Summary
Netthinneproteser har evnen til å generere visuelle oppfatninger. For å fremme utviklingen av nye proteser, er det nødvendig med ex vivo-metoder for å teste enheter før implantasjon. Denne artikkelen gir en omfattende protokoll for å studere kalsiumaktivitet i retinal ganglioncellelaget når de blir utsatt for elektrisk stimulering.
Abstract
Retinal dystrofier er en ledende årsak til blindhet over hele verden. Omfattende innsats pågår for å utvikle avanserte retinale proteser som kan omgå de svekkede lysfølsomme fotoreceptorcellene i den degenererte netthinnen, med sikte på delvis å gjenopprette syn ved å indusere visuelle percepts. En vanlig undersøkelsesvei innebærer design og produksjon av implanterbare enheter med en fleksibel fysisk struktur, som huser et høyt antall elektroder. Dette muliggjør effektiv og presis generering av visuelle persepter. Men med hver teknologiske fremskritt oppstår det behov for en pålitelig og håndterbar ex vivo-metode for å verifisere funksjonaliteten til enheten før den går videre til in vivo-eksperimenter , hvor faktorer utover enhetens ytelse spiller inn. Denne artikkelen presenterer en omfattende protokoll for å studere kalsiumaktivitet i retinal ganglioncellelaget (GCL) etter elektrisk stimulering. Spesielt er følgende trinn skissert: (1) fluorescerende merking av rottehinnen ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer, (2) fange fluorescenssignalet ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop mens du bruker forskjellige mønstre av elektrisk stimulering, og (3) ekstraherer og analyserer kalsiumsporene fra individuelle celler i GCL. Ved å følge denne prosedyren kan forskere effektivt teste nye stimuleringsprotokoller før de utfører in vivo-eksperimenter .
Introduction
Netthinnen inneholder fotoreceptorer, som er celler som er ansvarlige for å føle lys. De fanger fotoner og konverterer dem til nerveimpulser. Disse impulsene behandles deretter i netthinnen og overføres til den visuelle cortex, noe som resulterer i dannelsen av et visuelt bilde1. Retinitis pigmentosa (RP) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er degenerative sykdommer preget av progressivt tap av fotoreceptorer. Disse retinopatiene er blant de ledende årsakene til blindhet over hele verden1, påvirker millioner av individer og har betydelige medisinske, personlige og sosioøkonomiske konsekvenser for pasienter, helsevesen og samfunnet som helhet. Videre, med den aldrende befolkningen, anslås det at AMD-tilfeller vil øke med 15% innen 20502.
For tiden pågår det en rekke forskningsinnsats for å gjenopprette syn hos pasienter som er rammet av disse tilstandene3. En lovende tilnærming er bruken av retinalproteser, som har vist effektivitet i delvis gjenoppretting av visjon 4,5. Disse enhetene fanger lys fra den visuelle scenen og konverterer den til elektriske pulser. Disse pulsene leveres gjennom elektroder i en mikroelektrodegruppe (MEA) implantert i øyet, stimulerer de overlevende nevronene og omgår funksjonen til de tapte fotoreceptorene. De aktiverte retinale ganglioncellene (RGC) overfører utgangen til hjernen, hvor den tolkes som visuell oppfatning. Imidlertid ligger de viktigste begrensningene for nåværende implantater i oppløsningen av elektrodevevgrensesnittet6 og ikke-selektiv stimulering av forskjellige celletyper. Derfor, for å optimalisere utformingen av nye implanterbare enheter for mer effektiv visjonsrestaurering, er det avgjørende å forstå hvordan stimuleringsparadigmer kan utvikles for å selektivt aktivere celler i nærheten av elektrodene.
Kalsiumavbildning er en mye brukt teknikk for å studere nevral aktivitet, og tilbyr flere fordeler i forhold til ikke-optiske metoder 7,8. For det første gir den cellulær og subcellulær oppløsning. For det andre kan kalsiummarkører målrette mot bestemte celletyper. For det tredje tillater det langsiktig sporing, og for det fjerde muliggjør det observasjon av hele cellepopulasjoner mens man skiller mellom aktive og inaktive celler. Denne metoden gir indirekte bevis på cellulær aktivitet med en tidsmessig oppløsning i området hundrevis av millisekunder. Genetisk kodede fluorescerende kalsiumindikatorer, som GCaMP-sensorer, gjennomgår en konformasjonsendring ved binding til kalsium, noe som resulterer i økt fluorescens9. Rekombinante adenoassosierte virale vektorer (AAV) er et effektivt middel for å transdusere retinale celler med GCaMP10.
Denne protokollen presenterer en effektiv metode som benytter kalsiumavbildning for å teste stimuleringsprotokoller av retinalimplantater. Spesielt fokuserer vi på ex vivo rotte retinal vev og gir detaljerte trinnvise instruksjoner, fra prøveinnsamling til dataanalyse. Ved å tilby denne omfattende veiledningen kan forskere fra ulike bakgrunner begynne på elektrisk stimuleringseksperimentering med tillit.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med standard dyreetiske retningslinjer (European Communities Directive 86/609/EU) og godkjent av de lokale dyreetiske komiteene. 8 uker gamle Long Evans-rotter ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse).
1. Klargjøring av medier og flatmontering
- Ames' Medium (1 L)
- I en 1 l glassflaske, kombiner Ames 'Medium-pulver, 1,9 g / l NaHCO3, 10 ml penicillin / streptomycin 100x og 1 liter avionisert vann (se materialtabellen). Juster pH til 7,4 og osmolariteten til 280 mOsm med avionisert vann eller NaHCO3. Steriliser løsningen ved å filtrere den gjennom et 0,2 μm porestørrelsesfilter under en hette.
MERK: Oppbevar det steriliserte mediet ved 4 °C. Denne løsningen forblir stabil og kan brukes i opptil 1 måned.
- I en 1 l glassflaske, kombiner Ames 'Medium-pulver, 1,9 g / l NaHCO3, 10 ml penicillin / streptomycin 100x og 1 liter avionisert vann (se materialtabellen). Juster pH til 7,4 og osmolariteten til 280 mOsm med avionisert vann eller NaHCO3. Steriliser løsningen ved å filtrere den gjennom et 0,2 μm porestørrelsesfilter under en hette.
- Montering av membraner
- Fest en PTFE porøs membran (se materialfortegnelse) til en vaskemaskin med små dråper lim. La det tørke i minst 15 min.
- For å oppnå gjennomskinnelighet, senk membranene i 70% etanol i 1 min.
- Skyll membranene to ganger med avionisert vann for å fjerne etanolen helt. Oppbevar dem i avionisert vann for å forhindre opasitet.
2. GCL-merking og rotte retina flatmontering
MERK: Denne merkingsmetoden skiller ikke RGC fra fordrevne amakrine celler. Hvis selektiv merking av RGC er ønskelig, bør du vurdere å bruke AAVs med RGC-spesifikke promotorer11 og/eller retrograd merking gjennom synsnerven12. For å diskriminere mellom klasser av ON- og OFF-center RGC, klassifisere RGC basert på deres lysrespons13,14, og bruk nyere versjoner av genetisk kodede kalsiumindikatorer som gir økt følsomhet og evnen til å måle enkeltaksjonspotensialer15.
- Intravitreal injeksjon
- Bedøv den 8 uker gamle Long Evans-rotten med 2% isofluran / 1% O2 til det ikke er pedalrefleks, og oppretthold anestesi med en rotte nesemaske (se materialfortegnelse).
NOTAT: Under anestesi, plasser dyret på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen. - Administrer én dråpe kommersielt tilgjengelige øyedråper (se Materialfortegnelse) for å utvide pupillen.
- Før du fortsetter med kirurgi, undersøk øyet for abnormiteter ved bruk av fundoskopi og optisk koherenstomografi (OCT) med et in vivo retinal imaging system. Påfør en dråpe Methocel 2% for å lette hornhinnen-objektiv kontakt (se materialfortegnelse).
MERK: Hvis det oppdages noe unormalt, må du ikke fortsette med de påfølgende trinnene for det øyet. - Påfør en dråpe Prescaine som lokalbedøvelse. Fest øyelokket og limbal bindehinne med et kommersielt tilgjengelig suturfilament (se materialfortegnelse). Lag en 1 mm sklerotomi 4 mm fra limbus ved hjelp av en 30 G nål.
- Fest en 36 G stump kanyle til en presisjonssprøyte og injiser AAV-partiklene som bærer den genetisk kodede kalsiumindikatoren inn i glasslegemet i 30 sekunder, i en vinkel på 45°. I denne studien brukte vi AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml i HBSS) (se Materialfortegnelse).
MERK: AAV-konstruksjoner som ikke koder for potensielt tumorigene genprodukter eller toksinmolekyler og er produsert uten hjelpervirus, kan håndteres i Biosafety Level 1 (BSL-1)-anlegg. Ellers, hvis det anses som biologisk farlig materiale under BSL-2-inneslutning, må det tas riktige forholdsregler16. AAV-er som koder for GCaMP betraktes som BSL-1 og krever ikke manipulering under biosikkerhetsskap.
- Fest en 36 G stump kanyle til en presisjonssprøyte og injiser AAV-partiklene som bærer den genetisk kodede kalsiumindikatoren inn i glasslegemet i 30 sekunder, i en vinkel på 45°. I denne studien brukte vi AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml i HBSS) (se Materialfortegnelse).
- Påfør en dråpe Tobradex (se materialfortegnelse) for å forhindre betennelse og som antibiotikaprofylakse.
- Hvis du vil, kan du gjenta trinn 2, 3 og 4 med det andre øyet.
MERK: Sjekk dyrene 12-24 timer etter operasjonen for å sikre at det ikke er noen bivirkninger. - Tre dager etter injeksjon, undersøk retinalstrukturen ved hjelp av fundoskopi og OCT med et in vivo retinal imaging system (se materialtabell).
- To uker etter injeksjon skal GCL avgi fluorescens. Vurdere retinal struktur og AAV-ekspresjon ved fluorescens fundoskopi ved hjelp av et in vivo retinal imaging system.
MERK: Ifølge Weitz et al.12 blir fluorescens fra AAV2-CAG-GCaMP5G merkbar 1 uke etter injeksjon og intensiveres med 2 uker. Fra og med den fjerde uken induserer overekspresjon av GCaMP cytomorbiditet. Døende celler utviser et høyt baseline fluorescenssignal i kjernen og cytoplasma som ikke svinger som respons på stimulering. I friske celler er GCaMP-ekspresjon begrenset til cytoplasma og ekskludert fra kjernen 7,8,12,17,18. Disse funksjonene kan observeres ex vivo under mikroskopiavbildning. Vinduet for genuttrykk kan variere avhengig av virusvektoren og valgt promotor.
- Bedøv den 8 uker gamle Long Evans-rotten med 2% isofluran / 1% O2 til det ikke er pedalrefleks, og oppretthold anestesi med en rotte nesemaske (se materialfortegnelse).
- Retina-eksisjon og flatmontering
MERK: To til tre uker etter injeksjon avlives rotter som injiseres umiddelbart før elektrofysiologiprotokollen begynner, i samsvar med standard etiske retningslinjer (Det europeiske fellesskaps direktiv 86/609/EU) og godkjent av lokale etiske komiteer. Innånding av karbondioksid (CO2) brukes som metode for eutanasi i denne protokollen.- Øye enukleasjon
- Trykk forsiktig på utsiden av banen med et par buede tang for å stikke øyet litt ut fra øyehulen.
- Bruk en fjærsaks til å kutte musklene som holder øyet og enucleate det, pass på at du ikke punkterer øyebollet.
MERK: Fra dette trinnet, dissekere netthinnen under et stereomikroskop i oksygenert (95%O2 / 5% CO2) Ames 'medium.
- Retina excision
- Bruk et par små buede tang og fin vårsaks for å fjerne alt omkringliggende vev fra øyeeballet.
- Ta et stykke på ca 3 cm x 3 cm filterpapir og legg det på lokket på en 3,5 cm tallerken. Bløtlegg papiret med Ames' Medium.
- Plasser øyeeplet på toppen av papiret, med det fremre segmentet mot operatøren. Bruk en rett tang til å holde øyeeplet, plasser dem på toppen av ora serrata i omtrent 45 ° vinkel fra paraboloverflaten. Lag et lite kutt med et blad, ved å bruke mellomrommet mellom de rette tangene som referanse.
- Refunder øyeeplet til Ames 'Medium. Bruk en rett tang og fin fjærsaks for å skille øyets fremre og bakre segmenter.
- Fjern linsen forsiktig med to par rette tang. Deretter skiller du netthinnen fra scleraen.
- Klipp sclera mot optisk nerve ved hjelp av fin vårsaks til netthinnen er isolert fra øyekoppen.
- Bruk et fluorescensstereomikroskop for å identifisere regionen av netthinnen med det beste kalsiumindikatoruttrykket.
MERK: Omfanget av viral spredning avhenger av suksessen til den intravitreale injeksjonen. Å oppnå fluorescens over store deler av netthinnen kan kreve øvelse. Etterforskerens erfaring spiller en avgjørende rolle for å oppnå optimale resultater. - Bruk en plastpipette med kuttspiss til å overføre det valgte stykket av netthinnen til monteringsmembranen (monteringsmembrantrinn). Bruk en rett tang til å flatmontere netthinnen med GCL vendt opp.
- Med en plastpipette festet til en 100 μL pipettespiss, fjern mediet slik at netthinnenstykket fester seg til den porøse membranen. Vend enheten på MEA slik at GCL hviler på toppen av elektrodene.
- Fyll prøvebadet med oksygenert Ames' medium.
- Øye enukleasjon
3. Ex vivo kalsiumavbildning ved elektrisk stimulering
MERK: I dette arbeidet ble et proof-of-concept MEA brukt til ex vivo eksperimentering. De tilpassede MEA-ene ble produsert med 25 μm diameter porøse grafenbaserte elektroder på 500 μm tykt borosilikatglass med Ti/Au-spor og senere isolert med silisiumnitrid og SU-8 fotoresist12. Kalsiumavbildningsmetodene er imidlertid gyldige uavhengig av elektrodematerialet som brukes til stimulering.
- Still inn perfusjonssystemet slik at det oksygenerte Ames' medium konstant perfuserer prøvebadet ved 33 °C ved en konstant strømningshastighet på 5 ml/min.
- Ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop utstyrt med en fluorescerende lampe, en FITC-filterkube og et CMOS-kamera, inspiser netthinnen for et område der de stimulerende elektrodene og fluorescensen fra GCaMP-uttrykkende celler er synlige. Et 20x NA 0.75 luftmål ble brukt til denne studien.
MERK: For effektivt å stimulere (og registrere) cellene med elektrodene, må netthinnen og elektroden være i nær kontakt. Dermed er cellene synlig i samme fokalplan som elektrodene. Hvis det ikke er tilfelle, gjenta trinnene for netthinneeksisjon fra trinn 8 og utover. Når du bruker retina fra friske dyremodeller (med fungerende fotoreseptorer), merk at hver gang fluorescerende lampe slås på, vil det være noen fremkalte responser generert av lyset siden netthinnen er lysfølsom for bølgelengden som brukes til å spennende GCaMP-sensoren. Disse lysinduserte kalsiumendringene kan brukes til å vurdere vevets helsestatus. For å unngå å blande lys med elektrisk fremkalte responser, slå på lysrøret minst 1 min før du starter bildeopptaket. - For å fremkalle elektrisk fremkalte responser i GCL, velg en elektrode for å sende strømstyrte pulser. Still inn de elektriske stimuleringsparametrene i programvaren til pulsgeneratorenheten, for eksempel: form, amplitude, varighet, faseforsinkelse og frekvens av pulser som skal påføres.
MERK: Effektive stimulusparametere kan variere mye fra pulsbredder på 50 μs til 100 ms, med amplituder fra 0,1 μA til 10 μA. Disse parametrene, sammen med stimulusfrekvens, stimuluspolaritet, antall pulser og forsinkelser mellom faser, kan påvirke den spatiotemporale responsen observert ved kalsiumavbildning 19,20,21,22. Et tog med 40 bifasiske pulser som leverer 1 ms, 2 μA stimulering genererer ofte en synlig respons i merkede nevroner. - For å synkronisere bildeopptaket med stimuleringsleveransen, bruk pulsgeneratoren som en ekstern utløser for å kontrollere starten på bildeopptaket. Koble kameraet (se Materialfortegnelse) med pulsgeneratoren ved hjelp av utgangsutløsersignalet og sett "Capture Mode" av kameraprogramvaren til "External Start Trigger". Trykk på Start i kameraprogramvaren slik at den venter på at en ekstern utløser skal starte. Start bildeopptaket med pulsgeneratorprogramvaren.
MERK: Den eksterne utløserkontrollen kan være konfigurert forskjellig for forskjellige kameraer. Denne studien tok vanligvis bilder (512 x 512 piksler, 16-biters gråtoner) med 10 bilder per sekund i 1 minutt, samtidig som det ga utbrudd av bifasiske pulstog hver 10. Pulslevering starter etter 10 s, slik at de første rammene i alle eksperimenter tilsvarer spontan aktivitet. Avhengig av GCaMP-sensoren og analysen man skal utføre, må man kanskje justere registreringshastigheten i henhold til stignings- og forfallstidene til kalsiumindikatoren8. Vurder følsomheten for å oppdage enkeltaksjonspotensialer for kalsiumindikatoren15. - Lagre bildene med et filnavn som inneholder parameterne for elektrisk stimulering, for eksempel [Elektrodenummer]_[Pulsamplitude]_[Pulsvarighet]_[Pulsfrekvens]_Image001.
4. Dataanalyse
- ImageJ/FIJI for å trekke ut fluorescensintensitetsprofilen over tid og de romlige koordinatene fra cellesomaene
- Segmenter interesseområdet (ROI) med "Area Selection Tools" og legg det til i ROI Manager (Analyser > verktøy > ROI Manager > Legg til). Fra ROI Manager-menyen lagrer du den som en .zip-mappe (Mer > Lagre).
MERK: Vanligvis kan de samme avkastningene brukes på alle stimuleringseksperimenter siden de tilsvarer samme FOV. - Velg "Gjennomsnittlig grå verdi" som parameter som skal trekkes ut (Analyser > Angi målinger).
- Pakk ut "Gjennomsnittlig grå verdi" fra cellen somas ved å klikke Mer > Multi Measure. En dialogboks vises. Aktiver alternativene Mål alle 600 stykker og Én rad per stykke for å få én enkelt tabell der kolonner samsvarer med avkastning og rader samsvarer med tidsrammer. Lagre den genererte tabellen som et .xls regneark.
- Velg "Centroid" som parameter som skal trekkes ut (Analyser > Angi målinger).
- Pakk ut "Centroid" fra avkastningen ved å klikke på Mål. Den genererte tabellen tilsvarer koordinatene (X,Y) for avkastningen. Lagre det som et .xls regneark.
- Segmenter interesseområdet (ROI) med "Area Selection Tools" og legg det til i ROI Manager (Analyser > verktøy > ROI Manager > Legg til). Fra ROI Manager-menyen lagrer du den som en .zip-mappe (Mer > Lagre).
- Spesialbygd skript for å identifisere celler som reagerer på stimuli
MERK: MATLAB (se Materialfortegnelse) ble brukt her, men trinnene som er beskrevet, kan oppnås i alle programmeringsspråk. Brukere kan få tak i vårt spesialbygde skript ved å be om den tilsvarende forfatteren.- Korreksjon av fotoblekingseffekt: For å redusere bakgrunnen og fotoblekingseffekten, ta 15-20 bilder fra de ikke-stimulerende periodene før hver serie og tilpass dem til en lineær kurve [fit (poly1)].
MERK: I dette tilfellet, for en totalt 600-rammefilm der periodiske utbrudd av pulstog ble sendt hver 10. s, ble bilder 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 ansett som ikke-stimulerende perioder. - Normaliser ved hjelp av formelen: (X-min) / (max-min)
- Identifisering av responderende celler
- Beregn rotmiddelkvadratet (RMS) for de ikke-stimulerende periodene fra de normaliserte dataene. Dette vil bli betraktet som grunnlinjesignalet.
- Beregn maksimum av stimulerende perioder (rammer mellom de ikke-stimulerende periodene). I dette tilfellet, for en totalt 600-rammes film der periodiske utbrudd av pulstog ble sendt hver 10. s, ble bilder 91: 169, 191: 269, 291: 369, 391: 469, 491: 569 betraktet som stimulerende perioder.
- Hvis maksimumsverdien overgår grunnlinjesignalet med 2,5 ganger for en bestemt avkastning, merker du cellen som svar på den stimulerende perioden. Hvis cellen reagerer på tre av de fem stimulerende periodene, klassifiser den som en responderende celle.
- Korreksjon av fotoblekingseffekt: For å redusere bakgrunnen og fotoblekingseffekten, ta 15-20 bilder fra de ikke-stimulerende periodene før hver serie og tilpass dem til en lineær kurve [fit (poly1)].
Representative Results
Protokollen beskrevet i denne studien er basert på fluorescensavbildning og elektriske stimuleringsstudier utført av Weitz et al.12. Protokollen består av tre hoveddeler: (1) fluorescerende merking av GCL og flatmontering av netthinnen på MEA (figur 1-venstre), (2) visualisering av kalsiumaktivitet i GCL under elektrisk stimulering (figur 1-midten), og (3) ekstraksjon, prosessering og tolkning av bildedataene (figur 1-høyre).
For det første, som vist i figur 1-venstre, injiseres Long Evans-rotter intravitrealt med AAV2-CAG-GCaMP5G før avbildningsøkten. Det optimale virale uttrykket for denne vektoren oppstår 2 til 3 uker etter injeksjon12,18. Etter fullstendig bedøvelse av dyret, lages et pilothull ved hjelp av en 30 G nål, og deretter injiseres 5 μL AAV2-CAG-GCaMP5G sakte inn i glasslegemet ved hjelp av en 36 G stump nål festet til en presisjonssprøyte for å forhindre tilbakeløp. Under viral ekspresjon brukes et in vivo retinal imaging system for å vurdere tilstanden til retina etter operasjonen, med OCT-bilder som gir detaljert visualisering av retinallagene. Når genuttrykk er oppnådd, blir netthinnen forsiktig ekstrahert fra øyekoppen ved hjelp av et stereomikroskop og høypresisjons disseksjonsverktøy. Fra dette tidspunktet manipuleres vevet i oksygenerte medier for å bevare prøven. Den utskårne netthinnen, med GCL vendt oppover, monteres deretter på en plattform designet for flatmontering for å sikre stabilitet og forhindre prøveflyting. Prøven monteres på MEA-overflaten med GCL vendt mot elektrodene.
Deretter monteres MEA på grensesnittkortet på et omvendt fluorescerende mikroskop (figur 1-midten). Netthinneprøven gjennomsyres med oksygenerte medier ved 33 °C ved hjelp av et perfusjonssystem. Prøven kan opprettholdes i denne konfigurasjonen i flere timer. Den ønskede stimuleringsordningen er programmert, og bilder er anskaffet med en hastighet på 10 bilder per sekund. Det anbefales å navngi filmene i henhold til de anvendte elektriske stimuleringsparametrene. Bildeoppkjøp bør begynne før initiering av stimulering for å oppnå noen grunnlinjerammer uten stimulering, noe som vil tjene som en negativ kontroll.
Til slutt, som illustrert i figur 1-høyre, blir dataene hentet fra time-lapse-bildene ved å segmentere cellesomaene. Fotoblekingseffekter korrigeres ved å tilpasse dataene, og responsive celler identifiseres. Responsive celler er definert som de med fluorescenstopper under stimulering som overskrider grunnlinjen med 2,5 ganger. Hvis en celle reagerer på tre av de fem utbruddene av stimulering, anses den å reagere på det spesifikke stimuleringstoget.
Figur 1: Oversikt over studien. Skjematisk illustrasjon av protokollen for (venstre) fluorescerende merking av GCL på netthinnen og prøvemontering, (midten) satt opp forberedelse for ex vivo-opptak med elektrisk stimulering levert av en MEA, og (høyre) analyse av kalsiumavbildningsdataene for å klassifisere responsive celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Intravitreal-injisert retina
Forekomsten av komplikasjoner forbundet med intravitreale injeksjoner er svært lav. Imidlertid er det noen komplikasjoner som kan oppstå fra selve operasjonen, uavhengig av den injiserte komponenten. Disse komplikasjonene inkluderer kataraktdannelse, blødning i glasslegemet, forhøyning av intraokulært trykk og endoftalmitt23. For å avgjøre om disse komplikasjonene skyldes operasjonen, må dyret gjennomgå evaluering før prosedyren ved bruk av funduskopi og OCT. Tre dager etter injeksjonen skal dyrene følges opp. I figur 2A-D er netthinnen til et friskt injisert dyr vist. Etter to ukers injeksjon begynner RGC å uttrykke fluorescens, som kan visualiseres ved hjelp av fluorescensfundoskopi (figur 2B,C). OCT-bilder gir detaljert visualisering av disposisjon og tykkelse av retinale lag (figur 2D), og gir høyere oppløsning sammenlignet med funduskopi, spesielt når man vurderer netthinneløsning. Når netthinnen er flatmontert og avbildet ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop, blir det mulig å skille cellene og aksonbunter. I motsetning til andre kalsiumindikatorer er GCaMP-indikatoren begrenset til cytoplasma7, og fluorescens er ekskludert fra kjernen (figur 2E).
Figur 2: Representative bilder av den intravitreal-injiserte netthinnen. (A) Fundoskopi, (B) fluorescensfondoskopi, (C) zoom-inn av fluorescensfundoskopien, (D) OCT-bilde og (E) epi-fluorescensbilde av den utskårne netthinnen montert på en tilpasset MEA med grafenbaserte elektroder på 500 μm tykt borosilikatglass. I (E) svarer svarte linjer til Ti/Au-spor. Vektstenger: 115 μm (D) og 100 μm (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Elektroder og GCL-kontakt
For å fremkalle nevrale responser effektivt, er det avgjørende å sikre at den flatmonterte netthinnen er i nær kontakt med overflaten av MEA. En enkel måte å verifisere dette på er å visuelt bekrefte om cellene og elektrodene befinner seg i samme fokalplan (figur 3A). Hvis cellene ikke er i samme fokalplan som elektrodene (figur 3B), indikerer det at kontakten er suboptimal, noe som vil resultere i mindre effektiv stimulering.
Figur 3: Elektroder og GCL-kontakt. (A) Celler og elektroden (stjerne) i samme fokalplan. (B) Celler og elektroder som ikke er i samme fokalplan, noe som indikerer suboptimal kontakt for elektrisk stimulering i dette området. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ex vivo kalsiumavbildning ved elektrisk stimulering levert av en MEA
De resulterende dataene fra kalsiumavbildning består av time-lapse-bilder som overvåker den nevrale aktiviteten til hundrevis av celler som respons på elektrisk stimulering. Supraterskelstimuli forårsaker kalsiuminnstrømning til cellesomaene, noe som resulterer i en plutselig endring i fluorescensintensitet (video 1). Denne protokollen gjør det mulig å bestemme om en elektrode, MEA og / eller stimuleringsalgoritme fremkaller ønsket respons i nevralvev. Størrelsen og stigningen på elektrodene på MEA, samt andelen vev som studeres, vil bestemme passende objektiv forstørrelse å velge. For enkeltelektrodestimuleringsstudier med diametre fra 5 μm til 100 μm er vanligvis en 20-25x objektiv forstørrelse egnet (figur 4A), noe som gir en FOV på ca. 600 μm x 600 μm. For forsøk med stimulering med flere elektroder kan det være nødvendig med en 4-10x objektiv forstørrelse for å vurdere et større område på rundt 2 mm x 2 mm. Responsive celler kan enkelt identifiseres ved å generere en bildeprojeksjon med standardavvik for intervallfilmen (figur 4B og Video 1).
Figur 4: Kalsiumavbildning av GCL med elektrisk stimulering levert av en elektrode på 25 μm. (A) Maksimal projeksjon av en 60 s time-lapse-film og (B) standardavviksprojeksjon som tydelig viser celler som reagerer på elektriske stimuli fra en porøs grafenbasert elektrode med en diameter på 25 μm. Den stimulerende elektroden er indikert med en stjerne. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Analyse av kalsiumdynamikken over tid ved kontrollert stimulering
For hver identifiserte cellesoma ble gjennomsnittlige intensitetsverdier ekstrahert over tid. Figur 5A viser de fotoblekende korrigerte kalsiumsporene fra de responsive cellene. I dette eksemplet ble fem utbrudd av bifasiske pulstog (katodisk først, 40 sykluser, 1 ms varighet, 2 μA amplitude) levert hver 10. s (indikert med svarte linjer) under en 60 s bildeinnsamling. Innenfor et gitt eksperiment brukes de samme fem pulstogene for å teste konsistensen av responsen. Rammene som er tatt i de ikke-stimulerende periodene (uthevet i rødt) brukes til å utføre en lineær tilpasning, korrigere for fotoblekingseffekten.
Når de responderende cellene er identifisert, og deres koordinater (x,y) er kjent i forhold til den stimulerende elektroden, kan man undersøke forholdet mellom strømmen som kreves for å aktivere cellene og avstanden fra den stimulerende elektroden (figur 5B). Som forventet krever celler som ligger nærmere den stimulerende elektroden lavere strømverdier for å fremkalle en respons.
Figur 5: Representasjon av de elektrisk fremkalte responsene. (A) Kalsiumspor av cellesomas ved 5 utbrudd av pulstog (bifasisk, katodisk først, 40 sykluser, 1 ms varighet, 2 μA amplitude) hver 10 s (svarte linjer) under en 60 s bildeinnsamling. Ikke-stimulerende (røduthevede delbilder) og stimulerende punktum (guluthevede delbilder) vises. Spor som overgår baselinesignalet (rotmiddelkvadratet av de ikke-stimulerende periodene) med 2,5 ganger regnes som fremkalte responser. Celler som reagerer i tre av de fem stimulerende periodene klassifiseres som responderende celler. (B) Kalsiumaktivitetsfordelingskart som viser stimulerende elektrode (svart skissert sirkel) og celler (grå skissert sirkel). Fargekoden representerer den minste pulsamplituden som er nødvendig for å fremkalle en cellulær respons. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Kalsiumavbildning av GCL med elektrisk stimulering levert av en elektrode på 25 μm. Videoen viser forskjeller i fluorescensintensitet på grunn av elektrisk stimulering fra en porøs grafenbasert elektrode på 25 μm diameter. Venstre side viser den opprinnelige filmen, og høyre side viser standardavviksprojeksjonen der responderende celler lett kan identifiseres. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Protokollen beskrevet her tjener til å studere kalsiumdynamikken som forekommer i rotte retinal GCL ved elektrisk stimulering forsynt med en MEA. Det er en pålitelig og håndterbar metode, men krever litt trening, spesielt for å merke GCL jevnt effektivt og for å montere netthinnen riktig for å sikre optimal vev-elektrodekontakt. Denne protokollen er spesifikk for gnagere og må tilpasses hvis den brukes på en annen laboratorieart. De kritiske punktene, modifikasjonene og begrensningene i metodikken presenteres i detalj.
Intravitreale injeksjoner
Injeksjoner er mye brukt for okulær genlevering, med intravitreale injeksjoner som den foretrukne prosedyren. De har vist seg å være tryggere og mindre invasive sammenlignet med subretinale injeksjoner, som introduserer molekylene av interesse direkte mellom fotoreceptorene og retinalpigmentepitelet (RPE), og risikerer retinal detachment10. Det er imidlertid begrensninger, spesielt når du utfører disse injeksjonene i gnagermodeller. Den glassaktige humoren er gelatinøs, og hindrer viral diffusjon. Dessuten er linsen i gnagerøyne stor, noe som gjør det ikke-trivielt å sette inn nålen uten å skrape den. Presisjonssprøytenålene er ømfintlige og må byttes ofte. For å unngå hindring, vask dem med avionisert vann før og etter hver bruk og bytt dem regelmessig. I tillegg injiser innholdet sakte for å forhindre refluks og endringer i intraokulært trykk. Å oppnå stor og jevn fluorescens over netthinnen kan kreve øvelse.
Retinal celletransduksjon
Virale vektorer er en utmerket metode for in vivo genlevering, og AAV har blitt mye brukt for å transdusere retinale celler10. De har blitt godkjent som behandling for noen retinopatier som forårsaker menneskelig blindhet24. Imidlertid er deres bærekapasitet begrenset til 5 kb, inkludert de nødvendige regulatoriske elementene (f.eks. promotoren) 10,25. Det er flere serotyper tilgjengelig, hver med forskjellig tropisme. Velg den best egnede AAV basert på genene som skal leveres og cellene som skal transduseres26. For merking av RGC anbefales det å bruke AAV227.
Vinduet Genuttrykk
Det optimale virale uttrykket for AAV2-CAG-GCaMP5G er 2 til 3 uker etter injeksjon12,18. Utover den tidsrammen blir kjernene fra transfekterte celler fluorescerende, celler slutter å reagere på stimuli, og til slutt dør 7,28,29. Dette skyldes overekspresjonen av GCaMP-indikatoren, som omplasseres til kjernen. Tidsvinduet for optimalt genuttrykk vil variere avhengig av virusvektoren og den valgte promotoren30 og må bestemmes eksperimentelt før du fortsetter med denne protokollen.
Vev-elektrode kontakt
For optimale og reproduserbare resultater er det avgjørende å oppnå god vev-elektrodekontakt. Dårlig kontakt skyldes vanligvis den naturlige krumningen i netthinnen. En tilnærming er å kutte netthinnen i kvartaler, montere og avbilde en seksjon om gangen. Små deler av netthinnen kan bli bedre flatt, noe som resulterer i mer effektiv kontakt med overflaten av MEA. En annen potensiell årsak til dårlig kontakt er tilstedeværelsen av glassaktig humor. Når du utfører stimuleringseksperimenter som simulerer et epi-retinalt implantat, er det viktig å forsiktig fjerne glasslegemet under retina-eksisjon, da det kan fungere som en isolator for strøm. Her beskrives en enkel metode for å sjekke om kontakten er tilstrekkelig ved å visualisere elektroden og cellene i samme fokalplan.
Et alternativ til ex vivo retinal målinger er å vokse nevroner direkte på overflaten av elektrodene. Primærkultur av nevroner, som hippocampus-nevroner31, kan være nyttig for innledende tester for å evaluere funksjonaliteten til den nye stimulerende enheten. Imidlertid krever denne tilnærmingen fortsatt bruk av laboratoriedyr og representerer ikke kompleksiteten til retinalnettverket, noe som er viktig for å evaluere synaptiske responser på stimulering.
For å visualisere cellene under elektrode- og elektrodesporene, kan MEAer fremstilt med gjennomsiktige materialer som indiumtinnoksid (ITO) brukes 19,20,32. I tillegg til optiske målinger kan GCL-aktivitet ved elektrisk stimulering vurderes gjennom elektriske opptak. MEA kan brukes til å registrere det lokale feltpotensialet (LFP) til vevet. Dette kompromitterer imidlertid romlig oppløsning, da hver elektrode fanger aktivitet fra flere celler samtidig (avhengig av elektrodedimensjonene). Optisk opptak overvinner denne begrensningen og tilbyr kartlegging med høyere romlig oppløsning. Den største fordelen er evnen til å skille mellom aktive og inaktive celler mens du måler en stor FOV med enkeltcelleoppløsning. Blant alle cellulære aktivitetsreportere er kalsiumindikatorer godt beskrevet og mest brukte33.
Disclosures
Forfatterne har ingen opplysninger å tilføye manuskriptet.
Acknowledgments
Vi takker Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara og Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) for deres tekniske støtte, til Anna Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) fra Ophthalmology Research Group for deres støtte med intravitreale injeksjoner og in vivo retinal imaging.
Finansieringsenhetene som støttet dette arbeidet er: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programmet for sentre for fremragende forskning og utvikling (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya gjennom CERCA-programmet; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr. 871124); La Caixa Foundation (LCF / HR19 / 52160003); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | - |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | - |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | - |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | - |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | - |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | - | - |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | - |
| Blade | Swann-morton | 0308 | - |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | - |
| Carbogen | Air liquide | - | - |
| Curved-forceps | - | - | - |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | - |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | - |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | - |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | - |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | - |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | - |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | - |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | - |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | - | - |
| Long-Evans rat | Janvier | - | - |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | - | - |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | - |
| Methocel 2% | Omni Vision | - | - |
| Microelectrode array (MEA) | - | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | - |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | - |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | - |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | - |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | - |
| Prescaina | Llorens | - | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | - |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | - |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | - |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | - |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | - |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | - | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | - |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
- Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , Elsevier. 469-496 (2013).
- Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
- Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135 (2021).
- Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
- Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K.
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018 (2017).
- Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
- Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017 (2019).
- Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002 (2016).
- Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
- Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
- Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291 (2023).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
- Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504 (2018).
- Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
- Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829 (2022).
- Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
