Summary
現在のプロトコルはMCF-7セル拡散および移動の禁止のサリドロシドの薬理学の行為そしてメカニズムを評価するための広範囲の作戦を記述する。
Abstract
サリドロシド(Sal)には、抗発がん性、抗低酸素性、および抗炎症性の薬理活性が含まれています。.しかし、その根底にある抗乳がんメカニズムは不完全にしか解明されていません。それ故に、このプロトコルは人間の乳癌MCF-7セルの悪性増殖のPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道の調整のSalの潜在性を解読するように意図した。まず、MCF-7に対するSalの薬理活性をCCK-8および細胞スクラッチアッセイによって評価した。さらに、MCF-7細胞の耐性は、遊走およびマトリゲル浸潤アッセイによって測定されました。細胞アポトーシスおよびサイクルアッセイでは、MCF-7細胞をそれぞれアネキシンV-FITC/PIおよびフローサイトメトリー解析用の細胞周期染色検出キットを用いて段階的に処理しました。活性酸素種(ROS)およびCa2+のレベルをDCFH-DAおよびFluo-4 AM免疫蛍光染色によって調べました。Na+-K+-ATPaseおよびCa2+-ATPaseの活性は、対応する市販キットを用いて測定した。アポトーシスおよびPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路におけるタンパク質および遺伝子発現レベルは、それぞれウェスタンブロットおよびqRT-PCR解析を用いてさらに決定された。Sal処理は、用量依存的な効果でMCF-7細胞の増殖、遊走、および浸潤を有意に制限することがわかりました。一方、サル投与は、MCF-7細胞を劇的にアポトーシスと細胞周期停止に追いやった。免疫蛍光試験では、SalがMCF-7細胞におけるROSおよびCa2+産生を観察的に刺激することが示されました。さらなるデータにより、Salはアポトーシス促進性タンパク質であるBax、Bim、切断されたカスパーゼ-9/7/3、およびそれらに対応する遺伝子の発現レベルを促進することが確認されました。一貫して、Sal介入は、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、およびFoxO1タンパク質およびそれらに対応する遺伝子の発現を顕著に減少させた。結論として、Salは、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路を阻害することにより、MCF-7細胞の悪性増殖、遊走、および浸潤を減少させる可能性があるため、乳がんを治療するための潜在的なハーブ由来の化合物として使用できます。
Introduction
最も一般的に診断されるがんの1つであり、最も一般的な悪性腫瘍の1つである乳がんは、最新の統計によると、2020年までに世界中で230万例が発生し、全がん症例の11.7%を占めています1。乳がんの一般的な症状には、乳房の圧痛とうずき、乳房のしこりと痛み、乳頭の分泌物、びらんまたはくぼんだ皮膚、および腋窩リンパ節の肥大が含まれます1,2。さらに憂慮すべきことに、乳がんの新規患者数と全体的な発生率は毎年圧倒的な速度で増加し続けており、がん関連死の6.9%を占めています1。現在、乳がんの介入は、化学療法、手術、放射線療法、および包括的な治療が中心です。治療は患者の再発率と死亡率を効果的に低下させることができますが、長期治療の適用はしばしば多剤耐性、広範囲の脱毛、吐き気と嘔吐を引き起こし、深刻な精神的および心理的負担を引き起こします2,3。特に、乳がんによる多臓器転移の潜在的なリスクは、薬物療法の新しいハーブ源を探すことを人々に強いています4,5。
ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)を介したシグナル伝達は、複数の遺伝子の発現に影響を与えるスプライシングを介して、乳がんの増殖、増殖、および生存に関与しています6。PI3Kの下流シグナルセンシングタンパク質として、プロテインキナーゼB(AKT)が哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)タンパク質と結合して乳がんをさらに増加させる可能性があることを示唆する多くの証拠があります7,8,9。さらに、PI3K / AKT / mTORシグナル伝達の不活性化は、乳がんの悪性増殖を阻害し、アポトーシスを刺激する薬物の重要な要素であるとも主張されています10,11,12。腫瘍微小環境における極端な低酸素状態は、低酸素誘導性第1因子アルファ(HIF-1α)の大規模な急増を余儀なくされ、乳がんの進行をさらに悪化させることはよく知られています13,14,15。並行して、AKT刺激はHIF-1αの過剰蓄積にもつながり、乳がんサンプルのアポトーシスを制限します16,17。興味深いことに、PI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の活性化は、肺がん18、大腸がん19、卵巣がん20、前立腺がん21など、さまざまながんの病理学的進行と転移に関与していることが確認されています。HIF-1αによって調整されることに加えて、分岐頭部転写因子1(FoxO1)の過剰発現は、AKTシグナル伝達刺激によっても引き起こされ、乳がん細胞の周期停止とアポトーシスの阻害を促進します22,23。まとめると、上記の確かな証拠は、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達のカスケードの阻害が、乳がんにおける薬物療法の潜在的な新規標的である可能性があることを示唆しています。
サリドロシド(Sal)は、抗癌24,25、抗低酸素26,27,28,29、および免疫増強薬理活性30を発揮することが広く実証されています。水に溶けやすい薄茶色または褐色の粉末であり、フェニルエタノイド配糖体の一種であり、化学構造式はC14H 20 O7であり、分子量は300.331,32である。現代の薬理学的研究は、SalがPI3K-AKT-mTORシグナル伝達を抑制することにより、胃癌細胞のアポトーシスを促進することができることを実証している24。さらなる証拠はまた、Sal治療によるPI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の抑制が、化学療法剤に対する感受性を高めることによって癌細胞のアポトーシスに寄与する可能性があることを示唆しています25。証拠はまた、サルが細胞の移動と浸潤を制限し、ヒト乳がんMCF-7細胞のアポトーシスを促進することによって周期停止を引き起こすことを示唆しています33,34。しかし、SalがPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達を調節し、MCF-7細胞の悪性増殖を阻害できるかどうかは、まだ不明である。従って、このプロトコルはPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道によってMCF-7セル移動、浸潤、細胞周期およびapoptosisに対するSalの効果を探検することを向けた。細胞遊走や浸潤の評価、フローサイトメトリーによるアポトーシスや細胞周期の検出、活性酸素種(ROS)、Ca2+蛍光測定など、従来型の低コストで独立した実験からなる統合研究戦略は、従来の漢方薬を用いた抗がん研究の実験の全体的なデザインの参考となります。本研究の実験過程を図1に示す。
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Protocol
本研究に用いたMCF-7細胞は、市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1. 細胞培養
- MCF-7細胞を加湿した5%CO2 雰囲気、37°C、10%FBSおよび1%ペニシリン(10,000 U/mL)/ストレプトマイシン(10,000 μg/mL)を含むDMEMで培養します( 材料表参照)。
注:ディッシュの底の90%を覆う細胞を実験に用い、対照群、塩酸ドキソルビシン群(DXR、5μM)、Sal群(20μM、40μM、80μM)、または対照群、LY294002(10μM、PI3K阻害剤)群、Sal(80μM)群、LY294002(10μM)+Sal(80μM)群に割り付けた( 材料表参照)。
2. 細胞生存率アッセイ
注: この手順の詳細については、以前のレポート27 を参照してください。
- 密度8 x 104 細胞/ウェルのMCF-7細胞を96ウェルプレートに播種し、細胞が接着するまで、Sal(10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、160 μM、および320 μM)で24時間またはSal(20、40、80 μM)で12時間/24時間/36時間/48時間インキュベートします。
- 処理後、MCF-7細胞を10 μL/ウェルのCCK-8溶液( 材料表を参照)と2時間共インキュベートします。次に、自動マイクロプレートリーダーで450nm(OD450)の光学濃度を測定します。
3. 細胞の遊走と浸潤
注:この手順の詳細については、以前のレポート35を参照してください。
- 2 mL の 5 x 10 6 細胞/mL 細胞を6 ウェルプレートに播種し、皿の底の 90% を覆うようにインキュベートします。
- 滅菌ピペットチップで細胞単層の中心に沿って線状の引っ掻き傷を巻きます。0時間、24時間、48時間で光学顕微鏡を使用して画像を取得します。
- Image Jソフトウェアを使用して、引っかき傷の幅を測定します。
- トランズウェルアッセイでは、MCF-7細胞を血清培地なしで懸濁し、マトリゲルの有無にかかわらず、プレコートされた上部トランスウェルチャンバーにシードします( 材料表を参照)。
- トランズウェルチャンバーの底部では、化学誘導剤としてDMEM完全培地を使用します。24時間後、上部チャンバー内の細胞を除去し、残りの侵襲性細胞および移動細胞をメタノール35で固定する。
- MCF-7細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色します( 材料表を参照)。光学顕微鏡を使用して画像を撮影します。
4. Na+-K+-ATPaseおよびCa2+-Mg2+-ATPaseの活性評価
- ビシンコニン酸(BCA)キットを使用して、製造元の指示に従って、溶解したMCF-7細胞のタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。
- 溶解した細胞のサンプルを対応するグループの96ウェルプレートに加えます。その後、作業溶液を加えて、さらに37°Cで5分間インキュベートします。最後に、多機能マイクロプレートリーダーでOD636 の値を測定します。
5. アポトーシスと細胞周期のフローサイトメトリー解析
注:この手順の詳細については、以前のレポート31を参照してください。
- 細胞を消化し、回収してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)( 材料表を参照)で20分間染色した後、フローサイトメーターを使用してアポトーシス細胞の数を決定します。
- 再懸濁したサンプル溶液とPI溶液を混合して30分間インキュベーションした後、フローサイトメーターで検出します。
6. DCFH-DAおよびFluo-4 AM蛍光染色
注: この手順の詳細については、以前のレポート29 を参照してください。
- MCF-7細胞を10 μM DCFH-DA 蛍光プローブ( 材料表参照)を用いて37°Cで20分間インキュベートします。 PBSで3回洗浄して余剰DCFH-DAを十分に除去した後、励起波長488nm、発光波長525nmの蛍光強度を蛍光顕微鏡で検査します。
- MCF-7細胞を5 μM Fluo-4 AM蛍光プローブ溶液( 材料表参照)と37°Cで45分間インキュベートします。 PBSで3回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、励起波長488nm、発光波長516nmの蛍光強度値を求めます。
7.ウェスタンブロット
- 異なる薬物を含む5 x 10 6細胞/mL細胞懸濁液2 mLを6 ウェルプレートに加え、37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間培養します。
注:ウェスタンブロット解析のグループは、対照群、LY294002(10μM)群、Sal(80μM)群、LY294002(10μM)+Sal(80μM)群として設定しました( 材料表参照)。 - 細胞と上清を回収し、560 × g 、4°C、3分間遠心分離します。上澄みを捨て、予冷したPBSで2回洗浄する。各洗浄後、細胞を560 × g 、4°C、3分間遠心分離します。
- ステップ 7.2 の細胞サンプルに 50 μL の溶解バッファーを加え、15 分間のアイスバスを行います。8550 × g 、4°C、10分間遠心分離し、上清タンパク質サンプルを回収します。
- BCA法を用いてタンパク質濃度を検出した後、ステップ7.3のタンパク質サンプルとローディングバッファーを4:1の割合で混合し、金属浴中で100°Cで10分間変性させ、室温まで冷却します。
- ステップ7.4のタンパク質サンプル20 μgを添加し、10% SDS-PAGE(材料表を参照)を使用して分子量35の異なるタンパク質を分離し、0.22 μmのPVDFメンブレンに移します。5% BSAで閉塞した後、メンブレンを対応する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
注:一次抗体の希薄濃度は1:1,000です:切断カスパーゼ-9/7/3(CC-9/7/3)、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1、およびβ-アクチン( 材料表を参照)。 - 翌日、メンブレンをヤギ抗ウサギIgG二次抗体と37°Cで2時間インキュベートします。 ECL化学発光溶液を使用してメンブレンを現像し、非接触定量ウェスタンブロットイメージングシステムを使用して画像を撮影します( 材料表を参照)。
8. qRT-PCRの
- 遠心分離を行い、MCF-7細胞を560 x g 、4°C、3分間回収し、500 μLのバッファーRL1を5 × 106 細胞に加えます。細胞塊が見えなくなるまでピペットで繰り返しブローして混合します。
注:バッファー RL1 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。 - ステップ8.1の細胞ホモジネートをコレクションチューブに埋め込まれたDNAクリーニングカラムに移し、8,550 × g 、4°C、2分間遠心分離します。DNAクリーニングカラムを取り外し、上清をコレクションチューブに保管します。
注:DNA クリーニングカラムとコレクションチューブは、トータル RNA 分離キットの 2 つのコンポーネントです( 材料表を参照)。 - ステップ8.2の上清500μLに緩衝液RL2 800 μLを加え、穏やかに混合する。
注:バッファー RL2 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。使用前に、60 mLの緩衝液RL2に120 mLの無水エタノールを加えてください。 - ステップ 8.3 の混合物 700 μL をコレクションチューブに埋め込まれた RNA 専用カラムに移し、8,550 × g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。
注:RNA 専用カラムは、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。 - ステップ8.4を繰り返して、ステップ8.3の残りの混合物を処理します。
- 500 μL のバッファー RW1 を RNA 専用カラムに添加し、8,550 × g で 4 °C、1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。
注:バッファー RW1 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。 - 700 μL のバッファー RW2 を RNA 専用カラムに添加し、8,550 × g で 4 ◦C で 1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。手順8.7を一度繰り返します。
注:バッファー RW2 は、トータル RNA 単離キットの成分の 1 つです( 材料表を参照)。 - RNA のみのカラムをコレクションチューブに戻し、8550 × g で 4 °C、2 分間遠心分離して、残りのバッファー RW2 を除去します。
- RNA 専用カラムを新しいコレクションチューブに移し、65 °C で予熱した RNase フリー ddH2O 100 μL を RNA 専用カラムのメンブレンの中央に滴下します。25°Cで2分間置き、8,550 × g 、4°C、1分間遠心分離してRNA溶液を回収します。
注:RNaseフリーddH2Oは、total RNA単離キットの成分の1つです( 材料表を参照)。 - 5x反応バッファー4 μL、オリゴ(dT)18 プライマー1 μL、ランダム六量体プライマー1 μL、遺伝子特異的プライマー1 μL(表1を参照)、酵素ミックス1 μL、およびステップ8.9のRNA溶液5 μgを100 μLの8チューブストリップに加えます。反応系にRNaseフリーの水を20 μLまで添加します。
- システムの反応条件を次のように設定します:(1):95°C、30秒、1サイクル。(2):95°C、5秒、50サイクル、60°C、34秒;(3):95°C、5秒、1サイクル、65°C、60秒、97°C、1秒;(4):42°C、30秒、1サイクル。qRT-PCR手順を実行します。
注:標的遺伝子の相対発現レベルは、2−ΔΔCT法36,37によって定量的に分析された。qRT-PCR解析に用いた各遺伝子のプライマー情報を表1に示します。
9. 統計解析
- データを 3 つの独立した実験の平均±標準偏差として表します。
- グラフ作成および分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの検定を使用して、複数のグループ間の比較を分析します。この研究では、 P < 0.05 を統計的に有意なものとして定義しました。
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Representative Results
MCF-7細胞の過剰増殖の抑制と創傷治癒の遅延に対するSalの効果
乳がんに対するSalの可能性を探るために、まずヒト乳がんMCF-7細胞株の細胞増殖毒性と引っかきアッセイを用いて、その抗がん特性をテストしました。これらの細胞をSal(5〜320μM)の濃度系列と24時間共インキュベートし、細胞増殖をCCK-8アッセイを用いて評価した。細胞増殖に対するSalの用量依存的な阻害効果が観察され、40 μMで細胞の活力が50%低下しました(図2A)。次に、20 μM、40 μM、および 80 μM の塩分濃度を、その後の時点および創傷治癒評価用に選択しました。図2Bの結果は、Salが時間の経過とともにMCF-7細胞の活力を阻害し、24時間の共インキュベーション後にMCF-7細胞の活力が50%減少する可能性があることを示しています。図2C-Rは、創傷スクラッチアッセイによって決定された、MCF-7細胞の創傷治癒に対するSal処理の阻害効果を示す。さらに細胞スクラッチ試験を行ったところ、Sal(20 μM、40 μM、80 μM)で24時間培養すると、創傷治癒のプロセスが急激に妨げられることが確認されました(図2C、D)。
SalによるMCF-7細胞の悪性遊走・浸潤の抑制
多数の腫瘍細胞の移動とパラガン組織への浸潤傾向は、悪性腫瘍の典型的な特徴として認識されています。MCF-7細胞の遊走および浸潤に対するSalの効果は、細胞外マトリックスゲルの有無にかかわらずコーティングされたトランズウェルシステムを使用してさらに試験されました。Sal処理は、MCF-7細胞の望ましくない遊走(図3A-F)および浸潤(図3G-L)を有意に減少させた。図3Aに示すように、Salによる処理は驚くべきことにMCF-7細胞の遊走を中和しました。ほぼ満場一致で、MCF-7細胞の悪意のある侵入プロセスは、Salとのインキュベーション後に効果的に停止されました(図3B)。上記のデータは、乳がんの抑制におけるサルの利点を完全に確認しました。
MCF-7細胞におけるアポトーシスの促進と周期停止の促進におけるSalの効果
がん細胞の不死化と定期的な繁殖は、がんが悪化して広がる機会を提供します。当然のことながら、アポトーシスと周期抑制の促進も、がんを予防するための戦略として受け入れられています。フローサイトメトリーの結果は、Sal処理により、アポトーシス初期および後期のMCF-7細胞の数が増加することを示唆しています(図4A)。一方、対照群と比較して、Sal処理はG0/G1期の細胞数を急激に増加させ、S期細胞の割合を減少させました(図4B)。アポトーシスと周期停止の促進は、乳がんに対するサルの可能な薬理作用として役立つ可能性があります。.
MCF-7細胞における細胞内ROSおよびCa2+ 過剰産生の刺激に対するSalの効果
細胞内ROSおよびCa2+産生の継続的な刺激は、腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害することができる。図5A〜Eは、DCFH-DA免疫蛍光染色によって評価されたROS含量を示す。ROSの定量結果を図5Fに示します。Fluo-4 AM免疫蛍光染色を用いて、Ca2+濃度を検出しました(図5G-K)。図5LにCa2+の定量結果を示します。DCFH-DAの結果は、Salが対照群と比較してROS蛍光シグナルを有意に増強することを示しました(図5A)。一貫して、Sal介入はCa2+産生を明らかに増加させ、強調されたFluo-4 AM蛍光シグナルによって証明されました(図5B)。これらの結果は、ROSおよびCa2+シグナルがSalの抗乳がん活性に部分的に関与している可能性があることを総合的に示しました。
MCF-7細胞のミトコンドリア経路におけるアポトーシス誘導におけるSalの効果
ミトコンドリアの機能不全によって誘発されるアポトーシスが、多くの腫瘍細胞の最終的な運命を決定するという豊富な証拠があります。SalがMCF-7細胞のミトコンドリア機能調節とアポトーシス促進効果を媒介するかどうかを決定する際に、SalがNa+-K+-ATPase(図6A)およびCa2+-ATPase(図6B)の酵素活力を制限することが最初に示され、ミトコンドリア機能障害の促進における潜在的な役割が示されました。続いて、ウェスタンブロットおよびqRT-PCRデータから、Sal処理は、アポトーシス促進因子であるCC-9(図6C、D、G)、CC-7(図6C、E、H)、CC-3(図6C、F、I)、Bim(図6C、J、M)、およびBax(図6C、L、O)のタンパク質および遺伝子発現を促進し、抗アポトーシスBcl-2のタンパク質および遺伝子発現を阻害することが示されました(図6C、K,N) です。これらのデータは、アポトーシスと相まってMCF-7細胞のミトコンドリア機能障害が、乳がんに対するSalの作用機序に関与している可能性があることを部分的に示しています。
MCF-7細胞におけるPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路の抑制に対するSalの効果
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路は、腫瘍増殖を調節する重要なシグナル伝達経路として、乳がんの病理学的進行と悪化に関与しています。ウェスタンブロットの結果は、Sal処理がp-PI3K/PI3K(図7A、B)およびp-AKT/AKT(図7A、C)の比率を顕著に制限することを示しました。一方、mTOR(図7A、D)、HIF-1α(図7A、E)、およびFoxO1(図7A、F)のタンパク質発現も、Sal処理によって顕著に抑制されました。さらにqRT-PCR解析を行ったところ、Sal投与によりPI3K(図7G)、AKT(図7H)、mTOR(図7I)、HIF-1α(図7J)、およびFoxO1(図7K)の遺伝子発現レベルが低下することが示されました。結論として、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路の活性化の阻害は、乳がんに対するSalの潜在的な分子メカニズムである可能性があります。
図1:乳がんMCF-7細胞株に対するSalの作用の模式図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:SalのMCF-7細胞増殖毒性と創傷治癒特性(A)および(B)は、MCF-7細胞活性に対するSal処理の投与時間効果を示しています。(C-R)創傷スクラッチアッセイによって決定された、MCF-7細胞の創傷治癒に対するSal治療の阻害効果。上記のデータは、平均± SD、n = 3 として示されています。##p < 0.01 対対照群。スケールバー:200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:Sal処理によるMCF-7細胞の悪性遊走・浸潤の抑制 Sal処理は、MCF-7細胞の望ましくない(A-F)遊走および(G-L)浸潤を有意に減少させる。上記のデータは、平均± SD、n = 3 として示されています。対照群に対して<#p<0.05および##p<0.01。スケールバー:200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:Salによるアポトーシスの促進と細胞周期の抑制。フローサイトメトリーによって検出された、MCF-7細胞に対するSalの(A)アポトーシス促進および(B)細胞周期停止効果。上記のデータは、平均± SD、n = 3 として示されています。対照群に対して、#p < 0.05 および ##p < 0.01 です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:Sal処理によるMCF-7細胞におけるROSおよびCa2+の急増。 (A-E)ROS含量はDCFH-DA免疫蛍光染色により評価した。(F)ROSの定量的結果。(G-Kさん)Fluo-4 AM免疫蛍光染色を用いて、Ca2+濃度を検出しました。(L)Ca2+の定量結果。上記のデータは、平均± SD、n = 3 として示されています。対照群に対して、#p < 0.05 および ##p < 0.01 です。スケールバー:200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:MCF-7細胞のアポトーシスを伴うミトコンドリア機能障害の誘導に対するSal処理の効果。(A)Na+-K+-ATPaseおよび(B)Ca2+-ATPaseの酵素活性の低下。(C)(D)CC-9、(E)CC-7、(F)CC-3、(J)Bim、(K)Bcl-2、および(L)Baxタンパク質、および(G)カスパーゼ-9、(H)カスパーゼ-7、(I)カスパーゼ-3、(M)Bim、(N)Bcl-2、および(O)Bax遺伝子の代表的なタンパク質発現バンドとそれに対応する統計結果。上記のデータは、平均± SD、n = 3 として示されています。対照群に対して、#p < 0.05 および ##p < 0.01 でした。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:Sal処理によるPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路の抑制 。 (A)ウェスタンブロット解析で検出された代表的なタンパク質バンド。Salは、(B)p-PI3K/PI3K、(C)p-AKT/AKT、(D)mTOR、(E)HIF-1α、および(F)FoxO1のタンパク質発現を減少させた。サルは、(G)PI3K、(H)AKT、(I)mTOR、(J)HIF-1α、および(K)FoxO1の遺伝子発現レベルを抑制した。上記のデータは、平均± SD、n = 3 として示されています。# #p < 0.01 対対照群。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:SalによるMCF-7細胞におけるROSおよびCa2+ 産生の刺激と、PI3Kシグナル伝達の阻害。 mTORの関与により、AKTのリン酸化はSal投与後にさらに減少しました。その結果、HIF-1αとFoxO1の発現がダウンレギュレーションされ、MCF-7細胞の周期的な悪性増殖が阻害されました。一方、MCF-7細胞のアポトーシスの亢進は、Salの抗乳がんの可能性を示唆しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | GenBankアクセッション番号 | プライマー配列 (5'-3') | 長さ (bp) | |
| カスパーゼ-9 | NM_001229 | F、ガッカガガットtcgcaaaccagagg | 92 | |
| R、AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| カスパーゼ-7 | F、AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R、CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 (カスパーゼ 3) | NM_001354777 | F、CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R、CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| ビム | NM_001204106 | F、AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R、CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| BCL-2 | NM_000633 | F、GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R、GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| バックス | NM_001291428 | F、CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R、CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-アクチン | NM_031144 | F、AATCTGGCACCACACCTTCTACAAA | 172 | |
| R、GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F、フォワード;R、逆。 | ||||
表1:逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応に用いたプライマー。
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Discussion
乳がんはあらゆる年齢層に罹患し、計り知れない肉体的・精神的負担と大きな経済的圧力を引き起こします1。また、罹患率や死亡率が年々増加している乳がんは、従来の治療法を超えた効果的なハーブベースの複合療法の模索という点でも世界的に注目されています4,5。有望なことに、多くの証拠がSal 24,25,38の抗がん効果を明らかにしています。残念ながら、乳がんにおけるサルの役割と根底にある分子メカニズムは、まだほとんど不明のままです。この研究は、ヒト乳がんMCF-7細胞株の増殖、遊走、および浸潤に対するSalの有意な阻害効果を強調しています。その後、MCF-7細胞の刺激性アポトーシスと周期停止におけるSalの可能性を明らかにしました。一方、これらのデータは、サル投与がROSとCa2+のレベルを上昇させることも示しました。分子メカニズムのさらなる調査により、乳がん治療におけるSalのアポトーシス促進作用と、PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1経路に対するSalの効果が実証されました。
悪性で制御不能な増殖は、乳がんの発症を加速させ、リンパ管39および脳転移40のリスクを高める可能性がある。現在、市販されている化学療法薬は徐々に登場していますが、乳がんの治療に対する感度が低いという問題があり、より強力な化合物や新しい薬剤の組み合わせを求めることを余儀なくされています2,3。この研究のデータは、Sal処理がMCF-7細胞の悪性増殖を制限することを最初に実証しました。その後の細胞スクラッチアッセイにより、12時間および24時間のSalインキュベーションにより、MCF-7細胞の収束速度が低下することがさらに確認されました。腫瘍細胞の遊走および浸潤能力の検査は、抗腫瘍薬をスクリーニングするための敏感な指標と見なされています24,25。この研究のデータは、以前の発見33,34に沿って、SalがMCF-7細胞の遊走と浸潤のプロセスを大幅に減少させたことを示唆しています。腫瘍細胞の制御されていない細胞周期は、細胞の不死の運命を決定します24。したがって、アポトーシスの促進および細胞周期の中断は、化合物の抗癌電位を評価するための指標として認識され、受け入れられるようになった25。この研究では、フローサイトメトリー解析により、Sal処理がMCF-7細胞のアポトーシスをシグナル的に増加させることが示され、初期および後期アポトーシス細胞の割合の増加によって証明されました。また、G0/G1細胞の比率が増加し、MCF-7細胞周期のS期が乱されることから、乳がん細胞に対するSalの細胞周期遮断効果が示唆された。
軽度の低酸素性乳がん細胞微小環境は、ROSおよびCa2+ 産生の制限に関連しています。したがって、過剰なROSおよびCa2+ の蓄積は、乳がん細胞にアポトーシスイベントを誘発する可能性がある41。この研究における免疫蛍光法の結果は、Sal介入がROSおよびCa2+ 産生を大いに刺激し、MCF-7細胞のアポトーシスをさらに誘導する可能性があることを証明しました。新たな証拠は、アポトーシス促進性タンパク質BaxおよびBimのレベルの上昇、ならびに抗アポトーシスタンパク質Bcl-2のレベルの低下が、ミトコンドリア膜に出入りする物質の通路を一時的かつ強制的に開き、したがって腫瘍細胞のプログラムされたアポトーシスを引き起こす可能性があることを明らかにしている42。この研究では、SalとMCF-7細胞の共インキュベーションにより、BaxとBimが有意に増加し、Bcl-2のタンパク質と遺伝子発現が減少し、乳がん細胞のアポトーシスを促進するための潜在的な薬理学的効果が示唆されました。これらのデータはまた、Salがミトコンドリアのアポトーシス経路の重要な下流指標であるCC-9、CC-7、およびCC-3タンパク質とそれらに対応する遺伝子の発現を明示的に誘導していることを示唆しました。上記のデータは、乳がんに対するサルのアポトーシス促進効果がミトコンドリアアポトーシスの活性化に関連している可能性があることを部分的に示唆しています。.
分子メカニズムの研究により、PI3Kのリン酸化がAKTのリン酸化をさらに誘導し、乳がん細胞の増殖を促進することが確認されています6,7。一方、mTORの大量蓄積は、AKTリン酸化プロセスに関与することにより、乳がんの悪化にも寄与します8,9。一方では、リン酸化AKTはFoxO1の発現を直接刺激して、乳がんの細胞周期を促進し、アポトーシスを遅らせます22,23。並行して、活性化されたAKTは間接的にHIF-1α発現を活性化してFoxO1を生成し、乳がんの進行と転移を引き起こします16,17。したがって、PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1経路の活性化の阻害は、乳がん治療のための新しい戦略である可能性があります。PI3K阻害剤LY294002の介入により、SalがPI3Kのリン酸化を観察的に抑制することが実証されました。mTORタンパク質発現のダウンレギュレーションと併せて、Salはリン酸化AKTの発現レベルも低下させました。その結果、HIF-1αおよびFoxO1タンパク質の発現は、Sal処理後に同様に大幅に減少しました。同様に、qRT-PCRの結果は、Sal処理がPI3K、AKT、HIF-1α、およびFoxO1の遺伝子レベルを大幅に低下させ、MCF-7細胞の周期停止とアポトーシスの促進に寄与することを一貫して明らかにしました(図8)。まとめると、得られたデータは、サルが乳がんに対する作用を持つ天然ハーブ起源の潜在的な活性化合物である可能性があることを示唆しています。サル処理によるMCF-7細胞のアポトーシスと細胞周期阻害の促進は、乳がん細胞の遊走および浸潤能力を大幅に弱めました。特に、乳がんに対するSalの分子作用機序は、PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1経路の阻害に関連している可能性があります。全体として、複数の実験方法を統合したこのプロトコルは、抗乳がん薬の研究開発に一定の基準値を提供します。
この研究では、乳がんに対するサルの分子メカニズムの直接的な証拠はありません。PI3Kノックアウトマウス、PI3Kタンパク質の発現が高いまたは低い乳がん細胞株、および局所表面プラズモン共鳴技術は、乳がんの予防と治療のためのSalの直接的な分子標的を確認するために使用できる次のステップです29,31。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、四川省衛生健康委員会(120025)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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