Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于通过在细胞死亡诱导后连续成像接种的叶子来研究程序性细胞死亡起始的速率。
Abstract
超敏反应 （HR） 赋予的抗性是一种有效的防御反应，可以由 N 抗性基因决定。HR表现为在接种的叶子上形成细胞死亡区。在这里，提出了一种通过使用数码显微镜在细胞死亡开始和细胞死亡外观之间的时间内对接种的叶子进行成像来研究细胞死亡起始速率的方案。数码显微镜能够在所需的时间间隔内进行连续成像过程，从而可以精确地测定细胞死亡起始率，精确到几分钟，而传统方法则需要数小时。使用数码显微镜进行成像也不受光线的影响，因此可以在白天和晚上使用，而不会干扰植物的昼夜节律。可以使用该协议进行微小修改来研究导致程序性细胞死亡发展的不同病理系统。总体而言，该协议因此允许简单、准确和廉价地鉴定细胞死亡起始率。
Introduction
马铃薯是世界上种植最广泛的粮食作物之一，仅次于水稻、小麦和玉米，排名第四。然而，马铃薯生产可能受到马铃薯病毒Y（PVY）的严重影响，该病毒目前被认为是其最重要的病毒病原体1,2。在马铃薯植株中，简历。Rywal、几种 PVY 菌株（包括 PVY 菌株 N-Wilga）触发超敏反应 （HR） 赋予的耐药性，其中病原体对感染部位的限制表现为接种叶片上的坏死病变3.在该病理系统中，HR 由 Ny-1 抗性基因介导，该基因具有温度依赖性，因为在较低温度下生长的植物有效地发生坏死病变，而在在升高 （28 °C） 温度下组成型生长的植物中，耐药性流产被证明是缺乏病变形成和全身病毒传播 3,4.当植物被转移到较低的温度（22°C）时，细胞死亡开始，这可以通过在细胞死亡开始和细胞死亡出现之间的时间内对接种的叶子进行成像来跟踪细胞死亡开始的速率。
该协议展示了一种使用数码显微镜测定细胞死亡起始率的简单方法。通过在将植物从28°C转移到22°C后对接种的叶子进行成像，数码显微镜可以在所需的间隔内连续观察叶子。与使用其他方法（例如，共聚焦显微镜或用肉眼观察病变形成）不同，这允许确定病变形成的确切时间，因此，细胞死亡起始速率精确到几分钟，而不是在上述方法中数小时5,6。数码显微镜的使用也与光线无关，因此可以在白天和晚上使用。该方案还可用于识别参与细胞死亡起始的组分，或确定不同组分对细胞死亡起始率的影响，如果使用的植物是转基因的并且具有改变的目标组分水平。
Protocol
注：第 1 节和第 2 节描述了基于 Lukan 等人 7 概述的方法的植物材料制备的修改方案。具体来说，对受控环境条件和接种物制备进行了一些修改。
1. 种植马铃薯植物
- 种植健康的马铃薯简历。茎节组织培养中的 Rywal 植物8.
- 6-8周后，在无菌条件下，使用无菌镊子和手术刀在无菌纸上切下10个1厘米长的含有马铃薯植物节点的外植体。
- 将它们转移到装有Murashige和Skoog（MS30）培养基的塑料盒中（图1A），并在受控环境条件下生长（光照下为22°C，黑暗中为19°C，250μE或μmol/ m2 / s辐射和16小时光周期，相对湿度为55%±5%）。
- 微繁殖后 2 周将它们转移到土壤中。
- 用土壤填充花盆（r = 10 cm）。用手指在花盆中间的土壤上开一个3-4厘米深的洞，将洞装满水，等待其吸收。
- 将每盆一株植物放入洞中，将叶子留在表面以上。用土壤轻轻覆盖根部（图1B）。
注意：有些植物可能不会生根。从分析中排除这些植物。
- 在受控环境条件下（光照下为22°C，黑暗中为19°C，相对湿度为55%±5%，250μmol/ m2 / s辐射和16小时光周期）在生长室中生长土壤中的植物。
- 3-4周后，植物就准备好了。使用这些植物进行接种。
注意：植物应至少有3-4片完全发育的叶子，并有可见的小叶（图1C）。它们应该看起来很健康，没有明显的症状（黄色或棕色的叶子），这可能会被误认为是由 PVY 引起的病变。为了获得可比较的结果，应在所有实验中同时接种植物（例如，上午9点），以避免昼夜节律对植物免疫反应和病变形成的可能影响9,10,11。
2.接种准备和马铃薯接种
- 用PVY菌株N-Wilga（PVYN-Wi;登录号。EF558545）接种物如下所述。
注意：如果有多个数码显微镜可用，则可以同时接种更多植物。在接种前，植物应至少有三片完全发育的叶子（图1C）。PVYN-Wi 在马铃薯 cv. Pentland 中繁殖和维持。- 准备补充有二乙基二硫代氨基甲酸钠 （DIECA） 的磷酸盐缓冲液进行接种：混合 1.3 mL 的 0.2 M NaH 2 PO 4、8.7mL 的 0.2 M Na2HPO4 和 0.225 g DIECA。使用 ddH20 将体积补足至 100 mL。通过加入1M NaOH或1M HCl溶液将pH调节至7.6。
- 收获 6-8 周龄 PVYN-Wi 感染的马铃薯简历。将来自组织培养物的Pentland植物放在带有过滤网（每6株植物0.5克）的提取袋中，并加入补充有DIECA（4x质量的植物材料，质量：体积比）的磷酸盐缓冲液。使用手动均质器1-2分钟以获得均匀溶液。
- 用碳化硅粉轻轻撒在3-4周龄马铃薯植株（从步骤1.6开始）的前三个底部完全发育的叶子上。
注意：调整碳化硅粉的量。过多可能会造成损害，而过少可能会导致无效感染。最佳情况下，使用0.1 mg / cm的碳化硅粉末，即平均大小（约15cm2）的每片叶子约1.5mg粉末。 - 用接种物轻轻擦拭叶子（每片叶子~100μL）。10分钟后，用自来水彻底清洗叶子。
- 注意不要伤害叶子。不要超过孵育时间。根据叶片大小调整接种量 - 6.5μL/cm，即平均大小（约15cm2）的每片叶子约100μL。
- 将植物转移到生长室中，并在受控环境条件下（光照下28°C，黑暗中28°C，相对湿度为55%±5%，250μmol/ m2 / s辐射和16小时光周期）下生长3天。
3. 植物准备和使用数码显微镜记录病变发展
- 接种后3天，将接种的植物从保持在28°C的生长室转移到22°C的生长室，其他条件如步骤1.5所述。
- 选择要观察的植物。用胶带固定第二个接种的叶子（图1D）。在开始成像之前，确保所需的叶子完全固定（图1D）。
- 在笔记本电脑上安装用于图像捕获的软件应用程序。将数码显微镜连接到计算机。打开软件。
注意： 确保植物、数码显微镜和笔记本电脑位于靠近插座的架子上以插入计算机。选择要监测的叶子的决定可能取决于所研究的生物学问题，例如，导致形成有限程序性细胞死亡的过程类型。 - 将显微镜调整在固定叶片上方。使用数码显微镜上的刻度盘对焦（ 如图1E所示）。
- 确保视线尽可能宽，以增加捕捉病变形成的机会，但仍放大到足以发现病变的外观（通常使用 25 倍放大倍率）。
- 设置相机设置。单击图像右上角的“设置”按钮（图2A，圈出的第1部分）并调整相机设置：亮度（60-70），对比度（10-15），色相（0），白平衡，饱和度（45-50），锐度（0），伽玛（5）（图2B）。本研究中使用的设置如下：亮度 （64）、对比度 （14）、色相 （0）、饱和度 （47）、锐度 （0）、伽玛 （5）。
注意： 相机设置应根据外部光线进行调整，以确保最佳图像质量。设置可以根据用户在生长室中的条件进行调整。 - 通过单击 Image Capture 图标来设置图像捕获设置（图2C，圈出的第2部分）。单击“ 延时视频 ”按钮，并将 “图像捕获 ”设置为每15分钟一次，持续24小时（图2C）。
注意：拍摄的图像和成像持续时间之间的间隔是完全灵活的，可以根据实验的需要进行调整。在图像捕获之间的时间内，LED 灯关闭。在图像捕获过程中，LED 灯会自动打开。 - 单击“开始”按钮 开始 图像捕获（图2C）。
注意：从28°C转移到22°C后，植物应在24小时内开始发生病变。如果没有，这可能是接种无效的迹象。调整碳化硅粉的用量，确保接种物在叶片上孵育的时间正确，并通过qPCR测定接种物中的病毒丰度。 - 要保存图像，请选择所有图像并单击 “保存 ”图标（图 2B，圈出的第 3 部分）。设置 导出选项。将DPI设置为最大（300）（图2D）。保存后，删除程序中的所有图片。
- 对于图像分析，任何用于图像查看/编辑的程序都足够了。下面将介绍用于图像编辑的免费软件 ImageJ 的使用。
- 从单个视野导入图像的时间序列（在左上角，单击 “文件”，选择“ 导入”，然后选择 “图像序列”）。粘贴保存图片目录的路径，然后按 OK 按钮开始转换。
- 转换后，软件会自动打开一个内部视频播放器，显示最终视频。通过单击“文件” >“另存为 ”选项并选择 “AVI格式”来导出视频文件。将打开一个小窗口。 将帧速率 设置为 0.3 fps，然后按 OK 将视频另存为 AVI 视频文件。
注意：病变发展的时间也可以通过手动检查所有图像并找到病变出现的图像来确定。
Representative Results
本研究展示了通过马铃薯简历上的病变发生来研究细胞死亡起始的分步方案。Rywal，用数码显微镜。这样就可以确定程序性细胞死亡开始的确切时间。
已生根的植物在马铃薯 CV 后 2 周放入土壤中。Rywal微繁殖（图1A，B）。在所述条件下生长3-4周后，使用至少3-4片完全发育的叶子的植物，这些叶子具有可见的小叶，看起来健康，没有脱落的迹象，用于进一步分析（图1C）。使用本协议中描述的数码显微镜，我们以15分钟的间隔观察接种叶片上的相同区域，并确定病变的发生和及时的扩展（图3）。病变发生在15小时30分钟（图3）。
图1：用数码显微镜进行分析的植物准备 。 （A） 装有 MS 30 培养基和马铃薯 cv 的塑料盒。含有节点的 Rywal 植物外植体。（B） 马铃薯简历Rywal 植物在土壤中（微繁殖后 2 周）。（C） 马铃薯简历Rywal 植物，准备接种（放入土壤后 4 周），至少有三片完全发育的叶子。（D）马铃薯cv的第二次接种叶（箭头）。Rywal 植物定位并用胶带固定（箭头）。（E） 将植物放置在数码显微镜下，箭头指向用于对焦的刻度盘。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：用于记录病变发展的数字软件设置。 （A） 软件界面 - 用红色圈出的是 （1） 相机设置、（2） 图像捕捉设置和 （3） 保存图像按钮的选项。 （B） 带有相机设置的窗口，单击面板 A 中的 （1） 即可打开。 亮度、对比度、饱和度、锐度和伽玛应正确调整。（C） 具有图像捕获设置的窗口，单击面板 A 中表示的 （2） 打开。 （D） 具有图像保存设置的窗口，单击面板 A 中表示的 （3） 打开。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：在数码显微镜下观察到接种叶片上的病变形成。 在数码显微镜下以 23.6 倍放大倍率拍摄的 PVY 接种马铃薯叶中央部分的图像，间隔 5 分钟。将接种的植株置于28°C下3天，第3天，7：00开始用22°C的数码显微镜观察。（A） 在 21：02，病变还不可见，（B） 90 分钟后，在 22：32，病变可见。（C）在01：02和（D）次日凌晨07：32观察到病灶扩大。重复实验2次，病变分别发生在细胞死亡起始后8 h 15 min和12 h。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
所展示的方案允许用户通过使用数码显微镜在细胞死亡开始和细胞死亡外观之间的时间内连续成像接种的叶子来准确确定细胞死亡起始率。尽管有许多方法可以监测病变和植物病害的发生12,13,14,15，但该协议具有在不干扰植物昼夜节律的情况下进行与光无关的测量的优点，因为在测量之间关闭光。
接种后，植物应在28°C下生长3天。诱导超敏反应的 Ny-1 抗性基因具有温度依赖性，在较高温度下生长的植物中，导致抗性流产，表现为缺乏病变形成和全身性病毒传播3.将植物转移到22°C后，开始细胞死亡，因此为了获得准确的结果，应在转移后尽快开始用数码显微镜观察。准备植物成像的另一个关键步骤是固定叶子（图1D），因为植物在成像过程中会继续生长，这可能会使观察到的叶子偏离焦点，或者这种设置不会产生预期的结果。
如果将所描述的方案用于具有改变的目标组分的转基因植物，假设参与细胞死亡起始，则该方案使用户能够确定所研究组分的降低水平是否影响细胞死亡起始的速率。通过该协议，可以使用该协议在发生程序性细胞死亡的病理系统中识别参与细胞死亡起始的成分。识别这些成分的其他方法是，例如转录组分析，例如RNA-seq或各种形式的显微镜，这可能既昂贵又耗时16。该协议中描述的方法允许通过观察转基因植物和对照植物之间细胞死亡起始率的差异来简单且廉价地鉴定参与细胞死亡起始的组分。理想情况下，在这样的设置中，必须使用两台数码相机，因为转基因植物应在同一实验中与对照植物并行分析。
在该协议中，使用PVY菌株N-Wilga;然而，也可以使用这种病毒的其他毒株，例如GFP标记的PVY（PVY-N605（123）-GFP）7。此外，可以使用该协议进行微小修改，研究导致程序性细胞死亡发展的其他病理系统。
Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Barbara Jaklič提供的技术援助。这项研究得到了斯洛文尼亚研究与创新局的财政支持（研究核心资金编号P4-0165和项目Z4-3217：破译马铃薯抗病毒性中与氧化还原相关的信号互联性）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Autoclave A-21 CAV | Kambi |
N/A | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
| Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
| DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
| Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
| Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
| Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
| Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
| Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
| Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
| Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
| Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
| Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
| Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
| NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
| Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
| pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
| Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
| Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
| Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
| Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
| Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
| Tweezers | Braun | BD033R |
References
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