introducere uønsket støj og være mere udfordrende at fortolke end omhyggeligt udvalgte individuelle funktioner. For eksempel er modeloverfitting eller falske korrelationer udfordringer, der forekommer hyppigere i store datasæt 4,24. Fænotypisk profilering er derfor ikke beregnet til at erstatte hypotesedrevet eksperimentelt design, men snarere at tjene som udgangspunkt for nye hypoteser, der derefter kan testes. PD er en neurodegenerativ sygdom og manifesterer sig ofte først sent i livet. At studere PD-bundet sygdomsbiologi i iPSC-afledte neuroner kan derfor være en begrænsning, især når fokus er på klassiske sene stadier af PD, såsom α-synuclein-aggregering 17,25,26. Tværtimod, på grund af den relativt sene begyndelse af PD anslås den præsymptomatiske fase at være lang. Signifikante patologier kan derfor allerede påvises på cellulær basis i iPSC mDA neuronale modeller, mens hjernen på systemisk niveau er i stand til at kompensere for neuronalt og funktionelt tab i mange år27,28.
I fremtiden kan denne protokol tilpasses andre iPSC-afledte neurontyper, såsom kortikale eller motoriske neuroner, ved at erstatte mDA-neuronrelevante farvninger med farvninger med fokus på for eksempel synaptisk biologi eller intracellulære aggregater. Kortikale neuroner kunne for eksempel karakteriseres ved anvendelse af pan-neuritfarvning mod β-tubulin III og præ- og postsynaptiske proteiner såsom Synapsin1 og Homer, for hvilke antistoffer af høj kvalitet er blevet beskrevet29. Motorneuroner kunne fænotypes ved hjælp af antistoffer mod cholinacetyltransferase (ChAT), tjære-DNA-bindende protein 43 (TDP-43) og RNA-granulatmarkører30. Sammenfattende forventes det, at den præsenterede protokol til oprettelse af neuronale fænotypiske profiler vil være nyttig for forskersamfundet til at undersøge virkningerne af kemiske eller genetiske forstyrrelser på en bred vifte af neuronale fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er ansat af Ksilink.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle kolleger hos Ksilink for deres værdifulde hjælp og diskussioner, der fører til udformningen af den præsenterede protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H.
- Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
- Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
- Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
- Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
- Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
- Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
- Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
- Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
- Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
- Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
- Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
- Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
- Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
- Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
- Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
- Wu, Y., Le, W., Jankovic, J.
- Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
- Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).
