Summary
Het huidige protocol beschrijft een alomvattende strategie voor het evalueren van de farmacologische werking en het mechanisme van salidroside bij het remmen van de proliferatie en migratie van MCF-7-cellen.
Abstract
Salidroside (Sal) bevat anticarcinogene, antihypoxische en ontstekingsremmende farmacologische activiteiten. De onderliggende anti-borstkankermechanismen zijn echter slechts onvolledig opgehelderd. Vandaar dat dit protocol bedoeld was om het potentieel van Sal te decoderen bij het reguleren van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route in de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen van menselijke borstkanker. Ten eerste werd de farmacologische activiteit van Sal tegen MCF-7 geëvalueerd door middel van CCK-8- en celkrastesten. Bovendien werd de resistentie van MCF-7-cellen gemeten door middel van migratie- en Matrigel-invasietests. Voor celapoptose en cyclusassays werden MCF-7-cellen in stappen verwerkt met respectievelijk annexine V-FITC/PI en detectiekits voor celcycluskleuring voor flowcytometrieanalyses. De niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Ca2+ werden onderzocht door middel van DCFH-DA en Fluo-4 AM immunofluorescentiekleuring. De activiteiten van Na+-K+-ATPase en Ca2+-ATPase werden bepaald met behulp van de bijbehorende commerciële kits. De eiwit- en genexpressieniveaus in apoptose en de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route werden verder bepaald met behulp van respectievelijk western blot- en qRT-PCR-analyses. We ontdekten dat Sal-behandeling de proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen aanzienlijk beperkte, met dosisafhankelijke effecten. Ondertussen dwong de toediening van Sal MCF-7-cellen ook dramatisch om apoptose en celcyclusstilstand te ondergaan. De immunofluorescentietests toonden aan dat Sal de productie van ROS en Ca2+ in MCF-7-cellen waarneembaar stimuleerde. Verdere gegevens bevestigden dat Sal de expressieniveaus van pro-apoptotische eiwitten, Bax, Bim, gespleten caspase-9/7/3 en hun overeenkomstige genen bevorderde. Consequent verminderde Sal-interventie prominent de expressie van de Bcl-2-, p-PI3K/PI3K-, p-AKT/AKT-, mTOR-, HIF-1α- en FoxO1-eiwitten en hun overeenkomstige genen. Concluderend kan Sal worden gebruikt als een potentiële van kruiden afgeleide verbinding voor de behandeling van borstkanker, omdat het de kwaadaardige proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen kan verminderen door de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route te remmen.
Introduction
Als een van de meest gediagnosticeerde vormen van kanker en de meest voorkomende maligniteiten, geven de laatste statistieken aan dat er in 2020 wereldwijd 2,3 miljoen gevallen van borstkanker zijn ontstaan, goed voor 11,7% van alle gevallen vankanker1. Veel voorkomende symptomen van borstkanker zijn gevoelige en tintelingen in de borsten, knobbels en pijn in de borst, tepelafscheiding, erosie of ingevallen huid en vergrote oksellymfeklieren 1,2. Nog alarmerender is dat het aantal nieuwe gevallen en de totale incidentie van borstkanker elk jaar in een overweldigend tempo blijft toenemen, goed voor 6,9% van de kankergerelateerde sterfgevallen. Op dit moment bestaat de interventie bij borstkanker nog steeds voornamelijk uit chemotherapie, chirurgie, radiotherapie en uitgebreide behandeling. Hoewel behandeling het recidiefpercentage en het sterftecijfer van patiënten effectief kan verminderen, veroorzaakt langdurige behandeling vaak resistentie tegen meerdere geneesmiddelen, haaruitval op grote oppervlakken, misselijkheid en braken, en ernstige mentale en psychologische belasting 2,3. Met name het potentiële risico op meerdere orgaanmetastasen van borstkanker dwingt mensen ook om nieuwe kruidenbronnen van medicamenteuze therapie te zoeken 4,5.
Fosfoinositide 3-kinase (PI3K)-gemedieerde signalering is betrokken bij de groei, proliferatie en overleving van borstkanker door middel van splicing die de expressie van meerdere genen beïnvloedt6. Als een stroomafwaarts signaalgevoelig eiwit van PI3K, suggereert talrijk bewijs dat eiwitkinase B (AKT) zou kunnen paren met het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) -eiwit om borstkanker verder te verhogen 7,8,9. Bovendien wordt beweerd dat de deactivering van PI3K/AKT/mTOR-signalering ook een sleutelcomponent is in geneesmiddelen die kwaadaardige proliferatie remmen en apoptose stimuleren bij borstkanker10,11,12. Het is bekend dat extreme hypoxie in de micro-omgeving van de tumor een enorme toename van hypoxie-induceerbare factor 1-alfa (HIF-1α) veroorzaakt, wat de progressie van borstkanker verder verergert13,14,15. Tegelijkertijd leidt AKT-stimulatie ook tot overmatige accumulatie van HIF-1α, waardoor apoptose in borstkankermonsters wordt beperkt16,17. Interessant is dat is bevestigd dat de activering van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering betrokken is bij pathologische progressie en metastase bij verschillende vormen van kanker, waaronder longkanker18, colorectale kanker19, eierstokkanker20 en prostaatkanker21. Naast het feit dat het wordt georkestreerd door HIF-1α, wordt overexpressie van gevorkte hoofdtranscriptiefactor 1 (FoxO1) ook veroorzaakt door AKT-signaleringsstimulatie, die cyclusstilstand en remming van apoptose in borstkankercellen bevordert22,23. Samen suggereert het bovenstaande solide bewijs dat de remming van de cascade van PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering een potentieel nieuw doelwit kan zijn voor medicamenteuze behandeling bij borstkanker.
Van salidroside (Sal) is algemeen aangetoond dat het anti-kanker 24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 en immuunversterkende farmacologische activiteiten uitoefent 30. Het is een lichtbruin of bruin poeder dat gemakkelijk oplosbaar is in water, een soort fenylehanoïde glycoside is en een chemische structuurformule heeft van C14H 20 O7 en een molecuulgewicht van300,331,32. Modern farmacologisch onderzoek heeft aangetoond dat Sal de apoptose van maagkankercellen kan bevorderen door PI3K-AKT-mTOR-signalering te beperken24. Verder bewijs suggereert ook dat de onderdrukking van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering door Sal-behandeling kan bijdragen aan de apoptose van kankercellen door hun gevoeligheid voor chemotherapeutische middelen te vergroten25. Er zijn ook aanwijzingen dat Sal celmigratie en -invasie beperkt en cyclusstilstand veroorzaakt door apoptose te bevorderen in de MCF-7-cellen van borstkanker bij de mens33,34. Het valt echter nog te bezien of Sal de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan reguleren en de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen kan remmen. Daarom was dit protocol gericht op het onderzoeken van de effecten van Sal op MCF-7-celmigratie, invasie, celcyclus en apoptose via de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route. De geïntegreerde onderzoeksstrategieën die conventionele, goedkope en onafhankelijke experimenten omvatten, zoals celmigratie- en invasiebeoordelingen, apoptose en celcyclusdetectie door flowcytometrie, reactieve zuurstofspecies (ROS) en Ca2+ fluorescentiebepaling, enz., kunnen een referentie vormen voor het algemene ontwerp van experimenten voor antikankeronderzoek met traditionele kruidengeneeskunde. Het experimentele proces van deze studie is weergegeven in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De MCF-7-cellen die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron (zie de materiaaltabel).
1. Celkweek
- Kweek de MCF-7-cellen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C met DMEM dat 10% FBS en 1% penicilline (10.000 E/ml)/streptomycine (10.000 μg/ml) bevat (zie de materiaaltabel).
OPMERKING: De cellen die 90% van de bodem van de schaal bedekten, werden voor het experiment gebruikt en ingedeeld in de volgende groepen: controlegroep, doxorubicinehydrochloridegroep (DXR, 5 μM) en Sal-groepen (20 μM, 40 μM en 80 μM), of controlegroep, LY294002 (10 μM, een remmer van PI3K) groep, Sal (80 μM) groep en LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) groep (zie de Tabel met materialen).
2. Levensvatbaarheidstest van de cel
OPMERKING: Voor meer informatie over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport27.
- Zaad MCF-7-cellen met een dichtheid van 8 x 104 cellen/putje in platen met 96 putjes, en incubeer met Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM en 320 μM) gedurende 24 uur of Sal (20, 40, 80 μM) gedurende 12 uur/24 uur/36 uur/48 uur 's nachts totdat de cellen hechten.
- Co-incubeer na de behandeling de MCF-7-cellen met 10 μL/putje CCK-8-oplossing (zie de materiaaltabel) gedurende 2 uur. Meet vervolgens de optische dichtheid bij 450 nm (OD450) met een automatische microplaatlezer.
3. Celmigratie en invasie
OPMERKING: Voor details over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport35.
- Incubeer 2 ml van 5 x 10 cellen van 6 cellen/ml in platen met6 putjes om 90% van de bodem van de schaal te bedekken.
- Voer een lineaire kraswond uit langs het midden van de monolaag van de cel met een steriele pipetpunt. Maak beelden met een optische microscoop om 0 uur, 24 uur en 48 uur.
- Gebruik Image J-software om de breedte van de kraswonden te meten.
- Voor de transwell-test suspendeert u MCF-7-cellen zonder serummedium en zaad in de bovenste transwellkamer die vooraf is gecoat met of zonder Matrigel (zie de tabel met materialen).
- Gebruik op de bodem van de transwellkamer DMEM compleet medium als chemische inductor. Verwijder na 24 uur de cellen in de bovenste kamer en fixeer de resterende invasieve en migrerende cellen in methanol35.
- Kleur de MCF-7-cellen met een kristalviolette oplossing (zie de tabel met materialen). Leg de beelden vast met een optische microscoop.
4. Activiteitsevaluatie van Na+-K+-ATPase en Ca 2+-Mg2+-ATPase
- Gebruik een bicinchoninezuurkit (BCA) om de eiwitconcentratie in gelyseerde MCF-7-cellen te meten, volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel).
- Voeg monsters van de gelyseerde cellen in hun overeenkomstige groepen toe aan de platen met 96 putjes. Voeg daarna de werkoplossing toe om verder te incuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten. Meet ten slotte de waarden van OD636 met een multifunctionele microplaatlezer.
5. Flowcytometrie-analyse van apoptose en de celcyclus
OPMERKING: Voor details over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport31.
- Verbeter de cellen en oogst ze om te resuspenderen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een kleuring van 20 minuten met annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) (zie de materiaaltabel) en bepaal vervolgens het aantal apoptotische cellen met behulp van een flowcytometer.
- Meng de geresuspendeerde monsteroplossing met PI-oplossing gedurende een incubatie van 30 minuten, gevolgd door detectie met een flowcytometer.
6. DCFH-DA en Fluo-4 AM fluorescentiekleuring
OPMERKING: Voor details over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport29.
- Incubeer de MCF-7-cellen gedurende 20 minuten met een 10 μM DCFH-DA fluorescentiesonde (zie de materiaaltabel) bij 37 °C. Nadat u het overschot aan DCFH-DA grondig hebt verwijderd door drie keer te wassen met PBS, test u de fluorescentie-intensiteit bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 488 nm en 525 nm met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
- Incubeer de MCF-7-cellen met een 5 μM Fluo-4 AM fluorescerende sondeoplossing (zie de materiaaltabel) gedurende 45 minuten bij 37 °C. Bepaal na drie keer wassen met PBS de fluorescentie-intensiteitswaarden bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 488 nm en 516 nm met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
7. Westelijke vlek
- Voeg 2 ml van 5 x 10 6 cellen/ml celsuspensies met verschillende geneesmiddelen toe aan platen met6 putjes en kweek gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
OPMERKING: De groepen voor de western blot-analyse werden als volgt ingesteld: controlegroep, LY294002 (10 μM)-groep, Sal-groep (80 μM)-groep en LY294002-groep (10 μM) + Sal (80 μM) (zie de materiaaltabel). - Verzamel de cellen en het supernatant en centrifugeer bij 560 × g bij 4 °C gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg en was twee keer met voorgekoelde PBS. Centrifugeer de cellen na elke wasbeurt bij 560 × g bij 4 °C gedurende 3 min.
- Voeg 50 μL lysisbuffer toe aan het celmonster uit stap 7.2 voor een ijsbad van 15 minuten. Centrifugeer bij 8550 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten om het bovenstaande eiwitmonster te verzamelen.
- Na het detecteren van de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-methode, mengt u het eiwitmonster in stap 7.3 met de laadbuffer in een verhouding van 4:1, denatureert u gedurende 10 minuten bij 100 °C in een metaalbad en koelt u af tot kamertemperatuur.
- Voeg 20 μg van het eiwitmonster uit stap 7.4 toe, scheid de eiwitten met verschillende molecuulgewichten35met behulp van 10% SDS-PAGE (zie de tabel met materialen) en breng het vervolgens over naar PVDF-membranen van 0,22 μm. Na blokkade met 5% BSA de membranen met de bijbehorende primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C incuberen.
OPMERKING: De verdunde concentratie van de volgende primaire antilichamen is 1:1.000: gespleten caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 en β-actine (zie de materiaaltabel). - De volgende dag de membranen incuberen met secundair IgG-antilichaam van geiten tegen konijnen gedurende 2 uur bij 37 °C. Ontwikkel de membranen met behulp van een ECL-chemiluminescente oplossing en leg beelden vast met behulp van een contactloos kwantitatief western blot-beeldvormingssysteem (zie de materiaaltabel).
8. qRT-PCR
- Voer centrifugatie uit om MCF-7-cellen te verzamelen bij 560 x g bij 4 °C gedurende 3 minuten en voeg 500 μL buffer RL1 toe aan 5 × 106 cellen. Blaas en meng herhaaldelijk met een pipet totdat er geen celmassa's meer zichtbaar zijn.
OPMERKING: Buffer RL1 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). - Breng de in stap 8.1 bedoelde celhomogenaten over naar de DNA-reinigingskolom die in de verzamelbuis is ingebed en centrifugeer bij 8.550 × g bij 4 °C gedurende 2 min. Verwijder de DNA-reinigingskolom en bewaar het supernatans in de opvangbuis.
OPMERKING: De DNA-reinigingskolom en de verzamelbuis zijn twee van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). - Voeg 800 μL buffer RL2 toe aan 500 μL van het supernatans uit stap 8.2 en meng voorzichtig.
OPMERKING: Buffer RL2 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). Voeg voor gebruik 120 ml watervrije ethanol toe aan 60 ml buffer RL2. - Breng 700 μl van het mengsel uit stap 8.3 over in de kolom met alleen RNA die in de verzamelbuis is ingebed en centrifugeer bij 8.550 × g bij 4 °C gedurende 1 minuut. Gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.
OPMERKING: De kolom met alleen RNA is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de tabel met materialen). - Herhaal stap 8.4 om het resterende mengsel van stap 8.3 te verwerken.
- Voeg 500 μL buffer RW1 toe aan de kolom met alleen RNA en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.550 × g bij 4 °C. Gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.
OPMERKING: Buffer RW1 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). - Voeg 700 μL buffer RW2 toe aan de kolom met alleen RNA en centrifugeer bij 8.550 × g bij 4 ◦C gedurende 1 minuut. Gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis. Herhaal stap 8.7 eenmaal.
OPMERKING: Buffer RW2 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). - Plaats de RNA-kolom terug in de verzamelbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 8550 × g bij 4 °C om de resterende buffer RW2 te verwijderen.
- Breng de RNA-kolom over naar een nieuwe verzamelbuis en druppel 100 μL RNase-vrije ddH2O voorverwarmd bij 65 °C in het midden van het membraan voor de RNA-only kolom. Breng gedurende 2 minuten bij 25 °C en vang de RNA-oplossing op door centrifugatie bij 8.550 × g bij 4 °C gedurende 1 min.
OPMERKING: RNase-vrij ddH2O is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). - Voeg 4 μL 5x reactiebuffer, 1 μL oligo (dT)18 primer, 1 μL willekeurige hexameerprimer, 1 μL genspecifieke primer (zie tabel 1), 1 μL enzymmix en 5 μg van de RNA-oplossing uit stap 8.9 toe aan een strip van 100 μL met 8 buizen. Vul het reactiesysteem aan met RNasevrij water tot 20 μL.
- Stel de reactiecondities van het systeem als volgt in: (1): 95 °C, 30 s, 1 cyclus; (2): 95 °C, 5 s, 50 cycli, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 cyclus, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; en (4): 42 °C, 30 s, 1 cyclus. Voer de qRT-PCR-procedure uit.
OPMERKING: De relatieve expressieniveaus van de doelgenen werden kwantitatief geanalyseerd met behulp van de 2−ΔΔCT-methode 36,37. De primerinformatie van elk gen dat voor de qRT-PCR-analyse wordt gebruikt, staat vermeld in tabel 1.
9. Statistische analyse
- Druk de gegevens uit als het gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten.
- Analyseer de vergelijkingen tussen meerdere groepen met behulp van grafiek- en analysesoftware (zie de tabel met materialen) met een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door een Tukey's test. In dit werk werd P < 0,05 gedefinieerd als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effecten van Sal op het remmen van overmatige proliferatie en het vertragen van wondgenezing in MCF-7-cellen
Om het potentieel van Sal tegen borstkanker te onderzoeken, hebben we eerst de kankerbestrijdende eigenschappen getest met behulp van celproliferatietoxiciteit en krastesten van de MCF-7-cellijn van borstkanker bij mensen. Deze cellen werden gedurende 24 uur gecoördineerd met een concentratiereeks van Sal (5-320 μM) en de celproliferatie werd geëvalueerd met behulp van een CCK-8-test. Er werd een dosisafhankelijk remmend effect van Sal op de celproliferatie waargenomen, met een afname van 50% van de celvitaliteit bij 40 μM (Figuur 2A). Salconcentraties van 20 μM, 40 μM en 80 μM werden vervolgens geselecteerd voor de volgende tijdstippen en evaluatie van de wondgenezing. De resultaten in figuur 2B laten zien dat Sal de vitaliteit van MCF-7-cellen in de loop van de tijd zou kunnen remmen, met een afname van 50% in de vitaliteit van MCF-7-cellen na 24 uur co-incubatie. Figuur 2C-R toont het remmende effect van Sal-behandeling op de wondgenezing van MCF-7-cellen, zoals bepaald door de wondkrastest. Verdere celkrastests bevestigden ook dat 24 uur kweek met Sal (20 μM, 40 μM en 80 μM) het proces van wondgenezing sterk belemmerde (Figuur 2C,D).
Onderdrukking van kwaadaardige migratie en invasie van MCF-7-cellen door Sal
De migratie van grote aantallen tumorcellen en de neiging om parakankerweefsels binnen te dringen, worden erkend als typische kenmerken van kwaadaardige tumoren. De effecten van Sal op de migratie en invasie van MCF-7-cellen werden verder getest met behulp van een transwell-systeem gecoat met of zonder extracellulaire matrixgel. Sal-behandeling verminderde de ongewenste migratie (Figuur 3A-F) en invasie (Figuur 3G-L) van MCF-7-cellen aanzienlijk. Zoals te zien is in figuur 3A, neutraliseerde behandeling met Sal verrassend genoeg de migratie van MCF-7-cellen. Bijna unaniem werd het kwaadaardige invasieproces van MCF-7-cellen effectief stilgelegd na incubatie met Sal (Figuur 3B). De bovenstaande gegevens bevestigden volledig de voordelen van Sal bij het remmen van borstkanker.
Effecten van Sal bij het bevorderen van apoptose en het verbeteren van cyclusstilstand in MCF-7-cellen
De onsterfelijkheid en periodieke reproductie van kankercellen bieden mogelijkheden voor kanker om te verergeren en zich te verspreiden. Als vanzelfsprekend is de bevordering van apoptose en cyclusonderdrukking ook geaccepteerde strategieën geworden om kanker te voorkomen. De resultaten van flowcytometrie suggereerden dat Sal-behandeling het aantal MCF-7-cellen in de vroege en late apoptotische stadia verhoogde (Figuur 4A). Ondertussen verhoogde Sal-behandeling, in vergelijking met de controlegroep, ook het aantal cellen in de G0/G1-fase sterk, terwijl het aandeel cellen in de S-fase afnam (Figuur 4B). De bevordering van apoptose en cyclusstilstand kan dienen als de mogelijke farmacologische werking van Sal tegen borstkanker.
Effect van Sal op het stimuleren van intracellulaire ROS- enCa 2+ -overproductie in MCF-7-cellen
De continue stimulatie van intracellulaire ROS- enCa 2+-productie kan de groei van tumorcellen effectief remmen. Figuur 5A-E toont het ROS-gehalte beoordeeld door DCFH-DA immunofluorescentiekleuring. De kwantitatieve resultaten voor ROS zijn weergegeven in figuur 5F. Fluo-4 AM immunofluorescentiekleuring werd gebruikt om de Ca2+-concentratie te detecteren (Figuur 5G-K). Figuur 5L toont de kwantitatieve resultaten voor Ca2+. De DCFH-DA-resultaten toonden aan dat Sal de ROS-fluorescentiesignalen significant versterkte in vergelijking met de controlegroep (Figuur 5A). Consequent verhoogde Sal-interventie ook duidelijk de productie van Ca2+, wat blijkt uit het gemarkeerde Fluo-4 AM-fluorescentiesignaal (Figuur 5B). Deze resultaten gaven gezamenlijk aan dat ROS- enCa 2+-signalen gedeeltelijk betrokken kunnen zijn bij de anti-borstkankeractiviteit van Sal.
Effect van Sal bij het induceren van apoptose in de mitochondriale route van MCF-7-cellen
Er is overvloedig bewijs dat apoptose geïnduceerd door mitochondriale disfunctie het uiteindelijke lot van veel tumorcellen bepaalt. Bij het bepalen of Sal mitochondriale functieregulatie en apoptosebevorderende effecten in MCF-7-cellen medieert, werd eerst aangetoond dat Sal de enzymvitaliteit van Na+-K+-ATPase (Figuur 6A) en Ca2+-ATPase (Figuur 6B) beperkte, wat wijst op de mogelijke rol ervan bij het bevorderen van mitochondriale disfunctie. Vervolgens toonden western blot- en qRT-PCR-gegevens aan dat Sal-behandeling de eiwit- en genexpressie van de pro-apoptotische factoren CC-9 (Figuur 6C,D,G), CC-7 (Figuur 6C,E,H), CC-3 (Figuur 6C,F,I), Bim (Figuur 6C,J,M) en Bax (Figuur 6C,L,O) bevorderde, terwijl het de eiwit- en genexpressie van anti-apoptotische Bcl-2 remde (Figuur 6C,K,N). Deze gegevens tonen gedeeltelijk aan dat mitochondriale disfunctie in MCF-7-cellen in combinatie met apoptose betrokken kan zijn bij het werkingsmechanisme van Sal tegen borstkanker.
Effect van Sal op de onderdrukking van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route in MCF-7-cellen
De PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route, als een cruciale signaaltransductieroute die de tumorgroei reguleert, is betrokken bij de pathologische progressie en verslechtering van borstkanker. De resultaten van de western blot toonden aan dat Sal-behandeling de verhoudingen van p-PI3K/PI3K (Figuur 7A,B) en p-AKT/AKT (Figuur 7A,C) aanzienlijk beperkte. Ondertussen werd de eiwitexpressie van mTOR (Figuur 7A,D), HIF-1α (Figuur 7A,E) en FoxO1 (Figuur 7A,F) ook opmerkelijk onderdrukt door Sal-behandeling. Verdere qRT-PCR-analyse toonde ook aan dat toediening van Sal de genexpressieniveaus van PI3K (Figuur 7G), AKT (Figuur 7H), mTOR (Figuur 7I), HIF-1α (Figuur 7J) en FoxO1 (Figuur 7K) verlaagde. Concluderend kan de remming van de activering van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route een potentieel moleculair mechanisme van Sal tegen borstkanker zijn.
Figuur 1: Schematische weergave van de werking van Sal tegen de MCF-7 cellijn van borstkanker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: MCF-7 celproliferatie toxiciteit en wondgenezende eigenschappen van Sal. (A) en (B) tonen dosis-tijd effecten van Sal behandeling op MCF-7 celactiviteit. (C-R) Remmend effect van Sal-behandeling op wondgenezing in MCF-7-cellen, zoals bepaald door de wondkrastest. De bovenstaande gegevens worden geïllustreerd als het gemiddelde ± SD, n = 3. ##p < 0,01 vs. de controlegroep. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Onderdrukking van de kwaadaardige migratie en invasie van MCF-7-cellen door Sal-behandeling. Sal-behandeling vermindert de ongewenste (A-F) migratie en (G-L) invasie van MCF-7-cellen aanzienlijk. De bovenstaande gegevens worden geïllustreerd als het gemiddelde ± SD, n = 3. <#p < 0,05 en ##p < 0,01 vs. de controlegroep. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bevordering van apoptose en onderdrukking van de celcyclus door Sal. De (A) apoptotische promotie en (B) celcyclusstopeffecten van Sal op MCF-7-cellen, zoals gedetecteerd door flowcytometrie. De bovenstaande gegevens worden geïllustreerd als het gemiddelde ± SD, n = 3. #p < 0,05 en ##p < 0,01 vs. de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Piek van ROS en Ca2+ in MCF-7-cellen veroorzaakt door Sal-behandeling. (A-E) Het ROS-gehalte werd beoordeeld door middel van DCFH-DA immunofluorescentiekleuring. (F) Kwantitatieve resultaten voor ROS. (G-K) Fluo-4 AM immunofluorescentiekleuring werd gebruikt om de Ca2+ concentratie te detecteren. (L) Kwantitatieve resultaten voor Ca2+. De bovenstaande gegevens worden geïllustreerd als het gemiddelde ± SD, n = 3. #p < 0,05 en ##p < 0,01 vs. de controlegroep. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Effect van Sal-behandeling op het induceren van mitochondriale disfunctie in combinatie met apoptose in MCF-7-cellen. De verminderde enzymactiviteit van (A) Na+-K+-ATPase en (B) Ca2+-ATPase. (C) Representatieve eiwitexpressiebanden en de bijbehorende statistische resultaten voor (D) CC-9-, (E) CC-7-, (F) CC-3-, (J) Bim-, (K) Bcl-2- en (L) Bax-eiwitten en voor de (G) caspase-9-, (H) caspase-7-, (I) caspase-3-, (M) Bim-, (N) Bcl-2- en (O) Bax-genen. De bovenstaande gegevens worden geïllustreerd als het gemiddelde ± SD, n = 3. #p < 0,05 en ##p < 0,01 vs. de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Onderdrukking van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route door behandeling met Sal . (A) Representatieve eiwitbanden gedetecteerd door western blot-analyse. Sal verminderde de eiwitexpressie van (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α en (F) FoxO1. Sal verlaagde de genexpressieniveaus van (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α en (K) FoxO1. De bovenstaande gegevens worden geïllustreerd als het gemiddelde ± SD, n = 3. # #p < 0,01 vs. de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Stimulatie van ROS- en Ca2+- productie in MCF-7-cellen door Sal, vergezeld van de remming van PI3K-signaaltransductie. Met de betrokkenheid van mTOR werd de fosforylering van AKT verder verminderd na toediening van Sal. Bijgevolg blokkeerde de neerwaarts gereguleerde expressie van HIF-1α en FoxO1 de periodieke kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen. Ondertussen suggereerde de verbeterde apoptose van MCF-7-cellen het anti-borstkankerpotentieel van Sal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gen | GenBank toetreding nr. | Primer sequentie (5'-3') | Lengte (zp) | |
| Caspase-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-actine | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, vooruit; R, achteruit. | ||||
Tabel 1: Primers gebruikt voor de reverse transcriptie-kwantitatieve polymerasekettingreactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Borstkanker treft mensen van alle leeftijden en veroorzaakt een onberekenbare fysieke en mentale belasting en grote economische druk1. Borstkanker, met zijn toenemende morbiditeit en mortaliteit elk jaar, heeft ook wereldwijd de aandacht getrokken in termen van het zoeken naar effectieve op kruiden gebaseerde samengestelde therapieën die verder gaan dan conventionele behandelingen 4,5. Veelbelovend is dat een grote hoeveelheid bewijs de antikankereffecten van Sal24,25,38 heeft onthuld. Helaas zijn de rol van Sal bij borstkanker en de onderliggende moleculaire mechanismen nog grotendeels onbekend. Deze studie benadrukt de significante remmende effecten van Sal op de proliferatie, migratie en invasie van de MCF-7-cellijn van borstkanker bij de mens. Vervolgens onthulden we het potentieel van Sal bij irriterende apoptose en cyclusstilstand van MCF-7-cellen. Ondertussen toonden deze gegevens ook aan dat de toediening van Sal de niveaus van ROS en Ca2+ verhoogde. Verdere verkenning van de moleculaire mechanismen toonde de apoptosebevorderende werking van Sal bij de behandeling van borstkanker en het effect van Sal op de PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-route.
Kwaadaardige en ongecontroleerde proliferatie kan de ontwikkeling van borstkanker versnellen en het risico op lymfatische39 en hersenmetastasenverhogen 40. Momenteel zijn er geleidelijk aan beschikbare chemotherapeutische geneesmiddelen op de markt verschenen, maar deze hebben het probleem van een lage gevoeligheid voor de behandeling van borstkanker, waardoor mensen gedwongen worden om krachtigere verbindingen of nieuwe medicijncombinaties te zoeken 2,3. De gegevens in dit werk toonden voor het eerst aan dat Sal-behandeling de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen beperkte. Daaropvolgende celkrastesten bevestigden verder dat 12-uurs en 24-uurs Sal-incubatie de convergentiesnelheid van MCF-7-cellen verminderde. Tests voor de migratie van tumorcellen en het invasievermogen worden beschouwd als gevoelige indicatoren voor het screenen van antitumorgeneesmiddelen24,25. De gegevens in dit werk suggereerden dat Sal het proces van MCF-7-celmigratie en -invasie sterk verminderde, in overeenstemming met eerdere bevindingen33,34. De ongecontroleerde celcyclus van tumorcellen bepaalt het lot van celonsterfelijkheid24. Daarom zijn apoptosebevordering en onderbreking van de celcyclus erkende en geaccepteerde indices geworden voor het evalueren van het antikankerpotentieel van verbindingen25. In dit werk gaf flowcytometrie-analyse aan dat Sal-behandeling de apoptose in MCF-7-cellen aanzienlijk verhoogde, zoals blijkt uit een verhoogd aandeel vroege en late apoptotische cellen. Bovendien was de verhouding van G0/G1-cellen verhoogd en was de S-fase van de MCF-7-celcyclus verstoord, wat wijst op de celcyclusblokkerende effecten van Sal op borstkankercellen.
De milde hypoxische micro-omgeving van borstkankercellen wordt in verband gebracht met beperkingen in de productie van ROS en Ca2+ ; dus overmatige ROS- en Ca2+- accumulatie kan apoptotische gebeurtenissen in borstkankercellen induceren41. De immunofluorescentieresultaten in dit werk bewezen dat Sal-interventie de productie van ROS en Ca2+ sterk stimuleerde, wat de apoptose van MCF-7-cellen verder kan induceren. Opkomend bewijs heeft aangetoond dat verhoogde niveaus van de pro-apoptotische eiwitten Bax en Bim, evenals verlaagde niveaus van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2, de doorgang van materiaal in en uit het mitochondriale membraan tijdelijk en geforceerd kunnen openen, waardoor geprogrammeerde apoptose vantumorcellen wordt veroorzaakt. In deze studie verhoogde de co-incubatie van Sal met MCF-7-cellen Bax en Bim aanzienlijk, terwijl de eiwit- en genexpressie van Bcl-2 afnam, wat de mogelijke farmacologische effecten ervan op het bevorderen van apoptose in borstkankercellen suggereert. Deze gegevens suggereerden ook dat Sal duidelijk de expressie van CC-9-, CC-7- en CC-3-eiwitten induceerde, die belangrijke stroomafwaartse indicatoren zijn van de mitochondriale apoptoseroute, en hun overeenkomstige genen. De bovenstaande gegevens suggereren gedeeltelijk dat het proapoptotische effect van Sal op borstkanker verband kan houden met de activering van mitochondriale apoptose.
Moleculair mechanismestudies hebben bevestigd dat de fosforylering van PI3K de AKT-fosforylering verder kan induceren en de groei van borstkankercellen kan versnellen 6,7. In de tussentijd draagt de grote accumulatie van mTOR ook bij aan de verslechtering van borstkanker door deel te nemen aan het AKT-fosforyleringsproces 8,9. Aan de ene kant stimuleert gefosforyleerde AKT direct de expressie van FoxO1 om de borstkankercelcyclus te bevorderen en apoptose te vertragen22,23. Tegelijkertijd activeert geactiveerde AKT indirect HIF-1α-expressie om FoxO1 op te leveren, wat resulteert in progressie van borstkanker en metastase16,17. Bijgevolg kan de remming van de activering van de PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-route een nieuwe strategie zijn voor de behandeling van borstkanker. Met de tussenkomst van de PI3K-remmer LY294002 toonden de gegevens aan dat Sal de fosforylering van PI3K waarneembaar onderdrukte. In combinatie met de neerwaartse regulatie van de expressie van mTOR-eiwit, verlaagde Sal ook de expressieniveaus van gefosforyleerd AKT. Als gevolg hiervan was de expressie van HIF-1α- en FoxO1-eiwitten eveneens sterk verminderd na behandeling met Sal. Evenzo toonden de qRT-PCR-resultaten aan dat Sal-behandeling de genniveaus van PI3K, AKT, HIF-1α en FoxO1 aanzienlijk verminderde, wat bijdroeg aan de bevordering van cyclusstilstand en apoptose van MCF-7-cellen (Figuur 8). Gezamenlijk suggereren de verkregen gegevens dat Sal een potentiële actieve stof van natuurlijke plantaardige oorsprong zou kunnen zijn met een werking tegen borstkanker. De bevordering van MCF-7-celapoptose en remming van de celcyclus door Sal-behandeling verzwakte het migratie- en invasievermogen van borstkankercellen aanzienlijk. Met name het moleculaire werkingsmechanisme van Sal tegen borstkanker kan verband houden met de remming van de PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-route. Over het algemeen biedt dit protocol dat meerdere experimentele methoden integreert een zekere referentiewaarde voor het onderzoek en de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen borstkanker.
In deze studie is er geen direct bewijs van het moleculaire mechanisme van Sal tegen borstkanker. PI3K-knock-outmuizen, borstkankercellijnen met hoge of lage expressie van het PI3K-eiwit en lokale plasmonresonantietechnieken zijn de volgende stappen die kunnen worden gebruikt om de directe moleculaire doelen van Sal voor de preventie en behandeling van borstkanker te bevestigen29,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Gezondheidscommissie van de provincie Sichuan (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
