Summary
Nethindeproteser har evnen til at generere visuelle opfattelser. For at fremme udviklingen af nye proteser er der behov for ex vivo-metoder til test af enheder før implantation. Denne artikel giver en omfattende protokol til undersøgelse af calciumaktivitet i retinal ganglioncellelag, når de udsættes for elektrisk stimulering.
Abstract
Retinale dystrofier er en førende årsag til blindhed over hele verden. Der er en omfattende indsats i gang for at udvikle avancerede nethindeproteser, der kan omgå de svækkede lysfølsomme fotoreceptorceller i den degenererede nethinde, med det formål delvist at genoprette synet ved at fremkalde visuelle opfattelser. En almindelig undersøgelsesvej involverer design og produktion af implanterbare enheder med en fleksibel fysisk struktur, der huser et stort antal elektroder. Dette muliggør effektiv og præcis generering af visuelle opfattelser. Med hvert teknologisk fremskridt opstår der imidlertid et behov for en pålidelig og håndterbar ex vivo-metode til at verificere enhedens funktionalitet, inden der går videre til in vivo-eksperimenter , hvor faktorer ud over enhedens ydeevne spiller ind. Denne artikel præsenterer en omfattende protokol til undersøgelse af calciumaktivitet i retinal ganglioncellelag (GCL) efter elektrisk stimulering. Specifikt er følgende trin skitseret: (1) fluorescerende mærkning af rottenthinden ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer, (2) indfangning af fluorescenssignalet ved hjælp af et inverteret fluorescensmikroskop, mens der anvendes forskellige mønstre af elektrisk stimulering og (3) ekstraktion og analyse af calciumsporene fra individuelle celler inden for GCL. Ved at følge denne procedure kan forskere effektivt teste nye stimuleringsprotokoller, inden de udfører in vivo-eksperimenter .
Introduction
Nethinden indeholder fotoreceptorer, som er celler, der er ansvarlige for at registrere lys. De fanger fotoner og omdanner dem til nerveimpulser. Disse impulser behandles derefter i nethinden og overføres til den visuelle cortex, hvilket resulterer i dannelsen af et visuelt billede1. Retinitis Pigmentosa (RP) og aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er degenerative sygdomme karakteriseret ved det progressive tab af fotoreceptorer. Disse retinopatier er blandt de førende årsager til blindhed på verdensplan1, påvirker millioner af individer og har betydelige medicinske, personlige og socioøkonomiske konsekvenser for patienter, sundhedssystemer og samfundet som helhed. Desuden forventes det med den aldrende befolkning, at AMD-tilfælde vil stige med 15% inden 20502.
I øjeblikket er der adskillige forskningsbestræbelser i gang for at genoprette synet hos patienter, der er ramt af disse tilstande3. En lovende tilgang er brugen af retinale proteser, som har vist sig effektive til delvis at genoprette syn 4,5. Disse enheder fanger lys fra den visuelle scene og konverterer det til elektriske impulser. Disse impulser leveres gennem elektroder i et mikroelektrodearray (MEA) implanteret i øjet, stimulerer de overlevende neuroner og omgår funktionen af de tabte fotoreceptorer. De aktiverede retinale ganglionceller (RGC'er) overfører output til hjernen, hvor det fortolkes som visuel opfattelse. De største begrænsninger ved nuværende implantater ligger imidlertid i opløsningen af elektrodevævsgrænsefladen6 og den ikke-selektive stimulering af forskellige celletyper. For at optimere designet af nye implanterbare enheder til mere effektiv synsgendannelse er det derfor afgørende at forstå, hvordan stimuleringsparadigmer kan udvikles til selektivt at aktivere celler tæt på elektroderne.
Calciumbilleddannelse er en udbredt teknik til undersøgelse af neural aktivitet, der giver flere fordele i forhold til ikke-optiske metoder 7,8. For det første giver det cellulær og subcellulær opløsning. For det andet kan calciummarkører målrette mod specifikke celletyper. For det tredje giver det mulighed for langsigtet sporing, og for det fjerde muliggør det observation af hele cellepopulationer, samtidig med at der skelnes mellem aktive og inaktive celler. Denne metode giver indirekte bevis for cellulær aktivitet med en tidsmæssig opløsning i området hundreder af millisekunder. Genetisk kodede fluorescerende calciumindikatorer, såsom GCaMP-sensorer, gennemgår en konformationsændring ved binding til calcium, hvilket resulterer i øget fluorescens9. Rekombinante adeno-associerede virale vektorer (AAV'er) er et effektivt middel til at transducere retinale celler med GCaMP10.
Denne protokol præsenterer en effektiv metode, der anvender calciumbilleddannelse til test af stimuleringsprotokoller for nethindeimplantater. Specifikt fokuserer vi på ex vivo rotte retinal væv og giver detaljerede trinvise instruktioner, fra prøvetagning til dataanalyse. Ved at tilbyde denne omfattende vejledning kan forskere med forskellige baggrunde gå i gang med elektriske stimuleringseksperimenter med tillid.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med standard dyreetiske retningslinjer (European Communities Directive 86/609/EU) og godkendt af de lokale dyreetiske komitéer. 8 uger gamle Long Evans rotter blev anvendt til denne undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Klargøring af medier og fladmontering
- Ames' Medium (1 L)
- I en 1 L glasflaske kombineres Ames' Medium pulver, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml Penicillin/Streptomycin 100x og 1 L deioniseret vand (se Tabel over materialer). Juster pH til 7,4 og osmolariteten til 280 mOsm med deioniseret vand eller NaHCO3. Steriliser opløsningen ved at filtrere den gennem et 0,2 μm porestørrelsesfilter under en hætte.
BEMÆRK: Opbevar det steriliserede substrat ved 4 °C. Denne løsning forbliver stabil og kan bruges i op til 1 måned.
- I en 1 L glasflaske kombineres Ames' Medium pulver, 1,9 g/L NaHCO3, 10 ml Penicillin/Streptomycin 100x og 1 L deioniseret vand (se Tabel over materialer). Juster pH til 7,4 og osmolariteten til 280 mOsm med deioniseret vand eller NaHCO3. Steriliser opløsningen ved at filtrere den gennem et 0,2 μm porestørrelsesfilter under en hætte.
- Montering af membraner
- Fastgør en PTFE porøs membran (se tabel over materialer) til en skive ved hjælp af små dråber lim. Lad det tørre i mindst 15 min.
- For at opnå translucens nedsænkes membranerne i 70% ethanol i 1 min.
- Skyl membranerne to gange med deioniseret vand for helt at fjerne ethanolen. Opbevar dem i deioniseret vand for at forhindre opacitet.
2. GCL-mærkning og fladmontering af rottenethinden
BEMÆRK: Denne mærkningsmetode adskiller ikke RGC'er fra forskudte amakrinceller. Hvis selektiv mærkning af RGC'er ønskes, overveje at bruge AAV'er med RGC-specifikke promotorer11 og / eller retrograd mærkning gennem synsnerven12. For at skelne mellem klasser af ON- og OFF-center RGC'er skal du klassificere RGC'er baseret på deres lysrespons13,14 og bruge nyere versioner af genetisk kodede calciumindikatorer, der giver øget følsomhed og evnen til at måle enkelthandlingspotentialer15.
- Intravitreal injektion
- Bedøv den 8 uger gamle Long Evans rotte med 2% isofluran / 1%O2 , indtil der ikke er nogen pedalrefleks, og vedligehold anæstesi med en rotte næsemaske (se materialetabel).
BEMÆRK: Under anæstesi skal du placere dyret på en varmepude for at opretholde kropstemperaturen. - Administrer en dråbe kommercielt tilgængelige øjendråber (se materialetabel) for at udvide pupillen.
- Før du fortsætter med operationen, skal du undersøge øjet for abnormiteter ved hjælp af fundoskopi og optisk kohærenstomografi (OCT) med et in vivo retinal billeddannelsessystem. Påfør en dråbe Methocel 2% for at lette hornhindeobjektiv kontakt (se materialetabel).
BEMÆRK: Hvis der opdages abnormiteter, skal du ikke fortsætte med de efterfølgende trin for det øje. - Påfør en dråbe Prescaine som lokalbedøvelse. Fastgør øjenlåget og limbalkonjunktiva med et kommercielt tilgængeligt suturfilament (se materialetabel). Opret en 1 mm sklerotomi 4 mm fra limbussen ved hjælp af en 30 G nål.
- Sæt en 36 G stump kanyle på en præcisionssprøjte, og injicer AAV-partiklerne, der bærer den genetisk kodede calciumindikator, i glaslegemet i 30 sekunder i en vinkel på 45°. I denne undersøgelse brugte vi AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml i HBSS) (se materialetabel).
BEMÆRK: AAV-konstruktioner, der ikke koder for potentielt tumorigene genprodukter eller toksinmolekyler og produceres uden en hjælpervirus, kan håndteres i Biosafety Level 1 (BSL-1) faciliteter. Ellers skal der, hvis det betragtes som biofarligt materiale under BSL-2-indeslutning, træffes passende forholdsregler16. AAV'er, der koder for GCaMP, betragtes som BSL-1 og kræver ikke manipulation under biosikkerhedsskabe.
- Sæt en 36 G stump kanyle på en præcisionssprøjte, og injicer AAV-partiklerne, der bærer den genetisk kodede calciumindikator, i glaslegemet i 30 sekunder i en vinkel på 45°. I denne undersøgelse brugte vi AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml i HBSS) (se materialetabel).
- Påfør en dråbe Tobradex (se materialetabellen) for at forhindre betændelse og som antibiotikaprofylakse.
- Gentag eventuelt trin 2, 3 og 4 med det andet øje.
BEMÆRK: Kontroller dyrene 12-24 timer efter operationen for at sikre, at der ikke er bivirkninger. - Tre dage efter injektion undersøges retinalstrukturen ved hjælp af fundoskopi og OCT med et in vivo retinal billeddannelsessystem (se materialetabel).
- To uger efter injektion skal GCL udsende fluorescens. Vurder retinal struktur og AAV-ekspression ved fluorescensfundoskopi ved hjælp af et in vivo retinal billeddannelsessystem.
BEMÆRK: Ifølge Weitz et al.12 bliver fluorescens fra AAV2-CAG-GCaMP5G mærkbar 1 uge efter injektion og intensiveres med 2 uger. Fra og med den fjerde uge inducerer overekspression af GCaMP cytomorbiditet. Døende celler udviser et højt baseline fluorescenssignal i kernen og cytoplasmaet, der ikke svinger som reaktion på stimulering. I raske celler er GCaMP-ekspression begrænset til cytoplasmaet og udelukket fra kernen 7,8,12,17,18. Disse funktioner kan observeres ex vivo under mikroskopibilleddannelse. Vinduet for genekspression kan variere afhængigt af den virale vektor og den valgte promotor.
- Bedøv den 8 uger gamle Long Evans rotte med 2% isofluran / 1%O2 , indtil der ikke er nogen pedalrefleks, og vedligehold anæstesi med en rotte næsemaske (se materialetabel).
- Nethindeudskæring og fladmontering
BEMÆRK: To til tre uger efter injektion aflives intravitrealt injicerede rotter umiddelbart før elektrofysiologiprotokollen begynder i overensstemmelse med standard etiske retningslinjer (European Communities Directive 86/609 / EU) og godkendt af lokale etiske udvalg. Indånding af kuldioxid (CO2) anvendes som metode til eutanasi i denne protokol.- Øje enukleation
- Tryk forsigtigt på ydersiden af kredsløbet ved hjælp af et par buede tang for let at stikke øjet ud fra øjenhulen.
- Brug en fjedersaks til at skære musklerne, der holder øjet og enukleere det, og pas på ikke at punktere øjeæblet.
BEMÆRK: Start fra dette trin, disseker nethinden under et stereomikroskop i iltet (95%O2 / 5% CO2) Ames 'medium.
- Retina excision
- Brug et par små buede tang og en fin fjedersaks til at fjerne alt omgivende væv fra øjeæblet.
- Tag et stykke ca. 3 cm x 3 cm filterpapir og læg det på låget af et 3,5 cm fad. Læg papiret i blød med Ames' medium.
- Placer øjeæblet oven på papiret med det forreste segment vendt mod operatøren. Brug et par lige tang til at holde øjeæblet, og placer dem oven på ora serrata i en vinkel på ca. 45 ° fra skålens overflade. Lav et lille snit med et blad ved hjælp af mellemrummet mellem de lige tang som reference.
- Refunder øjeæblet i Ames 'medium. Brug et par lige tang og en fin fjedersaks til at adskille øjets forreste og bageste segment.
- Fjern forsigtigt linsen ved hjælp af to par lige pincet. Adskil derefter nethinden fra scleraen.
- Skær sclera mod synsnerven ved hjælp af fin fjedersaks, indtil nethinden er isoleret fra øjenkoppen.
- Brug et fluorescensstereomikroskop til at identificere det område af nethinden, der har det bedste calciumindikatorudtryk.
BEMÆRK: Omfanget af viral spredning afhænger af succesen af den intravitreale injektion. Opnåelse af fluorescens på tværs af store dele af nethinden kan kræve øvelse. Efterforskerens erfaring spiller en afgørende rolle for at opnå optimale resultater. - Brug en plastikpipette med skærespids til at overføre det valgte stykke af nethinden til monteringsmembranen (monteringsmembrantrin). Brug et par lige tang til at flatmontere nethinden med GCL opad.
- Fjern mediet med en plastikpipette fastgjort til en 100 μL pipettespids, så nethindestykket kan klæbe til den porøse membran. Vend enheden på MEA, så GCL hviler oven på elektroderne.
- Fyld prøvebadet med iltet Ames' medium.
- Øje enukleation
3. Ex vivo calciumbilleddannelse ved elektrisk stimulering
BEMÆRK: I dette arbejde blev der anvendt et proof-of-concept MEA til ex vivo-forsøg . De brugerdefinerede MEA'er blev fremstillet med porøse grafenbaserede elektroder med en diameter på 25 μm på 500 μm tykt borosilikatglas med Ti/Au-spor og senere isoleret med siliciumnitrid og SU-8 fotoresist12. Imidlertid er calciumbilleddannelsesmetoderne gyldige uanset det elektrodemateriale, der anvendes til stimulering.
- Indstil perfusionssystemet, så det iltede Ames' Medium konstant perfuserer prøvebadet ved 33 °C ved en konstant strømningshastighed på 5 ml/min.
- Brug et omvendt fluorescensmikroskop udstyret med en lysstofrør, en FITC-filterterning og et CMOS-kamera til at inspicere nethinden for et område, hvor de stimulerende elektroder og fluorescensen fra GCaMP-ekspressive celler er synlige. Et 20x NA 0,75 luftmål blev brugt til denne undersøgelse.
BEMÆRK: For effektivt at stimulere (og registrere) cellerne med elektroderne skal nethinden og elektroden være i tæt kontakt. Således er celler synligt i samme brændplan som elektroderne. Hvis det ikke er tilfældet, skal du gentage trinnene med retina-udskæring fra trin 8 og fremefter. Når du bruger nethinden fra sunde dyremodeller (med fungerende fotoreceptorer), skal du være opmærksom på, at hver gang lysstofrøret tændes, vil der være nogle fremkaldte reaktioner genereret af lyset, da nethinden er lysfølsom over for den bølgelængde, der bruges til at spænde GCaMP-sensoren. Disse lysinducerede calciumændringer kan bruges til at vurdere vævets sundhedstilstand. For at undgå at blande lys med elektrisk fremkaldte reaktioner skal du tænde lysstofrøret mindst 1 min, før du starter billedoptagelsen. - For at fremkalde elektrisk fremkaldte reaktioner i GCL skal du vælge en elektrode til at sende strømstyrede impulser. Indstil de elektriske stimuleringsparametre i pulsgeneratorenhedens software, såsom: form, amplitude, varighed, faseforsinkelse og frekvens af impulser, der skal påføres.
BEMÆRK: Effektive stimulusparametre kan variere meget fra pulsbredder på 50 μs til 100 ms med amplituder fra 0,1 μA til 10 μA. Disse parametre sammen med stimulusfrekvens, stimuluspolaritet, antal impulser og interfaseforsinkelser kan påvirke det rumlige tidsmæssige respons observeret ved calciumbilleddannelse 19,20,21,22. Et tog med 40 bifasiske impulser, der leverer 1 ms, 2 μA-stimulering, genererer ofte et synligt respons i mærkede neuroner. - For at synkronisere billedoptagelsen med stimuleringsleveringen skal du bruge pulsgeneratoren som en ekstern udløser til at styre starten på billedoptagelsen. Tilslut kameraet (se materialetabellen) med pulsgeneratoren ved hjælp af udgangsudløsersignalet, og indstil kamerasoftwarens "Capture Mode" til "External Start Trigger". Tryk på Start i kamerasoftwaren, så den venter på en ekstern udløser for at starte. Start billedoptagelsen med pulsgeneratorsoftwaren.
BEMÆRK: Den eksterne udløserkontrol kan være konfigureret forskelligt for forskellige kameraer. Denne undersøgelse erhvervede typisk billeder (512 x 512 pixels, 16-bit gråtoner) med 10 billeder i sekundet i 1 minut, mens den gav udbrud af bifasiske pulstog hver 10. s. Pulslevering starter efter 10 s, så de første rammer i alle eksperimenter svarer til spontan aktivitet. Afhængigt af GCaMP-sensoren og den analyse, man vil udføre, skal man muligvis justere optagehastigheden i henhold til stignings- og henfaldstiderne for din calciumindikator8. Overvej følsomheden til at detektere enkeltaktionspotentialer for calciumindikatoren15. - Gem billederne med et filnavn, der indeholder de anvendte elektriske stimuleringsparametre, f.eks. [Elektrodenummer]_[Pulsamplitude]_[Pulsvarighed]_[Pulsfrekvens]_Image001.
4. Analyse af data
- ImageJ/FIJI for at udtrække fluorescensintensitetsprofilen over tid og de rumlige koordinater fra cellesomaerne
- Segmentér interesseområdet (ROI) med "Værktøjer til områdevalg", og føj det til ROI Manager (Analysér > værktøjer > ROI Manager > Tilføj). Fra menuen ROI Manager skal du gemme den som en .zip mappe (Mere > Gem).
BEMÆRK: Typisk kan de samme ROI'er anvendes på alle stimuleringseksperimenter, da de svarer til det samme FOV. - Vælg "Gennemsnitlig grå værdi" som den parameter, der skal ekstraheres (Analyser > Indstil målinger).
- Uddrag den "gennemsnitlige grå værdi" fra cellesomaerne ved at klikke på Mere > multimål. Der vises en dialogboks. Aktivér indstillingerne Mål alle 600 udsnit og Én række pr. udsnit for at få vist en enkelt tabel, hvor kolonner svarer til investeringsafkast, og rækker svarer til tidsrammer. Gem den genererede tabel som et .xls regneark.
- Vælg "Centroid" som parameter, der skal ekstraheres (Analyser > Indstil målinger).
- Udtræk "Centroid" fra ROI'erne ved at klikke på Mål. Den genererede tabel svarer til koordinaterne (X,Y) for ROI'erne. Gem det som et .xls regneark.
- Segmentér interesseområdet (ROI) med "Værktøjer til områdevalg", og føj det til ROI Manager (Analysér > værktøjer > ROI Manager > Tilføj). Fra menuen ROI Manager skal du gemme den som en .zip mappe (Mere > Gem).
- Specialbygget script til at identificere celler, der reagerer på stimuli
BEMÆRK: MATLAB (se materialetabel) blev brugt her, men de beskrevne trin kan opnås i ethvert programmeringssprog. Brugere kan få vores specialbyggede script ved at anmode om den tilsvarende forfatter.- Korrektion af fotoblegningseffekt: For at afbøde baggrunds- og fotoblegningseffekten skal du tage 15-20 billeder fra de ikke-stimulerende perioder før hver burst og tilpasse dem til en lineær kurve [fit (poly1)].
BEMÆRK: I dette tilfælde blev billeder 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 betragtet som ikke-stimulerende perioder for i alt 600-frames, hvor periodiske udbrud af pulstog blev sendt hver 10. s. - Normaliser ved hjælp af formlen: (X-min) / (max-min)
- Identifikation af responderende celler
- Beregn rodmiddelkvadratet (RMS) for de ikke-stimulerende perioder ud fra de normaliserede data. Dette vil blive betragtet som basissignalet.
- Beregn maksimum for stimuleringsperioderne (rammer mellem de ikke-stimulerende perioder). I dette tilfælde blev rammer 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 betragtet som stimulerende perioder for en samlet film med 600 billeder, hvor periodiske udbrud af pulstog blev sendt hver 10. s.
- Hvis den maksimale værdi overstiger basislinjesignalet med 2,5 gange for et bestemt investeringsafkast, skal du mærke cellen som reaktion på den stimulerende periode. Hvis cellen reagerer på tre ud af de fem stimulerende perioder, skal du klassificere den som en responderende celle.
- Korrektion af fotoblegningseffekt: For at afbøde baggrunds- og fotoblegningseffekten skal du tage 15-20 billeder fra de ikke-stimulerende perioder før hver burst og tilpasse dem til en lineær kurve [fit (poly1)].
Representative Results
Protokollen beskrevet i denne undersøgelse er baseret på fluorescensbilleddannelse og elektriske stimuleringsundersøgelser udført af Weitz et al.12. Protokollen består af tre hoveddele: (1) fluorescerende mærkning af GCL og flad montering af nethinden på MEA (figur 1-venstre), (2) visualisering af calciumaktivitet i GCL under elektrisk stimulering (figur 1-midt) og (3) ekstraktion, behandling og fortolkning af billeddataene (figur 1-højre).
For det første, som afbildet i figur 1-venstre, injiceres Long Evans-rotter intravitvirkelig med AAV2-CAG-GCaMP5G før billeddannelsessessionen. Det optimale virale udtryk for denne vektor forekommer 2 til 3 uger efter injektion12,18. Efter fuld bedøvelse af dyret laves et pilothul ved hjælp af en 30 G nål, og derefter injiceres 5 μL AAV2-CAG-GCaMP5G langsomt i glaslegemet ved hjælp af en 36 G stump nål fastgjort til en præcisionssprøjte for at forhindre tilbagesvaling. Under viral ekspression bruges et in vivo retinal billeddannelsessystem til at vurdere tilstanden af nethinden efter operationen, hvor OCT-billeder giver detaljeret visualisering af retinale lag. Når genekspression er opnået, ekstraheres nethinden omhyggeligt fra øjenkoppen ved hjælp af et stereomikroskop og dissektionsværktøjer med høj præcision. Fra dette tidspunkt manipuleres vævet i iltede medier for at bevare prøven. Den udskårne nethinde, med GCL opad, monteres derefter på en platform designet til flad montering for at sikre stabilitet og forhindre prøveflydende. Prøven monteres på MEA-overfladen med GCL vendt mod elektroderne.
Dernæst monteres MEA på sit interfacekort på et inverteret fluorescerende mikroskop (figur 1-midten). Retinalprøven perfuseres med iltede medier ved 33 °C ved hjælp af et perfusionssystem. Prøven kan opretholdes i denne konfiguration i flere timer. Det ønskede stimuleringsskema er programmeret, og billeder erhverves med en hastighed på 10 billeder pr. Sekund. Det anbefales at navngive filmene i henhold til de anvendte elektriske stimuleringsparametre. Billedoptagelse bør begynde før initiering af stimulering for at opnå nogle baseline-rammer uden stimulering, hvilket vil tjene som en negativ kontrol.
Endelig, som illustreret i figur 1-højre, ekstraheres dataene fra time-lapse-billederne ved at segmentere cellesomaerne. Fotoblegningseffekter korrigeres ved at tilpasse dataene, og responsive celler identificeres. Responsive celler defineres som dem med fluorescenstoppe under stimulering, der overstiger deres baseline med 2,5 gange. Hvis en celle reagerer på tre ud af de fem udbrud af stimulering, anses den for at reagere på det specifikke stimuleringstog.
Figur 1: Oversigt over undersøgelsen. Skematisk illustration af protokollen til (venstre) fluorescerende mærkning af GCL i nethinden og prøvemontering, (midten) opsætning af forberedelse til ex vivo-optagelser med elektrisk stimulering leveret af en MEA og (højre) analyse af calciumbilleddataene for at klassificere responsive celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Intravitreal-injiceret nethinden
Forekomsten af komplikationer forbundet med intravitreale injektioner er meget lav. Der er dog nogle komplikationer, der kan opstå fra selve operationen, uanset den injicerede komponent. Disse komplikationer omfatter dannelse af grå stær, glaslegemeblødning, forhøjelse af intraokulært tryk og endophthalmitis23. For at afgøre, om disse komplikationer skyldes operationen, skal dyret gennemgå evaluering før proceduren ved hjælp af funduskopi og OCT. Tre dage efter injektionen skal dyrene følges op. I figur 2A-D vises nethinden hos et sundt injiceret dyr. Efter to ugers injektion begynder RGC'erne at udtrykke fluorescens, som kan visualiseres ved hjælp af fluorescensfundoskopi (figur 2B, C). OCT-billeder giver detaljeret visualisering af placeringen og tykkelsen af retinale lag (figur 2D), hvilket giver højere opløsning sammenlignet med funduskopi, især ved vurdering af nethindeløsning. Når nethinden er fladmonteret og afbildet ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop, bliver det muligt at skelne cellerne og axonbundterne. I modsætning til andre calciumindikatorer er GCaMP-indikatoren begrænset til cytoplasma7, og fluorescens er udelukket fra kernen (figur 2E).
Figur 2: Repræsentative billeder af den intravitrealinjicerede nethinde. (A) Fundoskopi, (B) fluorescensfundoskopi, (C) zoom-in af fluorescensfundoskopien, (D) OCT-billede og (E) epi-fluorescensbillede af den udskårne nethinde monteret på en brugerdefineret MEA med grafenbaserede elektroder på 500 μm tykt borosilikatglas. I (E) svarer sorte linjer til Ti/Au-spor. Skalastænger: 115 μm (D) og 100 μm (E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Elektroder og GCL-kontakt
For at fremkalde neurale reaktioner effektivt er det afgørende at sikre, at den fladmonterede nethinden er i tæt kontakt med overfladen af MEA. En enkel måde at verificere dette på er ved visuelt at bekræfte, om cellerne og elektroderne er placeret i samme brændplan (figur 3A). Hvis cellerne ikke er i samme brændplan som elektroderne (figur 3B), indikerer det, at kontakten er suboptimal, hvilket vil resultere i mindre effektiv stimulering.
Figur 3: Elektroder og GCL-kontakt. (A) Celler og elektroden (stjerne) i samme brændplan. (B) Celler og elektroder, der ikke befinder sig i samme brændplan, hvilket indikerer suboptimal kontakt for elektrisk stimulering i dette område. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ex vivo calciumbilleddannelse ved elektrisk stimulering leveret af et MEA
De resulterende data fra calciumbilleddannelse består af time-lapse-billeder, der overvåger den neurale aktivitet af hundredvis af celler som reaktion på elektrisk stimulering. Suprathreshold stimuli forårsager en calciumtilstrømning til cellesomaerne, hvilket resulterer i en pludselig ændring i fluorescensintensitet (video 1). Denne protokol gør det muligt at bestemme, om en elektrode-, MEA- og/eller stimuleringsalgoritme fremkalder det ønskede respons i neuralt væv. Størrelsen og tonehøjden af elektroderne på MEA samt andelen af væv, der undersøges, bestemmer den passende objektive forstørrelse, der skal vælges. Typisk til enkeltelektrodestimuleringsundersøgelser med diametre fra 5 μm til 100 μm er en 20-25x objektiv forstørrelse egnet (figur 4A), hvilket giver et synsfelt på ca. 600 μm x 600 μm. For forsøg, der involverer stimulering med flere elektroder, kan en 4-10x objektiv forstørrelse være nødvendig for at vurdere et bredere område på omkring 2 mm x 2 mm. Responsive celler kan let identificeres ved at generere en standardafvigelsesbilledprojektion af time-lapse-filmen (figur 4B og video 1).
Figur 4: Calciumbilleddannelse af GCL med elektrisk stimulering tilvejebragt af en elektrode med en diameter på 25 μm. (A) Maksimal projektion af en 60 s time-lapse-film og (B) standardafvigelsesprojektion, der tydeligt viser celler, der reagerer på elektriske stimuli fra en porøs grafenbaseret elektrode med en diameter på 25 μm. Den stimulerende elektrode er angivet med en stjerne. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Analyse af calciumdynamikken over tid ved kontrolleret stimulering
For hver identificeret cellesoma blev gennemsnitsintensitetsværdierne ekstraheret over tid. Figur 5A viser de fotoblegningskorrigerede calciumspor fra de responsive celler. I dette eksempel blev fem udbrud af bifasiske pulstog (katodisk først, 40 cyklusser, 1 ms varighed, 2 μA amplitude) leveret hver 10. sek. (angivet med sorte linjer) under en 60 s billedoptagelse. Inden for et givet eksperiment anvendes de samme fem pulstog til at teste responsens konsistens. De rammer, der er optaget i de ikke-stimulerende perioder (fremhævet med rødt), bruges til at udføre en lineær pasform, der korrigerer for fotoblegningseffekten.
Når de responderende celler er identificeret, og deres koordinater (x,y) er kendt i forhold til den stimulerende elektrode, kan man undersøge forholdet mellem den strøm, der kræves for at aktivere cellerne, og afstanden fra den stimulerende elektrode (figur 5B). Som forventet kræver celler placeret tættere på den stimulerende elektrode lavere strømværdier for at fremkalde et svar.
Figur 5: Repræsentation af de elektrisk fremkaldte reaktioner. (A) Calciumspor af cellesomaer ved 5 udbrud af pulstog (bifasisk, katodisk først, 40 cyklusser, 1 ms varighed, 2 μA amplitude) hver 10. sek. (sorte linjer) under en 60 s billedoptagelse. Ikke-stimulerende (rødfremhævede rammer) og stimulerende perioder (gul-fremhævede rammer) vises. Spor, der overstiger baselinesignalet (rodmiddelkvadratet for de ikke-stimulerende perioder) med 2,5 gange, betragtes som fremkaldte reaktioner. Celler, der reagerer i tre ud af de fem stimulerende perioder, klassificeres som responderende celler. (B) Kort over calciumaktivitetsfordeling, der viser den stimulerende elektrode (sort konturcirkel) og celler (grå konturcirkel). Farvekoden repræsenterer den mindste pulsamplitude, der er nødvendig for at fremkalde et cellulært respons. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Calciumbilleddannelse af GCL med elektrisk stimulering tilvejebragt af en elektrode med en diameter på 25 μm. Videoen viser forskelle i fluorescensintensitet på grund af elektrisk stimulering fra en porøs grafenbaseret elektrode med en diameter på 25 μm. Venstre side viser den originale film, og højre side viser standardafvigelsesprojektionen, hvor responderende celler let kan identificeres. Vægtstang: 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Protokollen beskrevet her tjener til at studere calciumdynamikken, der forekommer i rottens retinale GCL ved elektrisk stimulering forsynet med et MEA. Det er en pålidelig og håndterbar metode, men kræver en vis træning, især for ensartet mærkning af GCL effektivt og for at montere nethinden korrekt for at sikre optimal væv-elektrodekontakt. Denne protokol er specifik for gnavere og skal tilpasses, hvis den anvendes på en anden laboratorieart. De kritiske punkter, ændringer og begrænsninger i metoden præsenteres detaljeret.
Intravitreal injektioner
Injektioner anvendes i vid udstrækning til okulær genlevering, hvor intravitreale injektioner er den foretrukne procedure. De har vist sig at være sikrere og mindre invasive sammenlignet med subretinale injektioner, som introducerer molekylerne af interesse direkte mellem fotoreceptorerne og retinale pigmentepitel (RPE), hvilket risikerer nethindeløsning10. Der er dog begrænsninger, især når du udfører disse injektioner i gnavermodeller. Den glasagtige humor er gelatinøs og forhindrer viral diffusion. Desuden er linsen i gnaverøjne stor, hvilket gør det ikke-trivielt at indsætte nålen uden at ridse den. Præcisionssprøjtenålene er sarte og skal udskiftes ofte. For at forhindre obstruktion skal du vaske dem med deioniseret vand før og efter hver brug og udskifte dem regelmæssigt. Derudover injiceres indholdet langsomt for at forhindre opløsningsrefluks og ændringer i intraokulært tryk. At opnå stor og ensartet fluorescens over nethinden kan kræve øvelse.
Transduktion af nethindeceller
Virale vektorer er en fremragende metode til in vivo genlevering, og AAV'er har været meget udbredt til transducing retinale celler10. De er blevet godkendt som en behandling for nogle retinopatier, der forårsager menneskelig blindhed24. Deres transportkapacitet er dog begrænset til 5 kb, inklusive de krævede reguleringselementer (f.eks. promotoren)10,25. Der er flere serotyper tilgængelige, hver med forskellig tropisme. Vælg den bedst egnede AAV baseret på de gener, der skal leveres, og de celler, der skal transduceres26. Til mærkning af RGC'erne anbefales det at bruge AAV227.
Genekspression vindue
Den optimale virale ekspression for AAV2-CAG-GCaMP5G er 2 til 3 uger efter injektion12,18. Ud over denne tidsramme bliver kernerne fra transfekterede celler fluorescerende, celler holder op med at reagere på stimuli og dør i sidste ende 7,28,29. Dette skyldes overekspressionen af GCaMP-indikatoren, som translokeres ind i kernen. Tidsvinduet for optimal genekspression vil variere afhængigt af den virale vektor og den valgte promotor30 og skal bestemmes eksperimentelt, før du fortsætter med denne protokol.
Kontakt mellem væv og elektrode
For optimale og reproducerbare resultater er det afgørende at opnå god væv-elektrodekontakt. Dårlig kontakt skyldes typisk den naturlige krumning af nethinden. En tilgang er at skære nethinden i kvartaler, montere og billede en sektion ad gangen. Små dele af nethinden kan være bedre fladtrykt, hvilket resulterer i mere effektiv kontakt med overfladen af MEA. En anden potentiel årsag til dårlig kontakt er tilstedeværelsen af glasagtig humor. Når du udfører stimuleringseksperimenter, der simulerer et epi-retinal implantat, er det vigtigt omhyggeligt at fjerne glaslegemet humor under retina excision, da det kan fungere som en isolator til strøm. Her beskrives en simpel metode til at kontrollere, om kontakten er tilstrækkelig ved at visualisere elektroden og cellerne i samme brændplan.
Et alternativ til ex vivo retinale målinger er at dyrke neuroner direkte på overfladen af elektroderne. Primær kultur af neuroner, såsom hippocampale neuroner31, kan være nyttige til indledende tests for at evaluere funktionaliteten af den nye stimulerende enhed. Denne tilgang kræver dog stadig brug af forsøgsdyr og repræsenterer ikke kompleksiteten af nethindenetværket, hvilket er vigtigt for evaluering af synaptiske reaktioner på stimulering.
For at visualisere cellerne under elektrode- og elektrodesporene kan MEA'er fremstillet med gennemsigtige materialer såsom indiumtinoxid (ITO) anvendes 19,20,32. Ud over optiske målinger kan GCL-aktivitet ved elektrisk stimulering vurderes gennem elektriske optagelser. MEA kan bruges til at registrere vævets lokale feltpotentiale (LFP). Dette kompromitterer imidlertid rumlig opløsning, da hver elektrode fanger aktivitet fra flere celler samtidigt (afhængigt af elektrodedimensionerne). Optisk optagelse overvinder denne begrænsning og tilbyder kortlægning med højere rumlig opløsning. Dens største fordel er evnen til at skelne mellem aktive og inaktive celler, mens man måler et stort FOV med enkeltcelleopløsning. Blandt alle cellulære aktivitetsreportere er calciumindikatorer velbeskrevne og mest almindeligt anvendte33.
Disclosures
Forfatterne har ingen afsløringer at tilføje til manuskriptet.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara og Alina Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) for deres tekniske støtte, til Anna Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) fra Ophthalmology Research Group for deres støtte med intravitreale injektioner og in vivo retinal billeddannelse.
De finansieringsenheder, der støttede dette arbejde, er: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programmet for ekspertisecentre inden for F&U (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya gennem CERCA program; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr. 871124); La Caixa-stiftelsen (LCF/HR19/52160003); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | - |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | - |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | - |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | - |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | - |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | - | - |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | - |
| Blade | Swann-morton | 0308 | - |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | - |
| Carbogen | Air liquide | - | - |
| Curved-forceps | - | - | - |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | - |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | - |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | - |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | - |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | - |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | - |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | - |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | - |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | - | - |
| Long-Evans rat | Janvier | - | - |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | - | - |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | - |
| Methocel 2% | Omni Vision | - | - |
| Microelectrode array (MEA) | - | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | - |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | - |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | - |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | - |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | - |
| Prescaina | Llorens | - | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | - |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | - |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | - |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | - |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | - |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | - | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | - |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
- Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , Elsevier. 469-496 (2013).
- Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
- Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135 (2021).
- Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
- Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K.
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018 (2017).
- Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
- Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017 (2019).
- Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002 (2016).
- Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
- Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
- Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291 (2023).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
- Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504 (2018).
- Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
- Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829 (2022).
- Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
