Summary
Denne protokollen beskriver en omfattende strategi for evaluering av salidrosids farmakologiske virkning og mekanisme for å hemme MCF-7-celleproliferasjon og migrasjon.
Abstract
Salidroside (Sal) inneholder anti-kreftfremkallende, anti-hypoksiske og antiinflammatoriske farmakologiske aktiviteter. Imidlertid har de underliggende anti-brystkreftmekanismene bare blitt ufullstendig belyst. Derfor hadde denne protokollen til hensikt å dekode potensialet til Sal for å regulere PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen i den ondartede spredningen av humant brystkreft MCF-7-celler. For det første ble den farmakologiske aktiviteten til Sal mot MCF-7 evaluert ved CCK-8 og celleskrapeanalyser. Videre ble motstanden til MCF-7-celler målt ved migrasjon og Matrigel invasjonsanalyser. For celleapoptose og syklusanalyser ble MCF-7-celler behandlet i trinn med henholdsvis vedlegg V-FITC / PI og cellesyklusfargedeteksjonssett for flowcytometrianalyser. Nivåene av reaktive oksygenarter (ROS) og Ca2+ ble undersøkt ved DCFH-DA og Fluo-4 AM immunfluorescensfarging. Aktivitetene til Na+-K+-ATPase og Ca2+-ATPase ble bestemt ved bruk av tilsvarende kommersielle sett. Protein- og genuttrykksnivåene i apoptose og PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-banen ble videre bestemt ved hjelp av henholdsvis western blot- og qRT-PCR-analyser. Vi fant at Sal-behandling signifikant begrenset spredning, migrasjon og invasjon av MCF-7-celler med doseavhengige effekter. I mellomtiden tvang Sal-administrasjonen også dramatisk MCF-7-celler til å gjennomgå apoptose og cellesyklusarrest. Immunfluorescenstestene viste at Sal observerbart stimulerte ROS og Ca2+ produksjon i MCF-7-celler. Ytterligere data bekreftet at Sal fremmet ekspresjonsnivåene av pro-apoptotiske proteiner, Bax, Bim, spaltet caspase-9/7/3, og deres tilsvarende gener. Konsekvent reduserte Sal-intervensjon tydelig uttrykket av Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α og FoxO1-proteiner og deres tilsvarende gener. Avslutningsvis kan Sal brukes som en potensiell urt-avledet forbindelse for behandling av brystkreft, da det kan redusere ondartet spredning, migrasjon og invasjon av MCF-7-celler ved å hemme PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen.
Introduction
Som en av de vanligste kreftene og vanligste malignitetene, indikerer den siste statistikken at 2,3 millioner tilfeller av brystkreft dukket opp rundt om i verden innen 2020, og utgjorde 11,7% av alle krefttilfeller1. Vanlige symptomer på brystkreft inkluderer ømme og prikkende bryster, brystklumper og smerter, utslipp fra brystvorter, erosjon eller nedsunket hud og forstørrede aksillære lymfeknuter 1,2. Enda mer alarmerende, antall nye tilfeller og den totale forekomsten av brystkreft fortsetter å øke med en overveldende hastighet hvert år, og står for 6.9% av kreftrelaterte dødsfall1. For tiden involverer brystkreftintervensjon fortsatt hovedsakelig kjemoterapi, kirurgi, strålebehandling og omfattende behandling. Selv om behandling effektivt kan redusere tilbakefallsraten og dødeligheten hos pasienter, forårsaker langvarig behandlingsapplikasjon ofte multiresistens, stort hårtap, kvalme og oppkast og alvorlig psykisk og psykologisk belastning 2,3. Spesielt tvinger den potensielle risikoen for flere organmetastaser fra brystkreft også folk til å søke nye urtekilder til medisinering 4,5.
Fosfoinositid 3 kinase (PI3K)-mediert signalering er involvert i vekst, spredning og overlevelse av brystkreft gjennom spleising som påvirker uttrykket av flere gener6. Som et nedstrøms signalfølende protein av PI3K, tyder mange bevis på at proteinkinase B (AKT) kan koble seg sammen med pattedyrmålet for rapamycin (mTOR) protein for ytterligere å øke brystkreft 7,8,9. Videre har deaktivering av PI3K/AKT/mTOR-signalering også blitt hevdet å være en nøkkelkomponent i legemidler som hemmer ondartet spredning og stimulerer apoptose ved brystkreft10,11,12. Det er velkjent at ekstrem hypoksi i tumormikromiljøet tvinger en massiv økning i hypoksi-induserbar faktor 1 alfa (HIF-1α), noe som ytterligere forverrer utviklingen av brystkreft13,14,15. Parallelt fører AKT-stimulering også til overdreven akkumulering av HIF-1α, noe som begrenser apoptose i brystkreftprøver16,17. Interessant nok har aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering blitt bekreftet å være involvert i patologisk progresjon og metastase i en rekke kreftformer, inkludert lungekreft18, kolorektal kreft19, eggstokkreft20 og prostatakreft21. I tillegg til å være orkestrert av HIF-1α, utløses også overekspresjon av gaffelhodetranskripsjonsfaktor 1 (FoxO1) av AKT-signalstimulering, som fremmer syklusstans og hemming av apoptose i brystkreftceller22,23. Sammen antyder de ovennevnte solide bevisene at inhiberingen av kaskaden av PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signalering kan være et potensielt nytt mål for medisinering i brystkreft.
Salidroside (Sal) har vist seg å utøve anti-kreft 24,25, anti-hypoksi26,27,28,29, og immunforsterkende farmakologiske aktiviteter30. Det er et lysebrunt eller brunt pulver som er lett løselig i vann, er en type fenyletanoid glykosid, og har en kjemisk strukturformel på C14H20O7 og en molekylvekt på 300, 331, 32. Moderne farmakologiske undersøkelser har vist at Sal kan fremme apoptose av magekreftceller ved å begrense PI3K-AKT-mTOR-signalering24. Ytterligere bevis tyder også på at undertrykkelse av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering ved Sal-behandling kan bidra til apoptose av kreftceller ved å øke følsomheten for kjemoterapeutiske midler25. Bevis tyder også på at Sal begrenser cellemigrasjon og invasjon og forårsaker syklusarrest ved å fremme apoptose i den humane brystkreften MCF-7-celler33,34. Det gjenstår imidlertid å se om Sal kan regulere PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signalering og hemme den ondartede proliferasjonen av MCF-7-celler. Derfor hadde denne protokollen som mål å utforske effekten av Sal på MCF-7-cellemigrasjon, invasjon, cellesyklus og apoptose via PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen. De integrerte forskningsstrategiene som omfatter konvensjonelle, rimelige og uavhengige eksperimenter, for eksempel cellemigrasjon og invasjonsvurderinger, apoptose og cellesyklusdeteksjon ved flowcytometri, reaktive oksygenarter (ROS) og Ca2+ fluorescensbestemmelse, etc., kan gi en referanse for den overordnede utformingen av eksperimenter for anti-kreftforskning med tradisjonell urtemedisin. Den eksperimentelle prosessen i denne studien er vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MCF-7-cellene som ble brukt i denne studien ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialfortegnelsen).
1. Cellekultur
- Dyrkning av MCF-7-cellene i en fuktet 5 %CO2-atmosfære ved 37 °C med DMEM inneholdende 10 % FBS og 1 % penicillin (10 000 U/ml)/streptomycin (10 000 μg/ml) (se materialfortegnelsen).
MERK: Cellene som dekker 90% av bunnen av parabolen ble ansatt for eksperimentet og tildelt følgende grupper: kontrollgruppe, doksorubicinhydrokloridgruppe (DXR, 5 μM) og Sal-grupper (20 μM, 40 μM og 80 μM), eller kontrollgruppe, LY294002 (10 μM, en hemmer av PI3K) gruppe, Sal (80 μM) gruppe og LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) gruppe (se materialtabellen).
2. Celle levedyktighetsanalyse
MERK: For detaljer om denne prosedyren, se en tidligere rapport27.
- Frø MCF-7-celler med en tetthet på 8 x 104 celler / brønn i 96-brønnsplater, og inkuberer med Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM og 320 μM) i 24 timer eller Sal (20, 40, 80 μM) i 12 timer / 24 t / 36 t / 48 timer over natten til cellene er festet.
- Etter behandling, co-inkubere MCF-7-cellene med 10 μL / brønn av CCK-8-løsning (se materialtabellen) i 2 timer. Deretter måler du den optiske tettheten ved 450 nm (OD450) med en automatisk mikroplateleser.
3. Cellemigrasjon og invasjon
MERK: For detaljer om denne prosedyren, se en tidligere rapport35.
- Inkuber 2 ml av 5 x 10 6 celler / ml celler sådd i 6-brønnsplater for å dekke 90% av bunnen av fatet.
- Utfør et lineært ripesår langs midten av cellemonolaget med en steril pipettespiss. Ta bilder ved hjelp av et optisk mikroskop ved 0 timer, 24 timer og 48 timer.
- Bruk Image J-programvaren til å måle bredden på ripesårene.
- For transwellanalysen, suspender MCF-7-celler uten serummedium, og frø i det øvre transbrønnkammeret forhåndsbelagt med eller uten Matrigel (se materialfortegnelsen).
- I bunnen av transbrønnkammeret, bruk DMEM komplett medium som en kjemisk induktor. Etter 24 timer, fjern cellene i det øvre kammeret, og fikser de gjenværende invasive og innvandrercellene i metanol35.
- Beis MCF-7-cellene med krystallfiolett løsning (se materialfortegnelsen). Ta bildene med et optisk mikroskop.
4. Aktivitetsevaluering av Na+-K+-ATPase og Ca 2+-Mg2+-ATPase
- Bruk et bicinchoninsyre (BCA) -sett for å måle proteinkonsentrasjonen i lyserte MCF-7-celler, i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen).
- Legg til prøver av lyserte celler i deres tilsvarende grupper i 96-brønnplatene. Deretter tilsettes arbeidsløsningen for å inkubere ytterligere ved 37 °C i 5 minutter. Til slutt måler du verdiene til OD636 med en multifunksjonell mikroplateleser.
5. Flowcytometrianalyse av apoptose og cellesyklusen
MERK: For detaljer om denne prosedyren, se en tidligere rapport31.
- Fordøy cellene, og høst for å resuspendere i fosfatbufret saltvann (PBS) for en 20 min farging med anneksin V-FITC og propidiumjodid (PI) (se materialtabellen), og bestem deretter antall apoptotiske celler ved hjelp av et flowcytometer.
- Bland den resuspenderte prøveløsningen med PI-oppløsning i en 30 minutters inkubasjon, etterfulgt av deteksjon med et flowcytometer.
6. DCFH-DA og Fluo-4 AM fluorescensfarging
MERK: For detaljer om denne prosedyren, se en tidligere rapport29.
- Inkuber MCF-7-cellene i 20 minutter med en 10 μM DCFH-DA fluorescenssonde (se materialtabellen) ved 37 °C. Etter å ha fjernet overskuddet DCFH-DA grundig ved å vaske tre ganger med PBS, test fluorescensintensiteten ved eksitasjon og utslippsbølgelengder på henholdsvis 488 nm og 525 nm ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
- Inkuber MCF-7-cellene med en 5 μM Fluo-4 AM fluorescerende sondeløsning (se materialfortegnelsen) i 45 minutter ved 37 °C. Etter vask med PBS tre ganger, bestem fluorescensintensitetsverdiene ved eksitasjon og utslippsbølgelengder på henholdsvis 488 nm og 516 nm ved bruk av et fluorescensmikroskop.
7. Vestlig blott
- Tilsett 2 ml 5 x 10 6 celler/ml cellesuspensjoner inneholdende forskjellige legemidler i 6-brønnsplater, og dyrkning i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.
MERK: Gruppene for western blot-analysen ble satt som følger: kontrollgruppe, LY294002 (10 μM) gruppe, Sal (80 μM) gruppe og LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) gruppe (se materialtabellen). - Samle cellene og supernatanten, og sentrifuge ved 560 × g ved 4 °C i 3 minutter. Kast supernatanten og vask to ganger med forkjølt PBS. Etter hver vask, sentrifuger cellene ved 560 × g ved 4 °C i 3 minutter.
- Legg til 50 μL lysisbuffer til celleprøven fra trinn 7.2 for et 15 minutters isbad. Sentrifuge ved 8550 × g ved 4 °C i 10 minutter for å samle supernatantproteinprøven.
- Etter å ha påvist proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en BCA-metode, bland proteinprøven i trinn 7.3 med lastbuffer i forholdet 4: 1, denaturer ved 100 ° C i 10 minutter i et metallbad og avkjøl til romtemperatur.
- Tilsett 20 μg av proteinprøven fra trinn 7.4, separer proteinene med forskjellige molekylvekter35ved hjelp av 10% SDS-PAGE (se materialtabellen), og overfør deretter til 0,22 μm PVDF-membraner. Etter blokkering med 5 % BSA inkuberes membranene med tilsvarende primære antistoffer over natten ved 4 °C.
MERK: Den fortynnede konsentrasjonen av følgende primære antistoffer er 1:1000: spaltet caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 og β-aktin (se materialfortegnelsen). - Neste dag, inkuber membranene med geit anti-kanin IgG sekundært antistoff i 2 timer ved 37 ° C. Utvikle membranene ved hjelp av en ECL-kjemiluminescerende løsning, og ta bilder ved hjelp av et kontaktløst kvantitativt western blot-avbildningssystem (se materialfortegnelsen).
8. qRT-PCR
- Utfør sentrifugering for å samle MCF-7-celler ved 560 x g ved 4 °C i 3 minutter, og tilsett 500 μL buffer RL1 i 5 × 106 celler. Blås og blandes gjentatte ganger med en pipette til ingen cellemasser er synlige.
MERK: Buffer RL1 er en av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialtabellen). - Overfør cellehomogenatene i trinn 8.1 til DNA-rensekolonnen innebygd i oppsamlingsrøret, og sentrifuge ved 8 550 × g ved 4 °C i 2 minutter. Fjern DNA-rensekolonnen, og oppbevar supernatanten i oppsamlingsrøret.
MERK: DNA-rengjøringskolonnen og oppsamlingsrøret er to av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialfortegnelsen). - Tilsett 800 μL buffer RL2 til 500 μL av supernatanten fra trinn 8.2, og bland forsiktig.
MERK: Buffer RL2 er en av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialfortegnelsen). Tilsett 120 ml vannfri etanol til 60 ml buffer RL2 før bruk. - Overfør 700 μL av blandingen fra trinn 8,3 til RNA-kolonnen som er innebygd i oppsamlingsrøret, og sentrifuge ved 8 550 × g ved 4 °C i 1 min. Kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret.
MERK: Kolonnen med bare RNA er en av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialfortegnelsen). - Gjenta trinn 8.4 for å behandle den gjenværende blandingen fra trinn 8.3.
- Tilsett 500 μL buffer RW1 til RNA-kolonnen, og sentrifuge ved 8 550 × g ved 4 °C i 1 min. Kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret.
MERK: Buffer RW1 er en av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialfortegnelsen). - Tilsett 700 μL buffer RW2 til RNA-kolonnen, og sentrifuge ved 8,550 × g ved 4 ◦C i 1 min. Kast avfallsvæsken i oppsamlingsrøret. Gjenta trinn 8.7 én gang.
MERK: Buffer RW2 er en av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialtabellen). - Plasser kolonnen kun RNA tilbake i oppsamlingsrøret, og sentrifuge ved 8550 × g ved 4 °C i 2 minutter for å fjerne den gjenværende bufferen RW2.
- Overfør RNA-kolonnen til et nytt oppsamlingsrør, og drypp 100 μL RNase-fri ddH2O forvarmet ved 65 ° C inn i midten av membranen for RNA-kolonnen. Plasser ved 25 °C i 2 minutter, og samle RNA-løsningen ved sentrifugering ved 8 550 × g ved 4 °C i 1 min.
MERK: RNase-fri ddH2O er en av komponentene i det totale RNA-isolasjonssettet (se materialfortegnelsen). - Tilsett 4 μL 5x reaksjonsbuffer, 1 μL oligo (dT)18 primer, 1 μL tilfeldig heksameterprimer, 1 μL genspesifikk primer (se tabell 1), 1 μL enzymblanding og 5 μg RNA-oppløsning fra trinn 8,9 til en 100 μL 8-rørsstrimmel. Tilsett reaksjonssystemet med RNase-fritt vann til 20 μL.
- Still inn reaksjonsbetingelsene til systemet som følger: (1): 95 °C, 30 s, 1 syklus; (2): 95 °C, 5 s, 50 sykluser, 60 °C, 34 s; (3): 95 ° C, 5 s, 1 syklus, 65 ° C, 60 s, 97 ° C, 1 s; og (4): 42 °C, 30 s, 1 syklus. Utfør qRT-PCR-prosedyren.
MERK: De relative uttrykksnivåene av målgenene ble kvantitativt analysert ved 2-ΔΔCT-metoden 36,37. Primerinformasjonen for hvert gen som brukes til qRT-PCR-analysen er oppført i tabell 1.
9. Statistisk analyse
- Uttrykk dataene som gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
- Analyser sammenligningene mellom flere grupper ved hjelp av grafisk og analyseprogramvare (se materialfortegnelsen) med en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en Tukeys test. I dette arbeidet ble P < 0,05 definert som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av Sal på å hemme overflødig spredning og forsinke sårheling i MCF-7-celler
For å undersøke potensialet til Sal mot brystkreft, testet vi først dets kreftegenskaper ved hjelp av celleproliferasjonstoksisitet og ripeanalyser av den humane brystkreften MCF-7-cellelinjen. Disse cellene ble co-inkubert med en konsentrasjonsserie av Sal (5-320 μM) i 24 timer, og celleproliferasjonen ble evaluert ved hjelp av en CCK-8-analyse. En doseavhengig hemmende effekt av Sal på celleproliferasjon ble observert, med en 50 % reduksjon i cellevitalitet ved 40 μM (figur 2A). Salkonsentrasjoner på 20 μM, 40 μM og 80 μM ble deretter valgt for de påfølgende tidspunktene og evaluering av sårheling. Resultatene i figur 2B viser at Sal kunne hemme vitaliteten til MCF-7-celler over tid, med en 50% reduksjon i MCF-7-cellevitalitet etter 24 timer med co-inkubasjon. Figur 2C-R viser den hemmende effekten av Sal-behandling på sårheling av MCF-7-celler, målt ved sårripeanalysen. Ytterligere celleskrapetester bekreftet også at 24 timers kultur med Sal (20 μM, 40 μM og 80 μM) hindret sårhelingsprosessen kraftig (figur 2C,D).
Undertrykkelse av ondartet migrasjon og invasjon av MCF-7-celler av Sal
Migrasjonen av et stort antall tumorceller og tendensen til å invadere paracancervev er anerkjent som typiske trekk ved ondartede svulster. Effektene av Sal på migrasjon og invasjon av MCF-7-celler ble videre testet ved hjelp av et transbrønnsystem belagt med eller uten ekstracellulær matriksgel. Sal-behandling reduserte signifikant uønsket migrasjon (figur 3A-F) og invasjon (figur 3G-L) av MCF-7-celler. Som vist i figur 3A nøytraliserte behandling med Sal overraskende migrasjonen av MCF-7-celler. Nesten enstemmig ble den ondsinnede invasjonsprosessen av MCF-7-celler effektivt stengt etter inkubasjon med Sal (figur 3B). Ovennevnte data bekreftet fullt ut fordelene med Sal ved å hemme brystkreft.
Effekter av Sal for å fremme apoptose og forbedre syklusarrest i MCF-7-celler
Utødeliggjøring og periodisk reproduksjon av kreftceller gir muligheter for kreft å forverres og spre seg. Som en selvfølge har fremme av apoptose og syklusundertrykkelse også blitt aksepterte strategier for å forebygge kreft. Resultatene fra flowcytometri tydet på at Sal-behandling økte antallet MCF-7-celler i tidlig og sent apoptotisk stadium (figur 4A). I mellomtiden, sammenlignet med kontrollgruppen, økte Sal-behandlingen også kraftig antall celler i G0 / G1-fasen, samtidig som andelen S-faseceller ble redusert (figur 4B). Fremme av apoptose og syklusstans kan tjene som mulig farmakologisk virkning av Sal mot brystkreft.
Effekt av Sal på stimulering av intracellulær ROS og Ca2+ overproduksjon i MCF-7 celler
Den kontinuerlige stimuleringen av intracellulær ROS og Ca2+ produksjon kan effektivt hemme veksten av tumorceller. Figur 5A-E viser ROS-innholdet vurdert ved DCFH-DA immunfluorescensfarging. De kvantitative resultatene for ROS er vist i figur 5F. Fluo-4 AM immunfluorescensfarging ble brukt for å påvise Ca2+ konsentrasjonen (figur 5G-K). Figur 5L viser de kvantitative resultatene for Ca2+. DCFH-DA-resultatene viste at Sal signifikant forbedret ROS-fluorescenssignaler sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5A). Konsekvent forhøyet Sal-intervensjon også tydelig Ca2+ produksjon, dokumentert av det uthevede Fluo-4 AM-fluorescenssignalet (figur 5B). Disse resultatene indikerte samlet at ROS og Ca2+ signaler kan være delvis involvert i anti-brystkreftaktiviteten til Sal.
Effekt av Sal ved å indusere apoptose i mitokondrieveien til MCF-7-celler
Det er rikelig bevis på at apoptose indusert av mitokondriell dysfunksjon bestemmer den endelige skjebnen til mange tumorceller. Ved å bestemme om Sal medierer mitokondriell funksjonsregulering og apoptosefremmende effekter i MCF-7-celler, ble det først vist at Sal begrenset enzymvitalitetene til Na + -K + -ATPase (figur 6A) og Ca2 + -ATPase (figur 6B), og dermed indikerte dens potensielle rolle i å fremme mitokondriell dysfunksjon. Deretter viste vestlige blot- og qRT-PCR-data at Sal-behandling fremmet protein- og genuttrykket av de pro-apoptotiske faktorene CC-9 (figur 6C, D, G), CC-7 (figur 6C, E, H), CC-3 (figur 6C, F, I), Bim (figur 6C, J, M) og Bax (figur 6C, L, O), mens den hemmet protein- og genuttrykket av anti-apoptotisk Bcl-2 (figur 6C,K,N). Disse dataene viser delvis at mitokondriell dysfunksjon i MCF-7-celler kombinert med apoptose kan være involvert i virkningsmekanismen til Sal mot brystkreft.
Effekt av Sal på undertrykkelsen av PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen i MCF-7-celler
PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen, som en avgjørende signaltransduksjonsvei som regulerer tumorvekst, er involvert i patologisk progresjon og forverring av brystkreft. Western blot-resultatene viste at Sal-behandling tydelig begrenset forholdet mellom p-PI3K/PI3K (figur 7A,B) og p-AKT/AKT (figur 7A,C). I mellomtiden ble proteinuttrykket av mTOR (figur 7A, D), HIF-1α (figur 7A, E) og FoxO1 (figur 7A, F) også spesielt undertrykt ved Sal-behandling. Videre qRT-PCR-analyse viste også at Sal-administrasjon reduserte genuttrykksnivåene av PI3K (figur 7G), AKT (figur 7H), mTOR (figur 7I), HIF-1α (figur 7J) og FoxO1 (figur 7K). Avslutningsvis kan inhiberingen av aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-banen være en potensiell molekylær mekanisme for Sal mot brystkreft.
Figur 1 Skjematisk illustrasjon av Sals virkning mot brystkreftens MCF-7-cellelinje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MCF-7 celleproliferasjonstoksisitet og sårhelingsegenskaper av Sal. (A) og (B) viser dose-tidseffekter av Sal-behandling på MCF-7-celleaktivitet. (VG Nett) Hemmende effekt av Sal-behandling på sårtilheling i MCF-7-celler, som bestemt ved sårripeanalysen. Dataene ovenfor er illustrert som gjennomsnittet ± SD, n = 3. ##p < 0,01 kontra kontrollgruppen. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Undertrykkelse av malign migrasjon og invasjon av MCF-7-celler ved Sal-behandling. Sal-behandling reduserer signifikant uønsket (A-F) migrasjon og (G-L) invasjon av MCF-7-celler. Dataene ovenfor er illustrert som gjennomsnittet ± SD, n = 3. <#p < 0,05 og ##p < 0,01 kontra kontrollgruppen. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fremme av apoptose og undertrykkelse av cellesyklusen ved Sal. (A) apoptotisk promotering og (B) cellesyklusarresteffekter av Sal på MCF-7-celler, som detektert ved flowcytometri. Dataene ovenfor er illustrert som gjennomsnittet ± SD, n = 3. #p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bølge av ROS og Ca2+ i MCF-7-celler forårsaket av Sal-behandling. (A-E) ROS-innholdet ble vurdert ved DCFH-DA immunfluorescensfarging. (F) Kvantitative resultater for ROS. (VG Nett) Fluo-4 AM immunfluorescensfarging ble brukt for å oppdage Ca2+ -konsentrasjonen. (L) Kvantitative resultater for Ca2+. Dataene ovenfor er illustrert som gjennomsnittet ± SD, n = 3. #p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrollgruppen. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Effekt av Sal-behandling på indusering av mitokondriell dysfunksjon kombinert med apoptose i MCF-7-celler. De reduserte enzymaktivitetene til (A) Na+-K+-ATPase og (B) Ca2+-ATPase. (C) Representative proteinuttrykksbånd og deres tilsvarende statistiske resultater for (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 og (L) Bax-proteiner og for (G) caspase-9, (H) caspase-7, (I) caspase-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 og (O) Bax gener. Dataene ovenfor er illustrert som gjennomsnittet ± SD, n = 3. #p < 0,05 og ##p < 0,01 vs. kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Undertrykkelse av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-banen ved Sal-behandling . (A) Representative proteinbånd påvist ved western blot-analyse. Sal reduserte proteinuttrykket av (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α og (F) FoxO1. Sal dempet genuttrykksnivåer av (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α og (K) FoxO1. Dataene ovenfor er illustrert som gjennomsnittet ± SD, n = 3. # #p < 0,01 vs. kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Stimulering av ROS og Ca2+ produksjon i MCF-7 celler av Sal, ledsaget av inhibering av PI3K signaltransduksjon. Med involvering av mTOR ble fosforyleringen av AKT ytterligere redusert etter Sal-administrasjon. Følgelig blokkerte det nedregulerte uttrykket av HIF-1α og FoxO1 den periodiske ondartede proliferasjonen av MCF-7-celler. I mellomtiden antydet den forbedrede apoptosen av MCF-7-celler potensialet mot brystkreft til Sal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gen | GenBank tiltredelse nr. | Primer-sekvens (5'-3') | Lengde (bp) | |
| Caspase-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-aktin | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, fremover; R, omvendt. | ||||
Tabell 1: Primere brukt til revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brystkreft rammer personer i alle aldre og forårsaker uberegnelig fysisk og psykisk belastning og stort økonomisk press1. Brystkreft, med sin økende sykelighet og dødelighet hvert år, har også tiltrukket seg verdensomspennende oppmerksomhet når det gjelder å søke effektive urtebaserte sammensatte terapier utover konvensjonelle behandlinger 4,5. Lovende har en stor mengde bevis avslørt anti-kreft effekter av Sal24,25,38. Dessverre er Sals rolle i brystkreft og de underliggende molekylære mekanismene fortsatt stort sett ukjente. Denne studien fremhever de signifikante hemmende effektene av Sal på spredning, migrasjon og invasjon av den humane brystkreft MCF-7-cellelinjen. Deretter avslørte vi potensialet til Sal i irriterende apoptose og syklusarrest av MCF-7-celler. I mellomtiden viste disse dataene også at Sal-administrasjonen økte nivåene av ROS og Ca2+. Videre utforskning av molekylære mekanismer demonstrerte den apoptosefremmende virkningen av Sal i brystkreftbehandling og effekten av Sal på PI3K-AKT-HIF-1a-Foxo1-banen.
Ondartet og ukontrollert spredning kan akselerere utviklingen av brystkreft og øke risikoen for lymfatiske39 og hjernemetastaser40. For tiden har tilgjengelige kjemoterapeutiske legemidler på markedet gradvis dukket opp, men disse har spørsmålet om lav følsomhet for behandling av brystkreft, og tvinger dermed folk til å søke mer potente forbindelser eller nye legemiddelkombinasjoner 2,3. Dataene i dette arbeidet viste først at Sal-behandling begrenset den ondartede spredningen av MCF-7-celler. Påfølgende celleskrapeanalyser bekreftet videre at 12 timer og 24-timers Sal-inkubasjon reduserte konvergenshastigheten til MCF-7-celler. Tester for tumorcellemigrasjon og invasjonsevne betraktes som sensitive indikatorer for screening av antitumormedisiner24,25. Dataene i dette arbeidet antydet at Sal sterkt reduserte prosessen med MCF-7-cellemigrasjon og invasjon, i tråd med tidligere funn33,34. Den ukontrollerte cellesyklusen til tumorceller bestemmer skjebnen til celle udødelighet24. Derfor har apoptosefremmende og cellesyklusavbrudd blitt anerkjente og aksepterte indekser for evaluering av kreftpotensialet til forbindelser25. I dette arbeidet indikerte flowcytometrianalyse at Sal-behandling signaliserte økt apoptose i MCF-7-celler, noe som fremgår av en økt andel tidlige og sene apoptotiske celler. Videre ble forholdet mellom G0 / G1-celler økt, og S-fasen av MCF-7-cellesyklusen ble forstyrret, noe som indikerer cellesyklusblokkerende effekter av Sal på brystkreftceller.
Det milde hypoksiske brystkreftcellemikromiljøet er forbundet med begrensninger i ROS og Ca2+ produksjon; Dermed kan overdreven ROS og Ca2+ akkumulering indusere apoptotiske hendelser i brystkreftceller41. Immunfluorescensresultatene i dette arbeidet viste at Sal-intervensjon sterkt stimulerte ROS og Ca2+ produksjon, noe som ytterligere kan indusere apoptose av MCF-7-celler. Nye bevis har vist at forhøyede nivåer av de pro-apoptotiske proteinene Bax og Bim, samt reduserte nivåer av det anti-apoptotiske proteinet Bcl-2, midlertidig og med makt kan åpne passasjen av materiale inn og ut av mitokondriemembranen, og dermed utløse programmert apoptose av tumorceller42. I denne studien økte saminkubasjonen av Sal med MCF-7-celler Bax og Bim signifikant mens protein- og genuttrykket av Bcl-2 ble redusert, og antydet dermed dets potensielle farmakologiske effekter på å fremme apoptose i brystkreftceller. Disse dataene antydet også at Sal tydelig induserte uttrykket av CC-9-, CC-7- og CC-3-proteiner, som er viktige nedstrømsindikatorer for mitokondriell apoptosevei og deres tilsvarende gener. Ovennevnte data antyder delvis at den proapoptotiske effekten av Sal på brystkreft kan være relatert til aktivering av mitokondriell apoptose.
Molekylære mekanismestudier har bekreftet at fosforylering av PI3K ytterligere kan indusere AKT-fosforylering og akselerere veksten av brystkreftceller 6,7. I mellomtiden bidrar den store akkumuleringen av mTOR også til forverring av brystkreft ved å delta i AKT-fosforyleringsprosessen 8,9. På den ene siden stimulerer fosforylert AKT direkte FoxO1-uttrykk for å fremme brystkreftcellesyklusen og redusere apoptose22,23. Parallelt aktiverer aktivert AKT indirekte HIF-1α-uttrykk for å gi FoxO1, noe som resulterer i brystkreftprogresjon og metastase16,17. Følgelig kan inhiberingen av aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1a-Foxo1-banen være en ny strategi for brystkreftbehandling. Med intervensjonen av PI3K-hemmeren LY294002 viste dataene at Sal observerbart undertrykte fosforyleringen av PI3K. I forbindelse med nedreguleringen av mTOR-proteinuttrykk, senket Sal også ekspresjonsnivåene av fosforylert AKT. Som et resultat ble HIF-1α og FoxO1 proteinuttrykk også sterkt redusert etter Sal-behandling. På samme måte viste qRT-PCR-resultatene at Sal-behandling i stor grad reduserte gennivåene av PI3K, AKT, HIF-1α og FoxO1, noe som bidro til å fremme syklusarrest og apoptose av MCF-7-celler (figur 8). Samlet antyder de oppnådde dataene at Sal kan være en potensiell aktiv forbindelse av naturlig urteopprinnelse med virkning mot brystkreft. Fremme av MCF-7-celleapoptose og cellesyklushemming ved Sal-behandling svekket brystkreftcellenes migrasjons- og invasjonsevne sterkt. Spesielt kan den molekylære virkningsmekanismen til Sal mot brystkreft være relatert til inhiberingen av PI3K-AKT-HIF-1a-Foxo1-banen. Samlet sett gir denne protokollen som integrerer flere eksperimentelle metoder en viss referanseverdi for forskning og utvikling av anti-brystkreftmedisiner.
I denne studien er det ingen direkte bevis på den molekylære mekanismen til Sal mot brystkreft. PI3K knockoutmus, brystkreftcellelinjer med høyt eller lavt uttrykk av PI3K-proteinet og lokale overflateplasmonresonansteknikker er de neste trinnene som kan brukes til å bekrefte de direkte molekylære målene for Sal for forebygging og behandling av brystkreft29,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av helsekommisjonen i Sichuan-provinsen (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
