Summary
Denne protokol beskriver en omfattende strategi til evaluering af salidrosids farmakologiske virkning og mekanisme til hæmning af MCF-7-celleproliferation og migration.
Abstract
Salidrosid (Sal) indeholder anti-kræftfremkaldende, anti-hypoxiske og antiinflammatoriske farmakologiske aktiviteter. Imidlertid er dets underliggende anti-brystkræftmekanismer kun blevet ufuldstændigt belyst. Derfor havde denne protokol til hensigt at afkode Sal's potentiale til regulering af PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen i den ondartede spredning af humane brystkræft MCF-7-celler. For det første blev den farmakologiske aktivitet af Sal mod MCF-7 evalueret ved CCK-8 og celleridseassays. Desuden blev modstanden af MCF-7-celler målt ved migrations- og Matrigel invasionsassays. Til celleapoptose og cyklusassays blev MCF-7-celler behandlet i trin med annexin V-FITC / PI og cellecyklusfarvningsdetektionssæt til henholdsvis flowcytometrianalyser. Niveauerne af reaktive iltarter (ROS) og Ca2+ blev undersøgt ved DCFH-DA og Fluo-4 AM immunfluorescensfarvning. Aktiviteterne i Na+-K+-ATPase og Ca2+-ATPase blev bestemt ved hjælp af de tilsvarende kommercielle kits. Protein- og genekspressionsniveauerne i apoptose og PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen blev yderligere bestemt ved hjælp af henholdsvis western blot- og qRT-PCR-analyser. Vi fandt, at Sal-behandling signifikant begrænsede spredning, migration og invasion af MCF-7-celler med dosisafhængige virkninger. I mellemtiden tvang Sal-administrationen også dramatisk MCF-7-celler til at gennemgå apoptose og cellecyklusstop. Immunofluorescenstestene viste, at Sal observerbart stimulerede ROS og Ca2+ produktion i MCF-7 celler. Yderligere data bekræftede, at Sal fremmede ekspressionsniveauerne af pro-apoptotiske proteiner, Bax, Bim, spaltet caspase-9/7/3 og deres tilsvarende gener. Konsekvent reducerede Sal-intervention fremtrædende ekspressionen af proteinerne Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α og FoxO1 og deres tilsvarende gener. Afslutningsvis kan Sal bruges som en potentiel urteafledt forbindelse til behandling af brystkræft, da det kan reducere den ondartede spredning, migration og invasion af MCF-7-celler ved at hæmme PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-vejen.
Introduction
Som en af de mest almindeligt diagnosticerede kræftformer og mest almindelige maligniteter viser de seneste statistikker, at 2,3 millioner tilfælde af brystkræft opstod rundt om i verden i 2020, hvilket tegner sig for 11,7% af alle kræfttilfælde1. Almindelige symptomer på brystkræft omfatter ømhed og prikken i brystet, knuder og smerter i brystet, udflåd fra brystvorten, erosion eller sunket hud og forstørrede aksillære lymfeknuder 1,2. Endnu mere alarmerende er det, at antallet af nye tilfælde og den samlede forekomst af brystkræft fortsætter med at stige med en overvældende hastighed hvert år og tegner sig for 6,9% af kræftrelaterede dødsfald1. På nuværende tidspunkt involverer brystkræftintervention stadig hovedsageligt kemoterapi, kirurgi, strålebehandling og omfattende behandling. Selvom behandling effektivt kan reducere patienternes tilbagefaldsrate og dødelighed, forårsager langvarig behandlingsanvendelse ofte multiresistens, hårtab i store områder, kvalme og opkastning og alvorlig mental og psykologisk byrde 2,3. Især tvinger den potentielle risiko for flere organmetastaser fra brystkræft også folk til at søge nye urtekilder til lægemiddelterapi 4,5.
Phosphoinositid 3-kinase (PI3K)-medieret signalering er impliceret i vækst, spredning og overlevelse af brystkræft gennem splejsning, der påvirker ekspressionen af flere gener6. Som et nedstrøms signalfølende protein af PI3K tyder mange beviser på, at proteinkinase B (AKT) kunne parres med pattedyrsmålet for rapamycin (mTOR) protein for yderligere at øge brystkræft 7,8,9. Desuden er deaktivering af PI3K / AKT / mTOR-signalering også blevet hævdet at være en nøglekomponent i lægemidler, der hæmmer ondartet proliferation og stimulerer apoptose i brystkræft10,11,12. Det er velkendt, at ekstrem hypoxi i tumormikromiljøet tvinger en massiv stigning i hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF-1α), hvilket yderligere forværrer udviklingen af brystkræft13,14,15. Parallelt fører AKT-stimulering også til overdreven ophobning af HIF-1a, hvilket begrænser apoptose i brystkræftprøver16,17. Interessant nok er aktiveringen af PI3K-AKT-HIF-1α-signalering blevet bekræftet at være involveret i patologisk progression og metastase i en række kræftformer, herunder lungekræft18, kolorektal cancer19, kræft i æggestokkene20 og prostatacancer21. Ud over at være orkestreret af HIF-1α udløses gaffelhovedtranskriptionsfaktor 1 (FoxO1) overekspression også af AKT-signalstimulering, som fremmer cyklusstop og hæmning af apoptose i brystkræftceller22,23. Tilsammen tyder ovenstående solide beviser på, at hæmningen af kaskaden af PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan være et potentielt nyt mål for lægemiddelbehandling i brystkræft.
Salidrosid (Sal) har vist sig bredt at udøve anti-cancer 24,25, anti-hypoxi26,27,28,29 og immunforstærkende farmakologiske aktiviteter 30. Det er et lysebrunt eller brunt pulver, der er let opløseligt i vand, er en type phenylethanoidglycosid og har en kemisk strukturformel på C14H20O7 og en molekylvægt på300,331,32. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Sal kan fremme apoptose af gastriske kræftceller ved at begrænse PI3K-AKT-mTOR-signalering24. Yderligere beviser tyder også på, at undertrykkelsen af PI3K-AKT-HIF-1α-signalering ved Sal-behandling kan bidrage til apoptose af kræftceller ved at øge deres følsomhed over for kemoterapeutiske midler25. Beviser tyder også på, at Sal begrænser cellemigration og invasion og forårsager cyklusstop ved at fremme apoptose i de humane brystkræft MCF-7-celler33,34. Det er dog stadig at se, om Sal kan regulere PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signalering og hæmme den ondartede proliferation af MCF-7-celler. Derfor havde denne protokol til formål at undersøge virkningerne af Sal på MCF-7-cellemigration, invasion, cellecyklus og apoptose via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen. De integrerede forskningsstrategier, der omfatter konventionelle, billige og uafhængige eksperimenter, såsom cellemigrations- og invasionsvurderinger, apoptose og cellecyklusdetektion ved flowcytometri, reaktive iltarter (ROS) og Ca2+ fluorescensbestemmelse osv., Kan give en reference for det overordnede design af eksperimenter til kræftforskning med traditionel urtemedicin. Den eksperimentelle proces i denne undersøgelse er vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MCF-7-cellerne, der blev anvendt til denne undersøgelse, blev opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabellen).
1. Cellekultur
- Kultiver MCF-7-cellerne i en befugtet 5% CO2 atmosfære ved 37 °C med DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin (10.000 E / ml) / streptomycin (10.000 μg / ml) (se materialetabellen).
BEMÆRK: Cellerne, der dækker 90% af bunden af skålen, blev anvendt til eksperimentet og tildelt følgende grupper: kontrolgruppe, doxorubicinhydrochloridgruppe (DXR, 5 μM) og Sal-grupper (20 μM, 40 μM og 80 μM) eller kontrolgruppe, LY294002 (10 μM, en hæmmer af PI3K) gruppe, Sal (80 μM) gruppe og LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) gruppe (se materialetabellen).
2. Analyse af cellelevedygtighed
BEMÆRK: For nærmere oplysninger om denne procedure henvises til en tidligere rapport27.
- Seed MCF-7 celler med en densitet på 8 x 104 celler / brønd i 96-brønd plader, og inkubere med Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM, og 320 μM) for 24 timer eller Sal (20, 40, 80 μM) for 12 h / 24 h / 36 h / 48 timer natten over, indtil cellerne er vedhængende.
- Efter behandling inkuberes MCF-7-cellerne samtidig med 10 μL/hul CCK-8-opløsning (se materialetabellen) i 2 timer. Derefter måles den optiske densitet ved 450 nm (OD450) med en automatisk mikropladelæser.
3. Cellemigration og invasion
BEMÆRK: For nærmere oplysninger om denne procedure henvises til en tidligere rapport35.
- Inkuber 2 ml 5 x 10 6 celler / ml celler podet i 6-brøndplader for at dække 90% af bunden af skålen.
- Udfør et lineært ridsesår langs midten af cellemonolaget med en steril pipettespids. Hent billeder ved hjælp af et optisk mikroskop ved 0 h, 24 timer og 48 timer.
- Brug Image J-softwaren til at måle bredden af ridsesårene.
- Til transwell-analysen suspenderes MCF-7-celler uden serummedium og frø i det øvre transwellkammer, der er præbelagt med eller uden Matrigel (se materialetabellen).
- I bunden af transwellkammeret skal du bruge DMEM komplet medium som en kemisk inducer. Efter 24 timer fjernes cellerne i det øverste kammer, og de resterende invasive og vandrende celler fastgøres i methanol35.
- Plet MCF-7-cellerne med krystalviolet opløsning (se materialetabellen). Tag billederne ved hjælp af et optisk mikroskop.
4. Aktivitetsevaluering af Na+-K+-ATPase og Ca 2+-Mg2+-ATPase
- Brug et bicinchoninsyresæt (BCA) til at måle proteinkoncentrationen i lyserede MCF-7-celler ved at følge producentens anvisninger (se materialetabellen).
- Der tilsættes prøver af de lyserede celler i deres tilsvarende grupper i pladerne med 96 brønde. Derefter tilsættes arbejdsløsningen for yderligere at inkubere ved 37 °C i 5 minutter. Til sidst måles værdierne for OD636 med en multifunktionel mikropladelæser.
5. Flowcytometrianalyse af apoptose og cellecyklussen
BEMÆRK: For nærmere oplysninger om denne procedure henvises til en tidligere rapport31.
- Fordøje cellerne, og høst for at resuspendere i fosfatbufret saltvand (PBS) i en 20 minutters farvning med annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) (se materialetabellen), og bestem derefter antallet af apoptotiske celler ved hjælp af et flowcytometer.
- Den resuspenderede prøveopløsning blandes med PI-opløsning i en 30 minutters inkubation efterfulgt af detektion med et flowcytometer.
6. DCFH-DA og Fluo-4 AM fluorescensfarvning
BEMÆRK: For nærmere oplysninger om denne procedure henvises til en tidligere rapport29.
- MCF-7-cellerne inkuberes i 20 minutter med en 10 μM DCFH-DA fluorescenssonde (se materialetabellen) ved 37 °C. Efter grundig fjernelse af overskuddet af DCFH-DA ved vask tre gange med PBS testes fluorescensintensiteten ved excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 488 nm og 525 nm ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
- MCF-7-cellerne inkuberes med en 5 μM Fluo-4 AM fluorescerende sondeopløsning (se materialetabellen) i 45 minutter ved 37 °C. Efter vask med PBS tre gange bestemmes fluorescensintensitetsværdierne ved excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 488 nm og 516 nm ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
7. Vestlig blottelse
- Der tilsættes 2 ml 5 x 10 6 celler/ml cellesuspensioner indeholdende forskellige lægemidler i plader med6 huller, og der dyrkes i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 24 timer.
BEMÆRK: Grupperne til western blot-analysen blev indstillet som følger: kontrolgruppe, LY294002 (10 μM) gruppe, Sal (80 μM) gruppe og LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) gruppe (se materialetabellen). - Cellerne og supernatanten opsamles, og der centrifugeres ved 560 × g ved 4 °C i 3 minutter. Supernatanten kasseres, og der vaskes to gange med forkølet PBS. Efter hver vask centrifugeres cellerne ved 560 × g ved 4 °C i 3 minutter.
- Der tilsættes 50 μL lysisbuffer til celleprøven fra trin 7.2 i et 15 minutters isbad. Der centrifugeres ved 8550 × g ved 4 °C i 10 minutter for at opsamle supernatantproteinprøven.
- Efter påvisning af proteinkoncentrationen ved hjælp af en BCA-metode blandes proteinprøven i trin 7.3 med påfyldningsbuffer i forholdet 4:1, denatureres ved 100 °C i 10 minutter i et metalbad og afkøles til stuetemperatur.
- Tilsæt 20 μg af proteinprøven fra trin 7.4, separer proteinerne med forskellige molekylvægte35ved hjælp af 10% SDS-PAGE (se materialetabellen), og overfør derefter til 0,22 μm PVDF-membraner. Efter blokering med 5 % BSA inkuberes membranerne med de tilsvarende primære antistoffer natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Den fortyndede koncentration af følgende primære antistoffer er 1:1.000: spaltet caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 og β-actin (se materialetabellen). - Den næste dag inkuberes membranerne med gedeantikanin IgG sekundært antistof i 2 timer ved 37 °C. Udvikl membranerne ved hjælp af en ECL-kemiluminescerende opløsning, og tag billeder ved hjælp af et kontaktløst kvantitativt Western blot-billeddannelsessystem (se materialetabellen).
8. qRT-PCR
- Udfør centrifugering for at opsamle MCF-7-celler ved 560 x g ved 4 °C i 3 minutter, og tilsæt 500 μL buffer RL1 i 5 × 106 celler. Blæs og bland gentagne gange med en pipette, indtil ingen cellemasser er synlige.
BEMÆRK: Buffer RL1 er en af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). - Cellehomogenaterne i trin 8.1 overføres til DNA-renhedskolonnen i opsamlingsglasset, og centrifugeres ved 8,550 × g ved 4 °C i 2 min. DNA-rensekolonnen fjernes, og supernatanten opbevares i opsamlingsglasset.
BEMÆRK: DNA-rengøringssøjlen og opsamlingsrøret er to af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). - Fra trin 8.2 tilsættes 800 μL buffer RL2 til 500 μl supernatant, og bland forsigtigt.
BEMÆRK: Buffer RL2 er en af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). Tilsæt 120 ml vandfri ethanol til 60 ml buffer RL2 før brug. - 700 μL af blandingen fra trin 8.3 overføres til den rene RNA-kolonne, der er indlejret i opsamlingsglasset, og centrifugeres ved 8,550 × g ved 4 °C i 1 min. Kassér affaldsvæsken i opsamlingsrøret.
BEMÆRK: Den eneste RNA-kolonne er en af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). - Gentag trin 8.4 for at behandle den resterende blanding fra trin 8.3.
- Der tilsættes 500 μL buffer RW1 til kolonnen udelukkende RNA, og centrifugeres ved 8.550 × g ved 4 °C i 1 min. Kassér affaldsvæsken i opsamlingsrøret.
BEMÆRK: Buffer RW1 er en af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). - Der tilsættes 700 μL buffer RW2 til kolonnen kun RNA, og centrifugeres ved 8.550 × g ved 4 ◦C i 1 min. Kassér affaldsvæsken i opsamlingsrøret. Gentag trin 8.7 én gang.
BEMÆRK: Buffer RW2 er en af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). - Den rene RNA-kolonne hældes tilbage i opsamlingsglasset, og centrifugeres ved 8550 × g ved 4 °C i 2 minutter for at fjerne den resterende buffer RW2.
- Den rene RNA-kolonne overføres til et nyt opsamlingsrør, og der dryppes 100 μL RNasefri ddH2O, der er forvarmet til 65 °C, ind i midten af membranen til den rene RNA-kolonne. Der anbringes ved 25 °C i 2 minutter, og RNA-opløsningen opsamles ved centrifugering ved 8.550 × g ved 4 °C i 1 min.
BEMÆRK: RNase-fri ddH2O er en af komponenterne i det samlede RNA-isolationssæt (se materialetabellen). - Der tilsættes 4 μL 5x reaktionsbuffer, 1 μL oligo (dT)18 primer, 1 μL tilfældig hexamerprimer, 1 μL genspecifik primer (se tabel 1), 1 μL enzymblanding og 5 μg RNA-opløsning fra trin 8.9 i en 100 μL 8-rørsstrimmel. Suppler reaktionssystemet med RNasefrit vand til 20 μL.
- Systemets reaktionsbetingelser indstilles som følger: (1): 95 °C, 30 s, 1 cyklus; (2): 95 °C, 5 s, 50 cyklusser, 60 °C, 34 s (3): 95 °C, 5 s, 1 cyklus, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s og (4): 42 °C, 30 s, 1 cyklus. Udfør qRT-PCR-proceduren.
BEMÆRK: De relative ekspressionsniveauer af målgenerne blev kvantitativt analyseret ved 2−ΔΔCT-metoden 36,37. Primeroplysningerne for hvert gen, der anvendes til qRT-PCR-analysen, er anført i tabel 1.
9. Statistisk analyse
- Dataene udtrykkes som den gennemsnitlige ± standardafvigelse for tre uafhængige eksperimenter.
- Analyser sammenligningerne mellem flere grupper ved hjælp af graf- og analysesoftware (se materialetabellen) med en envejsvariansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Tukeys test. I dette arbejde blev P < 0,05 defineret som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkninger af Sal på hæmning af overskydende proliferation og forsinkelse af sårheling i MCF-7-celler
For at undersøge potentialet i Sal mod brystkræft testede vi først dets kræftegenskaber ved hjælp af celleproliferationstoksicitet og ridseanalyser af MCF-7-cellelinjen for human brystkræft. Disse celler blev co-inkuberet med en koncentrationsserie af Sal (5-320 μM) i 24 timer, og celleproliferation blev evalueret ved hjælp af et CCK-8-assay. En dosisafhængig hæmmende virkning af Sal på celleproliferation blev observeret med et fald på 50% i cellevitalitet ved 40 μM (figur 2A). Sal-koncentrationer på 20 μM, 40 μM og 80 μM blev derefter udvalgt til de efterfølgende tidspunkter og sårhelingsevaluering. Resultaterne i figur 2B viser, at Sal kunne hæmme vitaliteten af MCF-7-celler over tid med et fald på 50% i MCF-7-cellevitalitet efter 24 timers co-inkubation. Figur 2C-R viser den hæmmende virkning af Sal-behandling på sårhelingen af MCF-7-celler, som bestemt af sårridseassayet. Yderligere celleridsetest bekræftede også, at 24 timers kultur med Sal (20 μM, 40 μM og 80 μM) kraftigt hindrede sårhelingsprocessen (figur 2C, D).
Undertrykkelse af ondartet migration og invasion af MCF-7-celler af Sal
Migrationen af et stort antal tumorceller og tendensen til at invadere paracancervæv anerkendes som typiske træk ved maligne tumorer. Virkningerne af Sal på migration og invasion af MCF-7-celler blev yderligere testet ved hjælp af et transwell-system belagt med eller uden ekstracellulær matrixgel. Sal-behandling reducerede signifikant den uønskede migration (figur 3A-F) og invasion (figur 3G-L) af MCF-7-celler. Som vist i figur 3A neutraliserede behandling med Sal overraskende migrationen af MCF-7-celler. Næsten enstemmigt blev den ondsindede invasionsproces af MCF-7-celler effektivt lukket ned efter inkubation med Sal (figur 3B). Ovenstående data bekræftede fuldt ud fordelene ved Sal til at hæmme brystkræft.
Virkninger af Sal i at fremme apoptose og forbedre cyklusstop i MCF-7 celler
Udødeliggørelse og periodisk reproduktion af kræftceller giver kræften mulighed for at forværres og sprede sig. Som en selvfølge er fremme af apoptose og cyklusundertrykkelse også blevet accepterede strategier til forebyggelse af kræft. Resultaterne af flowcytometri antydede, at Sal-behandling øgede antallet af MCF-7-celler i de tidlige og sene apoptotiske stadier (figur 4A). I mellemtiden, sammenlignet med kontrolgruppen, øgede Sal-behandlingen også antallet af celler kraftigt i G0 / G1-fasen, samtidig med at andelen af S-faseceller blev reduceret (figur 4B). Fremme af apoptose og cyklusstop kan tjene som den mulige farmakologiske virkning af Sal mod brystkræft.
Effekt af Sal på stimulering af intracellulær ROS og Ca2+ overproduktion i MCF-7 celler
Den kontinuerlige stimulering af intracellulær ROS og Ca2+ produktion kan effektivt hæmme væksten af tumorceller. Figur 5A-E viser ROS-indholdet vurderet ved DCFH-DA-immunfluorescensfarvning. De kvantitative resultater for ROS er vist i figur 5F. Fluo-4 AM immunofluorescensfarvning blev anvendt til at detektere Ca2+ koncentrationen (figur 5G-K). Figur 5L viser de kvantitative resultater for Ca2+. DCFH-DA-resultaterne viste, at Sal signifikant forbedrede ROS-fluorescenssignaler sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5A). Konsekvent forhøjede Sal-intervention også tydeligt Ca2+ -produktionen, hvilket fremgår af det fremhævede Fluo-4 AM fluorescenssignal (figur 5B). Disse resultater indikerede samlet, at ROS og Ca2+ signaler kan være delvist involveret i Sals anti-brystkræftaktivitet.
Effekt af Sal ved inducering af apoptose i mitokondrievejen for MCF-7-celler
Der er rigelige beviser for, at apoptose induceret af mitokondriel dysfunktion bestemmer den ultimative skæbne for mange tumorceller. Ved bestemmelse af, om Sal medierer mitokondriefunktionsregulering og apoptosefremmende virkninger i MCF-7-celler, blev det først demonstreret, at Sal begrænsede enzymvitaliteterne af Na+-K+-ATPase (figur 6A) og Ca2+-ATPase (figur 6B), hvilket indikerer dets potentielle rolle i at fremme mitokondriel dysfunktion. Efterfølgende viste western blot- og qRT-PCR-data, at Sal-behandling fremmede protein- og genekspressionen af de pro-apoptotiske faktorer CC-9 (figur 6C, D, G), CC-7 (figur 6C, E, H), CC-3 (figur 6C, F, I), Bim (figur 6C, J, M) og Bax (figur 6C, L, O), mens det hæmmede proteinet og genekspressionen af anti-apoptotisk Bcl-2 (figur 6C,K,N). Disse data viser delvist, at mitokondriel dysfunktion i MCF-7-celler kombineret med apoptose kan være involveret i virkningsmekanismen for Sal mod brystkræft.
Effekt af Sal på undertrykkelsen af PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-vejen i MCF-7-celler
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen, som en afgørende signaltransduktionsvej, der regulerer tumorvækst, er involveret i den patologiske progression og forringelse af brystkræft. Western blot-resultaterne viste, at Sal-behandling fremtrædende begrænsede forholdet mellem p-PI3K / PI3K (figur 7A, B) og p-AKT / AKT (figur 7A, C). I mellemtiden blev proteinekspressionen af mTOR (figur 7A, D), HIF-1α (figur 7A, E) og FoxO1 (figur 7A, F) også markant undertrykt ved Sal-behandling. Yderligere qRT-PCR-analyse viste også, at Sal-administration reducerede genekspressionsniveauerne for PI3K (figur 7G), AKT (figur 7H), mTOR (figur 7I), HIF-1α (figur 7J) og FoxO1 (figur 7K). Afslutningsvis kan hæmningen af aktiveringen af PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen være en potentiel molekylær mekanisme for Sal mod brystkræft.
Figur 1: Skematisk illustration af virkningen af Sal mod brystkræft MCF-7 cellelinjen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: MCF-7 celleproliferation toksicitet og sårheling egenskaber af Sal. (A) og (B) viser dosis-tid effekter af Sal behandling på MCF-7 celleaktivitet. (C-R) Sal-behandlingens hæmmende virkning på sårheling i MCF-7-celler, bestemt af sårridseanalysen. Ovenstående data er illustreret som gennemsnittet ± SD, n = 3. ##p < 0,01 vs. kontrolgruppen. Vægtstænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Undertrykkelse af den ondartede migration og invasion af MCF-7-celler ved Sal-behandling. Sal-behandling reducerer signifikant uønsket (A-F) migration og (G-L) invasion af MCF-7-celler. Ovenstående data er illustreret som gennemsnittet ± SD, n = 3. <#p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrolgruppen. Vægtstænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Fremme af apoptose og undertrykkelse af cellecyklussen af Sal. Sals (A) apoptotiske promoverings- og (B) cellecyklusarrestvirkninger på MCF-7-celler, som detekteret ved flowcytometri. Ovenstående data er illustreret som gennemsnittet ± SD, n = 3. #p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrolgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Stigning i ROS og Ca2+ i MCF-7-celler forårsaget af Sal-behandling. (A-E) ROS-indholdet blev vurderet ved DCFH-DA-immunfluorescensfarvning. F) Kvantitative resultater for ROS. (G-K) Fluo-4 AM immunofluorescensfarvning blev anvendt til at detektere Ca2+ koncentrationen. L) Kvantitative resultater for Ca2+. Ovenstående data er illustreret som gennemsnittet ± SD, n = 3. #p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrolgruppen. Vægtstænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Effekt afSal-behandling på inducering af mitokondriel dysfunktion kombineret med apoptose i MCF-7-celler. De reducerede enzymaktiviteter af (A) Na+-K+-ATPase og (B)Ca2+-ATPase. C) Repræsentative proteinekspressionsbånd og deres tilsvarende statistiske resultater for (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 og (L) Bax proteiner og for (G) caspase-9, (H) caspase-7, (I) caspase-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 og (O) Bax gener. Ovenstående data er illustreret som gennemsnittet ± SD, n = 3. #p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrolgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Undertrykkelse af PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen ved Sal-behandling . (A) Repræsentative proteinbånd påvist ved western blot-analyse. Sal reducerede proteinekspressionen af (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α og (F) FoxO1. Sal dæmpede genekspressionsniveauer på (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α og (K) FoxO1. Ovenstående data er illustreret som gennemsnittet ± SD, n = 3. # #p < 0,01 vs. kontrolgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Stimulering af ROS og Ca2+ produktion i MCF-7 celler af Sal, ledsaget af hæmning af PI3K signaltransduktion. Med involvering af mTOR blev phosphoryleringen af AKT yderligere reduceret efter administration af Sal. Følgelig blokerede den nedregulerede ekspression af HIF-1α og FoxO1 den periodiske maligne proliferation af MCF-7-celler. I mellemtiden foreslog den forbedrede apoptose af MCF-7-celler Sal's anti-brystkræftpotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gen | GenBank tiltrædelse nr. | Primer sekvens (5'-3') | Længde (bp) | |
| Caspase-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-actin | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, fremad; R, omvendt. | ||||
Tabel 1: Primere anvendt til den revers transkriptionskvantitative polymerasekædereaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brystkræft rammer personer i alle aldre og forårsager en uberegnelig fysisk og psykisk byrde og et stort økonomisk pres1. Brystkræft, med sin stigende sygelighed og dødelighed hvert år, har også tiltrukket verdensomspændende opmærksomhed med hensyn til at søge effektive urtebaserede sammensatte terapier ud over konventionelle behandlinger 4,5. Lovende har en stor mængde beviser afsløret anti-cancer virkningerne af Sal24,25,38. Desværre er Sal's rolle i brystkræft og de underliggende molekylære mekanismer stadig stort set ukendte. Denne undersøgelse fremhæver de signifikante hæmmende virkninger af Sal på spredning, migration og invasion af den humane brystkræft MCF-7-cellelinje. Derefter afslørede vi Sal's potentiale i irriterende apoptose og cyklusstop af MCF-7-celler. I mellemtiden viste disse data også, at Sal-administration øgede niveauerne af ROS og Ca2+. Yderligere udforskning af de molekylære mekanismer demonstrerede den apoptosefremmende virkning af Sal i brystkræftbehandling og effekten af Sal på PI3K-AKT-HIF-1a-Foxo1-vejen.
Ondartet og ukontrolleret spredning kan fremskynde udviklingen af brystkræft og øge risikoen for lymfatisk39 og hjernemetastaser40. I øjeblikket er tilgængelige kemoterapeutiske lægemidler på markedet gradvist dukket op, men disse har spørgsmålet om lav følsomhed til behandling af brystkræft, hvilket tvinger folk til at søge mere potente forbindelser eller nye lægemiddelkombinationer 2,3. Dataene i dette arbejde viste først, at Sal-behandling begrænsede den ondartede proliferation af MCF-7-celler. Efterfølgende celleridseassays bekræftede yderligere, at 12 timers og 24 timers Sal-inkubation reducerede konvergenshastigheden for MCF-7-celler. Test for tumorcellemigration og invasionsevne betragtes som følsomme indikatorer til screening af antitumorlægemidler24,25. Dataene i dette arbejde antydede, at Sal kraftigt reducerede processen med MCF-7-cellemigration og invasion i overensstemmelse med tidligere fund33,34. Den ukontrollerede cellecyklus af tumorceller bestemmer skæbnen for celle udødelighed24. Derfor er apoptosefremme og cellecyklusafbrydelse blevet anerkendte og accepterede indekser til evaluering af forbindelsers anticancerpotentiale25. I dette arbejde indikerede flowcytometrianalyse, at Sal-behandling signalt øgede apoptose i MCF-7-celler, hvilket fremgår af en øget andel af tidlige og sene apoptotiske celler. Desuden blev forholdet mellem G0 / G1-celler øget, og S-fasen af MCF-7-cellecyklussen blev forstyrret, hvilket indikerer Sal's cellecyklusblokerende virkninger på brystkræftceller.
Det milde hypoxiske brystkræftcellemikromiljø er forbundet med begrænsninger i ROS- og Ca2+ -produktion; således kan overdreven ROS og Ca2+ akkumulering fremkalde apoptotiske hændelser i brystkræftceller41. Immunofluorescensresultaterne i dette arbejde viste, at Sal-intervention i høj grad stimulerede ROS- ogCa2+ -produktion, hvilket yderligere kan inducere apoptose af MCF-7-celler. Nye beviser har afsløret, at forhøjede niveauer af de pro-apoptotiske proteiner Bax og Bim samt reducerede niveauer af det anti-apoptotiske protein Bcl-2 midlertidigt og med magt kan åbne passage af materiale ind og ud af mitokondriemembranen og dermed udløse programmeret apoptose af tumorceller42. I denne undersøgelse øgede co-inkubationen af Sal med MCF-7-celler signifikant Bax og Bim, samtidig med at protein- og genekspressionen af Bcl-2 faldt, hvilket tyder på dets potentielle farmakologiske virkninger på at fremme apoptose i brystkræftceller. Disse data antydede også, at Sal tydeligt inducerede ekspressionen af CC-9-, CC-7- og CC-3-proteiner, som er nøgleindikatorer nedstrøms indikatorer for mitokondrieapoptosevejen og deres tilsvarende gener. Ovenstående data tyder delvis på, at den proapoptotiske virkning af Sal på brystkræft kan være relateret til aktiveringen af mitokondriel apoptose.
Molekylære mekanismeundersøgelser har bekræftet, at phosphorylering af PI3K yderligere kan inducere AKT-phosphorylering og fremskynde væksten af brystkræftceller 6,7. I mellemtiden bidrager den store ophobning af mTOR også til forværringen af brystkræft ved at deltage i AKT-fosforyleringsprocessen 8,9. På den ene side stimulerer fosforyleret AKT direkte FoxO1-ekspression for at fremme brystkræftcellecyklussen og bremse apoptose22,23. Parallelt aktiverer aktiveret AKT indirekte HIF-1α-ekspression for at give FoxO1, hvilket resulterer i brystkræftprogression og metastase16,17. Derfor kan hæmning af aktiveringen af PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-vejen være en ny strategi for behandling af brystkræft. Med interventionen af PI3K-hæmmeren LY294002 viste dataene, at Sal observerbart undertrykte phosphoryleringen af PI3K. I forbindelse med nedreguleringen af mTOR-proteinekspression sænkede Sal også ekspressionsniveauerne af phosphoryleret AKT. Som følge heraf blev HIF-1α- og FoxO1-proteinekspression ligeledes stærkt reduceret efter Sal-behandling. Tilsvarende afslørede qRT-PCR-resultaterne konformt, at Sal-behandling i vid udstrækning mindskede genniveauerne af PI3K, AKT, HIF-1α og FoxO1, hvilket bidrog til fremme af cyklusstop og apoptose af MCF-7-celler (figur 8). Samlet set tyder de opnåede data på, at Sal kunne være en potentiel aktiv forbindelse af naturlig urteoprindelse med virkning mod brystkræft. Fremme af MCF-7-celleapoptose og cellecyklushæmning ved Sal-behandling svækkede i høj grad brystkræftcellernes migrations- og invasionsevne. Især kan den molekylære virkningsmekanisme af Sal mod brystkræft være relateret til hæmningen af PI3K-AKT-HIF-1a-Foxo1-vejen. Samlet set giver denne protokol, der integrerer flere eksperimentelle metoder, en vis referenceværdi for forskning og udvikling af lægemidler mod brystkræft.
I denne undersøgelse er der ingen direkte beviser for den molekylære mekanisme af Sal mod brystkræft. PI3K knockout-mus, brystkræftcellelinjer med høj eller lav ekspression af PI3K-proteinet og lokale overfladeplasmonresonansteknikker er de næste trin, der kan bruges til at bekræfte de direkte molekylære mål for Sal til forebyggelse og behandling af brystkræft29,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af sundhedskommissionen i Sichuan-provinsen (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
