Summary
यहाँ हम कोशिका मृत्यु प्रेरण के बाद लगातार इमेजिंग टीका पत्तियों द्वारा क्रमादेशित कोशिका मृत्यु दीक्षा की दर का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (एचआर) -प्रदत्त प्रतिरोध एक प्रभावी रक्षा प्रतिक्रिया है जिसे एन प्रतिरोध जीन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। एचआर टीका पत्तियों पर कोशिका मृत्यु क्षेत्रों के गठन के रूप में प्रकट होता है। यहां, एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिका मृत्यु दीक्षा और कोशिका मृत्यु उपस्थिति के बीच के समय में इमेजिंग इनोक्यूलेटेड पत्तियों द्वारा कोशिका मृत्यु दीक्षा की दर का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। डिजिटल माइक्रोस्कोप वांछित अंतराल में एक सतत इमेजिंग प्रक्रिया को सक्षम बनाता है, जो पारंपरिक तरीकों में घंटों के विपरीत, मिनटों तक कोशिका मृत्यु दीक्षा दर का सटीक निर्धारण करने की अनुमति देता है। डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग भी प्रकाश से स्वतंत्र है और इसलिए पौधे की सर्कैडियन लय को परेशान किए बिना दिन और रात के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है। क्रमादेशित कोशिका मृत्यु विकास में जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न पैथोसिस्टम मामूली संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल इस प्रकार कोशिका मृत्यु दीक्षा दर की सरल, सटीक और सस्ती पहचान की अनुमति देता है।
Introduction
आलू दुनिया की सबसे व्यापक रूप से उगाई जाने वाली खाद्य फसलों में से एक है, चावल, गेहूं और मकई के बाद चौथा स्थान है। हालांकि, आलू का उत्पादन आलू वायरस वाई (पीवीवाई) से गंभीर रूप से प्रभावित हो सकता है, जिसे वर्तमान में इसका सबसे महत्वपूर्ण वायरस रोगज़नक़ 1,2 माना जाता है। आलू के पौधों में सीवी। Rywal, PVY के कई उपभेद (PVY तनाव N-Wilga सहित) अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (HR) -प्रदत्त प्रतिरोध को ट्रिगर करते हैं, जहां संक्रमण स्थल पर रोगज़नक़ का प्रतिबंध टीका पत्तियों पर नेक्रोटिक घावों के रूप में प्रकट होता है3. इस पैथोसिस्टम में, एचआर को एनवाई -1 प्रतिरोध जीन द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, जो तापमान पर निर्भर है, क्योंकि कम तापमान पर उगाए गए पौधे कुशलतापूर्वक नेक्रोटिक घावों को विकसित करते हैं, जबकि ऊंचे (28 डिग्री सेल्सियस) तापमान पर संवैधानिक रूप से उगाए गए पौधों में, प्रतिरोध का गर्भपात घाव गठन की कमी और प्रणालीगत वायरस प्रसार 3,4 के रूप में प्रदर्शित होता है. जब पौधों को कम तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित किया जाता है, तो कोशिका मृत्यु शुरू की जाती है, जिसका उपयोग कोशिका मृत्यु दीक्षा और कोशिका मृत्यु उपस्थिति के बीच के समय में इमेजिंग इनोक्यूलेटेड पत्तियों द्वारा कोशिका मृत्यु दीक्षा की दर का पालन करने के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिका मृत्यु दीक्षा दर के निर्धारण के लिए एक सरल विधि प्रदर्शित करता है। पौधे को 28 डिग्री सेल्सियस से 22 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करने के बाद टीका पत्तियों की इमेजिंग करके, एक डिजिटल माइक्रोस्कोप वांछित अंतराल में पत्ती के निरंतर अवलोकन को सक्षम बनाता है। अन्य तरीकों के उपयोग के विपरीत (उदाहरण के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी या नग्न आंखों के साथ घाव गठन के अवलोकन), यह घाव गठन का सही समय और इसलिए, कोशिका मृत्यु दीक्षा दर मिनट ठीक करने के लिए निर्धारित करने की अनुमति देता है, के रूप में aforementioned तरीकों 5,6 में घंटे के विपरीत. डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रकाश से भी स्वतंत्र है और इसलिए इसका उपयोग दिन और रात के दौरान किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिका मृत्यु दीक्षा में शामिल घटकों की पहचान करने या कोशिका मृत्यु दीक्षा दर पर विभिन्न घटकों के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है यदि उपयोग किए गए पौधे ट्रांसजेनिक हैं और ब्याज के घटकों के स्तर को बदल दिया है।
Protocol
नोट: धारा 1 और 2 लुकान एट अल.7द्वारा उल्लिखित तरीकों के आधार पर संयंत्र सामग्री तैयार करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन. विशेष रूप से, नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों और इनोकुलम तैयारी में कुछ संशोधन किए गए थे।
1. आलू के पौधे उगाना
- स्वस्थ आलू सीवी उगाएं। स्टेम नोड टिशू कल्चर में रयवाल पौधे8.
- 6-8 सप्ताह के बाद, बाँझ चिमटी और एक स्केलपेल चाकू का उपयोग बाँझ शर्तों के तहत बाँझ कागज पर आलू के पौधों से नोड्स युक्त दस 1 सेमी लंबे explants कटौती.
- उन्हें मुराशिगे और स्कूग (MS30) माध्यम (चित्रा 1 ए) के साथ प्लास्टिक के बक्से में स्थानांतरित करें और उन्हें नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में विकसित करें (प्रकाश में 22 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में 19 डिग्री सेल्सियस 250 माइक्रोन या μmol/m2/s विकिरण और 16-एच फोटोपेरियोड, 55% ± 5% की सापेक्ष आर्द्रता पर)।
- माइक्रोप्रोपैजेशन के 2 सप्ताह बाद उन्हें मिट्टी में स्थानांतरित करें।
- बर्तनों (r = 10 cm) को मिट्टी से भरें। एक बर्तन के बीच में मिट्टी में 3-4 सेमी गहरा छेद बनाने के लिए एक उंगली का उपयोग करें, छेद को पानी से भरें, और इसके अवशोषित होने की प्रतीक्षा करें।
- छेद में प्रति गमले में एक पौधा रखें, पत्तियों को सतह के ऊपर छोड़ दें। धीरे मिट्टी (चित्रा 1 बी) के साथ जड़ों को कवर.
नोट: कुछ पौधों में जड़ें विकसित नहीं हो सकती हैं। विश्लेषण से उन पौधों को बाहर करें।
- नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में एक विकास कक्ष में मिट्टी में पौधों को उगाएं (प्रकाश में 22 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में 19 डिग्री सेल्सियस, 55% ± 5% की सापेक्ष आर्द्रता पर, 250 μmol/m2/s विकिरण और 16-घंटे फोटोपेरियोड के साथ)।
- 3-4 सप्ताह के बाद, पौधे तैयार हैं। टीका लगाने के लिए इन पौधों का उपयोग करें।
नोट: पौधों में दिखाई देने वाले पत्रक (चित्रा 1 सी) के साथ कम से कम 3-4 पूरी तरह से विकसित पत्तियां होनी चाहिए। उन्हें स्वस्थ दिखना चाहिए, जिसमें कोई लक्षण दिखाई नहीं दे रहे हैं (पीले या भूरे रंग के पत्ते), जो पीवीवाई के कारण घावों के लिए गलत हो सकते हैं। तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, पौधों को एक ही समय में (जैसे, सुबह 9 बजे) सभी प्रयोगों में पौधे की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और घाव के गठन 9,10,11पर सर्कैडियन लय के संभावित प्रभावों से बचने के लिए टीका लगाया जाना चाहिए।
2. इनोकुलम तैयारी और आलू का टीका
- पीवीवाई स्ट्रेन एन-विल्गा (पीवीवाईएन-वाई; परिग्रहण संख्या) के साथ पौधे को टीका लगाएं। EF558545) इनोकुलम जैसा कि नीचे बताया गया है।
नोट: एक से अधिक डिजिटल माइक्रोस्कोप उपलब्ध होने पर समानांतर में अधिक पौधों को टीका लगाया जा सकता है। पौधों में टीकाकरण से पहले कम से कम तीन पूरी तरह से विकसित पत्तियां होनी चाहिए (चित्र 1सी)। पीवीवाईएन-वाई को आलू सीवी पेंटलैंड में गुणा और रखरखाव किया जाता है।- टीकाकरण के लिए सोडियम डायथाइलडिथियोकार्बामेट (डीईईसीए) के साथ पूरक फॉस्फेट बफर तैयार करें: 0.2 एम एनएएच 2 पीओ 4 के 1.3 एमएल, 0.2 एमना2एचपीओ4 के 8.7 एमएल और डीआईईसीए के 0.225 ग्राम मिलाएं। ddH20 का उपयोग करके वॉल्यूम को 100 एमएल तक बनाएं। 1 M NaOH या 1 M HCl समाधान जोड़कर pH को 7.6 में समायोजित करें।
- 6-8 सप्ताह पुराने PVYN-Wi संक्रमित आलू cv की कटाई करें। फिल्टर नेट (0.5 ग्राम प्रति 6 पौधों) के साथ निष्कर्षण बैग में टिशू कल्चर से पेंटलैंड पौधे और डीआईईसीए (पौधे सामग्री का 4x द्रव्यमान, द्रव्यमान: मात्रा अनुपात) के साथ पूरक फॉस्फेट बफर जोड़ें। एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए 1-2 मिनट के लिए एक हाथ homogenizer का प्रयोग करें.
- 3-4 सप्ताह पुराने आलू के पौधों (चरण 1.6 से) की पहली तीन नीचे की पूरी तरह विकसित पत्तियों को कार्बोरंडम पाउडर से हल्के से धूल लें।
नोट: कार्बोरंडम पाउडर की मात्रा समायोजित करें। बहुत अधिक नुकसान हो सकता है, जबकि बहुत कम अप्रभावी संक्रमण हो सकता है। इष्टतम रूप से, 0.1 मिलीग्राम/सेमी कार्बोरंडम पाउडर का उपयोग किया जाता है, जो औसत आकार (लगभग 1.5 सेमी2) के प्रति पत्ती लगभग 15 मिलीग्राम पाउडर है। - धीरे से इनोकुलम (~ 100 माइक्रोन प्रति पत्ती) के साथ पत्तियों को रगड़ें। 10 मिनट के बाद, अच्छी तरह नल के पानी के साथ पत्तियों धो लें.
- सावधान रहें कि पत्तियों को नुकसान न पहुंचे। इनक्यूबेशन समय से अधिक न करें। पत्ती के आकार के अनुसार इनोकुलम की मात्रा को समायोजित करें - 6.5 μL/cm, जो औसत आकार (लगभग 100 सेमी2) की पत्ती प्रति पत्ती लगभग 15 μL है।
- पौधों को एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें और उन्हें नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में विकसित करें (प्रकाश में 28 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में 28 डिग्री सेल्सियस 55% की सापेक्ष आर्द्रता पर 55% ± 5% की सापेक्ष आर्द्रता पर, 250 μmol/m2/s विकिरण और 16 घंटे फोटोपेरियोड) 3 दिनों के लिए।
3. घाव के विकास की रिकॉर्डिंग के लिए पौधे की तैयारी और डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना
- चरण 1.5 में वर्णित अन्य स्थितियों के साथ, टीकाकरण के 3 दिनों के बाद 22 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा विकास कक्ष से टीका लगाए गए पौधों को स्थानांतरित करें।
- अवलोकन के लिए एक पौधे का चयन करें। टेप (चित्रा 1 डी) का उपयोग कर दूसरे टीका पत्ती स्थिरीकरण. सुनिश्चित करें कि वांछित पत्ती इमेजिंग (चित्रा 1 डी) के साथ शुरू करने से पहले पूरी तरह से स्थिर है।
- लैपटॉप कंप्यूटर पर छवि कैप्चर के लिए एक सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन इंस्टॉल करें। डिजिटल माइक्रोस्कोप को कंप्यूटर से कनेक्ट करें। सॉफ्टवेयर खोलें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्लांट, डिजिटल माइक्रोस्कोप और लैपटॉप कंप्यूटर में प्लग करने के लिए सॉकेट के पास शेल्फ पर स्थित हैं। निगरानी की जाने वाली पत्तियों के चयन पर निर्णय अध्ययन किए गए जैविक प्रश्न पर निर्भर हो सकता है, उदाहरण के लिए, प्रक्रिया का प्रकार जो सीमित क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के गठन की ओर जाता है। - स्थिर पत्ती के ऊपर माइक्रोस्कोप को समायोजित करें। डिजिटल माइक्रोस्कोप ( चित्रा 1E में दिखाया गया है) पर डायल का उपयोग कर फोकस.
- सुनिश्चित करें कि घाव के गठन को पकड़ने की संभावना को बढ़ाने के लिए दृष्टि की रेखा यथासंभव चौड़ी है, लेकिन फिर भी घाव की उपस्थिति को देखने के लिए पर्याप्त रूप से बढ़ाई गई है (आमतौर पर, 25x आवर्धन का उपयोग किया जाता है)।
- कॅमेरा सेटिंग्ज सेट करा. छवि के ऊपरी दाएं कोने में सेटिंग बटन पर क्लिक करें (चित्र 2A, भाग 1 की परिक्रमा करें) और कैमरा सेटिंग्स समायोजित करें: चमक (60-70), कंट्रास्ट (10-15), ह्यू (0), श्वेत संतुलन, संतृप्ति (45-50), तीक्ष्णता (0), गामा (5) (चित्र 2B)। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स निम्नानुसार थीं: चमक (64), कंट्रास्ट (14), ह्यू (0), संतृप्ति (47), तीक्ष्णता (0), गामा (5)।
नोट: सर्वोत्तम छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए कैमरा सेटिंग्स को बाहरी प्रकाश में समायोजित किया जाना चाहिए। विकास कक्ष में उपयोगकर्ता की स्थितियों के अनुसार सेटिंग्स को अनुकूलित किया जा सकता है। - छवि कैप्चर (चित्रा 2 सी, परिक्रमा भाग 2) के लिए आइकन पर क्लिक करके छवि कैप्चर सेटिंग्स सेट करें। टाइम-लैप्स वीडियो बटन पर क्लिक करें और 24 घंटे (चित्रा 2 सी) के लिए हर 15 मिनट में इमेज कैप्चर सेट करें।
नोट: ली गई छवियों और इमेजिंग अवधि के बीच का अंतराल पूरी तरह से लचीला है और प्रयोग की जरूरतों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। छवि कैप्चर के बीच के समय में, एलईडी लाइट बंद हो जाती है। छवि कैप्चर के दौरान एलईडी लाइट स्वचालित रूप से चालू हो जाती है। - स्टार्ट बटन (चित्रा 2 सी) पर क्लिक करके छवि कैप्चर शुरू करें।
नोट: 28 डिग्री सेल्सियस से 22 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित होने के बाद, पौधों को 24 घंटे के भीतर घावों को विकसित करना शुरू कर देना चाहिए। यदि नहीं, तो यह अप्रभावी टीकाकरण का संकेत हो सकता है। कार्बोरंडम पाउडर की मात्रा को समायोजित करें, सुनिश्चित करें कि पत्तियों पर इनोकुलम इनक्यूबेशन का समय सही था, और क्यूपीसीआर द्वारा इनोकुलम में वायरस बहुतायत का निर्धारण करें। - छवियों को बचाने के लिए, सभी छवियों का चयन करें और सहेजें आइकन (चित्रा 2 बी, परिक्रमा भाग 3) पर क्लिक करें। निर्यात विकल्प सेट करें. डीपीआई को अधिकतम (300) (चित्रा 2 डी) पर सेट करें। सहेजने के बाद, प्रोग्राम में सभी चित्रों को हटा दें।
- छवि विश्लेषण के लिए, छवि देखने/संपादन के लिए कोई भी कार्यक्रम पर्याप्त है। छवि संपादन के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग, ImageJ, नीचे समझाया गया है।
- दृष्टि के एकल क्षेत्र से छवियों का समय अनुक्रम आयात करें (ऊपरी बाएं कोने पर, फ़ाइल पर क्लिक करें, आयात करें और फिर छवि अनुक्रम चुनें)। सहेजे गए चित्रों की निर्देशिका का पथ पेस्ट करें और रूपांतरण शुरू करने के लिए ओके बटन दबाएं।
- रूपांतरण के बाद, सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से अंतिम वीडियो दिखाते हुए एक आंतरिक वीडियो प्लेयर खोलता है। File > Save as विकल्प पर क्लिक करके और AVI फॉर्मेट का चयन करके वीडियो फ़ाइल निर्यात करें। एक छोटी सी खिड़की खुलती है। फ़्रेम दर को 0.3 fps के रूप में सेट करें और वीडियो को AVI वीडियो फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए OK दबाएं।
नोट: घाव के विकास का समय मैन्युअल रूप से सभी छवियों की जांच करके और एक छवि ढूंढकर भी निर्धारित किया जा सकता है जहां घाव दिखाई देता है।
Representative Results
यह अध्ययन आलू सीवी पर घाव की घटना के माध्यम से कोशिका मृत्यु दीक्षा का अध्ययन करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। Rywal, एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ। यह क्रमादेशित कोशिका मृत्यु दीक्षा का सही समय निर्धारित करने में सक्षम बनाता है।
जिन पौधों की जड़ें विकसित हुई हैं, उन्हें आलू सीवी के 2 सप्ताह बाद मिट्टी में डाल दिया गया था। रयवाल माइक्रोप्रोपैगेशन(चित्रा 1ए,बी)। वर्णित परिस्थितियों में विकास के 3-4 सप्ताह के बाद, कम से कम 3-4 पूरी तरह से विकसित पत्तियों वाले पौधे दिखाई देने वाले पत्रक के साथ जो स्वस्थ दिखते थे, जिसमें अनुपस्थिति के कोई संकेत नहीं थे, आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए थे (चित्र 1सी)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का प्रयोग, हम 15 मिनट के अंतराल पर टीका पत्ती पर एक ही क्षेत्र मनाया और घाव घटना और समय में विस्तार (चित्रा 3) निर्धारित किया. घाव 15 घंटे 30 मिनट (चित्रा 3) में हुआ।
चित्रा 1: एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण के लिए संयंत्र की तैयारी । (ए) एमएस 30 मध्यम और आलू सीवी के साथ एक प्लास्टिक बॉक्स। रयवाल नोड्स युक्त एक्सप्लांट। (B) आलू cv. मिट्टी में रयवाल का पौधा (माइक्रोप्रोपैगेशन के 2 सप्ताह बाद)। (C) आलू cv. रयवाल पौधा, टीकाकरण के लिए तैयार (मिट्टी में डालने के 4 सप्ताह बाद), कम से कम तीन पूरी तरह से विकसित पत्तियां होती हैं। (D) आलू cv का दूसरा टीका पत्ती (तीर)। Rywal संयंत्र तैनात और immobilized (तीर) टेप के साथ। (ई) संयंत्र डिजिटल माइक्रोस्कोप के नीचे तीर ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया डायल की ओर इशारा करते हुए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: घाव के विकास की रिकॉर्डिंग के लिए डिजिटल सॉफ्टवेयर सेटिंग। (ए) सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस - लाल रंग के साथ गोलाकार (1) कैमरा सेटिंग्स, (2) छवि कैप्चर सेटिंग्स, और (3) छवियों को सहेजने के लिए बटन के विकल्प हैं। (बी) कैमरा सेटिंग्स के साथ विंडो, जो पैनल ए में (1) पर एक क्लिक के साथ खुलती है। चमक, कंट्रास्ट, संतृप्ति, तीक्ष्णता और गामा को ठीक से समायोजित किया जाना चाहिए। (सी) छवि कैप्चर सेटिंग्स के साथ विंडो, जो पैनल ए में दर्शाए गए (2) पर एक क्लिक के साथ खुलती है। (डी) छवि बचत सेटिंग्स के साथ विंडो, जो पैनल ए में दर्शाए गए (3) पर एक क्लिक के साथ खुलती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: डिजिटल माइक्रोस्कोप के तहत मनाया टीका पत्ती पर घाव गठन. 23.6x आवर्धन पर पीवीवाई-टीका आलू के पत्ते के मध्य भाग की छवियां जैसा कि डिजिटल माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया है, 5 मिनट के अंतराल पर लिया गया है। टीका लगाए गए पौधों को 3 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था, और तीसरे दिन, 22 डिग्री सेल्सियस पर एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन 7:00 बजे शुरू हुआ। (ए) 21:02 बजे, घाव अभी तक दिखाई नहीं दे रहा है, (बी) 90 मिनट बाद, 22:32 बजे, घाव दिखाई दे रहा है। (सी) घाव का विस्तार अगली सुबह 01:02 और (डी) 07:32 पर देखा गया था। प्रयोग दो बार दोहराया गया था, और घाव क्रमशः कोशिका मृत्यु दीक्षा के बाद 8 घंटे 15 मिनट और 12 घंटे हुए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
प्रदर्शित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिका मृत्यु दीक्षा और कोशिका मृत्यु उपस्थिति के बीच के समय में लगातार इमेजिंग द्वारा कोशिका मृत्यु दीक्षा दर को सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देता है। हालांकि घाव और पौधे की बीमारीकी घटना 12,13,14,15 की निगरानी के कई तरीके हैं, इस प्रोटोकॉल संयंत्र circadian लय परेशान बिना प्रकाश स्वतंत्र माप का लाभ प्रस्तुत करता है, के रूप में प्रकाश माप के बीच बंद कर दिया है.
टीकाकरण के बाद, पौधों को 3 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ना चाहिए। एनवाई -1 प्रतिरोध जीन, जो एक अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, तापमान पर निर्भर है, और उच्च तापमान पर उगाए गए पौधों में, प्रतिरोध के गर्भपात की ओर जाता है, जो घाव के गठन और प्रणालीगत वायरस प्रसार की कमी के रूप में प्रकट होता है3. पौधों को 22 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करने के बाद, कोशिका मृत्यु शुरू की जाती है, इसलिए सटीक परिणामों के लिए, इस हस्तांतरण के बाद जितनी जल्दी हो सके डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन शुरू होना चाहिए। इमेजिंग के लिए पौधे की तैयारी में एक और महत्वपूर्ण कदम पत्ती(चित्रा 1डी)का स्थिरीकरण है, क्योंकि पौधे इमेजिंग के दौरान बढ़ता रहेगा, जो मनाया पत्ती को फोकस से बाहर ले जा सकता है, या इस तरह के सेट-अप वांछित परिणाम नहीं देगा।
यदि वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग ट्रांसजेनिक पौधों पर ब्याज के परिवर्तित घटकों के साथ किया जाता है, तो कोशिका मृत्यु दीक्षा में शामिल होने की परिकल्पना की जाती है, प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को यह निर्धारित करने में सक्षम बनाता है कि अध्ययन किए गए घटक का घटा हुआ स्तर कोशिका मृत्यु दीक्षा की दर को प्रभावित करता है या नहीं। इसके द्वारा, कोशिका मृत्यु दीक्षा में शामिल घटकों को पैथोसिस्टम में पहचाना जा सकता है, जहां इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके क्रमादेशित कोशिका मृत्यु होती है। इन घटकों की पहचान करने के लिए अन्य तरीकों हैं, उदाहरण के लिए, ऐसे आरएनए-सीक्यू या माइक्रोस्कोपी के विभिन्न रूपों के रूप में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण, जो महंगा और समय लेने वाली16 हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि ट्रांसजेनिक और नियंत्रण पौधों के बीच कोशिका मृत्यु दीक्षा दर में अंतर को देखकर कोशिका मृत्यु दीक्षा में शामिल घटकों की आसान और सस्ती पहचान के लिए अनुमति देता है. बेहतर रूप से, इस तरह के सेट-अप में, दो डिजिटल कैमरों का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि एक ट्रांसजेनिक संयंत्र का विश्लेषण उसी प्रयोग के भीतर एक नियंत्रण संयंत्र के समानांतर किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में, पीवीवाई तनाव एन-विल्गा का उपयोग किया गया था; हालांकि, इस वायरस के अन्य उपभेदों, उदाहरण के लिए, GFP-टैग PVY (PVY-N605(123)-GFP)7, भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, अन्य पैथोसिस्टम, जिसके परिणामस्वरूप क्रमादेशित कोशिका मृत्यु विकास का अध्ययन मामूली संशोधन के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जा सकता है।
Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए बारबरा जैकलिक को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को स्लोवेनियाई रिसर्च एंड इनोवेशन एजेंसी (रिसर्च कोर फंडिंग नंबर P4-0165 और प्रोजेक्ट Z4-3217: वायरस के खिलाफ आलू प्रतिरोध में रेडॉक्स से संबंधित सिग्नलिंग इंटरकनेक्टेडनेस को समझना) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Autoclave A-21 CAV | Kambi |
N/A | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
| Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
| DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
| Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
| Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
| Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
| Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
| Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
| Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
| Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
| Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
| Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
| Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
| NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
| Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
| pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
| Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
| Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
| Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
| Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
| Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
| Tweezers | Braun | BD033R |
References
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