Summary
망막 보철물은 시각적 지각을 생성하는 능력이 있습니다. 새로운 보철물의 개발을 앞당기기 위해서는 이식 전에 장치를 테스트하기 위한 생체 외 방법이 필요합니다. 이 논문은 전기 자극을 받았을 때 망막 신경절 세포층의 칼슘 활성을 연구하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
망막 이영양증은 전 세계적으로 실명의 주요 원인입니다. 퇴행성 망막의 손상된 빛 감지 광수용체 세포를 우회할 수 있는 첨단 망막 보철물을 개발하기 위한 광범위한 노력이 진행되고 있으며, 시각 지각을 유도하여 시력을 부분적으로 회복하는 것을 목표로 합니다. 조사의 일반적인 방법 중 하나는 많은 수의 전극을 수용하는 유연한 물리적 구조를 가진 이식 가능한 장치의 설계 및 생산과 관련이 있습니다. 이를 통해 시각 지각을 효율적이고 정확하게 생성할 수 있습니다. 그러나 각 기술 발전과 함께 장치의 성능 이외의 요인이 작용하는 생체 내 실험을 진행하기 전에 장치의 기능을 검증하기 위한 신뢰할 수 있고 관리 가능한 생체 외 방법이 필요합니다. 이 논문은 전기 자극 후 망막 신경절 세포층(GCL)의 칼슘 활성을 연구하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 구체적으로, (1) 유전적으로 인코딩된 칼슘 표지자를 사용하여 쥐의 망막을 형광 라벨링하고, (2) 전기 자극의 뚜렷한 패턴을 적용하면서 도립 형광 현미경을 사용하여 형광 신호를 캡처하고, (3) GCL 내의 개별 세포에서 칼슘 흔적을 추출하고 분석하는 단계가 요약되어 있습니다. 이 절차를 따름으로써 연구자들은 생체 내 실험을 수행하기 전에 새로운 자극 프로토콜을 효율적으로 테스트할 수 있습니다.
Introduction
망막에는 빛을 감지하는 세포인 광수용체가 있습니다. 그들은 광자를 포착하여 신경 자극으로 변환합니다. 이러한 자극은 망막 내에서 처리되어 시각 피질로 전달되어 시각 이미지(visual image)1가 형성된다. 색소성 망막염(RP)과 연령 관련 황반 변성(AMD)은 광수용체의 점진적인 소실을 특징으로 하는 퇴행성 질환입니다. 이러한 망막병증은 전 세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나이며1 수백만 명의 개인에게 영향을 미치고 환자, 의료 시스템 및 사회 전체에 심각한 의학적, 개인적, 사회경제적 영향을 미칩니다. 또한 인구 고령화로 인해 AMD 사례가 2050년까지 15% 증가할 것으로 예상됩니다2.
현재 이러한 질환을 앓고 있는 환자의 시력을 회복하기 위한 수많은 연구가 진행되고 있다3. 한 가지 유망한 접근법은 망막 보철물을 사용하는 것인데, 이는 부분적으로 시력을 회복시키는 효과가 입증되었습니다 4,5. 이 장치는 시각적 장면에서 빛을 포착하여 전기 펄스로 변환합니다. 이러한 펄스는 눈에 이식된 미세전극 어레이(MEA) 내의 전극을 통해 전달되어 살아남은 뉴런을 자극하고 손실된 광수용체의 기능을 우회합니다. 활성화된 망막 신경절 세포(RGC)는 출력을 뇌로 전달하여 시각적 지각으로 해석합니다. 그러나, 현재 임플란트의 주요 한계는 전극-조직 계면(6)의 해상도와 상이한 세포 유형의 비선택적 자극에 있다. 따라서 보다 효율적인 시력 회복을 위해 새로운 이식형 장치의 설계를 최적화하려면 전극에 근접한 세포를 선택적으로 활성화하기 위해 자극 패러다임을 개발할 수 있는 방법을 이해하는 것이 중요합니다.
칼슘 이미징은 신경 활동을 연구하기 위해 널리 사용되는 기술로, 비광학 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다 7,8. 첫째, 세포 및 세포 내 해상도를 제공합니다. 둘째, 칼슘 마커는 특정 세포 유형을 표적으로 삼을 수 있습니다. 셋째, 장기 추적이 가능하고, 넷째, 활성 세포와 비활성 세포를 구별하면서 전체 세포 집단을 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 수백 밀리초 범위의 시간적 분해능으로 세포 활동의 간접적인 증거를 제공합니다. GCaMP 센서와 같이 유전적으로 인코딩된 형광 칼슘 지시약은 칼슘에 결합할 때 구조적 변화를 겪어 형광을 증가시킨다9. 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)는 GCaMP10으로 망막 세포를 transduction하는 효과적인 수단입니다.
이 프로토콜은 망막 임플란트의 자극 프로토콜을 테스트하기 위해 칼슘 이미징을 활용하는 효율적인 방법을 제시합니다. 특히, 생체 외 쥐 망막 조직에 중점을 두고 샘플 수집에서 데이터 분석에 이르기까지 자세한 단계별 지침을 제공합니다. 이 포괄적인 가이드를 제공함으로써 다양한 배경의 연구자들이 자신 있게 전기 자극 실험을 시작할 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 시술은 표준 동물 윤리 지침(유럽 공동체 지침 86/609/EU)에 따라 수행되었으며 지역 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 생후 8주 된 Long Evans 쥐가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).
1. 미디어 및 플랫 마운팅 어셈블리 준비
- 에임스 미디엄 (1 L)
- 1L 유리병에 Ames' Medium 분말, 1.9g/L NaHCO3, 페니실린/스트렙토마이신 100x 10ml, 탈이온수 1L를 섞습니다( 재료 표 참조). 탈이온수 또는 NaHCO280을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 삼투압을 3mOsm으로 조정합니다. 후드 아래의 0.2μm 기공 크기 필터를 통해 용액을 여과하여 멸균합니다.
알림: 멸균된 배지는 4°C에서 보관하십시오. 이 용액은 안정적으로 유지되며 최대 1개월 동안 사용할 수 있습니다.
- 1L 유리병에 Ames' Medium 분말, 1.9g/L NaHCO3, 페니실린/스트렙토마이신 100x 10ml, 탈이온수 1L를 섞습니다( 재료 표 참조). 탈이온수 또는 NaHCO280을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 삼투압을 3mOsm으로 조정합니다. 후드 아래의 0.2μm 기공 크기 필터를 통해 용액을 여과하여 멸균합니다.
- 마운팅 멤브레인
- 작은 접착제 방울을 사용하여 하나의 PTFE 다공성 멤브레인( 재료 표 참조)을 와셔에 부착합니다. 최소 15분 동안 건조시킵니다.
- 반투명도를 얻으려면 멤브레인을 70% 에탄올에 1분 동안 담그십시오.
- 탈이온수로 멤브레인을 두 번 헹구어 에탄올을 완전히 제거합니다. 불투명을 방지하기 위해 탈이온수에 보관하십시오.
2. GCL 라벨링 및 쥐 망막 플랫 마운팅
참고: 이 표지 방법은 망막 신경절 세포를 변위된 무축삭 세포와 구별하지 않습니다. 망막 신경절 세포의 선택적 표지가 필요한 경우, 망막 신경절 특이적 프로모터(11)와 함께 AAV를 사용하거나 시신경(12)을 통한 역행성 표지를 사용하는 것을 고려한다. ON- 및 OFF-center 망막 신경절 세포의 등급을 구별하기 위해, 광 반응에 기초하여 망막 신경절 세포를 분류하고13,14, 향상된 감도와 단일 활동 전위를 측정할 수 있는 능력을 제공하는 새로운 버전의 유전자 인코딩 칼슘 표지자를 활용한다15.
- 유리체강내 주사
- 8주 된 Long Evans 쥐를 페달 반사가 없을 때까지 2% 이소플루란/1%O2 로 마취하고 쥐 코 마스크로 마취를 유지합니다( 재료 표 참조).
알림: 마취 중에는 체온을 유지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 올려 놓으십시오. - 동공을 확장시키기 위해 시중에서 판매되는 점안액( 재료 표 참조)을 한 방울 떨어뜨립니다.
- 수술을 진행하기 전에 안저경 검사와 생체 내 망막 영상 시스템과 함께 광간섭 단층 촬영(OCT)을 사용하여 눈에 이상이 있는지 검사합니다. 각막-객관적인 접촉을 촉진하기 위해 Methocel 2%를 한 방울 떨어뜨립니다( 재료 표 참조).
알림: 이상이 감지되면 해당 눈에 대한 후속 단계를 진행하지 마십시오. - 국소 마취제로 Prescaine 한 방울을 바릅니다. 시중에서 판매되는 봉합사 필라멘트로 눈꺼풀과 윤부 결막을 고정합니다( 재료 표 참조). 30G 바늘을 사용하여 변두리에서 4mm 떨어진 1mm 경화술을 만듭니다.
- 36G의 뭉툭한 바늘을 정밀 주사기에 부착하고 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약을 운반하는 AAV 입자를 45° 각도로 30초 동안 유리체에 주입합니다. 이 연구에서는 AAV2-CAG-GCaMP5G(HBSS에서 7.5 x 1011 GC/mL)를 사용했습니다( 자료표 참조).
참고: 잠재적으로 종양 유발 유전자 산물 또는 독소 분자를 암호화하지 않고 도우미 바이러스 없이 생산되는 AAV 구조체는 생물안전 레벨 1(BSL-1) 시설에서 취급할 수 있습니다. 그렇지 않고 BSL-2 격리 하에서 생물학적 유해 물질로 간주되는 경우 적절한 예방 조치를 취해야 합니다16. GCaMP에 대한 AAV 인코딩은 BSL-1로 간주되며 생물 안전 작업대에서 조작할 필요가 없습니다.
- 36G의 뭉툭한 바늘을 정밀 주사기에 부착하고 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약을 운반하는 AAV 입자를 45° 각도로 30초 동안 유리체에 주입합니다. 이 연구에서는 AAV2-CAG-GCaMP5G(HBSS에서 7.5 x 1011 GC/mL)를 사용했습니다( 자료표 참조).
- 염증을 예방하고 항생제 예방을 위해 Tobradex 한 방울( 재료 표 참조)을 바르십시오.
- 원하는 경우 다른 쪽 눈으로 2, 3, 4단계를 반복합니다.
알림: 수술 후 12-24시간 후에 동물을 검사하여 부작용이 없는지 확인하십시오. - 주사 3일 후, 안저경 검사와 생체 내 망막 영상 시스템으로 OCT를 사용하여 망막 구조를 검사합니다( 자료표 참조).
- 주입 후 2주가 지나면 GCL에서 형광이 방출됩니다. in vivo 망막 이미징 시스템을 사용하여 형광 안저경으로 망막 구조 및 AAV 발현을 평가합니다.
참고: Weitz et al.12에 따르면 AAV2-CAG-GCaMP5G의 형광은 주사 후 1주에 눈에 띄게 되고 2주까지 강화됩니다. 넷째 주부터 GCaMP의 과발현은 세포이환율을 유발합니다. 죽어가는 세포는 핵과 세포질에서 자극에 반응하여 변동하지 않는 높은 기준선 형광 신호를 나타냅니다. 건강한 세포에서 GCaMP 발현은 세포질에 국한되고핵 7,8,12,17,18에서 제외됩니다. 이러한 특징은 현미경 이미징 중에 생체 외에서 관찰할 수 있습니다. 유전자 발현의 창은 바이러스 벡터와 선택된 프로모터에 따라 달라질 수 있습니다.
- 8주 된 Long Evans 쥐를 페달 반사가 없을 때까지 2% 이소플루란/1%O2 로 마취하고 쥐 코 마스크로 마취를 유지합니다( 재료 표 참조).
- 망막 절제 및 평면 장착
참고: 주사 후 2-3주 후, 유리체강내 주사를 맞은 쥐는 표준 윤리 지침(유럽 공동체 지침 86/609/EU)에 따라 전기생리학 프로토콜이 시작되기 직전에 안락사되고 지역 윤리 위원회의 승인을 받습니다. 이산화탄소(CO2) 흡입은 이 프로토콜에서 안락사 방법으로 사용됩니다.- 눈 적출
- 구부러진 집게를 사용하여 안와(國広)의 바깥쪽을 부드럽게 눌러 안와(相度)에서 눈을 약간 돌출시킵니다.
- 스프링 가위를 사용하여 눈을 잡고 있는 근육을 자르고 안구를 뚫지 않도록 주의하면서 적출합니다.
알림: 이 단계부터 시작하여 산소가 공급된(95%O2 / 5%CO2) Ames' Medium에서 실체 현미경으로 망막을 해부합니다.
- 망막 절제
- 한 쌍의 작은 구부러진 집게와 가는 스프링 가위를 사용하여 안구에서 주변 조직을 모두 제거합니다.
- 약 3cm x 3cm 여과지 조각을 3.5cm 접시 뚜껑에 놓습니다. Ames' Medium에 종이를 담그십시오.
- 안구를 종이 위에 놓고 앞쪽 부분이 작업자를 향하도록 합니다. 한 쌍의 직선 집게를 사용하여 안구를 잡고 접시 표면에서 약 45° 각도로 ora serrata 위에 놓습니다. 직선 집게 사이의 공간을 참조로 사용하여 칼날로 작게 자릅니다.
- 안구를 에임스의 영매에 상환하십시오. 한 쌍의 직선 집게와 가는 스프링 가위를 사용하여 눈의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 분리합니다.
- 두 쌍의 직선 집게를 사용하여 렌즈를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 공막에서 망막을 분리합니다.
- 망막이 아이컵에서 분리될 때까지 가는 스프링 가위를 사용하여 공막을 시신경 쪽으로 자릅니다.
- 형광 실체 현미경을 사용하여 칼슘 지표 발현이 가장 좋은 망막 영역을 식별합니다.
참고: 바이러스 확산 정도는 유리체강내 주사의 성공 여부에 따라 다릅니다. 망막의 많은 부분에 걸쳐 형광을 얻으려면 연습이 필요할 수 있습니다. 연구자의 경험은 최적의 결과를 얻는 데 중요한 역할을 합니다. - 절단 팁 플라스틱 피펫을 사용하여 망막의 선택한 부분을 장착 멤브레인으로 옮깁니다(장착 멤브레인 단계). 한 쌍의 직선 집게를 사용하여 GCL이 위를 향하도록 망막을 평평하게 장착합니다.
- 100μL 피펫 팁에 부착된 플라스틱 피펫을 사용하여 매체를 제거하여 망막 조각이 다공성 멤브레인에 부착되도록 합니다. GCL이 전극 위에 놓이도록 어셈블리를 MEA로 뒤집습니다.
- 산소가 함유된 Ames' Medium으로 샘플 수조를 채웁니다.
- 눈 적출
3. 전기 자극에 대한 생체 외 칼슘 이미징
참고: 이 작업에서는 개념 증명 MEA가 생체 외 실험에 사용되었습니다. 맞춤형 MEA는 Ti/Au 트레이스가 있는 500μm 두께의 붕규산 유리에 25μm 직경의 다공성 그래핀 기반 전극으로 제작되었으며 나중에 질화규소 및 SU-8 포토레지스트12로 절연되었습니다. 그러나 칼슘 이미징 방법은 자극에 사용되는 전극 재료에 관계없이 유효합니다.
- 산소가 공급된 Ames' 배지가 33°C에서 5mL/분의 일정한 유속으로 시료 항온을 지속적으로 관류하도록 관류 시스템을 설정합니다.
- 형광 램프, FITC 필터 큐브 및 CMOS 카메라가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 GCaMP 발현 세포의 자극 전극과 형광을 볼 수 있는 영역이 있는지 망막을 검사합니다. 이 연구에는 20x NA 0.75 공기 대물렌즈가 사용되었습니다.
알림: 전극으로 세포를 효과적으로 자극(및 기록)하려면 망막과 전극이 밀접하게 접촉해야 합니다. 따라서 세포는 전극과 동일한 초점면에 눈에 띄게 있습니다. 그렇지 않은 경우 8단계부터 망막 절제 단계를 반복합니다. 건강한 동물 모델(기능하는 광수용체가 있음)의 망막을 사용하는 경우 형광등을 켤 때마다 망막이 GCaMP 센서를 여기시키는 데 사용되는 파장에 빛에 민감하기 때문에 빛에 의해 생성된 일부 유발 반응이 있습니다. 이러한 빛에 의한 칼슘 변화는 조직의 건강 상태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 빛과 전기적 반응이 혼합되는 것을 방지하려면 이미지 획득을 시작하기 최소 1분 전에 형광등을 켜십시오. - GCL에서 전기적 유발 응답을 이끌어내려면 전류 제어 펄스를 보낼 전극을 선택하십시오. 펄스 발생기 장치의 소프트웨어에서 모양, 진폭, 지속 시간, 위상 지연 및 적용할 펄스의 주파수와 같은 전기 자극 매개변수를 설정합니다.
참고: 효과적인 자극 파라미터는 펄스 폭이 50μs에서 100ms까지 다양할 수 있으며 진폭은 0.1μA에서 10μA입니다. 자극 주파수, 자극 극성, 펄스 수 및 계면 지연과 함께 이러한 매개변수는 칼슘 이미징 19,20,21,22에 의해 관찰되는 시공간 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 1ms, 2μA 자극을 전달하는 40개의 바이페이직 펄스 트레인은 종종 라벨링된 뉴런에서 가시적인 반응을 생성합니다. - 이미지 획득을 자극 전달과 동기화하려면 펄스 발생기를 외부 트리거로 사용하여 이미지 획득 시작을 제어합니다. 출력 트리거 신호를 사용하여 카메라( 재료 표 참조)를 펄스 발생기에 연결하고 카메라 소프트웨어의 "캡처 모드"를 "외부 시작 트리거"로 설정합니다. 카메라 소프트웨어에서 시작을 눌러 외부 트리거가 시작될 때까지 기다립니다. 펄스 발생기 소프트웨어로 이미지 수집을 시작합니다.
알림: 외부 트리거 컨트롤은 카메라마다 다르게 설정될 수 있습니다. 이 연구는 일반적으로 1분 동안 초당 10프레임으로 이미지(512 x 512픽셀, 16비트 그레이스케일)를 획득하면서 10초마다 바이페이직 펄스 트레인 버스트를 제공했습니다. 펄스 전달은 10초 후에 시작되므로 모든 실험의 첫 번째 프레임은 자발적인 활동에 해당합니다. GCaMP 센서와 수행할 분석에 따라 칼슘 표시기8의 상승 및 감소 시간에 따라 기록 속도를 조정해야 할 수도 있습니다. 칼슘 지시약15의 단일 활동 전위를 검출하기 위한 민감도를 고려한다. - [전극 번호]_[펄스 진폭]_[펄스 지속 시간]_[펄스 주파수]_Image001와 같이 적용된 전기 자극 파라미터가 포함된 파일 이름으로 이미지를 저장합니다.
4. 데이터 분석
- ImageJ/FIJI를 사용하여 시간 경과에 따른 형광 강도 프로파일과 세포 소마에서 공간 좌표를 추출합니다.
- "영역 선택 도구"를 사용하여 관심 영역(ROI)을 분할하고 ROI 관리자(분석 > 도구 > ROI 관리자 > 추가)에 추가합니다. ROI Manager 메뉴에서 .zip 폴더로 저장합니다(저장을 > 자세히 보기).
참고: 일반적으로 동일한 FOV에 해당하기 때문에 모든 자극 실험에 동일한 ROI를 적용할 수 있습니다. - 추출할 매개변수로 "평균 회색 값"을 선택합니다(분석 > 측정값 설정).
- More > Multi Measure를 클릭하여 세포 somas에서 "Mean gray value"를 추출합니다. 대화 상자가 나타납니다. Measure all 600 slices(600개 슬라이스 모두 측정) 및 One row per slice(슬라이스당 한 행) 옵션을 활성화하여 열이 ROI에 해당하고 행이 시간 프레임에 해당하는 단일 테이블을 얻습니다. 생성된 테이블을 .xls 스프레드시트로 저장합니다.
- 추출할 매개변수로 "Centroid"를 선택합니다(Analyze > Set measurements).
- 측정을 클릭하여 ROI에서 "Centroid"를 추출합니다. 생성된 테이블은 ROI의 좌표 (X,Y)에 대응됩니다. .xls 스프레드시트로 저장합니다.
- "영역 선택 도구"를 사용하여 관심 영역(ROI)을 분할하고 ROI 관리자(분석 > 도구 > ROI 관리자 > 추가)에 추가합니다. ROI Manager 메뉴에서 .zip 폴더로 저장합니다(저장을 > 자세히 보기).
- 자극에 반응하는 세포를 식별하기 위한 맞춤형 스크립트
참고: 여기서는 MATLAB( 재료 목차 참조)을 사용했지만 설명된 단계는 모든 프로그래밍 언어에서 수행할 수 있습니다. 사용자는 교신 작성자에게 요청하여 맞춤형 스크립트를 얻을 수 있습니다.- 광표백 효과 보정: 배경 및 광표백 효과를 완화하려면 각 버스트 전에 자극이 없는 기간에서 15-20프레임을 가져와 선형 곡선[fit(poly1)]에 맞춥니다.
참고: 이 경우 10초마다 주기적인 펄스 트레인 버스트가 전송되는 총 600프레임 동영상의 경우 프레임 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590은 자극이 없는 기간으로 간주되었습니다. - 공식을 사용하여 정규화: (X-min) / (max-min)
- 반응 세포 식별
- 정규화된 데이터에서 비자극 주기의 평균 제곱근(RMS)을 계산합니다. 이것은 기준 신호로 간주됩니다.
- 자극 기간의 최대값(자극하지 않는 기간 사이의 프레임)을 계산합니다. 이 경우 10초마다 주기적인 펄스 트레인 버스트가 전송되는 총 600프레임 동영상의 경우 프레임 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569가 자극 주기로 고려되었습니다.
- 특정 ROI에 대해 최대값이 기준 신호를 2.5배 초과하는 경우, 해당 자극 기간에 반응하는 세포에 태그를 지정합니다. 세포가 5개의 자극 기간 중 3개에 반응하면 반응 세포로 분류합니다.
- 광표백 효과 보정: 배경 및 광표백 효과를 완화하려면 각 버스트 전에 자극이 없는 기간에서 15-20프레임을 가져와 선형 곡선[fit(poly1)]에 맞춥니다.
Representative Results
이 연구에서 설명된 프로토콜은 Weitz et al.12에 의해 수행된 형광 이미징 및 전기 자극 연구를 기반으로 합니다. 프로토콜은 (1) GCL의 형광 표지 및 MEA의 망막 평면 장착(그림 1-왼쪽), (2) 전기 자극 중 GCL의 칼슘 활성 시각화(그림 1-가운데), (3) 이미징 데이터의 추출, 처리 및 해석(그림 1-오른쪽)의 세 가지 주요 부분으로 구성됩니다.
먼저, 그림 1-왼쪽에서 볼 수 있듯이 Long Evans 쥐는 이미징 세션 전에 AAV2-CAG-GCaMP5G를 유리체내로 주입합니다. 이 벡터에 대한 최적의 바이러스 발현은 주입 후 2 내지 3주 후에발생한다 12,18. 동물을 완전히 마취한 후 30G 바늘을 사용하여 파일럿 구멍을 만든 다음 역류를 방지하기 위해 정밀 주사기에 부착된 36G 뭉툭한 바늘을 사용하여 5μL의 AAV2-CAG-GCaMP5G를 유리체에 천천히 주입합니다. 바이러스 발현 중에 생체 내 망막 이미징 시스템을 사용하여 수술 후 망막의 상태를 평가하고 OCT 이미지를 통해 망막층을 자세히 시각화합니다. 유전자 발현이 이루어지면 실체 현미경과 고정밀 해부 도구를 사용하여 아이컵에서 망막을 조심스럽게 추출합니다. 이 시점부터 조직은 샘플을 보존하기 위해 산소가 공급된 배지에서 조작됩니다. 그런 다음 GCL이 위를 향하도록 절제된 망막을 평면 장착용으로 설계된 플랫폼에 장착하여 안정성을 보장하고 시료 부유를 방지합니다. 샘플은 GCL이 전극을 향하도록 MEA 표면에 장착됩니다.
그런 다음 MEA를 도립 형광 현미경의 인터페이스 기판에 장착합니다(그림 1-중간). 망막 샘플은 관류 시스템을 사용하여 33°C에서 산소가 공급된 배지로 관류됩니다. 샘플은 이 구성에서 몇 시간 동안 유지 관리할 수 있습니다. 원하는 자극 체계가 프로그래밍되고 초당 10프레임의 속도로 이미지가 획득됩니다. 적용된 전기 자극 매개변수에 따라 영화의 이름을 지정하는 것이 좋습니다. 이미지 획득은 자극이 시작되기 전에 시작되어 자극 없이 일부 기준선 프레임을 얻어야 하며, 이는 부정적인 대조군으로 작용합니다.
마지막으로, 그림 1-오른쪽에서 볼 수 있듯이 세포 소마를 분할하여 타임랩스 이미지에서 데이터를 추출합니다. 광표백 효과는 데이터를 피팅하여 보정되고 반응성 세포가 식별됩니다. 반응성 세포는 자극 중에 형광 피크가 기준선을 2.5배 초과하는 세포로 정의됩니다. 세포가 5번의 자극 중 3번의 폭발에 반응하면 특정 자극 열차에 반응하는 것으로 간주됩니다.
그림 1: 연구 개요. (왼쪽) 망막의 GCL을 형광 표지하고 시료를 장착하고, (가운데) MEA에서 제공하는 전기 자극을 사용하여 생체 외 기록을 준비하고, (오른쪽) 반응성 세포를 분류하기 위해 칼슘 이미징 데이터를 분석하기 위한 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유리체내 주입 망막
유리체강내 주사와 관련된 합병증의 발생률은 매우 낮습니다. 그러나 주사 성분에 관계없이 수술 자체로 인해 발생할 수 있는 몇 가지 합병증이 있습니다. 이러한 합병증에는 백내장 형성, 유리체 출혈, 안압 상승, 안구내염등이 포함된다 23. 이러한 합병증이 수술로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해 동물은 시술 전에 안저 내시경 검사와 OCT를 사용하여 평가를 받아야 합니다. 주사 후 3일이 지나면 동물을 추적해야 합니다. 그림 2A-D에는 건강한 주사 동물의 망막이 나와 있습니다. 주사 후 2주 후, 망막 신경절 세포는 형광을 발현하기 시작하며, 이는 형광 안저경을 사용하여 시각화할 수 있습니다(그림 2B,C). OCT 이미지는 망막층의 배치와 두께를 상세하게 시각화하며(그림 2D), 특히 망막 박리를 평가할 때 안저경에 비해 더 높은 해상도를 제공합니다. 망막을 평평하게 장착하고 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지화하면 세포와 축삭 다발을 구별할 수 있습니다. 다른 칼슘 표지자와 달리 GCaMP 표지자는 세포질7로 제한되며 형광은 핵에서 제외됩니다(그림 2E).
그림 2: 유리체내 주입 망막의 대표 이미지. (A) 안저경, (B) 형광 안저경, (C) 형광 안저경 검사의 확대, (D) OCT 이미지 및 (E) 500μm 두께의 붕규산 유리에 그래핀 기반 전극이 있는 맞춤형 MEA에 장착된 절제된 망막의 에피 형광 이미지. (E)에서 검은색 선은 Ti/Au 트레이스에 해당합니다. 눈금 막대: 115 μm(D) 및 100 μm(E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전극 및 GCL 접점
신경 반응을 효과적으로 유발하기 위해서는 편평하게 장착된 망막이 MEA 표면과 밀접하게 접촉하도록 하는 것이 중요합니다. 이를 확인하는 간단한 방법은 셀과 전극이 동일한 초점면에 있는지 육안으로 확인하는 것입니다(그림 3A). 셀이 전극과 동일한 초점면에 있지 않은 경우(그림 3B), 접촉이 최적이 아니라는 것을 나타내며, 이는 덜 효과적인 자극을 초래합니다.
그림 3: 전극 및 GCL 접점. (A) 동일한 초점면에 있는 셀과 전극(별표). (B) 세포와 전극이 동일한 초점면에 있지 않아 해당 영역의 전기 자극에 대한 최적이 아닌 접촉을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MEA에서 제공하는 전기 자극에 따른 생체 외 칼슘 이미징
칼슘 이미징의 결과 데이터는 전기 자극에 반응하여 수백 개의 세포의 신경 활동을 모니터링하는 타임 랩스 이미지로 구성됩니다. 초역치 자극은 세포 체내로 칼슘 유입을 일으켜 형광 강도의 급격한 변화를 초래합니다(비디오 1). 이 프로토콜을 사용하면 전극, MEA 및/또는 자극 알고리즘이 신경 조직에서 원하는 반응을 유도하는지 여부를 결정할 수 있습니다. MEA에서 전극의 크기와 피치, 연구 중인 조직의 비율에 따라 선택할 적절한 대물렌즈 배율이 결정됩니다. 일반적으로 직경이 5μm에서 100μm 사이인 단일 전극 자극 연구의 경우 약 600μm x 600μm의 FOV를 제공하는 20-25x 대물렌즈 배율이 적합합니다(그림 4A). 여러 전극을 사용한 자극과 관련된 실험의 경우 약 2mm x 2mm의 더 넓은 영역을 평가하기 위해 4-10x 대물렌즈 배율이 필요할 수 있습니다. 반응성 세포는 타임랩스 동영상의 표준 편차 이미지 프로젝션을 생성하여 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 4B 및 비디오 1).
그림 4: 25μm 직경의 전극이 제공하는 전기 자극을 사용한 GCL의 칼슘 이미징. (A) 60초 타임랩스 동영상의 최대 투영 및 (B) 25μm 직경의 다공성 그래핀 기반 전극에서 전기 자극에 반응하는 세포를 명확하게 묘사한 표준 편차 투영. 자극 전극은 별표로 표시됩니다. 척도 막대: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
통제된 자극에 따른 시간 경과에 따른 칼슘 역학 분석
식별된 각 세포 소마에 대해 평균 강도 값은 시간이 지남에 따라 추출되었습니다. 그림 5A 는 반응성 세포에서 광표백 보정된 칼슘 흔적을 보여줍니다. 이 예에서는 60초 이미지 획득 동안 10초(검은색 선으로 표시)마다 5개의 바이페이직 펄스 트레인(음극 우선, 40 사이클, 1ms 지속 시간, 2μA 진폭)이 전달되었습니다. 주어진 실험 내에서 응답의 일관성을 테스트하기 위해 동일한 5개의 펄스 트레인이 적용됩니다. 자극하지 않는 기간 동안 캡처된 프레임(빨간색으로 강조 표시)은 선형 맞춤을 수행하는 데 사용되어 광표백 효과를 보정합니다.
반응하는 세포가 식별되고 자극 전극에 대한 좌표(x,y)가 알려지면 세포를 활성화하는 데 필요한 전류와 자극 전극으로부터의 거리 사이의 관계를 조사할 수 있습니다(그림 5B). 예상대로 자극 전극에 더 가까운 셀은 반응을 유발하기 위해 더 낮은 전류 값이 필요합니다.
그림 5: 전기적 유발 반응의 표현. (A) 60초 이미지 획득 중 10초(검은색 선)마다 펄스 트레인 5회 버스트(biphasic, cathodic-first, 40 cycle, 1 ms duration, 2 μA amplitude)에 대한 세포 소마의 칼슘 흔적. 자극적이지 않은 기간(빨간색으로 강조 표시된 프레임)과 자극적인 기간(노란색으로 강조 표시된 프레임)이 표시됩니다. 기준선 신호(비자극 기간의 제곱 평균 제곱근)를 2.5배 초과하는 트레이스는 유발 반응으로 간주됩니다. 5개의 자극 기간 중 3개에 반응하는 세포는 반응 세포로 분류됩니다. (B) 자극 전극(검은색 윤곽선 원)과 세포(회색 윤곽선 원)를 보여주는 칼슘 활성 분포도. 색상 코드는 셀룰러 반응을 유발하는 데 필요한 최소 펄스 진폭을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 25μm 직경의 전극이 제공하는 전기 자극을 사용한 GCL의 칼슘 이미징. 이 비디오는 직경 25μm의 다공성 그래핀 기반 전극의 전기 자극으로 인한 형광 강도의 차이를 보여줍니다. 왼쪽은 원본 동영상을 보여주고 오른쪽은 반응 세포를 쉽게 식별할 수 있는 표준 편차 투영을 보여줍니다. 척도 막대: 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 MEA와 함께 제공된 전기 자극 시 쥐 망막 GCL에서 발생하는 칼슘 역학을 연구하는 역할을 합니다. 이는 신뢰할 수 있고 관리하기 쉬운 방법이지만 특히 GCL을 균일하게 라벨링하고 최적의 조직-전극 접촉을 보장하기 위해 망막을 적절하게 장착하기 위해 약간의 교육이 필요합니다. 이 프로토콜은 설치류에만 해당되며 다른 실험실 종에 적용하는 경우 조정해야 합니다. 방법론의 중요한 점, 수정 사항 및 한계가 자세히 제시됩니다.
유리체강내 주사
주사는 안구 유전자 전달에 널리 사용되며 유리체강 내 주사가 선호되는 절차입니다. 망막하 주사에 비해 더 안전하고 덜 침습적인 것으로 입증되었는데, 이 주사는 광수용체와 망막 색소 상피(RPE) 사이에 관심 분자를 직접 도입하여 망막 박리의 위험을 초래한다10. 그러나 특히 설치류 모델에서 이러한 주입을 수행할 때 한계가 있습니다. 유리체액은 젤라틴으로 바이러스 확산을 방해합니다. 또한 설치류 눈의 수정체는 커서 바늘을 긁지 않고 삽입하는 것이 어렵지 않습니다. 정밀 주사기 바늘은 섬세하여 자주 교체해야 합니다. 방해를 방지하려면 매번 사용 전후에 탈이온수로 세척하고 정기적으로 교체하십시오. 또한 용액 역류와 안압의 변화를 방지하기 위해 내용물을 천천히 주입하십시오. 망막 전체에 걸쳐 크고 균일한 형광을 얻으려면 연습이 필요할 수 있습니다.
망막 세포 형질도입
바이러스 벡터는 in vivo 유전자 전달을 위한 탁월한 방법이며, AAV는 망막 세포를 형질도입하는 데 널리 사용되어 왔다10. 그들은 인간의 실명을 유발하는 일부 망막병증에 대한 치료법으로 승인되었습니다24. 그러나, 이들의 캐리어 용량은 필요한 규제 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함하여 5kb로 제한된다(10,25). 여러 혈청형을 사용할 수 있으며, 각각 다른 영양성을 가지고 있습니다. 전달될 유전자와 형질도입될 세포에 기초하여 가장 적합한 AAV를 선택한다26. 망막 신경절 세포를 라벨링할 때는 AAV227을 사용하는 것이 좋습니다.
유전자 발현 창
AAV2-CAG-GCaMP5G에 대한 최적의 바이러스 발현은 주입 후 2-3주이다12,18. 이 기간이 지나면 형질주입된 세포의 핵이 형광이 되고, 세포는 자극에 반응하지 않으며, 결국죽는다 7,28,29. 이는 핵으로 전위된 GCaMP 표지자의 과발현 때문입니다. 최적의 유전자 발현을 위한 시간 윈도우는 바이러스 벡터 및 선택된 프로모터(30)에 따라 달라질 것이며, 이 프로토콜을 진행하기 전에 실험적으로 결정될 필요가 있다.
조직-전극 접촉
최적의 재현 가능한 결과를 얻으려면 우수한 조직-전극 접촉을 달성하는 것이 중요합니다. 접촉 불량은 일반적으로 망막의 자연스러운 곡률로 인해 발생합니다. 한 가지 방법은 망막을 4등분하고 한 번에 한 부분씩 장착하고 이미지를 촬영하는 것입니다. 망막의 작은 부분을 더 잘 평평하게 만들어 MEA 표면과 더 효과적으로 접촉할 수 있습니다. 접촉이 잘 되지 않는 또 다른 잠재적인 이유는 유리체액의 존재입니다. 망막 상피 임플란트를 시뮬레이션하는 자극 실험을 수행할 때 망막 절제 중에 유리체액이 전류에 대한 절연체 역할을 할 수 있으므로 조심스럽게 제거하는 것이 중요합니다. 여기서, 동일한 초점면에서 전극과 셀을 시각화하여 접촉이 충분한지 확인하는 간단한 방법을 설명합니다.
생체 외 망막 측정의 대안은 전극 표면에서 직접 뉴런을 성장시키는 것입니다. 해마 뉴런(31)과 같은 뉴런의 1차 배양은 새로운 자극 장치의 기능을 평가하기 위한 초기 테스트에 유용할 수 있다. 그러나 이 접근법은 여전히 실험실 동물을 사용해야 하며 자극에 대한 시냅스 반응을 평가하는 데 중요한 망막 네트워크의 복잡성을 나타내지 않습니다.
전극 및 전극 트레이스 아래의 셀을 시각화하기 위해 인듐 주석 산화물(ITO)과 같은 투명한 재료로 제작된 MEA를 사용할 수 있습니다 19,20,32. 광학 측정 외에도 전기 자극에 따른 GCL 활성은 전기 기록을 통해 평가할 수 있습니다. MEA는 조직의 국소 전위(LFP)를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이것은 각 전극이 동시에 여러 셀의 활동을 포착하기 때문에 공간 분해능을 손상시킵니다(전극 크기에 따라 다름). 광학 기록은 이러한 한계를 극복하고 더 높은 공간 해상도 매핑을 제공합니다. 주요 장점은 단일 셀 분해능으로 큰 FOV를 측정하면서 활성 셀과 비활성 셀을 구별할 수 있다는 것입니다. 모든 세포 활동 보고자들 중에서, 칼슘 지표는 잘 설명되어 있으며 가장 일반적으로 사용된다33.
Disclosures
저자는 원고에 추가할 공개가 없습니다.
Acknowledgments
기술 지원을 해준 Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara 및 Alina Hirschmann(ICFO-Institut de Ciències Fotòniques)과 유리체강내 주사 및 생체 내 망막 이미징을 지원해 준 안과 연구 그룹의 Anna Duarri(VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research)에게 감사드립니다.
이 작업을 지원한 자금 지원 기관은 다음과 같습니다: Fundació CELLEX; Fundació 미르-푸이그; Ministerio de Economía y Competitividad - R&D 우수 센터를 위한 Severo Ochoa 프로그램(CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); CERCA 프로그램을 통한 카탈루냐 총독; Laserlab-Europe(EU-H2020 GA 번호 871124); 라 카이샤 재단(LCF/HR19/52160003); 및 Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | - |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | - |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | - |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | - |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | - |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | - | - |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | - |
| Blade | Swann-morton | 0308 | - |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | - |
| Carbogen | Air liquide | - | - |
| Curved-forceps | - | - | - |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | - |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | - |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | - |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | - |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | - |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | - |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | - |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | - |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | - | - |
| Long-Evans rat | Janvier | - | - |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | - | - |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | - |
| Methocel 2% | Omni Vision | - | - |
| Microelectrode array (MEA) | - | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | - |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | - |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | - |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | - |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | - |
| Prescaina | Llorens | - | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | - |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | - |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | - |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | - |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | - |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | - | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | - |
References
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