Summary
Burada, hücre ölümü indüksiyonunu takiben aşılanmış yaprakları sürekli görüntüleyerek programlanmış hücre ölümü başlatma oranını incelemek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Aşırı duyarlı yanıt (HR) verilen direnç, N direnç genleri tarafından belirlenebilen etkili bir savunma yanıtıdır. HR, aşılanmış yapraklarda hücre ölüm bölgelerinin oluşumu olarak kendini gösterir. Burada, dijital bir mikroskop kullanarak hücre ölümü başlangıcı ile hücre ölümü görünümü arasındaki sürede aşılanmış yaprakları görüntüleyerek hücre ölümü başlatma oranını incelemek için bir protokol sunulmaktadır. Dijital mikroskop, geleneksel yöntemlerde saatler yerine tam olarak dakikalara kadar hücre ölümü başlama hızının doğru bir şekilde belirlenmesine olanak tanıyan, istenilen aralıklarla sürekli bir görüntüleme işlemi sağlar. Dijital mikroskopla görüntüleme de ışıktan bağımsızdır ve bu nedenle bitkinin sirkadiyen ritmini bozmadan gece ve gündüz kullanılabilir. Programlanmış hücre ölümü gelişimi ile sonuçlanan farklı patosistemler, küçük değişikliklerle bu protokol kullanılarak incelenebilir. Genel olarak, protokol böylece hücre ölümü başlatma oranının basit, doğru ve ucuz bir şekilde tanımlanmasına izin verir.
Introduction
Patates, dünyanın en çok yetiştirilen gıda ürünlerinden biridir ve pirinç, buğday ve mısırın ardından dördüncü sırada yer almaktadır. Bununla birlikte, patates üretimi, şu anda en önemli virüs patojeni 1,2 olarak kabul edilen patates virüsü Y'den (PVY) ciddi şekilde etkilenebilir. Patates bitkilerinde cv. Buna ek olarak, birkaç PVY suşu (PVY suşu N-Wilga dahil), patojenin enfeksiyon bölgesiyle olan kısıtlamasının aşılanmış yapraklarda nekrotik lezyonlar olarak ortaya çıktığı aşırı duyarlı yanıt (HR) ile verilen direnci tetikler3. Bu patosistemde, HR'ye sıcaklığa bağlı olan Ny-1 direnç geni aracılık eder, çünkü daha düşük sıcaklıklarda yetiştirilen bitkiler verimli bir şekilde nekrotik lezyonlar geliştirirken, yapısal olarak yüksek (28 °C) sıcaklıkta yetiştirilen bitkilerde, direncin düşüklüğü lezyon oluşumu ve sistemik virüs yayılımı eksikliği olarak gösterilmiştir 3,4. Bitkiler daha düşük bir sıcaklığa (22 °C) aktarıldığında, hücre ölümü başlatılır, bu da hücre ölümünün başlaması ile hücre ölümü görünümü arasındaki sürede aşılanmış yaprakları görüntüleyerek hücre ölümü başlama hızını takip etmek için kullanılabilir.
Bu protokol, dijital mikroskop kullanılarak hücre ölümü başlama hızının belirlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. Bitki 28 °C'den 22 °C'ye transfer edildikten sonra aşılanan yaprakların görüntülenmesiyle, dijital mikroskop yaprağın istenilen aralıklarla sürekli gözlemlenmesini sağlar. Diğer yöntemlerin kullanımından farklı olarak (örneğin, konfokal mikroskopi veya çıplak gözle lezyon oluşumunun gözlemlenmesi), bu, lezyon oluşumunun tam zamanının ve dolayısıyla hücre ölümü başlama hızının tam olarak dakikalara kadar belirlenmesine izin verir, yukarıda belirtilen yöntemlerdesaatlerin aksine 5,6. Dijital mikroskop kullanımı da ışıktan bağımsızdır ve bu nedenle gündüz ve gece kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda hücre ölümünün başlatılmasında yer alan bileşenleri tanımlamak veya kullanılan bitkiler transgenik ise ve ilgilenilen bileşenlerin seviyeleri değişmişse, farklı bileşenlerin hücre ölümü başlatma hızı üzerindeki etkilerini belirlemek için de kullanılabilir.
Protocol
NOT: Bölüm 1 ve 2, Lukan ve ark.7 tarafından özetlenen yöntemlere dayalı olarak bitki materyali hazırlama için değiştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Spesifik olarak, kontrollü çevre koşullarında ve aşı hazırlığında bazı değişiklikler yapılmıştır.
1. Büyüyen patates bitkileri
- Sağlıklı patates cv yetiştirin. Kök düğüm doku kültüründe rywal bitkileri8.
- 6-8 hafta sonra, steril cımbız ve neşter bıçağı kullanarak steril koşullar altında steril kağıt üzerinde patates bitkilerinden düğümler içeren on adet 1 cm uzunluğunda eksplant kesin.
- Bunları Murashige ve Skoog (MS30) ortamı ile plastik kutulara aktarın (Şekil 1A) ve kontrollü çevre koşulları altında büyütün (250 μE veya μmol/m2/s radyasyon ve 16 saatlik fotoperiyot ile ışıkta 22 °C ve karanlıkta 19 °C, %55 ± %5 bağıl nemde).
- Mikro çoğaltmadan 2 hafta sonra toprağa aktarın.
- Saksıları (r = 10 cm) toprakla doldurun. Bir tencerenin ortasındaki toprakta 3-4 cm derinliğinde bir çukur oluşturmak için parmağınızı kullanın, deliği suyla doldurun ve emmesini bekleyin.
- Yaprakları yüzeyin üzerinde bırakarak deliğe saksı başına bir bitki yerleştirin. Kökleri nazikçe toprakla örtün (Şekil 1B).
NOT: Bazı bitkilerde kök gelişmeyebilir. Bu bitkileri analizin dışında tutun.
- Bitkileri toprakta kontrollü çevre koşulları altında (ışıkta 22 °C ve karanlıkta 19 °C, %55 ± %5 bağıl nemde, 250 μmol/m2/s radyasyon ve 16 saatlik fotoperiyot ile) bir büyüme odasında büyütün.
- 3-4 hafta sonra bitkiler hazırdır. Aşılanmak için bu bitkileri kullanın.
NOT: Bitkiler, görünür yaprakçıklara sahip en az 3-4 tam gelişmiş yaprağa sahip olmalıdır (Şekil 1C). PVY'nin neden olduğu lezyonlarla karıştırılabilecek görünür semptomlar (sarı veya kahverengi yapraklar) olmadan sağlıklı görünmelidirler. Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, sirkadiyen ritmin bitki bağışıklık tepkisi ve lezyon oluşumuüzerindeki olası etkilerinden kaçınmak için tüm deneylerde bitkiler aynı anda (örneğin sabah 9'da) aşılanmalıdır 9,10,11.
2. Aşı hazırlama ve patates aşılama
- Bitkiyi PVY suşu N-Wilga (PVYN-Wi; erişim no. EF558545) aşağıda belirtildiği gibi aşılama.
NOT: Birden fazla dijital mikroskop mevcutsa, daha fazla bitki paralel olarak aşılanabilir. Bitkiler aşılamadan önce en az üç tam gelişmiş yaprağa sahip olmalıdır (Şekil 1C). PVYN-Wi , patates cv'de çoğaltılır ve korunur.- Aşılama için sodyum dietilditiokarbamat (DIECA) ile desteklenmiş fosfat tamponu hazırlayın: 1.3 mL 0.2 M NaH2PO4, 8.7 mL 0.2 MNa2HPO4ve 0.225 g DIECA'yı karıştırın. ddH20 kullanarak hacmi 100 mL'ye yükseltin. 1 M NaOH veya 1 M HCl çözeltisi ekleyerek pH'ı 7,6'ya ayarlayın.
- 6-8 haftalık PVYN-Wi enfekte patates cv'yi hasat edin. Pentland bitkileri, filtre ağlı ekstraksiyon torbalarında (6 bitki başına 0,5 g) doku kültüründen elde edilir ve DIECA (4x bitki materyali kütlesi, kütle: hacim oranı) ile takviye edilmiş fosfat tamponu eklenir. Homojen bir çözelti elde etmek için 1-2 dakika el tipi homojenizatör kullanın.
- 3-4 haftalık patates bitkilerinin ilk üç dip tam gelişmiş yaprağını (adım 1.6'dan itibaren) karborundum tozu ile hafifçe tozlayın.
NOT: Carborundum tozu miktarını ayarlayın. Çok fazlası hasara neden olabilirken, çok azı etkisiz enfeksiyona neden olabilir. Optimal olarak, ortalama büyüklükte (yaklaşık 15cm2) yaprak başına yaklaşık 1,5 mg toz olan 0,1 mg/cm karborundum tozu kullanılır. - Yaprakları inokülumla nazikçe ovalayın (yaprak başına ~ 100 μL). 10 dakika sonra yaprakları musluk suyuyla iyice yıkayın.
- Yapraklara zarar vermemeye dikkat edin. Kuluçka süresini aşmayın. Aşı miktarını yaprak boyutuna göre ayarlayın - 6,5 μL/cm, ortalama büyüklükteki yaprak başına yaklaşık 100 μL'dir (yaklaşık 15cm2).
- Bitkileri bir büyüme odasına aktarın ve kontrollü çevre koşullarında (ışıkta 28 °C ve karanlıkta 28 °C, %55 ± %5 bağıl nemde, 250 μmol/m2/s radyasyon ve 16 saat fotoperiyot ile) 3 gün boyunca büyütün.
3. Bitki hazırlama ve lezyon gelişimini kaydetmek için dijital mikroskobu kullanma
- Aşılanmış bitkileri, aşılamadan 3 gün sonra 28 °C'de tutulan büyüme odasından 22 °C'de bir büyüme odasına, adım 1.5'te açıklanan diğer koşullarla aktarın.
- Gözlem için bir bitki seçin. İkinci aşılanmış yaprağı bant kullanarak hareketsiz hale getirin (Şekil 1D). Görüntülemeye başlamadan önce istenen yaprağın tamamen hareketsiz olduğundan emin olun (Şekil 1D).
- Dizüstü bilgisayara görüntü yakalama için bir yazılım uygulaması yükleyin. Dijital mikroskobu bilgisayara bağlayın. Yazılımı açın.
NOT: Bilgisayarı prize takmak için bitkinin, dijital mikroskobun ve dizüstü bilgisayarın soketin yanındaki rafa yerleştirildiğinden emin olun. İzlenecek yaprakların seçimine ilişkin karar, incelenen biyolojik soruya, örneğin sınırlı programlanmış hücre ölümünün oluşumuna yol açan sürecin türüne bağlı olabilir. - Mikroskobu hareketsiz yaprağın üzerine ayarlayın. Dijital mikroskop üzerindeki kadranı kullanarak odaklanın ( Şekil 1E'de gösterilmiştir).
- Lezyonun oluşumunu yakalama şansını artırmak için görüş hattının mümkün olduğunca geniş olduğundan, ancak yine de lezyonun görünümünü tespit edecek kadar büyütüldüğünden emin olun (tipik olarak 25x büyütme kullanılır).
- Kamera ayarlarını yapın. Görüntünün sağ üst köşesindeki Ayarlar düğmesine tıklayın (Şekil 2A, daire içine alınmış bölüm 1) ve kamera ayarlarını yapın: Parlaklık (60-70), Kontrast (10-15), Ton (0), Beyaz Dengesi, Doygunluk (45-50), Netlik (0), Gama (5) (Şekil 2B). Bu çalışmada kullanılan ayarlar şu şekildedir: Parlaklık (64), Kontrast (14), Ton (0), Doygunluk (47), Netlik (0), Gama (5).
NOT: En iyi görüntü kalitesini sağlamak için kamera ayarları dış ışığa göre ayarlanmalıdır. Ayarlar, kullanıcının büyüme odasındaki koşullarına göre uyarlanabilir. - Görüntü Yakalama simgesine tıklayarak görüntü yakalama ayarlarını yapın (Şekil 2C, daire içine alınmış bölüm 2). Hızlandırılmış Video düğmesine tıklayın ve Görüntü Yakalamayı 24 saat boyunca her 15 dakikada bir ayarlayın (Şekil 2C).
NOT: Alınan görüntüler ile görüntüleme süresi arasındaki aralık tamamen esnektir ve deneyin ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir. Görüntü yakalama arasındaki sürede, LED ışığı söner. Görüntü yakalama sırasında LED ışığı otomatik olarak açılır. - BAŞLAT düğmesine tıklayarak görüntü yakalamayı başlatın (Şekil 2C).
NOT: 28 °C'den 22 °C'ye aktarıldıktan sonra, bitkiler 24 saat içinde lezyonlar geliştirmeye başlamalıdır. Değilse, bu etkisiz aşılamanın bir işareti olabilir. Karborundum tozu miktarını ayarlayın, yapraklarda aşılama inkübasyon süresinin doğru olduğundan emin olun ve qPCR ile aşıdaki virüs bolluğunu belirleyin. - Görüntüleri kaydetmek için tüm görüntüleri seçin ve Kaydet simgesine tıklayın (Şekil 2B, daire içine alınmış bölüm 3). Dışa aktarma seçeneklerini ayarlayın. DPI'yı maksimuma (300) ayarlayın (Şekil 2D). Kaydettikten sonra programdaki tüm resimleri silin.
- Görüntü analizi için, görüntü görüntüleme/düzenleme için herhangi bir program yeterlidir. Görüntü düzenleme için ücretsiz yazılım olan ImageJ'in kullanımı aşağıda açıklanmıştır.
- Tek bir görüş alanından görüntülerin zaman sırasını içe aktarın (sol üst köşede Dosya'yı tıklatın, İçe Aktar'ı ve ardından Görüntü Sırası'nı seçin). Kaydedilen resimlerin dizininin yolunu yapıştırın ve dönüştürmeyi başlatmak için OK düğmesine basın.
- Dönüştürmeden sonra, yazılım otomatik olarak son videoyu gösteren dahili bir video oynatıcı açar. Dosya > Farklı kaydet seçeneğine tıklayarak ve AVI Formatı'nı seçerek video dosyasını dışa aktarın. Küçük bir pencere açılır. Kare Hızını 0.3 fps olarak ayarlayın ve videoyu bir AVI video dosyası olarak kaydetmek için Tamam'a basın.
NOT: Lezyon gelişim zamanı, tüm görüntülerin manuel olarak kontrol edilmesi ve lezyonun göründüğü bir görüntünün bulunmasıyla da belirlenebilir.
Representative Results
Bu çalışma, patates cv'sinde lezyon oluşumu yoluyla hücre ölümü başlangıcını incelemek için adım adım bir protokol göstermektedir. Rywal, dijital mikroskop ile. Bu, programlanmış hücre ölümü başlangıcının tam zamanının belirlenmesini sağlar.
Kök gelişen bitkiler patates cv'sinden 2 hafta sonra toprağa konur. Rywal mikroyayılımı (Şekil 1A, B). Tarif edilen koşullar altında 3-4 haftalık büyümeden sonra, daha fazla analiz için sağlıklı görünen, görünür yaprakçıklara sahip en az 3-4 tam gelişmiş yapraklı bitkiler kullanıldı (Şekil 1C). Bu protokolde anlatıldığı gibi dijital mikroskop kullanarak, aşılanmış yaprak üzerinde aynı alanı 15 dakika aralıklarla gözlemledik ve zaman içinde lezyon oluşumunu ve genişlemesini belirledik (Şekil 3). Lezyon 15 saat 30 dakika sonra ortaya çıktı (Şekil 3).
Şekil 1: Dijital mikroskop ile analiz için bitki hazırlığı . (A) MS 30 orta ve patates cv içeren plastik bir kutu. Rywal bitkisi düğümler içeren eksplantlar. (B) Patates cv. Toprakta rywal bitkisi (mikro çoğaltmadan 2 hafta sonra). (C) Patates cv. Aşılamaya hazır (toprağa konulduktan 4 hafta sonra), en az üç tam gelişmiş yaprağa sahip rywal bitkisi. (D) Patatesin ikinci aşılanmış yaprağı (ok) cv. Rywal bitkisi bantla konumlandırılmış ve hareketsiz hale getirilmiştir (ok). (E) Odaklama için kullanılan kadranı gösteren ok ile dijital mikroskop altında konumlandırılmış bitki. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lezyon gelişiminin kaydedilmesi için dijital yazılım ayarı. (A) Yazılım arayüzü - (1) fotoğraf makinesi ayarları, (2) görüntü yakalama ayarları ve (3) görüntü kaydetme düğmesi için kırmızı daire içine alınmış seçeneklerdir. (B) A panelinde (1) üzerine tıklanarak açılan kamera ayarlarının bulunduğu pencere. Parlaklık, Kontrast, Doygunluk, Netlik ve Gama uygun şekilde ayarlanmalıdır. (C) Panel A'da gösterilen (2) üzerine tıklandığında açılan görüntü yakalama ayarlarının bulunduğu pencere. (D) Panel A'da gösterilen (3) işaretine tıklanarak açılan görüntü kaydetme ayarlarının bulunduğu pencere. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dijital mikroskop altında gözlenen aşılanmış yaprakta lezyon oluşumu. PVY aşılı patates yaprağının orta kısmının dijital mikroskop altında görüldüğü gibi 23,6x büyütmede 5 dakikalık aralıklarla çekilmiş görüntüleri. Aşılanan bitkiler 3 gün boyunca 28 °C'ye konuldu ve üçüncü gün saat 7:00'de 22 °C'de dijital mikroskop ile gözleme başlandı. (A) Saat 21:02'de lezyon henüz görülmez, (B) 90 dakika sonra, saat 22:32'de lezyon görülür. (C) Ertesi sabah 01:02'de ve (D) 07:32'de lezyon genişlemesi gözlendi. Deney iki kez tekrarlandı ve lezyonlar hücre ölümünün başlamasından 8 saat 15 dakika ve 12 saat sonra meydana geldi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Gösterilen protokol, kullanıcının dijital bir mikroskop kullanarak hücre ölümü başlangıcı ile hücre ölümü görünümü arasındaki sürede aşılanmış yaprakları sürekli olarak görüntüleyerek hücre ölümü başlatma hızını doğru bir şekilde belirlemesini sağlar. Lezyonu ve bitki hastalığı oluşumunuizlemenin çok sayıda yolu olmasına rağmen 12,13,14,15, bu protokol, ölçümler arasında ışık kapatıldığı için bitkinin sirkadiyen ritmini bozmadan ışıktan bağımsız ölçüm avantajı sunar.
Aşılamadan sonra bitkiler 3 gün boyunca 28 °C'de büyümelidir. Aşırı duyarlı bir tepkiye neden olan Ny-1 direnç geni, sıcaklığa bağlıdır ve daha yüksek sıcaklıklarda yetiştirilen bitkilerde, lezyon oluşumu eksikliği ve sistemik virüs yayılımı olarak kendini gösteren direncin düşmesine yol açar3. Bitkiler 22 °C'ye aktarıldıktan sonra hücre ölümü başlar, bu nedenle doğru sonuçlar için bu transferden sonra mümkün olan en kısa sürede dijital mikroskop ile gözleme başlanmalıdır. Bitkinin görüntüleme için hazırlanmasındaki bir diğer önemli adım, yaprağın hareketsiz hale getirilmesidir (Şekil 1D), çünkü bitki görüntüleme sırasında büyümeye devam edecek, bu da gözlemlenen yaprağı odak dışına çıkarabilir veya bu tür bir kurulum istenen sonuçları vermeyecektir.
Açıklanan protokol, hücre ölümünün başlatılmasında rol oynadığı varsayılan değiştirilmiş bileşenlere sahip transgenik bitkiler üzerinde kullanılırsa, protokol, kullanıcının, çalışılan bir bileşenin azaltılmış seviyesinin hücre ölümü başlatma oranını etkileyip etkilemediğini belirlemesini sağlar. Bununla, hücre ölümünün başlatılmasında yer alan bileşenler, bu protokol kullanılarak programlanmış hücre ölümünün meydana geldiği patosistemlerde tanımlanabilir. Bu bileşenleri tanımlamak için diğer yöntemler, örneğin, pahalı ve zaman alıcı olabilen RNA-seq veya çeşitli mikroskopi formları gibi transkriptomik analizlerdir16. Bu protokolde açıklanan yöntem, transgenik ve kontrol bitkileri arasındaki hücre ölümü başlatma oranlarındaki farklılıkları gözlemleyerek hücre ölümünün başlamasına dahil olan bileşenlerin kolay ve ucuz bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Optimal olarak, böyle bir kurulumda, bir transgenik tesisin aynı deney içinde bir kontrol tesisi ile paralel olarak analiz edilmesi gerektiğinden, iki dijital kamera kullanılmalıdır.
Bu protokolde PVY suşu N-Wilga kullanıldı; bununla birlikte, bu virüsün diğer suşları, örneğin GFP etiketli PVY (PVY-N605 (123) -GFP) 7 de kullanılabilir. Ayrıca, programlanmış hücre ölümü gelişimi ile sonuçlanan diğer patosistemler, küçük modifikasyonlarla bu protokol kullanılarak incelenebilir.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Teknik yardım için Barbara Jaklič'e teşekkür ederiz. Bu araştırma, Slovenya Araştırma ve İnovasyon Ajansı tarafından finansal olarak desteklenmiştir (araştırma temel fonu no. P4-0165 ve proje Z4-3217: Virüslere karşı patates direncinde redoksla ilgili sinyal birbirine bağlılığının deşifre edilmesi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Autoclave A-21 CAV | Kambi |
N/A | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
| Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
| DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
| Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
| Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
| Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
| Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
| Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
| Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
| Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
| Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
| Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
| Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
| NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
| Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
| pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
| Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
| Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
| Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
| Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
| Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
| Tweezers | Braun | BD033R |
References
- Karasev, A. V., Gray, S. M. Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato. Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).
- Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity. Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).
- Szajko, K., et al. The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance. Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).
- Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding. Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).
- Lukan, T., et al. Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato. Frontiers in Plant Science. 9, 168 (2018).
- Baebler, Š, et al. Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato. Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).
- Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy. Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).
- Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. Potato in vitro culture techniques and biotechnology. Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator). Nature. 470, 110-115 (2011).
- Roden, L. C., Ingle, R. A. Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions. Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).
- Srivastava, D., et al. Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response. Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).
- Mulaosmanovic, E., et al. High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis. Plant Methods. 16, 62 (2020).
- Martinelli, F., et al. Advanced methods of plant disease detection. A review. Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).
- Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review. Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426 (2019).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Rowarth, N. M., et al. RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis). BMC Plant Biology. 21 (1), 375 (2021).
