Summary
Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de snelheid van geprogrammeerde celdoodinitiatie door continu geïnoculeerde bladeren in beeld te brengen na celdoodinductie.
Abstract
Overgevoeligheidsrespons (HR)-verleende resistentie is een effectieve afweerrespons die kan worden bepaald door de N-resistentiegenen. HR manifesteert zich als de vorming van celdoodzones op geïnoculeerde bladeren. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bestuderen van de snelheid van celdoodinitiatie door geïnoculeerde bladeren af te beelden in de tijd tussen de celdoodinitiatie en het verschijnen van de celdood met behulp van een digitale microscoop. De digitale microscoop maakt een continu beeldvormingsproces mogelijk met de gewenste intervallen, waardoor de initiatiesnelheid van de celdood tot op enkele minuten nauwkeurig kan worden bepaald, in tegenstelling tot uren bij traditionele methoden. Beeldvorming met de digitale microscoop is ook onafhankelijk van licht en kan daarom zowel overdag als 's nachts worden gebruikt zonder het circadiane ritme van de plant te verstoren. Verschillende pathosystemen die resulteren in de ontwikkeling van geprogrammeerde celdood kunnen met behulp van dit protocol met kleine aanpassingen worden bestudeerd. Over het algemeen maakt het protocol dus een eenvoudige, nauwkeurige en goedkope identificatie van het initiatiepercentage van celdood mogelijk.
Introduction
Aardappel is een van 's werelds meest geteelde voedselgewassen, op de vierde plaats na rijst, tarwe en maïs. De aardappelproductie kan echter ernstig worden aangetast door aardappelvirus Y (PVY), dat momenteel wordt beschouwd als de belangrijkste virusziekteverwekker 1,2. In aardappelplanten cv. Rywal, veroorzaken verschillende stammen van PVY (waaronder PVY-stam N-Wilga) door overgevoeligheidsrespons (HR) verleende resistentie, waarbij de beperking van de ziekteverwekker tot de infectieplaats zich manifesteert als necrotische laesies op geïnoculeerde bladeren3. In dit pathosysteem wordt HR gemedieerd door het Ny-1-resistentiegen, dat temperatuurafhankelijk is, aangezien planten die bij lagere temperaturen worden gekweekt efficiënt necrotische laesies ontwikkelen, terwijl bij planten die constitutief worden gekweekt bij verhoogde (28 °C) temperatuur, abortus van resistentie wordt aangetoond als gebrek aan laesievorming en systemische virusverspreiding 3,4. Wanneer de planten worden overgebracht naar een lagere temperatuur (22 °C), wordt de celdood geïnitieerd, die kan worden benut om de snelheid van celdoodinitiatie te volgen door geïnoculeerde bladeren af te beelden in de tijd tussen het begin van de celdood en het verschijnen van de celdood.
Dit protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het bepalen van het initiatiepercentage van celdood met behulp van een digitale microscoop. Door de geënte bladeren in beeld te brengen na het overbrengen van de plant van 28 °C naar 22 °C, maakt een digitale microscoop continue observatie van het blad in de gewenste intervallen mogelijk. In tegenstelling tot het gebruik van andere methoden (bijvoorbeeld confocale microscopie of observatie van laesievorming met het blote oog), maakt dit het mogelijk om het exacte tijdstip van laesievorming te bepalen en dus het initiatiepercentage van de celdood tot op minuten nauwkeurig, in tegenstelling tot uren in bovengenoemde methoden 5,6. Het gebruik van de digitale microscoop is ook onafhankelijk van licht en kan daarom zowel overdag als 's nachts worden gebruikt. Dit protocol kan ook worden gebruikt om componenten te identificeren die betrokken zijn bij het initiëren van celdood of om de effecten van verschillende componenten op het initiatiepercentage van celdood te bepalen als gebruikte planten transgeen zijn en veranderde niveaus van interessante componenten hebben.
Protocol
OPMERKING: In de paragrafen 1 en 2 wordt een aangepast protocol beschreven voor de bereiding van plantaardig materiaal op basis van de methoden die zijn beschreven door Lukan et al.7. In het bijzonder werden enkele wijzigingen aangebracht in gecontroleerde omgevingsomstandigheden en entvoorbereiding.
1. Aardappelplanten kweken
- Kweek gezonde aardappel cv. Rywal planten in stengelknoopweefselkweek8.
- Snijd na 6-8 weken tien explantaten van 1 cm lang met knopen van aardappelplanten op steriel papier onder steriele omstandigheden met een steriel pincet en een scalpelmes.
- Breng ze over in plastic dozen met Murashige en Skoog (MS30) medium (Figuur 1A) en kweek ze onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (22 °C in het licht en 19 °C in het donker met 250 μE of μmol/m2/s straling en een 16-uurs fotoperiode, bij een relatieve vochtigheid van 55% ± 5%).
- Breng ze 2 weken na microvermeerdering over in de grond.
- Vul de potten (r = 10 cm) met aarde. Gebruik een vinger om een gat van 3-4 cm diep in de grond in het midden van een pot te maken, vul het gat met water en wacht tot het is opgenomen.
- Plaats één plant per pot in het gat en laat de bladeren boven het oppervlak. Bedek de wortels voorzichtig met aarde (Figuur 1B).
OPMERKING: Sommige planten ontwikkelen mogelijk geen wortels. Sluit die planten uit van de analyse.
- Kweek de planten in aarde in een groeikamer onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (22 °C in het licht en 19 °C in het donker, bij een relatieve luchtvochtigheid van 55% ± 5%, met 250 μmol/m2/s straling en een fotoperiode van 16 uur).
- Na 3-4 weken zijn de planten klaar. Gebruik deze planten om geënt te worden.
OPMERKING: Planten moeten ten minste 3-4 volledig ontwikkelde bladeren hebben met zichtbare blaadjes (Figuur 1C). Ze moeten er gezond uitzien, zonder zichtbare symptomen (gele of bruine bladeren), die kunnen worden aangezien voor laesies veroorzaakt door PVY. Om vergelijkbare resultaten te bereiken, moeten planten in alle experimenten tegelijkertijd (bijv. om 9 uur 's ochtends) worden geïnoculeerd om mogelijke effecten van het circadiane ritme op de immuunrespons van planten en laesievorming te voorkomen 9,10,11.
2. Entvoorbereiding en aardappelinoculatie
- Inoculeer de plant met PVY-stam N-Wilga (PVYN-Wi; toelatingsnr. EF558545) entmateriaal zoals hieronder vermeld.
OPMERKING: Er kunnen meer planten parallel worden geënt als er meer dan één digitale microscoop beschikbaar is. Planten moeten ten minste drie volledig ontwikkelde bladeren hebben voordat ze worden geïnoculeerd (Figuur 1C). PVYN-Wi wordt vermenigvuldigd en gehandhaafd in aardappel cv. Pentland.- Bereid fosfaatbuffer, aangevuld met natriumdiethyldithiocarbamaat (DIECA), voor inoculatie: Meng 1,3 ml 0,2 M NaH 2 PO 4, 8,7 ml0,2 M Na2HPO4 en 0,225 g DIECA. Vul het volume aan tot 100 ml met ddH20. Pas de pH aan tot 7,6 door 1 M NaOH of 1 M HCl-oplossing toe te voegen.
- Oogst 6-8 weken oude PVYN-Wi besmette aardappel cv. Pentlandplanten uit weefselkweek in extractiezakken met filternet (0,5 g per 6 planten) en fosfaatbuffer toevoegen aangevuld met DIECA (4x massa plantmateriaal, massa: volume verhouding). Gebruik een handhomogenisator gedurende 1-2 minuten om een homogene oplossing te verkrijgen.
- Bestuif de eerste drie onderste volledig ontwikkelde bladeren van 3-4 weken oude aardappelplanten (uit stap 1.6) licht met carborundumpoeder.
NOTITIE: Pas de hoeveelheid carborundumpoeder aan. Te veel kan schade veroorzaken, terwijl te weinig kan leiden tot een ineffectieve infectie. Optimaal wordt 0,1 mg/cm carborundumpoeder gebruikt, dat is ongeveer 1,5 mg poeder per blad van gemiddelde grootte (ongeveer 15cm2). - Wrijf de bladeren voorzichtig in met het inoculum (~100 μL per blad). Was de bladeren na 10 minuten grondig met kraanwater.
- Pas op dat u de bladeren niet beschadigt. Overschrijd de incubatietijd niet. Pas de hoeveelheid van het inoculum aan de bladgrootte aan - 6,5 μL/cm, dat is ongeveer 100 μL per blad van gemiddelde grootte (ongeveer 15 cm2).
- Breng de planten over naar een groeikamer en kweek ze gedurende 3 dagen onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (28 °C in het licht en 28 °C in het donker bij een relatieve luchtvochtigheid van 55% ± 5%, met 250 μmol/m2/s straling en een fotoperiode van 16 uur).
3. Voorbereiding van de plant en gebruik van de digitale microscoop voor het registreren van de ontwikkeling van laesies
- Breng de geïnoculeerde planten 3 dagen na inoculatie over van de op 28 °C gehouden groeikamer naar een groeikamer bij 22 °C, onder andere omstandigheden zoals beschreven in stap 1.5.
- Selecteer een plant om te observeren. Immobiliseer het tweede geënte blad met tape (Figuur 1D). Zorg ervoor dat het gewenste blad volledig geïmmobiliseerd is voordat u met beeldvorming begint (Figuur 1D).
- Installeer een softwaretoepassing voor het vastleggen van afbeeldingen op de laptop. Sluit de digitale microscoop aan op de computer. Open de software.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de plant, digitale microscoop en laptop op de plank in de buurt van het stopcontact staan om de computer aan te sluiten. De beslissing over de selectie van de te controleren bladeren kan afhangen van de bestudeerde biologische vraag, bijvoorbeeld het type proces dat leidt tot de vorming van beperkte geprogrammeerde celdood. - Stel de microscoop af boven het geïmmobiliseerde blad. Stel scherp met behulp van de draaiknop op de digitale microscoop (weergegeven in afbeelding 1E).
- Zorg ervoor dat de zichtlijn zo breed mogelijk is om de kans op het vastleggen van de vorming van de laesie te vergroten, maar nog steeds voldoende vergroot om het uiterlijk van de laesie te zien (meestal wordt een vergroting van 25x gebruikt).
- Stel de camera-instellingen in. Klik op de knop Instellingen in de rechterbovenhoek van de afbeelding (Figuur 2A, omcirkeld deel 1) en pas de camera-instellingen aan: Helderheid (60-70), Contrast (10-15), Tint (0), Witbalans, Verzadiging (45-50), Scherpte (0), Gamma (5) ( Figuur 2B). De instellingen die in dit onderzoek zijn gebruikt, waren als volgt: Helderheid (64), Contrast (14), Tint (0), Verzadiging (47), Scherpte (0), Gamma (5).
NOTITIE: De camera-instellingen moeten worden aangepast aan het licht van buitenaf om de beste beeldkwaliteit te garanderen. De instellingen kunnen worden aangepast aan de omstandigheden van de gebruiker in de groeikamer. - Stel de instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen in door op het pictogram voor Image Capture te klikken (Figuur 2C, omcirkeld deel 2). Klik op de knop Time-Lapsed Video en stel Image Capture elke 15 minuten in gedurende 24 uur (Figuur 2C).
OPMERKING: Het interval tussen de gemaakte beelden en de duur van de beeldvorming is volledig flexibel en kan worden aangepast aan de behoeften van het experiment. In de tijd tussen het vastleggen van de beelden wordt het LED-licht uitgeschakeld. Het LED-lampje wordt automatisch ingeschakeld tijdens het vastleggen van beelden. - Start het vastleggen van afbeeldingen door op de START-knop te klikken (Figuur 2C).
OPMERKING: Na te zijn overgebracht van 28 °C naar 22 °C, zouden planten binnen 24 uur laesies moeten beginnen te ontwikkelen. Zo niet, dan kan dit een teken zijn van ineffectieve inenting. Pas de hoeveelheid carborundumpoeder aan, zorg ervoor dat de incubatietijd van het inoculum op bladeren correct was en bepaal de virusovervloed in het inoculum met qPCR. - Om afbeeldingen op te slaan, selecteert u alle afbeeldingen en klikt u op het pictogram Opslaan (Figuur 2B, omcirkeld deel 3). Exportopties instellen. Stel DPI in op maximaal (300) (Figuur 2D). Verwijder na het opslaan alle foto's in het programma.
- Voor beeldanalyse is elk programma voor het bekijken/bewerken van beelden voldoende. Het gebruik van gratis software voor beeldbewerking, ImageJ, wordt hieronder uitgelegd.
- Importeer de tijdsreeks van afbeeldingen uit één gezichtsveld (klik in de linkerbovenhoek op Bestand, selecteer Importeren en vervolgens Afbeeldingsreeks). Plak het pad van de map met opgeslagen foto's en druk op de OK knop om de conversie te starten.
- Na de conversie opent de software automatisch een interne videospeler met de uiteindelijke video. Exporteer het videobestand door op de optie Bestand > Opslaan als te klikken en AVI-formaat te selecteren. Er gaat een klein venster open. Stel de framesnelheid in op 0.3 fps en druk op OK om de video op te slaan als een AVI-videobestand.
OPMERKING: Het tijdstip van de ontwikkeling van de laesie kan ook worden bepaald door alle afbeeldingen handmatig te controleren en een afbeelding te vinden waar de laesie verschijnt.
Representative Results
Deze studie demonstreert een stapsgewijs protocol voor het bestuderen van celdoodinitiatie door het optreden van laesies op aardappel cv. Rywal, met een digitale microscoop. Dit maakt het mogelijk om het exacte tijdstip van geprogrammeerde celdoodinitiatie te bepalen.
Planten die wortels hebben ontwikkeld, werden 2 weken na aardappel cv in de grond gezet. Rywal micropropagatie (Figuur 1A,B). Na 3-4 weken groei onder beschreven omstandigheden werden planten met ten minste 3-4 volledig ontwikkelde bladeren met zichtbare blaadjes die er gezond uitzagen, zonder tekenen van abscissie, gebruikt voor verdere analyse (Figuur 1C). Met behulp van een digitale microscoop zoals beschreven in dit protocol, observeerden we hetzelfde gebied op het geïnoculeerde blad met tussenpozen van 15 minuten en bepaalden we het optreden en de uitbreiding van de laesie in de tijd (Figuur 3). De laesie trad op om 15 uur en 30 minuten (figuur 3).
Figuur 1: Voorbereiding van de plant voor analyse met een digitale microscoop . (A) Een plastic doos met MS 30 medium en aardappel cv. Rywal-plant explanteert met knopen. (B) Aardappel cv. Rywal plant in de volle grond (2 weken na microvermeerdering). (C) Aardappel cv. Rywal-plant, klaar voor inoculatie (4 weken nadat hij in de grond is gezet), met ten minste drie volledig ontwikkelde bladeren. (D) Tweede geënte blad (pijl) van aardappel cv. Rywal-installatie gepositioneerd en geïmmobiliseerd (pijl) met tape. (E) Plant geplaatst onder de digitale microscoop met de pijl gericht naar de draaiknop die wordt gebruikt om scherp te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Digitale software-instelling voor het registreren van de ontwikkeling van laesies. (A) Software-interface - rood omcirkeld zijn opties voor de knop voor (1) camera-instellingen, (2) instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen en (3) het opslaan van afbeeldingen. (B) Venster met camera-instellingen, dat wordt geopend met een klik op (1) in paneel A. Helderheid, contrast, verzadiging, scherpte en gamma moeten correct worden afgesteld. (C) Venster met instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen, dat wordt geopend met een klik op (2) aangegeven in paneel A. (D) Venster met instellingen voor het opslaan van afbeeldingen, dat wordt geopend met een klik op (3) aangegeven in paneel A. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Laesievorming op het geënte blad waargenomen onder de digitale microscoop. Beelden van het centrale deel van PVY-geënt aardappelblad met een vergroting van 23,6x zoals gezien onder de digitale microscoop, genomen met tussenpozen van 5 min. Geënte planten werden gedurende 3 dagen op 28 °C gezet en op de derde dag begon de waarneming met een digitale microscoop bij 22 °C om 7.00 uur. (A) Om 21:02 is de laesie nog niet zichtbaar, (B) 90 min later, om 22:32, is de laesie zichtbaar. (C) De uitbreiding van de laesie werd waargenomen om 01:02 uur en (D) om 07:32 uur de volgende ochtend. Het experiment werd twee keer herhaald en de laesies traden respectievelijk 8 uur en 15 minuten en 12 uur na het begin van de celdood op. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het gedemonstreerde protocol stelt de gebruiker in staat om het initiatiepercentage van de celdood nauwkeurig te bepalen door continu geïnoculeerde bladeren af te beelden in de tijd tussen de initiatie van de celdood en het verschijnen van de celdood met behulp van een digitale microscoop. Hoewel er tal van manieren zijn om het optreden van laesies en plantenziekten te monitoren12,13,14,15, biedt dit protocol het voordeel van lichtonafhankelijke metingen zonder het circadiane ritme van de plant te verstoren, omdat het licht tussen de metingen wordt uitgeschakeld.
Na de inoculatie moeten de planten gedurende 3 dagen bij 28 °C groeien. Ny-1-resistentiegen , dat een overgevoeligheidsreactie induceert, is temperatuurafhankelijk en leidt bij planten die bij hogere temperaturen worden gekweekt tot abortus van resistentie, wat zich manifesteert als gebrek aan laesievorming en systemische virusverspreiding3. Nadat planten zijn overgebracht naar 22 °C, wordt de celdood geïnitieerd, dus voor nauwkeurige resultaten moet de waarneming met een digitale microscoop zo snel mogelijk na deze overdracht beginnen. Een andere cruciale stap in de voorbereiding van de plant op beeldvorming is de immobilisatie van het blad (Figuur 1D), omdat de plant tijdens de beeldvorming zal blijven groeien, waardoor het waargenomen blad onscherp kan worden, of een dergelijke opstelling niet de gewenste resultaten zal geven.
Als het beschreven protocol wordt gebruikt op transgene planten met veranderde componenten van belang, waarvan wordt verondersteld dat ze betrokken zijn bij het initiëren van celdood, stelt het protocol de gebruiker in staat om te bepalen of het verlaagde niveau van een bestudeerde component van invloed is op de snelheid van het initiëren van celdood. Daardoor kunnen componenten die betrokken zijn bij het initiëren van celdood worden geïdentificeerd in pathosystemen, waar geprogrammeerde celdood optreedt, met behulp van dit protocol. Andere methoden om deze componenten te identificeren zijn bijvoorbeeld transcriptomische analyse zoals RNA-seq of verschillende vormen van microscopie, die duur en tijdrovend kunnen zijn16. De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om componenten die betrokken zijn bij het initiëren van celdood gemakkelijk en goedkoop te identificeren door verschillen in celdoodinitiatiepercentages tussen transgene en controleplanten waar te nemen. Optimaal moeten in een dergelijke opstelling twee digitale camera's worden gebruikt, aangezien een transgene plant parallel met een controleplant binnen hetzelfde experiment moet worden geanalyseerd.
In dit protocol werd PVY-stam N-Wilga gebruikt; andere stammen van dit virus, bijvoorbeeld GFP-gelabeld PVY (PVY-N605(123)-GFP)7, kunnen echter ook worden gebruikt. Bovendien zouden andere pathosystemen, die resulteren in de ontwikkeling van geprogrammeerde celdood, met behulp van dit protocol met kleine aanpassingen kunnen worden bestudeerd.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Wij danken Barbara Jaklič voor haar technische assistentie. Dit onderzoek werd financieel ondersteund door het Sloveense Agentschap voor Onderzoek en Innovatie (onderzoek kernfinanciering nr. P4-0165 en project Z4-3217: Deciphering redox-related signaling interconnectedness in aardappelresistentie tegen virussen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Autoclave A-21 CAV | Kambi |
N/A | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
| Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
| DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
| Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
| Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
| Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
| Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
| Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
| Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
| Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
| Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
| Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
| Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
| NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
| Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
| pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
| Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
| Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
| Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
| Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
| Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
| Tweezers | Braun | BD033R |
References
- Karasev, A. V., Gray, S. M. Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato. Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).
- Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity. Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).
- Szajko, K., et al. The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance. Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).
- Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding. Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).
- Lukan, T., et al. Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato. Frontiers in Plant Science. 9, 168 (2018).
- Baebler, Š, et al. Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato. Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).
- Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy. Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).
- Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. Potato in vitro culture techniques and biotechnology. Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator). Nature. 470, 110-115 (2011).
- Roden, L. C., Ingle, R. A. Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions. Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).
- Srivastava, D., et al. Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response. Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).
- Mulaosmanovic, E., et al. High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis. Plant Methods. 16, 62 (2020).
- Martinelli, F., et al. Advanced methods of plant disease detection. A review. Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).
- Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review. Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426 (2019).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Rowarth, N. M., et al. RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis). BMC Plant Biology. 21 (1), 375 (2021).
