Summary
As próteses retinianas têm a capacidade de gerar percepções visuais. Para avançar no desenvolvimento de novas próteses, são necessários métodos ex vivo para testar os dispositivos antes do implante. Este artigo fornece um protocolo abrangente para o estudo da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina quando submetido à estimulação elétrica.
Abstract
As distrofias retinianas são uma das principais causas de cegueira em todo o mundo. Esforços extensivos estão em andamento para desenvolver próteses retinianas avançadas que possam contornar as células fotorreceptoras sensíveis à luz prejudicadas na retina degenerada, com o objetivo de restaurar parcialmente a visão induzindo percepções visuais. Uma via comum de investigação envolve o projeto e a produção de dispositivos implantáveis com uma estrutura física flexível, abrigando um alto número de eletrodos. Isso permite a geração eficiente e precisa de percepções visuais. No entanto, a cada avanço tecnológico, surge a necessidade de um método ex vivo confiável e gerenciável para verificar a funcionalidade do dispositivo antes de progredir para experimentos in vivo , onde fatores além do desempenho do dispositivo entram em jogo. Este artigo apresenta um protocolo abrangente para estudar a atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina (GCL) após estimulação elétrica. Especificamente, as seguintes etapas são descritas: (1) marcação fluorescente da retina de ratos usando indicadores de cálcio codificados geneticamente, (2) captura do sinal de fluorescência usando um microscópio de fluorescência invertida enquanto se aplicam padrões distintos de estimulação elétrica, e (3) extração e análise dos traços de cálcio de células individuais dentro da GCL. Ao seguir esse procedimento, os pesquisadores podem testar eficientemente novos protocolos de estimulação antes de realizar experimentos in vivo .
Introduction
A retina contém fotorreceptores, que são células responsáveis por detectar a luz. Eles capturam fótons e os convertem em impulsos nervosos. Esses impulsos são então processados dentro da retina e transmitidos ao córtex visual, resultando na formação de uma imagem visual1. A Retinose Pigmentar (RP) e a Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI) são doenças degenerativas caracterizadas pela perda progressiva dos fotorreceptores. Essas retinopatias estão entre as principais causas de cegueira no mundo1, impactando milhões de indivíduos e tendo consequências médicas, pessoais e socioeconômicas significativas para os pacientes, os sistemas de saúde e a sociedade como um todo. Além disso, com o envelhecimento da população, projeta-se que os casos de DMRI aumentem em 15% até 20502.
Atualmente, inúmeras pesquisas estão em andamento para restaurar a visão em pacientes afetados por essascondições3. Uma abordagem promissora é o uso de próteses retinianas, que têm demonstrado eficácia na restauração parcial da visão 4,5. Esses dispositivos captam a luz da cena visual e a convertem em pulsos elétricos. Esses pulsos são entregues através de eletrodos dentro de um arranjo de microeletrodos (MEA) implantado no olho, estimulando os neurônios sobreviventes e ignorando a função dos fotorreceptores perdidos. As células ganglionares ativadas da retina (CGRs) transmitem a saída para o cérebro, onde é interpretada como percepção visual. Entretanto, as principais limitações dos implantes atuais residem na resolução da interface eletrodo-tecido6 e na estimulação não seletiva dos diferentes tipos celulares. Portanto, para otimizar o projeto de novos dispositivos implantáveis para uma restauração da visão mais eficiente, é crucial entender como paradigmas de estimulação podem ser desenvolvidos para ativar seletivamente células próximas aos eletrodos.
A cintilografia com cálcio é uma técnica amplamente empregada no estudo da atividade neural, oferecendo diversas vantagens em relação aos métodos nãoópticos7,8. Em primeiro lugar, fornece resolução celular e subcelular. Em segundo lugar, os marcadores de cálcio podem ter como alvo tipos celulares específicos. Em terceiro lugar, permite o rastreamento a longo prazo e, em quarto lugar, permite a observação de populações celulares inteiras, distinguindo entre células ativas e inativas. Este método fornece evidência indireta de atividade celular com uma resolução temporal na faixa de centenas de milissegundos. Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente, como os sensores GCaMP, sofrem uma mudança conformacional ao se ligarem ao cálcio, resultando em aumento da fluorescência9. Os vetores virais adenoassociados (AAVs) recombinantes são um meio eficaz de transdução de células da retina com GCaMP10.
Este protocolo apresenta um método eficiente que utiliza imagens de cálcio para testar protocolos de estimulação de implantes de retina. Especificamente, nos concentramos no tecido retiniano de rato ex vivo e fornecemos instruções detalhadas passo a passo, desde a aquisição da amostra até a análise dos dados. Ao oferecer este guia abrangente, pesquisadores de várias origens podem embarcar na experimentação de estimulação elétrica com confiança.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas animais padrão (Diretiva 86/609/UE das Comunidades Europeias) e aprovados pelos comitês locais de ética animal. Ratos Long Evans com 8 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação de suportes e montagem plana
- Meio de Ames (1 L)
- Em um frasco de vidro de 1 L, combine o pó Ames' Medium, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml de Penicilina/Estreptomicina 100x e 1 L de água deionizada (ver Tabela de Materiais). Ajustar o pH para 7,4 e a osmolaridade para 280 mOsm com água deionizada ou NaHCO3. Esterilizar a solução filtrando-a através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm sob uma capa.
NOTA: Conservar o meio esterilizado a 4 °C. Esta solução permanece estável e pode ser usada por até 1 mês.
- Em um frasco de vidro de 1 L, combine o pó Ames' Medium, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml de Penicilina/Estreptomicina 100x e 1 L de água deionizada (ver Tabela de Materiais). Ajustar o pH para 7,4 e a osmolaridade para 280 mOsm com água deionizada ou NaHCO3. Esterilizar a solução filtrando-a através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm sob uma capa.
- Membranas de montagem
- Conecte uma membrana porosa de PTFE (consulte Tabela de Materiais) a uma lavadora usando pequenas gotas de cola. Deixe secar por pelo menos 15 min.
- Para obter translucidez, mergulhe as membranas em etanol 70% por 1 min.
- Enxaguar as membranas duas vezes com água deionizada para remover completamente o etanol. Armazene-os em água deionizada para evitar opacidade.
2. Marcação GCL e montagem plana da retina do rato
Observação : este método de marcação não diferencia RGCs de células amacrinas deslocadas. Se a marcação seletiva de RGCs for desejada, considere o uso de AAVs com promotores específicos para RGC11 e/ou marcação retrógrada através do nervo óptico12. Para discriminar entre classes de CGRs centrais, classificar os RGCs com base em sua resposta à luz13,14 e utilizar versões mais recentes de indicadores de cálcio codificados geneticamente que oferecem maior sensibilidade e capacidade de medir potenciais de ação únicos15.
- Injeção intravítrea
- Anestesiar o rato Long Evans de 8 semanas de idade com isoflurano a 2%/O2 a 1% até que não haja reflexo pedal e manter a anestesia com uma máscara nasal de rato (ver Tabela de Materiais).
OBS: Durante a anestesia, posicione o animal sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. - Administrar uma gota de colírio disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) para dilatar a pupila.
- Antes de prosseguir com a cirurgia, examine o olho em busca de anormalidades usando fundoscopia e tomografia de coerência óptica (OCT) com um sistema de imagem retiniana in vivo . Aplicar uma gota de Methocel 2% para facilitar o contacto córneo-objetivo (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Se alguma anormalidade for detectada, não prossiga com as etapas subsequentes para esse olho. - Aplicar uma gota de Prescaína como anestésico local. Fixar a pálpebra e a conjuntiva limbal com um filamento de sutura comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Criar uma esclerotomia de 1 mm a 4 mm do limbo usando uma agulha de 30 G.
- Anexar uma agulha romba de 36 G a uma seringa de precisão e injetar as partículas de AAV que transportam o indicador de cálcio codificado geneticamente no vítreo por 30 s, em um ângulo de 45°. Neste estudo, utilizamos AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x10 11 GC/mL em HBSS) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As construções AAV que não codificam produtos genéticos potencialmente tumorigênicos ou moléculas de toxinas e são produzidas sem um vírus auxiliar podem ser manipuladas em instalações de Nível de Biossegurança 1 (BSL-1). Caso contrário, se considerado material bioperigoso sob contenção BSL-2, precauções adequadas devem ser tomadas16. Os AAVs que codificam para GCaMP são considerados BSL-1 e não requerem manipulação sob gabinetes de biossegurança.
- Anexar uma agulha romba de 36 G a uma seringa de precisão e injetar as partículas de AAV que transportam o indicador de cálcio codificado geneticamente no vítreo por 30 s, em um ângulo de 45°. Neste estudo, utilizamos AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x10 11 GC/mL em HBSS) (ver Tabela de Materiais).
- Aplicar uma gota de Tobradex (ver Tabela de Materiais) para prevenir a inflamação e como profilaxia antibiótica.
- Se desejar, repita as etapas 2, 3 e 4 com o outro olho.
NOTA: Verifique os animais 12-24 h após a cirurgia para garantir que não há reações adversas. - Três dias após a injeção, examine a estrutura da retina usando fundoscopia e OCT com um sistema de imagem retiniana in vivo (ver Tabela de Materiais).
- Duas semanas após a injeção, o GCL deve emitir fluorescência. Avaliar a estrutura retiniana e a expressão de AAV por fundoscopia de fluorescência usando um sistema de imagem retiniana in vivo .
NOTA: Segundo Weitz et al.12, a fluorescência do AAV2-CAG-GCaMP5G torna-se perceptível em 1 semana pós-injeção e intensifica-se em 2 semanas. A partir da quarta semana, a superexpressão de GCaMP induz citomorbidade. As células moribundas exibem um alto sinal basal de fluorescência no núcleo e no citoplasma que não flutua em resposta à estimulação. Em células normais, a expressão de GCaMP é confinada ao citoplasma e excluída do núcleo 7,8,12,17,18. Essas características podem ser observadas ex vivo durante exames de microscopia. A janela de expressão gênica pode variar dependendo do vetor viral e do promotor escolhido.
- Anestesiar o rato Long Evans de 8 semanas de idade com isoflurano a 2%/O2 a 1% até que não haja reflexo pedal e manter a anestesia com uma máscara nasal de rato (ver Tabela de Materiais).
- Excisão de retina e montagem plana
NOTA: Duas a três semanas após a injeção, os ratos injetados intravítreos são eutanasiados imediatamente antes do início do protocolo de eletrofisiologia, de acordo com as diretrizes éticas padrão (Diretiva 86/609/UE das Comunidades Europeias) e aprovadas pelos comitês de ética locais. A inalação de dióxido de carbono (CO2) é utilizada como método de eutanásia neste protocolo.- Enucleação ocular
- Pressione suavemente o exterior da órbita usando um par de pinças curvas para projetar ligeiramente o olho da cavidade ocular.
- Use uma tesoura de mola para cortar os músculos que seguram o olho e enucleá-lo, tomando cuidado para não perfurar o globo ocular.
OBS: A partir desta etapa, dissecar a retina sob estereomicroscópio em meio de Ames oxigenado (95% O2 /5% CO2).
- Excisão de retina
- Use um par de pinças curvas pequenas e uma tesoura de mola fina para remover todo o tecido circundante do globo ocular.
- Pegue um pedaço de papel de filtro de aproximadamente 3 cm x 3 cm e coloque-o na tampa de um prato de 3,5 cm. Mergulhe o papel com o Medium de Ames.
- Coloque o globo ocular sobre o papel, com o segmento anterior voltado para o operador. Use um par de pinças retas para segurar o globo ocular, posicionando-as em cima da ora serrata em um ângulo de aproximadamente 45° da superfície do prato. Faça um pequeno corte com uma lâmina, utilizando o espaço entre as pinças retas como referência.
- Reembolse o globo ocular no meio de Ames. Use uma pinça reta e uma tesoura fina para separar os segmentos anterior e posterior do olho.
- Remova cuidadosamente a lente usando dois pares de pinças retas. Em seguida, separe a retina da esclera.
- Corte a esclera em direção ao nervo óptico usando uma tesoura fina de mola até que a retina seja isolada da ocular.
- Use um estereomicroscópio de fluorescência para identificar a região da retina com a melhor expressão indicadora de cálcio.
NOTA: A extensão da propagação viral depende do sucesso da injeção intravítrea. Conseguir fluorescência em grandes porções da retina pode exigir prática. A experiência do investigador desempenha um papel crucial na obtenção de resultados ótimos. - Usando uma pipeta de plástico de ponta cortada, transfira a peça selecionada da retina para a membrana de montagem (etapas das membranas de montagem). Use um par de pinças retas para montar a retina com a GCL voltada para cima.
- Com uma pipeta de plástico acoplada a uma ponta de pipeta de 100 μL, remova o meio para permitir que a peça de retina adera à membrana porosa. Vire o conjunto para o MEA para que o GCL fique em cima dos eletrodos.
- Encher o banho de amostra com meio de Ames oxigenado.
- Enucleação ocular
3. Imagem ex vivo de cálcio após estimulação elétrica
NOTA: Neste trabalho, uma prova de conceito MEA foi usada para experimentação ex vivo . Os MEAs personalizados foram confeccionados com eletrodos à base de grafeno poroso de 25 μm de diâmetro sobre vidro borossilicato de 500 μm de espessura com traços de Ti/Au e posteriormente isolados com nitreto de silício e fotorresiste SU-812. No entanto, os métodos de imagem com cálcio são válidos independentemente do material do eletrodo usado para estimulação.
- Ajuste o sistema de perfusão de modo que o meio de Ames oxigenado perfunde constantemente o banho de amostra a 33 °C a uma vazão constante de 5 mL/min.
- Usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lâmpada fluorescente, um cubo de filtro FITC e uma câmera CMOS, inspecione a retina em busca de uma área onde os eletrodos estimuladores e a fluorescência das células que expressam GCaMP são visíveis. Uma objetiva aérea de 20x NA 0,75 foi utilizada para este estudo.
NOTA: Para efetivamente estimular (e registrar) as células com os eletrodos, a retina e o eletrodo precisam estar em contato próximo. Assim, as células estão visivelmente no mesmo plano focal que os eletrodos. Se não for o caso, repita os passos de excisão da retina a partir do passo 8. Ao usar retinas de modelos animais saudáveis (com fotorreceptores funcionantes), observe que toda vez que a lâmpada fluorescente for ligada, haverá algumas respostas evocadas geradas pela luz, uma vez que a retina é sensível à luz ao comprimento de onda usado para excitar o sensor GCaMP. Essas alterações de cálcio induzidas pela luz podem ser usadas para avaliar o estado de saúde do tecido. Para evitar misturar luz com respostas evocadas elétricas, ligue a lâmpada fluorescente pelo menos 1 min antes de iniciar a aquisição da imagem. - Para obter respostas evocadas eletroelétricas na GCL, selecione um eletrodo para enviar pulsos controlados por corrente. Definir os parâmetros de estimulação elétrica no software do aparelho gerador de pulsos, tais como: forma, amplitude, duração, atraso de fase e frequência dos pulsos a serem aplicados.
NOTA: Os parâmetros efetivos do estímulo podem variar amplamente de larguras de pulso de 50 μs a 100 ms, com amplitudes variando de 0,1 μA a 10 μA. Esses parâmetros, juntamente com a frequência do estímulo, a polaridade do estímulo, o número de pulsos e os atrasos interfásicos, podem influenciar a resposta espaço-temporal observada pela imagem do cálcio 19,20,21,22. Um trem de 40 pulsos bifásicos que fornece estimulação de 1 ms, 2 μA geralmente gera uma resposta visível em neurônios marcados. - Para sincronizar a aquisição da imagem com a liberação da estimulação, utilize o gerador de pulsos como gatilho externo para controlar o início da aquisição da imagem. Conecte a câmera (consulte Tabela de Materiais) com o gerador de pulsos usando o sinal de gatilho de saída e defina o "Modo de captura" do software da câmera como "Gatilho de início externo". Pressione Iniciar no software da câmera para que ele aguarde um gatilho externo para iniciar. Inicie a aquisição da imagem com o software gerador de pulsos.
Observação : O controle de gatilho externo pode ser configurado de forma diferente para câmeras diferentes. Este estudo normalmente adquiriu imagens (512 x 512 pixels, escala de cinza de 16 bits) a 10 quadros por segundo por 1 minuto, fornecendo rajadas de trens de pulso bifásicos a cada 10 s. A entrega do pulso começa após 10 s, de modo que os primeiros quadros em todos os experimentos correspondem à atividade espontânea. Dependendo do sensor GCaMP e da análise que será realizada, pode ser necessário ajustar a taxa de gravação de acordo com os tempos de subida e decaimento do seu indicador de cálcio8. Considere a sensibilidade para detectar potenciais de ação únicos do indicador de cálcio15. - Salve as imagens com um nome de arquivo que inclua os parâmetros de estimulação elétrica aplicados, como [Número do eletrodo]_[Amplitude do pulso]_[Duração do pulso]_[Frequência do pulso]_Image001.
4. Análise dos dados
- ImageJ/FIJI para extrair o perfil de intensidade de fluorescência ao longo do tempo e as coordenadas espaciais dos somas celulares
- Segmente a região de interesse (ROI) com as "Ferramentas de Seleção de Área" e adicione-a ao ROI Manager (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). No menu ROI Manager, salve-o como uma pasta .zip (Mais > Salvar).
NOTA: Normalmente, as mesmas ROIs podem ser aplicadas a todos os experimentos de estimulação, uma vez que correspondem ao mesmo FOV. - Selecione o "Valor cinza médio" como o parâmetro a ser extraído (Analisar > Definir medidas).
- Extraia o "Valor médio de cinza" dos somas de célula clicando em Mais > Multi Medida. Uma caixa de diálogo será exibida. Habilite as opções Medir todas as 600 fatias e Uma linha por fatia para obter uma única tabela na qual as colunas correspondem a ROIs e as linhas correspondem a períodos de tempo. Salve a tabela gerada como uma planilha .xls.
- Selecione o "Centroide" como parâmetro a ser extraído (Analisar > Definir medidas).
- Extraia o "Centroide" das ROIs clicando em Medir. A tabela gerada corresponde às coordenadas (X,Y) das ROIs. Salve-o como uma planilha .xls.
- Segmente a região de interesse (ROI) com as "Ferramentas de Seleção de Área" e adicione-a ao ROI Manager (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). No menu ROI Manager, salve-o como uma pasta .zip (Mais > Salvar).
- Script personalizado para identificar células que respondem aos estímulos
NOTA: MATLAB (consulte Tabela de Materiais) foi usado aqui, mas as etapas descritas podem ser alcançadas em qualquer linguagem de programação. Os usuários podem obter nosso script personalizado solicitando o autor correspondente.- Correção do efeito fotobranqueador: Para mitigar o efeito de fundo e fotoclareamento, pegue de 15 a 20 quadros dos períodos não estimulantes antes de cada explosão e encaixe-os em uma curva linear [ajuste (poly1)].
NOTA: Neste caso, para um filme total de 600 quadros em que rajadas periódicas de trens de pulso foram enviadas a cada 10 s, os quadros 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 foram considerados como períodos não estimulantes. - Normalizar usando a fórmula: (X-min) / (max-min)
- Identificação das células que respondem
- Calcule a raiz quadrada da média (RMS) dos períodos não estimulantes a partir dos dados normalizados. Isso será considerado como o sinal de linha de base.
- Calcule o máximo dos períodos estimulantes (frames entre os períodos não estimulantes). Neste caso, para um filme total de 600 quadros em que rajadas periódicas de trens de pulso foram enviadas a cada 10 s, os quadros 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 foram considerados como os períodos de estimulação.
- Se o valor máximo exceder o sinal basal em 2,5 vezes para uma ROI específica, marque a célula como respondendo a esse período de estimulação. Se a célula responder a três dos cinco períodos de estimulação, classifique-a como uma célula respondedora.
- Correção do efeito fotobranqueador: Para mitigar o efeito de fundo e fotoclareamento, pegue de 15 a 20 quadros dos períodos não estimulantes antes de cada explosão e encaixe-os em uma curva linear [ajuste (poly1)].
Representative Results
O protocolo descrito neste estudo é baseado nos estudos de imagem de fluorescência e estimulação elétrica realizados por Weitz et al.12. O protocolo consiste em três partes principais: (1) marcação fluorescente do GCL e flat-mounting da retina no MEA (Figura 1-esquerda), (2) visualização da atividade do cálcio no GCL durante a estimulação elétrica (Figura 1-meio) e (3) extração, processamento e interpretação dos dados de imagem (Figura 1-direita).
Primeiro, como mostrado na Figura 1-esquerda, ratos Long Evans são injetados intravítreos com AAV2-CAG-GCaMP5G antes da sessão de imagem. A expressão viral ideal para esse vetor ocorre 2 a 3 semanas após a injeção12,18. Após anestesiar totalmente o animal, um orifício piloto é feito usando uma agulha de 30 G e, em seguida, 5 μL de AAV2-CAG-GCaMP5G são lentamente injetados no vítreo usando uma agulha romba de 36 G conectada a uma seringa de precisão para evitar o refluxo. Durante a expressão viral, um sistema de imagem retiniana in vivo é usado para avaliar a condição da retina pós-cirurgia, com imagens de OCT fornecendo visualização detalhada das camadas retinianas. Uma vez que a expressão gênica é alcançada, a retina é cuidadosamente extraída da ocular usando um microscópio estéreo e ferramentas de dissecção de alta precisão. A partir daí, o tecido é manipulado em meio oxigenado para preservar a amostra. A retina excisada, com o GCL voltado para cima, é então montada em uma plataforma projetada para montagem plana para garantir a estabilidade e evitar a flutuação da amostra. A amostra é montada na superfície do MEA com o GCL voltado para os eletrodos.
Em seguida, o MEA é montado em sua placa de interface em um microscópio fluorescente invertido (Figura 1-meio). A amostra retiniana é perfundida com meio oxigenado a 33 °C usando um sistema de perfusão. O exemplo pode ser mantido nessa configuração por várias horas. O esquema de estimulação desejado é programado e as imagens são adquiridas a uma taxa de 10 quadros por segundo. Recomenda-se nomear os filmes de acordo com os parâmetros de estimulação elétrica aplicados. A aquisição das imagens deve ser iniciada antes do início da estimulação para obtenção de alguns quadros basais sem estimulação, que servirão como controle negativo.
Finalmente, como ilustrado na Figura 1-direita, os dados são extraídos das imagens de lapso de tempo segmentando os somas. Os efeitos do fotoclareamento são corrigidos ajustando-se os dados, e as células responsivas são identificadas. As células responsivas são definidas como aquelas com picos de fluorescência durante a estimulação que excedem sua linha de base em 2,5 vezes. Se uma célula responde a três das cinco explosões de estimulação, ela é considerada responsiva a esse trem específico de estimulação.
Figura 1: Visão geral do estudo. Ilustração esquemática do protocolo para (esquerda) marcação fluorescente da GCL da retina e montagem da amostra, (meio) preparação para gravações ex vivo com estimulação elétrica fornecida por um MEA, e (direita) análise dos dados de imagem de cálcio para classificar células responsivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Retina injetada intravítrea
A incidência de complicações associadas às injeções intravítreas é muito baixa. No entanto, existem algumas complicações que podem surgir da própria cirurgia, independentemente do componente injetado. Essas complicações incluem formação de catarata, hemorragia vítrea, elevação da pressão intraocular e endoftalmite23. Para determinar se essas complicações são causadas pela cirurgia, o animal precisa passar por avaliação antes do procedimento usando fundoscopia e OCT. Três dias após a injeção, os animais devem ser acompanhados. Na Figura 2A-D, mostra-se a retina de um animal saudável injetado. Após duas semanas da injeção, os CGRs começam a expressar fluorescência, que pode ser visualizada por fundoscopia de fluorescência (Figura 2B,C). As imagens de OCT permitem visualização detalhada da disposição e espessura das camadas retinianas (Figura 2D), oferecendo maior resolução em relação à fundoscopia, principalmente quando se avalia o descolamento de retina. Uma vez que a retina é plana e imageada usando um microscópio de fluorescência invertido, torna-se possível distinguir as células e os feixes de axônio. Ao contrário de outros indicadores de cálcio, o indicador GCaMP é restrito ao citoplasma7, e a fluorescência é excluída do núcleo (Figura 2E).
Figura 2: Imagens representativas da retina injetada intravítrea. (A) Fundoscopia, (B) fundoscopia de fluorescência, (C) zoom da fundoscopia de fluorescência, (D) imagem de OCT e (E) imagem de epifluorescência da retina excisada montada em um MEA personalizado com eletrodos à base de grafeno em vidro borossilicato de 500 μm de espessura. Em (E), as linhas pretas correspondem aos traços Ti/Au. Barras de escala: 115 μm (D) e 100 μm (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Eletrodos e contato GCL
A fim de evocar respostas neurais de forma eficaz, é crucial garantir que a retina plana esteja em contato próximo com a superfície do MEA. Uma maneira simples de verificar isso é confirmando visualmente se as células e os eletrodos estão localizados no mesmo plano focal (Figura 3A). Se as células não estiverem no mesmo plano focal dos eletrodos (Figura 3B), isso indica que o contato é subótimo, o que resultará em estimulação menos efetiva.
Figura 3: Eletrodos e contato GCL. (A) Células e o eletrodo (asterisco) no mesmo plano focal. (B) Células e eletrodos não no mesmo plano focal, indicando contato subótimo para estimulação elétrica nessa área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagem ex vivo de cálcio após estimulação elétrica fornecida por um MEA
Os dados resultantes da imagem do cálcio consistem em imagens de lapso de tempo que monitoram a atividade neural de centenas de células em resposta à estimulação elétrica. Estímulos supralimiares causam um influxo de cálcio para os somas, resultando em uma mudança brusca na intensidade da fluorescência (Vídeo 1). Esse protocolo permite determinar se um eletrodo, MEA e/ou algoritmo de estimulação provoca a resposta desejada no tecido neural. O tamanho e o pitch dos eletrodos no MEA, bem como a proporção de tecido a ser estudado, determinarão a ampliação objetiva apropriada a ser escolhida. Tipicamente, para estudos de estimulação com eletrodo único com diâmetros variando de 5 μm a 100 μm, uma objetiva de 20-25x é adequada (Figura 4A), fornecendo um FOV de aproximadamente 600 μm x 600 μm. Para experimentos envolvendo estimulação com múltiplos eletrodos, um aumento objetivo de 4-10x pode ser necessário para avaliar uma área maior, em torno de 2 mm x 2 mm. As células responsivas podem ser facilmente identificadas gerando uma projeção de imagem de desvio padrão do filme de lapso de tempo (Figura 4B e Vídeo 1).
Figura 4: Imagem de cálcio do GCL com estimulação elétrica fornecida por um eletrodo de 25 μm de diâmetro. (A) Projeção máxima de um filme time-lapse de 60 s e (B) projeção de desvio padrão mostrando claramente células que respondem a estímulos elétricos a partir de um eletrodo poroso à base de grafeno de 25 μm de diâmetro. O eletrodo estimulador é indicado com um asterisco. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Análise da dinâmica do cálcio ao longo do tempo sob estimulação controlada
Para cada soma celular identificada, os valores médios de intensidade foram extraídos ao longo do tempo. A Figura 5A mostra os traços de cálcio corrigidos pelo fotoclareamento das células responsivas. Neste exemplo, cinco rajadas de trens de pulso bifásicos (catódico primeiro, 40 ciclos, 1 ms de duração, 2 μA de amplitude) foram entregues a cada 10 s (indicados por linhas pretas) durante uma aquisição de imagem de 60 s. Dentro de um determinado experimento, os mesmos cinco trens de pulso são aplicados para testar a consistência da resposta. Os quadros capturados durante os períodos não estimulantes (destacados em vermelho) são utilizados para realizar um ajuste linear, corrigindo o efeito de fotoclareamento.
Uma vez identificadas as células respondedoras e conhecidas suas coordenadas (x,y) em relação ao eletrodo estimulador, pode-se examinar a relação entre a corrente necessária para ativar as células e a distância do eletrodo estimulador (Figura 5B). Como esperado, células localizadas mais próximas ao eletrodo estimulador requerem valores de corrente mais baixos para evocar uma resposta.
Figura 5: Representação das respostas evocadas elétricas. (A) Traços de cálcio de somas celulares após 5 rajadas de trens de pulso (bifásico, catódico-primeiro, 40 ciclos, 1 ms de duração, 2 μA de amplitude) a cada 10 s (linhas pretas) durante uma aquisição de imagem de 60 s. São mostrados períodos não estimulantes (quadros destacados em vermelho) e estimulantes (quadros destacados em amarelo). São considerados respostas evocadas os traços que ultrapassam em 2,5 vezes o sinal basal (raiz quadrada média dos períodos não estimulantes). As células que respondem em três dos cinco períodos de estimulação são classificadas como células respondedoras. (B) Mapa de distribuição da atividade do cálcio mostrando o eletrodo estimulador (círculo delineado preto) e as células (círculo delineado cinza). O código de cores representa a amplitude de pulso mínima necessária para evocar uma resposta celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagem de cálcio do GCL com estimulação elétrica fornecida por um eletrodo de 25 μm de diâmetro. O vídeo mostra diferenças na intensidade da fluorescência devido à estimulação elétrica de um eletrodo poroso à base de grafeno de 25 μm de diâmetro. O lado esquerdo mostra o filme original, e o lado direito mostra a projeção do desvio padrão, onde as células que respondem podem ser facilmente identificadas. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.
Discussion
O protocolo aqui descrito serve para estudar a dinâmica do cálcio que ocorre na GCL retiniana de ratos após estimulação elétrica fornecida com um MEA. É um método confiável e gerenciável, mas requer algum treinamento, particularmente para rotular uniformemente o GCL de forma eficiente e montar a retina corretamente para garantir o contato ideal tecido-eletrodo. Este protocolo é específico para roedores e precisa ser adaptado se aplicado a uma espécie de laboratório diferente. Os pontos críticos, modificações e limitações da metodologia são apresentados em detalhes.
Injeções intravítreas
As injeções são amplamente utilizadas para liberação de genes oculares, sendo as intravítreas o procedimento preferido. Mostraram-se mais seguros e menos invasivos quando comparados às injeções sub-retinianas, que introduzem as moléculas de interesse diretamente entre os fotorreceptores e o epitélio pigmentado da retina (EPR), colocando em risco o descolamento deretina10. No entanto, existem limitações, principalmente na realização dessas injeções em modelos de roedores. O humor vítreo é gelatinoso, dificultando a difusão viral. Além disso, a lente nos olhos de roedores é grande, tornando não trivial inserir a agulha sem coçá-la. As agulhas de seringa de precisão são delicadas e precisam ser substituídas com frequência. Para evitar obstrução, lave-os com água deionizada antes e depois de cada uso e substitua-os regularmente. Além disso, injete o conteúdo lentamente para evitar o refluxo da solução e alterações na pressão intraocular. Conseguir fluorescência grande e uniforme em toda a retina pode exigir prática.
Transdução de células retinianas
Os vetores virais são um excelente método para a liberação gênica in vivo, e os AAVs têm sido amplamente utilizados para transdução de células retinianas10. Eles foram aprovados como tratamento para algumas retinopatias que causam cegueira humana24. No entanto, sua capacidade de portadora é limitada a 5 kb, incluindo os elementos regulatórios necessários (por exemplo, o promotor)10,25. Existem vários sorotipos disponíveis, cada um com tropismo diferente. Escolher o AAV mais adequado com base nos genes a serem liberados e nas células a serem transduzidas26. Para a marcação dos CGRs, recomenda-se o uso do AAV227.
Janela de expressão gênica
A expressão viral ideal para AAV2-CAG-GCaMP5G é de 2 a 3 semanas após a injeção 12,18. Após esse período, os núcleos das células transfectadas tornam-se fluorescentes, as células param de responder aos estímulos e, finalmente, morrem 7,28,29. Isso se deve à superexpressão do indicador GCaMP, que é translocado para o núcleo. A janela de tempo para a expressão gênica ideal varia dependendo do vetor viral e do promotor escolhido30 e precisa ser determinada experimentalmente antes de prosseguir com este protocolo.
Contato tecido-eletrodo
Para resultados ótimos e reprodutíveis, é crucial alcançar um bom contato tecido-eletrodo. O mau contato é tipicamente devido à curvatura natural da retina. Uma abordagem é cortar a retina em quartos, montar e criar imagens de uma seção de cada vez. Pequenas porções da retina podem ser melhor achatadas, resultando em contato mais efetivo com a superfície do MEA. Outra razão potencial para o mau contato é a presença de humor vítreo. Ao realizar experimentos de estimulação simulando um implante epirretiniano, é importante remover cuidadosamente o humor vítreo durante a excisão da retina, pois ele pode atuar como um isolante da corrente. Aqui, um método simples é descrito para verificar se o contato é suficiente, visualizando o eletrodo e as células no mesmo plano focal.
Uma alternativa às medidas retinianas ex vivo é cultivar neurônios diretamente na superfície dos eletrodos. A cultura primária de neurônios, como os neurônios do hipocampo31, pode ser útil para testes iniciais para avaliar a funcionalidade do novo dispositivo estimulante. No entanto, essa abordagem ainda requer o uso de animais de laboratório e não representa a complexidade da rede retiniana, importante para avaliar as respostas sinápticas à estimulação.
Para a visualização das células sob os traços do eletrodo e do eletrodo, podem ser utilizados MEAs confeccionados com materiais transparentes, como o óxido de índio estanho (ITO) 19,20,32. Além das medidas ópticas, a atividade da GCL à estimulação elétrica pode ser avaliada por meio de registros elétricos. O MEA pode ser usado para registrar o potencial de campo local (LFP) do tecido. No entanto, isso compromete a resolução espacial, pois cada eletrodo capta a atividade de várias células simultaneamente (dependendo das dimensões do eletrodo). A gravação óptica supera essa limitação e oferece mapeamento de maior resolução espacial. Sua principal vantagem é a capacidade de distinguir entre células ativas e inativas enquanto mede um grande FOV com resolução de célula única. Dentre todos os notificadores de atividade celular, os indicadores de cálcio são bem descritos e mais comumente utilizados33.
Disclosures
Os autores não têm informações a acrescentar ao manuscrito.
Acknowledgments
Agradecemos a Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara e Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) pelo apoio técnico, a Anna Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) do grupo de Pesquisa em Oftalmologia pelo apoio com as injeções intravítreas e a imagem retiniana in vivo .
As entidades financiadoras que apoiaram este trabalho são: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Programa Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa para Centros de Excelência em P&D (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya através do programa CERCA; Laserlab-Europa (EU-H2020 GA nº 871124); Fundação La Caixa (LCF/HR19/52160003); e Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | - |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | - |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | - |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | - |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | - |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | - | - |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | - |
| Blade | Swann-morton | 0308 | - |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | - |
| Carbogen | Air liquide | - | - |
| Curved-forceps | - | - | - |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | - |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | - |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | - |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | - |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | - |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | - |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | - |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | - |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | - | - |
| Long-Evans rat | Janvier | - | - |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | - | - |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | - |
| Methocel 2% | Omni Vision | - | - |
| Microelectrode array (MEA) | - | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | - |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | - |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | - |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | - |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | - |
| Prescaina | Llorens | - | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | - |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | - |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | - |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | - |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | - |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | - | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | - |
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