Summary
本方案描述了一种综合策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移中的药理作用和机制。
Abstract
红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎药理活性。然而，其潜在的抗乳腺癌机制尚未完全阐明。因此，该协议旨在解码Sal在调节人乳腺癌MCF-7细胞恶性增殖中PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的潜力。首先，通过CCK-8和细胞划痕试验评估Sal对MCF-7的药理活性。此外，通过迁移和基质胶侵袭试验测量MCF-7细胞的抗性。对于细胞凋亡和周期测定，分别使用膜联蛋白 V-FITC/PI 和细胞周期染色检测试剂盒分步处理 MCF-7 细胞进行流式细胞术分析。DCFH-DA和Fluo-4 AM免疫荧光染色检测活性氧（ROS）和Ca2+水平。使用相应的商业试剂盒测定Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性。分别采用Western blot和qRT-PCR分析进一步测定细胞凋亡和PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路中的蛋白和基因表达水平。我们发现Sal治疗显着限制了MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭，并具有剂量依赖性效应。同时，Sal 给药还显着迫使 MCF-7 细胞发生凋亡和细胞周期停滞。免疫荧光试验显示，Sal可观察到刺激MCF-7细胞中ROS和Ca2+的产生。进一步数据证实，Sal促进了促凋亡蛋白Bax、Bim、裂解caspase-9/7/3及其相应基因的表达水平。一致地，Sal 干预显着降低了 Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α 和 FoxO1 蛋白及其相应基因的表达。总之，Sal 可作为治疗乳腺癌的潜在草药衍生化合物，因为它可以通过抑制 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 通路来减少 MCF-7 细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。
Introduction
作为最常见的癌症和最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，截至2020年，全球出现了230万例乳腺癌病例，占所有癌症病例的11.7%1。乳腺癌的常见症状包括乳房压痛和刺痛、乳房肿块和疼痛、溢液、皮肤糜烂或凹陷以及腋窝淋巴结肿大 1,2。更令人震惊的是，乳腺癌的新病例数和总体发病率每年继续以惊人的速度增长，占癌症相关死亡人数的6.9%1。目前，乳腺癌干预仍主要涉及化疗、手术、放疗和综合治疗。虽然治疗可以有效降低患者的复发率和死亡率，但长期应用治疗往往会引起产生多重耐药性、大面积脱发、恶心呕吐，以及严重的精神和心理负担2,3。值得注意的是，乳腺癌多器官转移的潜在风险也迫使人们寻求新的草药来源的药物治疗4,5。
磷酸肌醇 3 激酶 （PI3K） 介导的信号转导通过影响多个基因表达的剪接与乳腺癌的生长、增殖和存活有关6.作为 PI3K 的下游信号感应蛋白，大量证据表明蛋白激酶 B （AKT） 可以与哺乳动物雷帕霉素靶标 （mTOR） 蛋白偶联，以进一步增加乳腺癌 7,8,9。此外，PI3K/AKT/mTOR 信号转导的失活也被认为是抑制乳腺癌恶性增殖和刺激细胞凋亡的药物的关键成分10,11,12。众所周知，肿瘤微环境中的极度缺氧迫使缺氧诱导因子 1 α （HIF-1α） 大量激增，这进一步恶化了乳腺癌的进展13,14,15。同时，AKT 刺激也会导致 HIF-1α 的过度积累，从而限制乳腺癌样本中的细胞凋亡16,17。有趣的是，PI3K-AKT-HIF-1α 信号转导的激活已被证实参与多种癌症的病理进展和转移，包括肺癌18、结直肠癌19、卵巢癌20 和前列腺癌21。除了由 HIF-1α 协调外，AKT 信号刺激还触发分叉头转录因子 1 （FoxO1） 过表达，从而促进乳腺癌细胞的周期停滞和细胞凋亡抑制 22,23。综上所述，上述确凿证据表明，抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号转导的级联反应可能是乳腺癌药物治疗的潜在新靶点。
红景天苷 （Sal） 已被广泛证明具有抗癌 24,25、抗缺氧26、27、28、29 和增强免疫力的药理活性30。它是一种浅棕色或棕色粉末，易溶于水，是苯乙烷苷的一种，化学式为C14H 20 O7，分子量为300.331,32。现代药理学研究表明，Sal可以通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导来促进胃癌细胞的凋亡24。进一步的证据还表明，Sal 治疗对 PI3K-AKT-HIF-1α 信号传导的抑制可能通过增强癌细胞对化疗药物的敏感性来促进癌细胞的凋亡25。证据还表明，Sal 通过促进人乳腺癌 MCF-7 细胞的凋亡来限制细胞迁移和侵袭并导致周期停滞33,34。然而，Sal能否调控PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号传导并抑制MCF-7细胞的恶性增殖还有待观察。因此，该方案旨在通过PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1途径探索Sal对MCF-7细胞迁移，侵袭，细胞周期和细胞凋亡的影响。采用常规、低成本、自主实验的综合研究策略，如细胞迁移和侵袭评估、流式细胞术细胞凋亡和细胞周期检测、活性氧（ROS）和Ca2+荧光测定等，可为传统草药抗癌研究的实验整体设计提供参考。本研究的实验过程如图1所示。
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Protocol
用于本研究的 MCF-7 细胞是从商业来源获得的（参见 材料表）。
1. 细胞培养
- 在37°C的湿润5%CO2 气氛中用含有10%FBS和1%青霉素（10,000U / mL）/链霉素（10,000μg/ mL）的DMEM培养MCF-7细胞（参见 材料表）。
注：覆盖培养皿底部90%的细胞用于实验，并分为以下组：对照组，盐酸多柔比星组（DXR，5μM）和Sal组（20μM，40μM和80μM），或对照组，LY294002（10μM，PI3K抑制剂）组，Sal（80μM）组和LY294002（10μM）+ Sal（80μM）组（参见 材料表）。
2. 细胞活力测定
注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告27。
- 在 96 孔板中以 8 x 104 个细胞/孔的密度接种 MCF-7 细胞，并与 Sal（10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、160 μM 和 320 μM）孵育 24 小时或 Sal（20、40、80 μM）孵育 12 小时/24 小时/36 小时/48 小时过夜，直到细胞贴壁。
- 处理后，将MCF-7细胞与10μL/孔的CCK-8溶液（参见 材料表）共同孵育2小时。然后，用自动酶标仪测量450nm（OD450）处的光密度。
3.细胞迁移和侵袭
注：有关此程序的详情，请参阅以前的报告35。
- 孵育 2 mL 接种在 6 孔板中的 5 x 106 个细胞/mL 细胞，以覆盖培养皿底部的 90%。
- 用无菌移液器吸头沿细胞单层的中心进行线性划痕缠绕。使用光学显微镜在0小时，24小时和48小时采集图像。
- 使用 Image J 软件测量划痕的宽度。
- 对于transwell测定，悬浮不含血清培养基的MCF-7细胞，并在预涂有或不涂有基质胶的上部transwell室中接种（参见 材料表）。
- 在transwell室的底部，使用DMEM完全培养基作为化学诱导剂。24小时后，除去上腔室中的细胞，并将剩余的侵袭性和迁移性细胞固定在甲醇35中。
- 用结晶紫溶液染色MCF-7细胞（参见 材料表）。使用光学显微镜捕获图像。
4. Na+-K+-ATPase和Ca 2+-Mg2+-ATPase的活性评价
- 按照制造商的说明，使用二辛可宁酸 （BCA） 试剂盒测量裂解的 MCF-7 细胞中的蛋白质浓度（参见 材料表）。
- 将相应组的裂解细胞样品添加到96孔板中。之后，加入工作溶液，在37°C下进一步孵育5分钟。最后，用多功能酶标仪测量OD636 的值。
5. 细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术分析
注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告31。
- 消化细胞，并收获重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色20分钟（参见 材料表），然后使用流式细胞仪确定凋亡细胞的数量。
- 将重悬的样品溶液与PI溶液混合孵育30分钟，然后用流式细胞仪检测。
6. DCFH-DA和Fluo-4 AM荧光染色
注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告29。
- 将MCF-7细胞与10μM DCFH-DA荧光探针（参见 材料表）在37°C下孵育20分钟。 用PBS洗涤三次彻底除去多余的DCFH-DA后，使用荧光显微镜分别测试激发波长和发射波长为488nm和525nm的荧光强度。
- 将MCF-7细胞与5μM Fluo-4 AM荧光探针溶液（参见 材料表）在37°C下孵育45分钟。 用PBS洗涤三次后，使用荧光显微镜分别测定激发波长和发射波长为488nm和516nm的荧光强度值。
7. 蛋白质印迹
- 将含有不同药物的 2 mL 5 x 10 6 个细胞/mL 细胞悬浮液加入6 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 24 小时。
注：蛋白质印迹分析组设置如下：对照组，LY294002（10μM）组，Sal（80μM）组和LY294002（10μM）+ Sal（80μM）组（参见 材料表）。 - 收集细胞和上清液，并在4°C下以560× g 离心3分钟。弃去上清液，用预冷的PBS洗涤两次。每次洗涤后，将细胞在4°C下以560× g 离心3分钟。
- 向步骤7.2中的细胞样品中加入50μL裂解缓冲液，进行15分钟的冰浴。在4°C下以8550× g 离心10分钟以收集上清液蛋白质样品。
- 使用BCA方法检测蛋白质浓度后，将步骤7.3中的蛋白质样品与上样缓冲液以4：1的比例混合，在100°C下在金属浴中变性10分钟，并冷却至室温。
- 加入来自步骤7.4的20μg蛋白质样品，使用10%SDS-PAGE（参见材料表）分离不同分子量35的蛋白质，然后转移到0.22μmPVDF膜上。用5%BSA封闭后，将膜与相应的一抗在4°C下孵育过夜。
注：以下一抗的稀释浓度为 1：1,000：裂解的半胱天冬酶-9/7/3 （CC-9/7/3）、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1 和 β-肌动蛋白（参见 材料表）。 - 第二天，将膜与山羊抗兔IgG二抗在37°C下孵育2小时。 使用ECL化学发光溶液显影膜，并使用非接触式定量蛋白质印迹成像系统捕获图像（参见 材料表）。
8. qRT-PCR检测
- 在4°C下以560× g 离心收集MCF-7细胞3分钟，并将500μL缓冲液RL1加入5×106细胞中 。用移液管反复吹气和混合，直到看不到细胞团。
注：缓冲液RL1是总RNA分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。 - 将步骤8.1中的细胞匀浆转移到嵌入收集管中的DNA清洁柱中，并在4°C下以8,550× g 离心2分钟。取出DNA清洗柱，将上清液保留在收集管中。
注：DNA 清洗柱和收集管是总 RNA 分离试剂盒中的两个组分（参见 材料表）。 - 将 800 μL 缓冲液 RL2 加入步骤 8.2 的 500 μL 上清液中，轻轻混合。
注：缓冲液 RL2 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。使用前将 120 mL 无水乙醇加入 60 mL 缓冲液 RL2 中。 - 将步骤8.3中的700μL混合物转移到嵌入收集管中的仅RNA柱中，并在4°C下以8,550× g 离心1分钟。丢弃收集管中的废液。
注：仅 RNA 色谱柱是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。 - 重复步骤 8.4 以处理步骤 8.3 中剩余的混合物。
- 向仅RNA色谱柱中加入500μL缓冲液RW1，并在4°C下以8,550× g 离心1分钟。丢弃收集管中的废液。
注：缓冲液 RW1 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。 - 向仅 RNA 色谱柱中加入 700 μL 缓冲液 RW2，并在 4 ◦C 下以 8,550 × g 离心 1 分钟。丢弃收集管中的废液。重复步骤 8.7 一次。
注：缓冲液 RW2 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。 - 将仅RNA色谱柱放回收集管中，并在4°C下以8550 ×g 离心2分钟以除去剩余的缓冲液RW 2。
- 将仅RNA色谱柱转移到新的收集管中，并将100μL在65°C下预热的无RNase的ddH2O滴入仅RNA色谱柱的膜中心。置于25°C下2分钟，并通过在4°C下以8,550× g 离心1分钟来收集RNA溶液。
注：无 RNase 的 ddH2O 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。 - 将 4 μL 5x 反应缓冲液、1 μL 寡核苷酸 （dT）18 引物、1 μL 随机六聚体引物、1 μL 基因特异性引物（见表 1）、1 μL 酶混合物和 5 μg 步骤 8.9 的 RNA 溶液加入 100 μL 8 管条中。用不含RNase的水补充反应系统至20μL。
- 设置系统的反应条件如下：（1）：95°C，30s，1个循环;（2）：95 °C，5 s，50 次循环，60 °C，34 s;（3）：95 °C、5 s、1 个周期、65 °C、60 s、97 °C、1 s;（4）：42°C，30s，1个循环。执行qRT-PCR程序。
注：通过2−ΔΔCT方法36,37定量分析靶基因的相对表达水平。用于qRT-PCR分析的每个基因的引物信息列于表1中。
9. 统计分析
- 将数据表示为三个独立实验的平均值±标准差。
- 使用绘图和分析软件（参见 材料表）分析多个组之间的比较，先进行单因素方差分析 （ANOVA），然后进行 Tukey 检验。在这项工作中， P < 0.05 被定义为具有统计学意义。
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Representative Results
Sal 对抑制 MCF-7 细胞过度增殖和延缓伤口愈合的影响
为了探究 Sal 对抗乳腺癌的潜力，我们首先使用细胞增殖毒性和人乳腺癌 MCF-7 细胞系的划痕测定测试了其抗癌特性。将这些细胞与浓度系列的Sal（5-320μM）共同孵育24小时，并使用CCK-8测定法评估细胞增殖。观察到Sal对细胞增殖的剂量依赖性抑制作用，在40μM时细胞活力下降50%（图2A）。然后选择 20 μM、40 μM 和 80 μM 的 Sal 浓度进行后续时间点和伤口愈合评估。图2B中的结果表明，随着时间的推移，Sal可以抑制MCF-7细胞的活力，共孵育24小时后MCF-7细胞活力下降了50%。图 2C-R 显示了 Sal 治疗对 MCF-7 细胞伤口愈合的抑制作用，由伤口划痕测定确定。进一步的细胞划痕测试也证实，用Sal（20μM，40μM和80μM）培养24小时严重阻碍了伤口愈合过程（图2C，D）。
Sal 抑制 MCF-7 细胞的恶性迁移和侵袭
大量肿瘤细胞的迁移和侵入癌组织倾向被认为是恶性肿瘤的典型特征。使用涂有或不涂有细胞外基质凝胶的transwell系统进一步测试了Sal对MCF-7细胞迁移和侵袭的影响。Sal处理显着减少了MCF-7细胞的不良迁移（图3A-F）和侵袭（图3G-L）。如图 3A 所示，用 Sal 处理出人意料地中和了 MCF-7 细胞的迁移。几乎一致地，MCF-7细胞的恶意侵袭过程在与Sal孵育后被有效关闭（图3B）。以上数据充分印证了Sal在抑制乳腺癌方面的优势。
Sal 促进 MCF-7 细胞凋亡和增强周期阻滞的作用
癌细胞的永生化和周期性繁殖为癌症恶化和扩散提供了机会。当然，促进细胞凋亡和周期抑制也已成为公认的预防癌症的策略。流式细胞术的结果表明，Sal处理增加了早期和晚期凋亡阶段MCF-7细胞的数量（图4A）。同时，与对照组相比，Sal处理也急剧增加了G0/G1期的细胞数量，同时降低了S期细胞的比例（图4B）。促进细胞凋亡和周期阻滞可能是Sal对乳腺癌的可能药理作用。
Sal 对刺激 MCF-7 细胞细胞内 ROS 和 Ca2+ 过量产生的影响
持续刺激细胞内ROS和Ca2+的产生，可有效抑制肿瘤细胞的生长。图5A-E显示了通过DCFH-DA免疫荧光染色评估的ROS含量。 ROS的定量结果如图5F所示。Fluo-4 AM免疫荧光染色检测Ca2+浓度（图5G-K）。图5L显示了Ca2+的定量结果。DCFH-DA结果表明，与对照组相比，Sal显著增强了ROS荧光信号（图5A）。一致地，Sal干预也明显提高了Ca2+的产生，突出显示的Fluo-4 AM荧光信号证明了这一点（图5B）。这些结果表明，ROS和Ca2+信号可能部分参与了Sal的抗乳腺癌活性。
Sal诱导MCF-7细胞线粒体通路凋亡的影响
有大量证据表明，线粒体功能障碍诱导的细胞凋亡决定了许多肿瘤细胞的最终命运。在确定Sal是否介导MCF-7细胞的线粒体功能调节和细胞凋亡促进作用时，首先证明Sal限制了Na+-K + -ATPase（图6A）和Ca 2+-ATPase（图6B）的酶活力，从而表明其在促进线粒体功能障碍方面的潜在作用。随后，Western blot和qRT-PCR数据显示，Sal处理促进了促凋亡因子CC-9（图6C，D，G）、CC-7（图6C，E，H）、CC-3（图6C，F，I）、Bim（图6C，J，M）和Bax（图6C，L，O）的蛋白和基因表达，同时抑制了抗凋亡Bcl-2的蛋白和基因表达（图6C，K，N）。这些数据部分表明，MCF-7细胞中的线粒体功能障碍与细胞凋亡相结合，可能与Sal对乳腺癌的作用机制有关。
Sal对MCF-7细胞PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路抑制的影响
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路作为调控肿瘤生长的关键信号转导通路，参与乳腺癌的病理进展和恶化。蛋白质印迹结果显示，Sal处理显著限制了p-PI3K/PI3K（图7A，B）和p-AKT/AKT（图7A，C）的比率。同时，Sal处理也明显抑制了mTOR（图7A，D），HIF-1α（图7A，E）和FoxO1（图7A，F）的蛋白表达。进一步的qRT-PCR分析还表明，Sal给药降低了PI3K（图7G）、AKT（图7H）、mTOR（图7I）、HIF-1α（图7J）和FoxO1（图7K）的基因表达水平。综上所述，抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的激活可能是Sal对抗乳腺癌的潜在分子机制。
图 1：Sal 对乳腺癌 MCF-7 细胞系的作用示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：Sal 的 MCF-7 细胞增殖毒性和伤口愈合特性。 （A） 和 （B） 显示了 Sal 处理对 MCF-7 细胞活性的剂量时间影响。（中至右）Sal 治疗对 MCF-7 细胞伤口愈合的抑制作用，通过伤口划痕测定确定。以上数据表示为 SD ±平均值，n = 3。##p < 0.01 与对照组相比。比例尺：200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：Sal 处理抑制 MCF-7 细胞的恶性迁移和侵袭。 Sal 处理显着减少 MCF-7 细胞的不良 （A-F） 迁移和 （G-L） 侵袭。以上数据表示为 SD ±平均值，n = 3。与对照组相比，<#p < 0.05，##p < 0.01。比例尺：200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：Sal 促进细胞凋亡和抑制细胞周期。通过流式细胞术检测 Sal 对 MCF-7 细胞的 （A） 凋亡促进和 （B） 细胞周期阻滞作用。以上数据表示为 SD ±平均值，n = 3。#p < 0.05，##p < 0.01。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：Sal 处理引起的 MCF-7 细胞中 ROS 和 Ca2+ 的激增。 （A-E） 通过DCFH-DA免疫荧光染色评估ROS含量。（F） ROS的定量结果。（G-K）Fluo-4 AM免疫荧光染色检测Ca2+浓度。（L） Ca2+的定量结果。以上数据表示为 SD ±平均值，n = 3。#p < 0.05，##p < 0.01。比例尺：200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：Sal 治疗对诱导 MCF-7 细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡的影响。（A） Na+-K+-ATPase 和 （B） Ca2+-ATP 酶的酶活性降低。（C） （D） CC-9、（E） CC-7、（F） CC-3、（J） Bim、（K） Bcl-2 和 （L） Bax 蛋白以及 （G） caspase-9、（H） caspase-7、（I） caspase-3、（M） Bim、（N） Bcl-2 和 （O） Bax 基因的代表性蛋白表达条带及其相应的统计结果。以上数据表示为 SD ±平均值，n = 3。#p < 0.05，##p < 0.01。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：Sal 处理对 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 通路的抑制 。 （A） 通过蛋白质印迹分析检测到的代表性蛋白条带。Sal 降低了 （B） p-PI3K/PI3K、（C） p-AKT/AKT、（D） mTOR、（E） HIF-1α 和 （F） FoxO1 的蛋白表达。Sal 抑制了 （G） PI3K、（H） AKT、（I） mTOR、（J） HIF-1α 和 （K） FoxO1 的基因表达水平。以上数据表示为 SD ±平均值，n = 3。# #p < 0.01 与对照组相比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：Sal 刺激 MCF-7 细胞中 ROS 和 Ca2+ 的产生，同时抑制 PI3K 信号转导。 在mTOR的参与下，Sal给药后AKT的磷酸化进一步降低。因此，HIF-1α和FoxO1的下调阻断了MCF-7细胞的周期性恶性增殖。同时，MCF-7细胞凋亡的增强表明了Sal的抗乳腺癌潜力。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 基因 | GenBank入藏号 | 引物序列 （5'-3'） | 长度 （bp） | |
| 半胱天冬酶-9 | NM_001229 | F， GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R，AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| 半胱天冬酶-7 | F， AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R， CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| 半胱天冬酶-3 | NM_001354777 | F， CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R， CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| 比姆 | NM_001204106 | F， AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R， CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2型 | NM_000633 | F： GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R，GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| 巴克斯 | NM_001291428 | F， CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R， CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β肌动蛋白 | NM_031144 | F， AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R， GGATAGCACACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F， 向前;R，反转。 | ||||
表1：用于逆转录-定量聚合酶链反应的引物。
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Discussion
乳腺癌影响所有年龄段的人，并造成不可估量的身心负担和巨大的经济压力1.乳腺癌的发病率和死亡率逐年增加，在寻求传统治疗之外的有效草药复合疗法方面也引起了全世界的关注4,5。有希望的是，大量证据揭示了 Sal24,25,38 的抗癌作用。不幸的是，Sal在乳腺癌中的作用和潜在的分子机制仍然很大程度上是未知的。本研究强调了Sal对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖、迁移和侵袭的显著抑制作用。随后，我们揭示了 Sal 在刺激 MCF-7 细胞凋亡和周期阻滞方面的潜力。同时，这些数据还表明，Sal 给药增加了 ROS 和 Ca2+ 的水平。进一步探索其分子机制，证明了Sal在乳腺癌治疗中的细胞凋亡促进作用以及Sal对PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1通路的影响。
恶性和不受控制的增殖会加速乳腺癌的发展，并增加淋巴管39 和脑转移的风险40。目前，市场上已有的化疗药物逐渐出现，但这些药物对治疗乳腺癌存在敏感性低的问题，因此迫使人们寻求更有效的化合物或新的药物组合2,3。这项工作中的数据首先表明，Sal治疗限制了MCF-7细胞的恶性增殖。随后的细胞划痕试验进一步证实，12 小时和 24 小时 Sal 孵育降低了 MCF-7 细胞的收敛速率。肿瘤细胞迁移和侵袭能力的检测被认为是筛选抗肿瘤药物的敏感指标24,25。这项工作中的数据表明，Sal 大大减少了 MCF-7 细胞迁移和侵袭的过程，与先前的发现一致33,34。肿瘤细胞不受控制的细胞周期决定了细胞不朽的命运24.因此，促进细胞凋亡和细胞周期中断已成为评估化合物25抗癌潜力的公认和公认的指标。在这项工作中，流式细胞术分析表明，Sal 处理显着增加了 MCF-7 细胞的凋亡，早期和晚期凋亡细胞的比例增加证明了这一点。此外，G0/G1细胞比例增加，MCF-7细胞周期的S期受到干扰，表明Sal对乳腺癌细胞具有细胞周期阻断作用。
轻度缺氧乳腺癌细胞微环境与 ROS 和 Ca2+ 产生的限制有关;因此，过量的 ROS 和 Ca2+ 积累可诱导乳腺癌细胞凋亡事件41。本研究的免疫荧光结果证明，Sal干预极大地刺激了ROS和Ca2+ 的产生，这可能进一步诱导MCF-7细胞的凋亡。新出现的证据表明，促凋亡蛋白 Bax 和 Bim 水平升高，以及抗凋亡蛋白 Bcl-2 水平降低，可以暂时和强行打开物质进出线粒体膜的通道，从而触发肿瘤细胞的程序性细胞凋亡42。在这项研究中，Sal与MCF-7细胞共孵育可显著增加Bax和Bim，同时降低Bcl-2的蛋白和基因表达，从而表明其对促进乳腺癌细胞凋亡的潜在药理作用。这些数据还表明，Sal明显诱导了CC-9、CC-7和CC-3蛋白的表达，这些蛋白是线粒体凋亡途径的关键下游指标，以及它们相应的基因。上述数据部分表明，Sal对乳腺癌的促凋亡作用可能与线粒体凋亡的激活有关。
分子机制研究证实，PI3K的磷酸化可以进一步诱导AKT磷酸化，加速乳腺癌细胞的生长6,7。同时，mTOR的大量积累也通过参与AKT磷酸化过程而导致乳腺癌恶化8,9。一方面，磷酸化的AKT直接刺激FoxO1表达，促进乳腺癌细胞周期，减缓细胞凋亡22,23。同时，激活的 AKT 间接激活 HIF-1α 表达以产生 FoxO1，导致乳腺癌进展和转移16,17。因此，抑制PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1通路的激活可能是乳腺癌治疗的新策略。在PI3K抑制剂LY294002的干预下，数据表明Sal可观察到抑制PI3K的磷酸化。结合mTOR蛋白表达的下调，Sal还降低了磷酸化AKT的表达水平。结果，HIF-1α 和 FoxO1 蛋白表达在 Sal 处理后同样大幅降低。同样，qRT-PCR结果一致地显示，Sal处理广泛降低了PI3K、AKT、HIF-1α和FoxO1的基因水平，有助于促进MCF-7细胞的周期停滞和凋亡（图8）。总的来说，获得的数据表明，Sal 可能是一种潜在的天然草药来源的活性化合物，具有对抗乳腺癌的作用。Sal处理促进MCF-7细胞凋亡和抑制细胞周期，大大削弱了乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。值得注意的是，Sal 对乳腺癌的分子作用机制可能与抑制 PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 通路有关。总体而言，该方案融合了多种实验方法，为抗乳腺癌药物的研发提供了一定的参考价值。
在这项研究中，没有直接证据表明Sal对乳腺癌的分子机制。PI3K 敲除小鼠、PI3K 蛋白高表达或低表达的乳腺癌细胞系以及局部表面等离子体共振技术是可用于确认 Sal 用于预防和治疗乳腺癌的直接分子靶点的下一步29,31。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了四川省卫生健康委员会（120025）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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