Summary
Dit protocol beschrijft de celkweek van dopaminerge neuronen in de middenhersenen, gevolgd door immunologische kleuring en het genereren van neuronale fenotypische profielen op basis van verworven microscopisch kleine beelden met een hoog gehalte die de identificatie van fenotypische variaties als gevolg van genetische of chemische modulaties mogelijk maken.
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) is gekoppeld aan een reeks celbiologische processen die dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen veroorzaken. Veel van de huidige in vitro PD-cellulaire modellen missen complexiteit en houden geen rekening met meerdere fenotypes. Fenotypische profilering in humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide mDA-neuronen kan deze tekortkomingen aanpakken door tegelijkertijd een reeks neuronale fenotypes in een PD-relevant celtype parallel te meten. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen en analyseren van fenotypische profielen van in de handel verkrijgbare menselijke mDA-neuronen. Een neuronspecifiek fluorescerend kleuringspaneel wordt gebruikt om de nucleaire, α-synucleïne, tyrosinehydroxylase (TH) en microtubuli-geassocieerd proteïne 2 (MAP2) gerelateerde fenotypes te visualiseren. Het beschreven fenotypische profileringsprotocol is schaalbaar omdat het gebruik maakt van platen met 384 putjes, automatische vloeistofverwerking en high-throughput microscopie. Het nut van het protocol wordt geïllustreerd met behulp van gezonde donor mDA-neuronen en mDA-neuronen die de PD-gekoppelde G2019S-mutatie dragen in het Leucine-rijke repeat kinase 2 (LRRK2)-gen. Beide cellijnen werden behandeld met de LRRK2-kinaseremmer PFE-360 en fenotypische veranderingen werden gemeten. Daarnaast laten we zien hoe multidimensionale fenotypische profielen kunnen worden geanalyseerd met behulp van clustering of machine learning-gestuurde gesuperviseerde classificatiemethoden. Het beschreven protocol zal vooral interessant zijn voor onderzoekers die werken aan het modelleren van neuronale ziekten of het bestuderen van effecten van chemische verbindingen in menselijke neuronen.
Introduction
Bij de ziekte van Parkinson (PD) zijn verschillende celbiologische processen verstoord. Mitochondriale disfunctie, oxidatieve stress, eiwitafbraakdefecten, verstoring van vesiculaire handel en endolysosomale functie zijn bijvoorbeeld vaak in verband gebracht met dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen, worden vaak waargenomen bij PD1. Daarom lijkt PD meerdere ziektemechanismen te omvatten die met elkaar kunnen interageren en elkaar kunnen verergeren. Een nuttige manier om dit mechanistische samenspel te onderzoeken, is het creëren van een uitgebreide fenotypische vingerafdruk of profiel van dopaminerge (mDA) neuronen in de middenhersenen.
Fenotypische profilering is een benadering waarbij een profiel van een steekproef wordt gemaakt op basis van een verzameling meetbare kenmerken, en ten tweede worden voorspellingen gedaan over een steekproef op basis van dit profiel 2,3. Het doel van profilering is om een breed scala aan kenmerken vast te leggen, waarvan sommige mogelijk niet eerder in verband zijn gebracht met een ziekte of behandeling3. Hierdoor kan profilering onverwachte biologische processen aan het licht brengen. Fenotypische profilering is meestal gebaseerd op fluorescerend gekleurde cellen, en gestandaardiseerde assays, zoals Cell Painting, zijn ontwikkeld om fenotypische profielen te creëren4. Recentelijk is fenotypische profilering bijvoorbeeld toegepast voor de karakterisering van kleine moleculen of de nauwkeurige voorspelling van PD-subtypes uitsluitend op basis van van patiënten afgeleide fibroblasten 5,6. Ondanks deze vooruitgang is fenotypische profilering zelden toegepast op postmitotisch gedifferentieerde cellen, zoals van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide mDA-neuronen die PD-gekoppelde mutaties tot expressie brengen, zoals LRRK2 G2019S. Belangrijke uitdagingen van iPSC-afgeleide modellen zijn onder meer de aanwezigheid van subtiele of variabele pathologische kenmerken in differentiatiebatches of genotypen, en het feit dat geïsoleerde PD-fenotypes niet de volledige complexiteit van de ziekte weergeven. Bovendien, hoewel iPSC-neuronale modellen fysiologisch relevant zijn, worden ze zelden gebruikt in PD-onderzoeksprocessen vanwege zorgen over technische complexiteit 7,8.
We hebben eerder een robuuste methodologie ontwikkeld om meerdere PD-gerelateerde pathofysiologische fenotypes te meten in menselijke mDA-neuronen die zowel gevoelig zijn voor genetische als door chemische verbindingen geïnduceerde fenotypische veranderingen. Dit artikel beschrijft in detail een verder geoptimaliseerde versie van deze methodologie om fenotypische profielen te maken van mDA-neuronen (Figuur 1). Dit protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van de eerder beschreven fenotypische profileringsbenaderingen, zoals het gebruik van hoogwaardige mDA-neuronen en technische reproduceerbaarheid. Voor het eerst maakt dit protocol fenotypische profilering mogelijk in fysiologisch relevante post-mitotische mDA-neuronen na chemische verstoringen op een zeer schaalbare manier. Volledig gedifferentieerde en gecryopreserveerde mDA-neuronen zijn in de handel verkrijgbaar, waardoor de differentiatievariabiliteit van batch tot batch aanzienlijk wordt verminderd. Ten tweede kan de technische variabiliteit verder worden verminderd door gebruik te maken van een goed gedefinieerd experimenteel ontwerp (d.w.z. kweekduur of het vermijden van randputten), geautomatiseerde vloeistofbehandeling en geautomatiseerde microscopie. Daarnaast worden hier de eerste stappen van fenotypische profielanalyse met behulp van unsupervised clustering of supervised classificatiebenaderingen beschreven, waarbij wordt aangegeven hoe fenotypische profileringsgegevens kunnen worden geanalyseerd. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in fenotypische veranderingen van mDA-neuronen geïnduceerd door genetische of chemische verstoringen, met name wanneer een zeer schaalbare onderzoeksopzet vereist is, bijvoorbeeld tijdens screeningcampagnes of wanneer de effecten van een kleiner aantal verbindingen moeten worden bestudeerd, bijvoorbeeld om toxische effecten te bepalen. Samenvattend wordt verwacht dat de toepassing van fenotypische profilering van menselijke neuronen een waardevolle techniek is om complexe ziektegerelateerde fenotypes te bestuderen en de cellulaire effecten van kandidaat-geneesmiddelen te karakteriseren.
Figuur 1: Schematische weergave van het experimentele protocol voor het genereren van op afbeeldingen gebaseerde fenotypische profielen van menselijke iPSC-afgeleide mDA-neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van medium en platen voor het zaaien van neuronen (dag 1)
- Om de platen voor te bereiden op het zaaien van neuronen op dag 1, verwarmt u laminine vlak voor gebruik tot kamertemperatuur (RT). Bereid de laminineoplossing voor door de laminine-stockoplossing (0,1 mg/ml) 1/10 te verdunnen in koud PBS+/+ (met Ca 2+ en Mg2+).
OPMERKING: Alle reagentia staan vermeld in de materiaaltabel. De samenstelling van oplossingen en buffers wordt beschreven in de tabellen 1 tot en met 4. - Voeg vervolgens 25 μL van de laminineoplossing toe aan elk putje van een Poly-D-Lysine (PDL) voorgecoate plaat met 384 putjes en incubeer een nacht bij 4 °C. De gecoate platen kunnen maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
OPMERKING: Het protocol kan hier maximaal een week worden gepauzeerd. Sluit de platen af met plastic folie. - Bereid Complete Maintenance Media voor en bewaar ze maximaal een maand bij 4 °C (tabel 1).
2. Ontdooien van neuronen (dag 0)
- Om de neuronen op dag 0 te ontdooien, verwarmt u een waterbad voor tot 37 °C en brengt u de Complete Maintenance Media in evenwicht met RT, beschermd tegen licht.
- Haal de injectieflacon met de in de handel verkregen bevroren neuronen (zie Materiaaltabel) uit de tank met vloeibare stikstof en plaats deze op droogijs. Plaats de injectieflacon vervolgens 2 minuten in het waterbad. Zodra de vloeistof volledig is ontdooid, desinfecteert u de injectieflacon met 70% ethanol.
- Zuig de ontdooide neuronen op met een P1000-pipet (ongeveer 370 μL) en breng ze over in een centrifugebuis van 50 ml zonder op en neer pipetteren. Spoel vervolgens de injectieflacon met 630 μL Complete Maintenance Medium, doseer druppel voor druppel (hoek van 45°) in de tube van 50 ml. Schud langzaam tijdens het doseren.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om het medium langzaam, druppel voor druppel, af te geven om osmotische breuk van de cellen te voorkomen. Een hoek van 45° en lichte agitatie minimaliseren de hoge lokale osmotische druk tijdens het pipetteren. - Voeg op dezelfde manier 1 ml Complete Maintenance Medium toe aan de centrifugebuis van 50 ml met een P1000-pipet. Voeg vervolgens langzaam 2 ml Compleet Onderhoudsmedium toe. Voorzichtig roeren tijdens het doseren.
- Tel de cellen. Maak een microbuisje met 10 μL Trypan Blue en 10 μL celsuspensie en voeg toe aan een telkamerglaasje (10 μL). Voer tellingen uit met behulp van een geautomatiseerde cellenteller (zie Materiaaltabel) of handmatig.
- Centrifugeer na het tellen de buis van 50 ml met de neuronen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met een P1000-pipet en 1 ml Compleet Onderhoudsmedium. Voeg vervolgens het benodigde volume toe om de gewenste concentratie te bereiken (300.000 cellen/ml, zie ook volgende stap).
3. Zaaien van neuronen op voorbereide platen (dag 0)
- Om neuronen op dag 0 op de voorbereide platen te zaaien, haalt u de gecoate platen uit de koelkast, plaatst u ze onder de kap van de celkweek en laat u ze ongeveer 30 minuten in evenwicht zijn met RT.
- Vlak voor het zaaien 15 μL coatingoplossing opzuigen met een geautomatiseerde vloeistofverwerker of een 16-kanaals pipet. Laat ongeveer 10 μL per putje over om beschadiging van de coating te voorkomen.
- Doseer vervolgens 50 μL van de celoplossing met 300.000 cellen/ml (bereid in stap 2.6) per putje met een 16-kanaals pipet, wat resulteert in 15.000 gezaaide neuronen per putje en een uiteindelijk volume per putje van 60 μL.
- Vermijd in een plaat met 384 putjes het gebruik van kolommen 1, 2, 23, 24 en rijen A, B, O en P om mogelijke randeffecten te minimaliseren die van invloed kunnen zijn op de fenotypische profielen. Vul de ongebruikte lege putjes met 80 μL PBS. Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO2 .
4. Gemiddelde verandering of samengestelde behandeling (dag 3)
- Afhankelijk van het aantal putjes een geschikte hoeveelheid Complete Maintenance Medium voorverwarmen bij RT. Beschermen tegen licht.
- Als een mediumwissel nodig is, gaat u verder met stap 4.4. Als een samengestelde behandeling gewenst is, controleer dan de concentratie van de samengestelde voorraad en het gebruikte oplosmiddel (water, DMSO, methanol, enz.).
- Bereid een 1,5x geconcentreerde samengestelde oplossing voor alle gewenste concentraties die moeten worden getest. Bereid de samengestelde verdunningen voor met behulp van Complete Maintenance Medium.
OPMERKING: Gebruik als neutrale controle het betreffende oplosmiddel in dezelfde concentratie als de geteste verbinding. Als meerdere of onbekende verbindingen in verschillende concentraties worden gebruikt, is het raadzaam om een afzonderlijk dosis-responsexperiment uit te voeren om de effecten van oplosmiddelen op het fenotypische profiel te meten. - Als een automatisch pipetteersysteem wordt gebruikt, voeg dan 60 μl van de 1,5x samengestelde oplossing toe aan een bewaarplaat met 384 putjes. U kunt ook een 16-kanaals pipet gebruiken. Als een mediumwissel nodig is, voeg dan 60 μL Compleet Onderhoudsmedium toe.
- Gebruik het automatische pipetteersysteem om 40 μL medium per putje uit de neuronbevattende plaat te zuigen en weg te gooien om 20 μL/putje te behouden. Voeg vervolgens 40 μL/putje 1,5x samengestelde oplossing uit de 384-wells bewaarplaat toe aan elk putje om de gewenste eindconcentratie te verkrijgen.
NOTITIE: Het is van cruciaal belang om geen volledige mediumwisselingen uit te voeren, maar om altijd restmedium in de put te laten om schade aan het neuronale tapijt of de coating te voorkomen. - Als neuronale kweek langer dan de 6 dagen wordt uitgevoerd die in dit protocol worden beschreven, verander dan het medium elke 2-3 dagen.
5. Neuronfixatie en kleuring (dag 6 tot 7)
- Om de neuronen op dag 6 en 7 te fixeren en te kleuren, maakt u gebruik van een geautomatiseerde vloeistofverwerker voor alle doseer- en wasstappen. U kunt ook een 16-kanaals pipet gebruiken.
- Bereid een 10% Triton X-100 oplossing door Triton X-100 te verdunnen in 1x PBS. Draai totdat de oplossing homogeen is. Bewaren bij 4 °C.
- Om de neuronen te fixeren, doseert u 20 μL/putje 16% PFA, wat resulteert in een eindconcentratie van 4%. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT en was hem drie keer met 1x PBS. Laat 20 μL/putje PBS over na de laatste wasbeurt.
LET OP: PFA wordt erkend als een gevaarlijke stof waarvan bekend is dat deze orale, dermale en respiratoire toxiciteit veroorzaakt. Het vormt ook een bedreiging voor de ogen en kan leiden tot genetische mutaties en kanker. Een juiste omgang met PFA vereist het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals oog- en gelaatsbescherming, naast het zorgen voor een goede ventilatie. Het is belangrijk om het vrijkomen van PFA in het milieu te voorkomen. - Voor permeabilisatie en blokkering bereidt u een 2x blokkerende oplossing (tabel 2).
- Voeg 20 μL/putje 2x blokkeringsoplossing (1x eindconcentratie) toe, incubeer gedurende 1 uur bij RT en was eenmaal met PBS. Bewaar 20 μL/putje PBS na het wassen.
- Voor primaire antilichaamkleuring (zie Materiaaltabel) bereidt u een 2x primaire kleuringsbuffer voor (tabel 3).
- Voeg 20 μL/putje 2x primaire kleuringsbuffer (1x eindconcentratie) toe en incubeer een nacht bij 4 °C. De volgende ochtend op dag 7 drie keer wassen met PBS. Laat na het wassen 20 μL/putje PBS staan.
- Voor secundaire antilichaamkleuring (zie Materiaaltabel) bereidt u een 2x secundaire kleuringsbuffer voor (tabel 4).
- Voeg 20 μL/putje 2x secundaire kleuringsbuffer toe (1x eindconcentratie), incubeer gedurende 2 uur bij RT uit de buurt van licht en was driemaal met PBS. Laat 100 μL PBS/welle staan na de laatste wasbeurt.
- Voeg aluminium afdichting toe aan de plaat om verdamping te minimaliseren. U kunt de plaat ook afdekken met plastic folie en aluminiumfolie. Ga verder met beeldacquisitie of bewaar de plaat bij 4 °C.
OPMERKING: Het protocol kan hier maximaal een week worden gepauzeerd. Als achtergrondfluorescentie wordt waargenomen, overweeg dan om de blokkeertijd te verlengen. Als de kleuring onvoldoende is, probeer dan de primaire antilichaamconcentratie of incubatietijd te verhogen.
- Voeg aluminium afdichting toe aan de plaat om verdamping te minimaliseren. U kunt de plaat ook afdekken met plastic folie en aluminiumfolie. Ga verder met beeldacquisitie of bewaar de plaat bij 4 °C.
6. Beeldvorming van fluorescerend gekleurde neuronen (dag 7)
- Maak afbeeldingen van de vergulde, gekweekte en gekleurde neuronen op dag 7. Gebruik bij voorkeur een geautomatiseerde confocale fluorescentiemicroscoop (zie Tabel met materialen). U kunt ook handmatig afbeeldingen verkrijgen.
- Verwerf de Hoechst-, TH-, α-synucleïne- en MAP2-kanalen met behulp van respectievelijk 405 nm, 488 nm, 561 nm en 647 nm lasers (Afbeelding 2).
OPMERKING: Om voldoende gedetailleerde gegevens voor fenotypische profilering te genereren, gebruikt u een 40x-objectief en verkrijgt u 16 velden/put met behulp van Z-stacks bestaande uit 3 Z-segmenten gescheiden door 2 μm. In het geval dat er pipetteergerelateerde schade is in het neuronale tapijt, probeer dan te voorkomen dat u deze gebieden in beeld brengt. - Pas afhankelijk van de microscoop en camera de belichtingstijden en excitatie-intensiteiten voor elk van de vier fluorescentiekanalen afzonderlijk aan om een optimaal dynamisch bereik van de fluorescerende intensiteiten te verkrijgen.
OPMERKING: Beeldvormingssoftware biedt vaak een histogram om de ideale belichtingstijd te bepalen. Als het histogram te veel naar links is verschoven in het lage signaalbereik, is de belichtingstijd te kort of is de excitatie-intensiteit te laag. Als er een scherpe klif is op het maximale signaalniveau aan de rechterkant, dan is de signaalwaarde verzadigd. Verminder in dit geval de excitatie-intensiteit of verkort de belichtingstijd. - Sla afbeeldingen op in een verliesvrij en open formaat, zoals .tif.
7. Beeldverwerking (dag 8)
- Beeldsegmentatie en extractie van fenotypische kenmerken zijn vereist voor het maken van kwantitatieve fenotypische profielen. Gebruik de PhenoLink-software voor beeldsegmentatie en functie-extractie (Tabel met materialen). Instructies voor het installeren van PhenoLink zijn te vinden in de GitHub-repository (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
OPMERKING: Beeldsegmentatie wordt gebruikt om verschillende objecten of regio's in een afbeelding te identificeren en te scheiden, terwijl fenotypische kenmerkextractie wordt gebruikt om relevante informatie uit die regio's te analyseren en te extraheren. Er zijn verschillende alternatieve softwareoplossingen beschikbaar, zoals CellProfiler10, ImageJ/FIJI11, Napari 12 of het Knime Analytics Platform13 om kwantitatieve informatie te extraheren uit meerkanaals fluorescentiebeelden. - Voer beeldsegmentatie uit op voor belichting gecorrigeerde RAW-afbeeldingen. Bepaal de respectievelijke intensiteitsdrempels voor fluorescentiekanalen empirisch per plaat, zodat het achtergrondsignaal minimaal is en het gewenste gesegmenteerde signaal overeenkomt met het signaal in het onbewerkte beeld. Platen die op dezelfde dag worden verwerkt en gekleurd, vereisen doorgaans vergelijkbare kanaalintensiteitsdrempels voor segmentatie.
- Definieer de grootte en intensiteit van de kern om levende van dode cellen te scheiden. Als u 40x-afbeeldingen gebruikt, behoudt u alle andere standaardparameters en voert u de software uit. Per put zullen honderdzesentwintig kwantitatieve beeldkenmerken worden berekend (aanvullende tabel 1).
- Gebruik de resulterende kwantitatieve gegevens in tabelvorm om fenotypische profielen te construeren en fenotypische profielen van verschillende cellijnen of behandelingscondities te vergelijken. Elke rij komt overeen met een biologische toestand (put) en elke kolom komt overeen met een bepaald fenotypisch kenmerk.
OPMERKING: We bieden een voorbeeld van een uitvoerbestand samen met de data-analysepijplijn om het gebruik ervan te illustreren (zie Materiaaltabel). Daarnaast toont figuur 3 de samenstelling van een fenotypisch profiel.
8. Fenotypische profielgeneratie en visualisatie (dag 8)
- Als u Python en Jupyter niet op uw computer hebt geïnstalleerd, installeert u de Anaconda-distributie en opent u de Jupyter-software. Download het meegeleverde Jupyter-notebook en alle andere meegeleverde bestanden en sla ze op in dezelfde map (zie Materiaaltabel). Open het Jupyter-notebookbestand met behulp van de Jupyter-software.
OPMERKING: Anaconda is een gratis en open-source platform voor programmeertalen zoals Python. Dit platform wordt geleverd met de Python-interpreter Jupyter die het meegeleverde Jupyter-notebook kan uitvoeren om fenotypische profielen (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling) te maken en te analyseren. - Voer het Jupyter-notebook cel voor cel uit met behulp van de Jupyter-software. De opgegeven voorbeeldgegevens .fth en vereisten .txt bestanden moeten zich in dezelfde map bevinden als het Jupyter-notebook. Elke Jupyter-notebookcel is geannoteerd om de functionaliteit ervan uit te leggen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om het Jupyter-notebook in de juiste volgorde te gebruiken, te beginnen met het laden en schalen van gegevens en om cel voor cel naar het einde te gaan. Alle gegevens en grafische uitvoer worden opgeslagen in een nieuw gemaakte map in de bronmap van het Jupyter-notebook. Figuur 4 geeft de workflow en de output van de workflow weer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fenotypische profilering in mDA-neuronen is een efficiënte manier om meerdere aspecten van cellulaire biologie en hun veranderingen tijdens de experimentele modulatie te kwantificeren. Om deze methodologie te illustreren, maakte deze studie gebruik van gecryopreserveerde LRRK2 G2019S en gezonde donor mDA-neuronen. Deze neuronen zijn ongeveer 37 dagen gedifferentieerd, zijn postmitotische en tot expressie gebrachte neuronale markers (TUBB3 en MAP2) en dopaminerge neuronenmarkers, waaronder tyrosinehydroxylase (TH) in combinatie met FOXA2, terwijl de gliamarker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) afwezig is14. Volgens het beschreven protocol werden beide cellijnen gedurende 6 dagen gekweekt en behandeld met 0,1 μM PFE-360, een LRRK2-kinaseremmer. De neuronen werden gekleurd met behulp van de nucleaire kleuring Hoechst en antilichamen tegen α-synucleïne, TH en MAP2 (Figuur 2).
Vervolgens werden afbeeldingen gesegmenteerd en werden fenotypische kenmerken geëxtraheerd. We hebben 126 kwantitatieve kenmerken bepaald die kunnen worden geaggregeerd tot goed onderbouwde fenotypische profielen (Figuur 3A,B). Elke functie en de waarde ervan volgens de experimentele voorwaarde is toegankelijk. Sommige kenmerken vertoonden veranderingen bij de behandeling van het middel. De fluorescentie-intensiteit van α-synucleïne in TH-positieve cellen nam bijvoorbeeld af na behandeling met PFE-360 (Figuur 3C, linkerpaneel). Andere kenmerken vertoonden alleen verschillen tussen de geteste cellijnen, maar niet bij samengestelde behandeling. Dit was bijvoorbeeld het geval voor de lengte van het MAP2-neurietnetwerk of de verhouding tussen TH-positieve neuronen (Figuur 3C, midden- en rechterpaneel). Het is essentieel om het volledige fenotypische profiel in overweging te nemen om de fenotypische variaties in verschillende cellijnen of samengestelde behandelingen op een minder selectieve en uitgebreide manier te analyseren.
Tijdens de beeldanalysestap worden altijd alle 126 kenmerken berekend. Evenzo worden tijdens gegevensanalyse alle kenmerken in overweging genomen, maar het machine learning-algoritme kent gewichten toe aan individuele kenmerken om de biologische klassen te scheiden. De workflow voor gegevensanalyse begint met het laden van gegevens en het schalen van functies (Figuur 4A). Schalen is belangrijk voor machine learning omdat het helpt bij het normaliseren van de gegevens en ervoor zorgt dat elke functie op een vergelijkbare schaal is. Dit kan helpen de prestaties van machine learning-algoritmen te verbeteren door ze minder gevoelig te maken voor de schaal van de invoerfuncties. Bovendien kan schaalvergroting de interpreteerbaarheid van machine learning-modellen helpen verbeteren door het gemakkelijker te maken om het relatieve belang van verschillende functies te vergelijken. In de volgende stap wordt een clusteranalyse uitgevoerd (Figuur 4B). Clustering kan nuttig zijn voor het verkennen van de structuur van hoogdimensionale datasets en het identificeren van patronen in de gegevens die mogelijk niet meteen duidelijk zijn als je naar individuele kenmerken kijkt. Hiërarchische clustering op basis van de cosinusafstand tussen goed gebaseerde fenotypische profielen liet sterke verschillen zien tussen cellijnen, maar minder voor medicamenteuze behandeling. Gegevens van met PFE-360 behandelde putjes geclusterd binnen de met DMSO behandelde controlegroep, wat wijst op geen sterke verschillen met behulp van deze vergelijkingsmetriek. Naast clustering zijn benaderingen voor dimensiereductie ook nuttige hulpmiddelen om de overeenkomsten en verschillen van multidimensionale fenotypische profileringsgegevens te visualiseren. Hier hebben we gebruik gemaakt van Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP)15 (Figuur 4C). Net als bij de vorige op cosinusafstand gebaseerde benadering, vertoonde PaCMAP voornamelijk verschillen tussen de twee cellijnen en in mindere mate tussen PFE-360 of DMSO-controle behandelde putjes. Zowel cosinusafstandsclustering als PaCMAP zijn niet-gesuperviseerde methoden en het is onwaarschijnlijk dat ze kleine verschillen oppikken die alleen aanwezig zijn in geselecteerde fenotypische kenmerken, bijvoorbeeld omdat een verbinding slechts een paar fenotypes verandert (d.w.z. alleen neurietgerelateerde kenmerken). Om deze beperking van fenotypische profielanalyse aan te pakken, hebben we machine learning-gestuurde gesuperviseerde classificatie uitgevoerd. In het bijzonder hebben we de Light gradient-boosting machine (LightGBM) (Figuur 4D). LightGBM is een gesuperviseerd machine learning-algoritme dat beslissingsboomalgoritmen gebruikt om een model te maken dat kan worden gebruikt voor rangschikking of classificatie16. LightGBM is ontworpen om sneller en efficiënter te zijn dan traditionele, op bomen gebaseerde algoritmen zoals het Random forest-algoritme. Het algoritme werd getraind met fenotypische profielgegevens van één plaat en testte het getrainde model op gegevens van een tweede onafhankelijke plaat. Het LightGBM-model had een totale nauwkeurigheid van 85% en voorspelde correct de experimentele categorie (cellijn of verbinding) van de meeste putten. De nauwkeurigheid voor cellijnvoorspelling was hoger dan voor samengestelde voorspelling, maar ook 60% van de met verbindingen behandelde putten werd correct voorspeld, wat superieur is aan klassieke methoden zonder toezicht. LightGBM geeft toegang tot het belang van de respectieve fenotypische kenmerken voor de classificatie van de vier klassen (Figuur 4D). Belangrijke fenotypische kenmerken die de cellijnen en medicamenteuze behandelingen onderscheiden, zijn bijvoorbeeld gerelateerd aan het celoppervlak of de cellulaire intensiteiten van de MAP2- en TH-kleuringen. Het oppervlak van het TH- en α-synucleïne dubbel-positieve cytoplasma was het belangrijkste kenmerk dat cellijnen en samengestelde behandelingen onderscheidde, gevolgd door de verhouding dode cellen. We leveren een Jupyter-notebook die gegevensplotten en alle niet-gesuperviseerde en gesuperviseerde analysemethoden uitvoert die hier worden beschreven (zie Tabel met materialen). De verkregen resultaten illustreren het potentieel van fenotypische profilering om cellijnen en samengestelde behandelingseffecten in menselijke mDA-neuronen te onderscheiden.
Figuur 2: Immunokleuring van humane iPSC-afgeleide mDA-neuronen. Representatieve beelden van alle verkregen fluorescentiekanalen worden getoond. Gezonde donor of LRRK2 G2019S mutatiedragende mDA-neuronen werden behandeld met DMSO of met 0,1 μM van de LRRK2-kinaseremmer PFE-360. De behandeling werd uitgevoerd op dag 3 en de cellen werden gefixeerd op dag 6 zoals beschreven in het protocol. Schaalbalken: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Creatie van een fenotypisch profiel op basis van individuele fenotypische kenmerken. (A) Geselecteerde fenotypische kenmerken die uit de afzonderlijke fluorescentiekanalen kunnen worden geëxtraheerd, worden getoond. (B) Fenotypische kenmerken kunnen worden samengevoegd tot een fenotypisch profiel. Meerdere fenotypische profielen kunnen worden gegenereerd onder verschillende experimentele omstandigheden die aanwezig zijn op de plaat met 384 putjes. (C) Voorbeelden van fenotypische kenmerken en de bijbehorende waarden per experimentele conditie. Elk datapunt komt overeen met een meting uit één put. Welch's ongelijke varianties t-toets werd gebruikt voor significantietesten. Statistische significantie wordt weergegeven als * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 en niet significant (ns = p > 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: fenotypische profielen van mDA-neuronen bevatten kwantitatieve informatie en kunnen worden gebruikt om fenotypes te classificeren . (A) Schematisch overzicht van de workflow voor gegevensanalyse. (B) Geaggregeerde fenotypische profielen van controle- en medicamenteuze mDA-neuronen. (C) Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP) niet-gesuperviseerde dimensiereductie van fenotypische profielgegevens. (D) Light gradient-boosting machine (LightGBM) gecontroleerde classificatie van fenotypische profielgegevens. Het classificatie-algoritme werd getraind op fenotypische profielgegevens van één plaat en werd toegepast om experimentele klassen in een tweede plaat te voorspellen. Linkerdeelvenster: De verwarringsmatrix toont de relatie tussen de vier echte gegevensklassen en de vier voorspelde klassen door het model. Over het algemeen voorspelt het model de gegevensklasse in 85% van de gevallen correct. Rechterpaneel: De 10 belangrijkste fenotypische kenmerken voor de LightGBM-classifier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagentia | Voor 100 ml |
| iCell Basisstation Medium 1 | 100 ml |
| iCell Neuraal Supplement B | 2 ml |
| iCell Zenuwstelsel Supplement | 1 ml |
Tabel 1: Samenstelling van complete onderhoudsmedia.
| Reagens | 2x oplossing | Definitieve concentratie | Voor 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 78 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS-voorraadoplossing | 20% | 10% | 20 ml |
Tabel 2: Samenstelling van 2x blokkerende oplossing.
| Reagens | 2x concentratie | Definitieve concentratie | Voor 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 87,36 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS-voorraadoplossing | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-TH | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-α-synucleïne | 1/250 | 1/500 | 0,4 ml |
| Anti-MAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0,04 ml |
Tabel 3: Samenstelling van de primaire kleuringsbuffer.
| Reagens | 2x concentratie | Definitieve concentratie | Voor 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 86,7 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS-voorraadoplossing | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-muis A488 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-konijn A555 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-kip A647 | 1/125 | 1/250 | 0,8 ml |
| Hoechst | 1/1000 | 1/2000 | 0,1 ml |
Tabel 4: Samenstelling van 2x secundaire kleuringsbuffer.
Aanvullende tabel 1: Overzicht van alle geëxtraheerde fenotypische kenmerken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fenotypische profilering is een techniek om een groot aantal fenotypes in cellen te meten door fluorescerende kleuringen, microscopie en beeldanalyse toe te passen. Fenotypische profielen kunnen worden verkregen en vergeleken tussen cellijnen of andere experimentele omstandigheden om complexe veranderingen in de celbiologie te begrijpen die onopgemerkt kunnen blijven bij het gebruik van een enkele uitlezing. Hier beschrijven we de toepassing van fenotypische profilering op menselijke iPSC-afgeleide mDA-neuronen, een celtype dat vaak wordt gebruikt om PD-cellulaire biologie te modelleren17,18,19. Fenotypische profilering in mDA-neuronen heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder gebruikte profileringsbenaderingen die generieke fluorescerende kleuringen4, niet-neuronale celtypen5,6 of niet schaalbaar zijn 7,8. De hier gepresenteerde methode maakt fenotypische profilering mogelijk in fysiologisch relevante postmitotische mDA-neuronen. Ten tweede vermindert het gebruik van iPSC-afgeleide gecryopreserveerde mDA-neuronen de differentiatievariabiliteit van batch tot batch aanzienlijk. Ten derde, door gebruik te maken van een goed gedefinieerd experimenteel ontwerp, geautomatiseerde vloeistofbehandeling en geautomatiseerde microscopie, kan de technische variabiliteit verder worden verminderd en wordt het protocol zeer schaalbaar en opent het de mogelijkheid om mDA-neuronen te gebruiken voor fenotypische screeningcampagnes. Ten slotte geeft gesuperviseerde classificatie gebruikers de mogelijkheid om de belangrijkste kenmerken van fenotypische profielen te groeperen en te begrijpen en kan daarom helpen om nieuwe biologie te ontdekken.
Fenotypische profilering maakt het mogelijk om individuele kenmerken te verkennen om follow-uphypothesen te ontwikkelen die leiden tot mechanistische vervolgstudies. We toonden bijvoorbeeld aan dat LRRK2 G2019S mDA-neuronen verschillen van controle-mDA-neuronen op basis van hun α-synucleïnegehalte, MAP2-neurietlengte en de verhouding van TH-positieve cellen (Figuur 3C). Samengestelde behandeling met de LRRK2-kinaseremmer PFE-360 verandert echter alleen het gehalte aan α-synucleïne en heeft geen effect op de lengte van MAP2-neurieten of de verhouding van TH-positieve cellen. Een gewenste chemische verbinding zou een ensemble van fenotypes moeten redden. Een fenotypisch profiel bevat de vereiste informatie en kan worden verkend met behulp van clustering- of dimensionaliteitsreductietechnieken, die kunnen helpen bij het visualiseren van complexe functie-interacties in 2-dimensionale plots. Cosinusclustering op basis van afstand maakt de nauwkeurige scheiding van beide cellijnen mogelijk (Figuur 4B). Dimensiereductie met behulp van PaCMAP illustreert verder hoe beide cellijnen verschillende clusters vormen, en dat PFE-360-behandeling leidt tot onderscheidbare, maar nog steeds vergelijkbare algemene fenotypes, waarschijnlijk vanwege de impact op slechts enkele gemeten kenmerken zoals α-synucleïnegehalte (Figuur 4C). Supervised machine learning kan daarentegen helpen bij het voorspellen van interessante profielen op basis van hun kenmerken. Het LightGBM-model dat op de gegevens was getraind, voorspelde nauwkeurig de gezonde donor en LRRK2-gemuteerde mDA-neuronen in de testgegevens. De identificatie van met PFE-360 behandelde neuronen was minder nauwkeurig, vermoedelijk omdat de effecten van chemische verbindingen op fenotypes zwakker zijn dan de genetische effecten (Figuur 4C). Het oppervlak van TH en α-synucleïne dubbelpositief cytoplasma was het belangrijkste kenmerk dat cellijnen en samengestelde behandelingen onderscheidde, gevolgd door de verhouding dode cellen. Verschillende andere topkenmerken hadden betrekking op het cellulaire oppervlak. Daarom lijkt celgrootte een algemeen onderscheidend kenmerk te zijn tussen gezonde controle- en LRRK2-gemuteerde mDA-neuronen (Figuur 4D). Deze aanpak laat dus zien hoe machine learning de meest bepalende fenotypische kenmerken in een complexe dataset kan identificeren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om nieuwe hypothesen te ontwikkelen en die hypothesen te testen in secundaire assays.
CellPainting is een populaire benadering geworden om fenotypische profielen te maken en maakt gebruik van een gestandaardiseerde set fluorescentiesondes en een gedefinieerd protocol 3,4,20,21,22,23. Hier werd besloten om een meer mDA-neuronspecifiek kleuringspaneel te gebruiken, bestaande uit de Hoechst-kernkleuring en antilichamen tegen α-synucleïne, TH en MAP2. Andere fluorescerende kleuringen met behulp van een lysosoom-geassocieerd LAMP1-antilichaam of mitochondriën-gerichte kleurstoffen TMRM of MitoTracker zijn in het verleden door ons aangebracht en richten zich op meer specifieke aspecten van PD cellulaire biologie9. Standaard lichtmicroscopie is beperkt in die zin dat slechts vier fluorescerende golflengten kunnen worden opgelost. Het toevoegen van lysosomale of mitochondriale kleuringen aan het huidige kleurpaneel is daarom niet gemakkelijk mogelijk. Afhankelijk van de biologische vraag kunnen kleuringen worden uitgewisseld. Als alternatief kunnen twee biologische structuren worden gekleurd met dezelfde golflengte op voorwaarde dat hun morfologie te onderscheiden is en dat ze gelokaliseerd zijn in verschillende celcompartimenten.
Om de screeningscompatibiliteit van het protocol te vergroten, is het ontworpen om een minimum aantal pipetteerstappen en een korte kweekduur te vereisen. Cruciaal voor de methode zijn alle stappen voor het omgaan met vloeistoffen, omdat ze de coating kunnen beïnvloeden of kunnen leiden tot het loslaten van neuronen. Zoals aangegeven in het protocol is het aan te raden om altijd een resthoeveelheid medium in de put achter te laten. Het is ook van cruciaal belang om voorzichtig om te gaan met de mDA-neuronen, aangezien ze een zeer kwetsbaar celtype zijn. Voer het ontdooien precies uit zoals aangegeven om overmatige celdood als gevolg van osmotische breuk van het celmembraan te voorkomen. De zaaidichtheid werd geoptimaliseerd om voldoende gegevens per put te genereren en tegelijkertijd overmatige overlappende structuren, zoals neurieten of kernen, in de beelden te voorkomen. Fenotypische profielen zijn zeer gevoelig voor positie-effecten in de plaat 2,4,23. Zoals aangegeven in het protocol, gebruik geen randputten. Bovendien wordt het gebruik van ten minste vijf technische replicaten per experimentele conditie aanbevolen bij het plannen van een experiment. In het ideale geval verdeel je de replicaten willekeurig over de plaat.
Zoals bij elke methode heeft neuronale fenotypische profilering beperkingen. Fenotypische profileringsdatasets kunnen erg groot zijn, vooral wanneer ze worden berekend voor afzonderlijke cellen. Hoewel het hebben van meer fenotypische kenmerken voordelig kan zijn, zoals het onthullen van een voorheen onbekend mechanisme of het waarborgen van de stabiliteit van het testsysteem, kan het ook ongewenste ruis introduceren en moeilijker te interpreteren zijn dan zorgvuldig geselecteerde individuele kenmerken. Modeloverfitting of onechte correlaties zijn bijvoorbeeld uitdagingen die vaker voorkomen in grote datasets 4,24. Fenotypische profilering is daarom niet bedoeld om hypothese-gedreven experimenteel ontwerp te vervangen, maar eerder om als startpunt te dienen voor nieuwe hypothesen die vervolgens kunnen worden getest. PD is een neurodegeneratieve ziekte en manifesteert zich vaak pas laat in het leven. Het bestuderen van PD-gerelateerde ziektebiologie in iPSC-afgeleide neuronen kan daarom een beperking zijn, vooral wanneer de focus ligt op klassieke kenmerken van PD in een laat stadium, zoals α-synucleïne-aggregatie 17,25,26. Integendeel, vanwege het relatief late begin van PD wordt de presymptomatische fase als lang geschat. Significante pathologieën kunnen daarom al op cellulaire basis worden gedetecteerd in iPSC mDA-neuronale modellen, terwijl de hersenen op systemisch niveau in staat zijn om neuronaal en functioneel verlies gedurende vele jaren te compenseren27,28.
In de toekomst kan dit protocol worden aangepast aan andere iPSC-afgeleide neurontypen, zoals corticale of motorneuronen, door mDA-neuronrelevante kleuringen te vervangen door kleuringen die zich richten op bijvoorbeeld synaptische biologie of intracellulaire aggregaten. Corticale neuronen kunnen bijvoorbeeld worden gekarakteriseerd met behulp van panneurietkleuring tegen β-tubuline III en pre- en postsynaptische eiwitten zoals Synapsin1 en Homerus, waarvoor hoogwaardige antilichamen zijn beschreven29. Motorneuronen kunnen worden gefenotypeerd met behulp van antilichamen tegen choline-acetyltransferase (ChAT), TAR-DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) en RNA-korrelmarkers30. Samenvattend wordt verwacht dat het gepresenteerde protocol om neuronale fenotypische profielen te creëren nuttig zal zijn voor de onderzoeksgemeenschap om de effecten van chemische of genetische verstoringen op een breed scala aan neuronale fenotypes te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn in dienst van Ksilink.
Acknowledgments
De auteurs willen alle collega's bij Ksilink bedanken voor hun waardevolle hulp en discussies die hebben geleid tot het ontwerp van het gepresenteerde protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H.
- Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
- Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
- Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
- Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
- Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
- Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
- Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
- Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
- Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
- Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
- Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
- Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
- Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
- Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
- Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
- Wu, Y., Le, W., Jankovic, J.
- Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
- Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).
