Summary
Il presente protocollo descrive una strategia completa per valutare l'azione farmacologica e il meccanismo del salidroside nell'inibire la proliferazione e la migrazione delle cellule MCF-7.
Abstract
Il salidroside (Sal) contiene attività farmacologiche anticancerogene, antiipossiche e antinfiammatorie. Tuttavia, i suoi meccanismi anti-cancro al seno sono stati chiariti solo in modo incompleto. Quindi, questo protocollo intendeva decodificare il potenziale di Sal nella regolazione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 nella proliferazione maligna delle cellule MCF-7 del carcinoma mammario umano. In primo luogo, l'attività farmacologica di Sal contro MCF-7 è stata valutata mediante CCK-8 e saggi di graffio cellulare. Inoltre, la resistenza delle cellule MCF-7 è stata misurata mediante saggi di migrazione e invasione di Matrigel. Per l'apoptosi cellulare e i saggi del ciclo, le cellule MCF-7 sono state processate in fasi con annessina V-FITC/PI e kit di rilevamento della colorazione del ciclo cellulare per le analisi di citometria a flusso, rispettivamente. I livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e Ca2+ sono stati esaminati mediante colorazione a immunofluorescenza DCFH-DA e Fluo-4 AM. Le attività di Na+-K+-ATPasi e Ca2+-ATPasi sono state determinate utilizzando i corrispondenti kit commerciali. I livelli di espressione proteica e genica nell'apoptosi e nella via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sono stati ulteriormente determinati utilizzando analisi western blot e qRT-PCR, rispettivamente. Abbiamo scoperto che il trattamento con Sal ha limitato significativamente la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 con effetti dose-dipendenti. Nel frattempo, la somministrazione di Sal ha anche drammaticamente costretto le cellule MCF-7 a subire l'apoptosi e l'arresto del ciclo cellulare. I test di immunofluorescenza hanno mostrato che Sal stimolava in modo osservabile la produzione di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7. Ulteriori dati hanno confermato che Sal ha promosso i livelli di espressione delle proteine pro-apoptotiche, Bax, Bim, caspasi scissa-9/7/3 e dei loro geni corrispondenti. Coerentemente, l'intervento di Sal ha ridotto in modo prominente l'espressione delle proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e dei loro geni corrispondenti. In conclusione, Sal può essere utilizzato come potenziale composto derivato da erbe per il trattamento del cancro al seno, in quanto può ridurre la proliferazione maligna, la migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 inibendo la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduction
Essendo uno dei tumori più comunemente diagnosticati e delle neoplasie maligne più comuni, le ultime statistiche indicano che 2,3 milioni di casi di cancro al seno sono emersi in tutto il mondo entro il 2020, pari all'11,7% di tutti i casi di cancro1. I sintomi comuni del cancro al seno includono tensione mammaria e formicolio, noduli e dolore al seno, secrezione dal capezzolo, erosione o pelle infossata e linfonodi ascellari ingrossati 1,2. Ancora più allarmante, il numero di nuovi casi e l'incidenza complessiva del cancro al seno continuano ad aumentare a un ritmo schiacciante ogni anno, rappresentando il 6,9%dei decessi correlati al cancro. Attualmente, l'intervento per il cancro al seno prevede ancora principalmente chemioterapia, chirurgia, radioterapia e trattamento completo. Sebbene il trattamento possa ridurre efficacemente il tasso di recidiva e il tasso di mortalità dei pazienti, l'applicazione del trattamento a lungo termine spesso causa resistenza multifarmaco, perdita di capelli su vasta area, nausea e vomito e grave carico mentale e psicologico 2,3. In particolare, il potenziale rischio di metastasi multiple d'organo da cancro al seno costringe anche le persone a cercare nuove fonti erboristiche di terapia farmacologica 4,5.
La segnalazione mediata dalla fosfoinositide 3 chinasi (PI3K) è implicata nella crescita, nella proliferazione e nella sopravvivenza del carcinoma mammario attraverso lo splicing che influenza l'espressione di più geni6. Come proteina di rilevamento del segnale a valle di PI3K, numerose evidenze suggeriscono che la proteina chinasi B (AKT) potrebbe accoppiarsi con il bersaglio dei mammiferi della proteina rapamicina (mTOR) per aumentare ulteriormente il cancro al seno 7,8,9. Inoltre, la disattivazione della segnalazione PI3K/AKT/mTOR è stata anche ritenuta una componente chiave nei farmaci che inibiscono la proliferazione maligna e stimolano l'apoptosi nel carcinoma mammario10,11,12. È ben noto che l'ipossia estrema nel microambiente tumorale costringe a un massiccio aumento del fattore 1 alfa inducibile dall'ipossia (HIF-1α), che peggiora ulteriormente la progressione del cancro al seno13,14,15. Parallelamente, la stimolazione AKT porta anche a un eccessivo accumulo di HIF-1α, limitando l'apoptosi nei campioni di cancro al seno16,17. È interessante notare che è stato confermato che l'attivazione della segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α è coinvolta nella progressione patologica e nelle metastasi in una varietà di tumori, tra cui il cancro del polmone18, il cancro del colon-retto19, il cancro ovarico20 e il cancro alla prostata21. Oltre ad essere orchestrata da HIF-1α, la sovraespressione del fattore di trascrizione della testa biforcuta 1 (FoxO1) è anche innescata dalla stimolazione della segnalazione AKT, che promuove l'arresto del ciclo e l'inibizione dell'apoptosi nelle cellule di cancro al seno22,23. Insieme, le solide evidenze di cui sopra suggeriscono che l'inibizione della cascata di segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 può essere un potenziale nuovo bersaglio per la terapia farmacologica nel carcinoma mammario.
È stato ampiamente dimostrato che il salidroside (Sal) esercita attività antitumorali24,25, anti-ipossia26,27,28,29 e immuno-potenzianti30. È una polvere marrone chiaro o marrone facilmente solubile in acqua, è un tipo di glicoside feniletanoide e ha una formula di struttura chimica di C14H 20 O7 e un peso molecolare di300.331,32. Moderne indagini farmacologiche hanno dimostrato che Sal può promuovere l'apoptosi delle cellule tumorali gastriche limitando la segnalazione PI3K-AKT-mTOR24. Ulteriori evidenze suggeriscono anche che la soppressione della segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α da parte del trattamento con Sal può contribuire all'apoptosi delle cellule tumorali aumentando la loro sensibilità agli agenti chemioterapici25. L'evidenza suggerisce anche che Sal limita la migrazione e l'invasione cellulare e provoca l'arresto del ciclo promuovendo l'apoptosi nelle cellule MCF-7 del cancro al seno umano33,34. Tuttavia, resta da vedere se Sal può regolare la segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inibire la proliferazione maligna delle cellule MCF-7. Pertanto, questo protocollo mirava a esplorare gli effetti di Sal sulla migrazione, l'invasione, il ciclo cellulare e l'apoptosi delle cellule MCF-7 attraverso la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Le strategie di ricerca integrate che comprendono esperimenti convenzionali, a basso costo e indipendenti, come le valutazioni della migrazione e dell'invasione cellulare, l'apoptosi e il rilevamento del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la determinazione della fluorescenza Ca2+, ecc., possono fornire un riferimento per la progettazione complessiva di esperimenti per la ricerca anti-cancro con la medicina erboristica tradizionale. Il processo sperimentale di questo studio è mostrato nella Figura 1.
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Protocol
Le cellule MCF-7 utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali).
1. Colture cellulari
- Coltura delle cellule MCF-7 in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C con DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina (10.000 U/mL)/streptomicina (10.000 μg/mL) (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Le cellule che coprono il 90% del fondo del piatto sono state impiegate per l'esperimento e assegnate ai seguenti gruppi: gruppo di controllo, gruppo cloridrato doxorubicina (DXR, 5 μM) e gruppi Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM), o gruppo di controllo, gruppo LY294002 (10 μM, un inibitore di PI3K), gruppo Sal (80 μM) e gruppo LY294002 (10 μM) + gruppo Sal (80 μM) (vedere la tabella dei materiali).
2. Saggio di vitalità cellulare
NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente27.
- Seminare cellule MCF-7 con una densità di 8 x 104 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e incubare con Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM e 320 μM) per 24 ore o Sal (20, 40, 80 μM) per 12 ore/24 ore/36 ore/48 ore durante la notte fino a quando le cellule non sono aderenti.
- Dopo il trattamento, co-incubare le cellule MCF-7 con 10 μL/pozzetto di soluzione CCK-8 (vedere la tabella dei materiali) per 2 ore. Quindi, misurare la densità ottica a 450 nm (OD450) con un lettore automatico per micropiastre.
3. Migrazione e invasione cellulare
NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente35.
- Incubare 2 mL di 5 x 106 cellule/mL di cellule seminate in piastre a 6 pozzetti per coprire il 90% del fondo della capanna.
- Eseguire una ferita lineare a graffio lungo il centro del monostrato cellulare con un puntale sterile per pipetta. Acquisire immagini utilizzando un microscopio ottico a 0 ore, 24 ore e 48 ore.
- Utilizzare il software Image J per misurare la larghezza delle ferite da graffio.
- Per il saggio del transwell, sospendere le cellule MCF-7 senza terreno sierico e seminare nella camera del transwell superiore pre-rivestita con o senza Matrigel (vedere la Tabella dei materiali).
- Nella parte inferiore della camera del pozzetto, utilizzare il terreno DMEM completo come induttore chimico. Dopo 24 ore, rimuovere le cellule nella camera superiore e fissare le restanti cellule invasive e migranti nel metanolo35.
- Colorare le cellule MCF-7 con una soluzione di cristallo violetto (vedere la tabella dei materiali). Cattura le immagini utilizzando un microscopio ottico.
4. Valutazione dell'attività di Na+-K+-ATPasi e Ca 2+-Mg2+-ATPasi
- Utilizzare un kit di acido bicinchoninico (BCA) per misurare la concentrazione proteica nelle cellule MCF-7 lisate, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Aggiungere i campioni delle cellule lisate nei gruppi corrispondenti nelle piastre a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere la soluzione di lavoro per incubare ulteriormente a 37 °C per 5 min. Infine, misurare i valori di OD636 con un lettore multifunzione per micropiastre.
5. Analisi citometrica a flusso dell'apoptosi e del ciclo cellulare
NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente31.
- Digerire le cellule e prelevare per risospenderle in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per una colorazione di 20 minuti con annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) (vedere la tabella dei materiali), quindi determinare il numero di cellule apoptotiche utilizzando un citometro a flusso.
- Miscelare la soluzione del campione risospeso con la soluzione PI per un'incubazione di 30 minuti, seguita dal rilevamento con un citometro a flusso.
6. Colorazione a fluorescenza DCFH-DA e Fluo-4 AM
NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente29.
- Incubare le cellule MCF-7 per 20 minuti con una sonda a fluorescenza DCFH-DA da 10 μM (vedere la tabella dei materiali) a 37 °C. Dopo aver rimosso accuratamente il DCFH-DA in eccesso lavando tre volte con PBS, testare l'intensità della fluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 488 nm e 525 nm, utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Incubare le cellule MCF-7 con una soluzione di sonda fluorescente Fluo-4 AM da 5 μM (vedere la tabella dei materiali) per 45 minuti a 37 °C. Dopo aver lavato con PBS tre volte, determinare i valori di intensità della fluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente di 488 nm e 516 nm utilizzando un microscopio a fluorescenza.
7. Macchia occidentale
- Aggiungere 2 mL di 5 x 10 sospensioni cellulari da 6 cellule/mL contenenti diversi farmaci in piastre a6 pozzetti e fermentare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
NOTA: I gruppi per l'analisi western blot sono stati impostati come segue: gruppo di controllo, gruppo LY294002 (10 μM), gruppo Sal (80 μM) e gruppo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (vedere la tabella dei materiali). - Raccogliere le cellule e il surnatante e centrifugare a 560 × g a 4 °C per 3 min. Scartare il surnatante e lavare due volte con PBS preraffreddato. Dopo ogni lavaggio, centrifugare le celle a 560 × g a 4 °C per 3 min.
- Aggiungere 50 μL di tampone di lisi al campione cellulare del passaggio 7.2 per un bagno di ghiaccio di 15 minuti. Centrifugare a 8550 × g a 4 °C per 10 minuti per raccogliere il campione di proteina surnatante.
- Dopo aver rilevato la concentrazione proteica con un metodo BCA, miscelare il campione proteico nella fase 7.3 con il tampone di carico in un rapporto di 4:1, denaturare a 100 °C per 10 minuti in un bagno di metallo e raffreddare a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 μg del campione proteico del passaggio 7.4, separare le proteine con diversi pesi molecolari35utilizzando SDS-PAGE al 10% (vedere la tabella dei materiali), quindi trasferire su membrane PVDF da 0,22 μm. Dopo il blocco con BSA al 5%, incubare le membrane con i corrispondenti anticorpi primari per una notte a 4 °C.
NOTA: La concentrazione diluita dei seguenti anticorpi primari è di 1:1.000: caspasi-9/7/3 scissa (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 e β-actina (vedere la tabella dei materiali). - Il giorno successivo, incubare le membrane con l'anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra per 2 ore a 37 °C. Sviluppare le membrane utilizzando una soluzione chemiluminescente ECL e acquisire immagini utilizzando un sistema di imaging western blot quantitativo senza contatto (vedere la tabella dei materiali).
8. PCR qRT
- Eseguire la centrifugazione per raccogliere le cellule MCF-7 a 560 x g a 4 °C per 3 minuti e aggiungere 500 μL di tampone RL1 in 5 × 106 cellule. Soffiare e mescolare ripetutamente con una pipetta fino a quando non sono visibili masse cellulari.
NOTA: Il tampone RL1 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). - Trasferire gli omogenati cellulari nella fase 8.1 nella colonna di pulizia del DNA incorporata nella provetta di raccolta e centrifugare a 8.550 × g a 4 °C per 2 minuti. Rimuovere la colonna di pulizia del DNA e conservare il surnatante nella provetta di raccolta.
NOTA: La colonna per la pulizia del DNA e la provetta di raccolta sono due dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). - Aggiungere 800 μL di tampone RL2 a 500 μL del surnatante del passaggio 8.2 e mescolare delicatamente.
NOTA: Il tampone RL2 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). Aggiungere 120 mL di etanolo anidro a 60 mL di tampone RL2 prima dell'uso. - Trasferire 700 μL della miscela dalla fase 8.3 nella colonna di solo RNA incorporata nella provetta di raccolta e centrifugare a 8.550 × g a 4 °C per 1 min. Gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
NOTA: La colonna di solo RNA è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). - Ripetere il passaggio 8.4 per lavorare la miscela rimanente dal passaggio 8.3.
- Aggiungere 500 μL di tampone RW1 alla colonna di solo RNA e centrifugare a 8.550 × g a 4 °C per 1 min. Gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
NOTA: Il tampone RW1 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). - Aggiungere 700 μL di tampone RW2 alla colonna di solo RNA e centrifugare a 8.550 × g a 4 ◦C per 1 min. Gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta. Ripetere il passaggio 8.7 una volta.
NOTA: Il tampone RW2 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). - Riposizionare la colonna di solo RNA nella provetta di raccolta e centrifugare a 8550 × g a 4 °C per 2 minuti per rimuovere il tampone RW2 rimanente.
- Trasferire la colonna di solo RNA in una nuova provetta di raccolta e far gocciolare 100 μL di ddH2O privo di RNasi preriscaldato a 65 °C al centro della membrana per la colonna di solo RNA. Porre a 25 °C per 2 minuti e raccogliere la soluzione di RNA per centrifugazione a 8.550 × g a 4 °C per 1 minuto.
NOTA: Il ddH2O privo di RNasi è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). - Aggiungere 4 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di primer oligo (dT)18 , 1 μL di primer per esamero casuale, 1 μL di primer gene-specifico (vedere Tabella 1), 1 μL di miscela enzimatica e 5 μg della soluzione di RNA del passaggio 8.9 in una striscia da 100 μL a 8 provette. Integrare il sistema di reazione con acqua priva di RNasi a 20 μL.
- Impostare le condizioni di reazione del sistema come segue: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 cicli, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; e (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Eseguire la procedura qRT-PCR.
NOTA: I livelli di espressione relativi dei geni bersaglio sono stati analizzati quantitativamente con il metodo 2−ΔΔCT 36,37. Le informazioni sul primer di ciascun gene utilizzato per l'analisi qRT-PCR sono elencate nella Tabella 1.
9. Analisi statistica
- Esprimere i dati come media ± deviazione standard di tre esperimenti indipendenti.
- Analizza i confronti tra più gruppi utilizzando un software di rappresentazione grafica e analisi (vedi la Tabella dei Materiali) con un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita da un test di Tukey. In questo lavoro, P < 0,05 è stato definito come statisticamente significativo.
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Representative Results
Effetti del Sal sull'inibizione dell'eccesso di proliferazione e sul ritardo della guarigione delle ferite nelle cellule MCF-7
Per sondare il potenziale di Sal contro il cancro al seno, abbiamo prima testato le sue proprietà antitumorali utilizzando la tossicità della proliferazione cellulare e i saggi di graffio della linea cellulare MCF-7 del cancro al seno umano. Queste cellule sono state co-incubate con una serie di concentrazioni di Sal (5-320 μM) per 24 ore e la proliferazione cellulare è stata valutata utilizzando un saggio CCK-8. È stato osservato un effetto inibitorio dose-dipendente di Sal sulla proliferazione cellulare, con un calo del 50% della vitalità cellulare a 40 μM (Figura 2A). Le concentrazioni di Sal di 20 μM, 40 μM e 80 μM sono state quindi selezionate per i successivi punti temporali e la valutazione della guarigione della ferita. I risultati nella Figura 2B mostrano che Sal potrebbe inibire la vitalità delle cellule MCF-7 nel tempo, con una diminuzione del 50% della vitalità delle cellule MCF-7 dopo 24 ore di co-incubazione. La Figura 2C-R mostra l'effetto inibitorio del trattamento con Sal sulla guarigione delle cellule MCF-7, come determinato dal test del graffio della ferita. Ulteriori test di scratch cellulare hanno anche confermato che 24 ore di coltura con Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM) hanno fortemente ostacolato il processo di guarigione della ferita (Figura 2C,D).
Soppressione della migrazione maligna e dell'invasione delle cellule MCF-7 da parte di Sal
La migrazione di un gran numero di cellule tumorali e la tendenza ad invadere i tessuti paratumorali sono riconosciute come caratteristiche tipiche dei tumori maligni. Gli effetti di Sal sulla migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 sono stati ulteriormente testati utilizzando un sistema transwell rivestito con o senza gel di matrice extracellulare. Il trattamento con Sal ha ridotto significativamente la migrazione indesiderata (Figura 3A-F) e l'invasione (Figura 3G-L) delle cellule MCF-7. Come mostrato nella Figura 3A, il trattamento con Sal ha sorprendentemente neutralizzato la migrazione delle cellule MCF-7. Quasi all'unanimità, il processo di invasione dannosa delle cellule MCF-7 è stato effettivamente interrotto dopo l'incubazione con Sal (Figura 3B). I dati di cui sopra hanno pienamente confermato i vantaggi di Sal nell'inibire il cancro al seno.
Effetti di Sal nel promuovere l'apoptosi e migliorare l'arresto del ciclo nelle cellule MCF-7
L'immortalizzazione e la riproduzione periodica delle cellule tumorali offrono opportunità al cancro di peggiorare e diffondersi. Naturalmente, anche la promozione dell'apoptosi e della soppressione del ciclo è diventata una strategia accettata per la prevenzione del cancro. I risultati della citometria a flusso hanno suggerito che il trattamento con Sal ha aumentato il numero di cellule MCF-7 nelle fasi apoptotiche precoci e tardive (Figura 4A). Nel frattempo, rispetto al gruppo di controllo, il trattamento con Sal ha anche aumentato notevolmente il numero di cellule nella fase G0/G1, riducendo al contempo la proporzione di cellule della fase S (Figura 4B). La promozione dell'apoptosi e dell'arresto del ciclo può servire come possibile azione farmacologica di Sal contro il cancro al seno.
Effetto di Sal sulla stimolazione della sovrapproduzione intracellulare di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7
La stimolazione continua della produzione intracellulare di ROS e Ca2+ può inibire efficacemente la crescita delle cellule tumorali. La Figura 5A-E mostra il contenuto di ROS valutato mediante colorazione in immunofluorescenza DCFH-DA. I risultati quantitativi per i ROS sono mostrati nella Figura 5F. La colorazione a immunofluorescenza Fluo-4 AM è stata impiegata per rilevare la concentrazione di Ca2+ (Figura 5G-K). La Figura 5L mostra i risultati quantitativi per Ca2+. I risultati del DCFH-DA hanno mostrato che Sal ha migliorato significativamente i segnali di fluorescenza ROS rispetto al gruppo di controllo (Figura 5A). Coerentemente, l'intervento di Sal ha anche aumentato distintamente la produzione di Ca2+, evidenziato dal segnale di fluorescenza Fluo-4 AM evidenziato (Figura 5B). Questi risultati hanno indicato collettivamente che i segnali ROS e Ca2+ potrebbero essere in parte coinvolti nell'attività anti-cancro al seno di Sal.
Effetto di Sal nell'indurre l'apoptosi nella via mitocondriale delle cellule MCF-7
Ci sono abbondanti prove che l'apoptosi indotta dalla disfunzione mitocondriale determina il destino finale di molte cellule tumorali. Nel determinare se Sal media la regolazione della funzione mitocondriale e gli effetti di promozione dell'apoptosi nelle cellule MCF-7, è stato dimostrato per la prima volta che Sal limita la vitalità enzimatica di Na+-K+-ATPasi (Figura 6A) e Ca2+-ATPasi (Figura 6B), indicando così il suo potenziale ruolo nel promuovere la disfunzione mitocondriale. Successivamente, i dati di western blot e qRT-PCR hanno mostrato che il trattamento con Sal ha promosso l'espressione proteica e genica dei fattori pro-apoptotici CC-9 (Figura 6C, D, G), CC-7 (Figura 6C, E, H), CC-3 (Figura 6C, F, I), Bim (Figura 6C, J, M) e Bax (Figura 6C, L, O), mentre ha inibito l'espressione proteica e genica dell'anti-apoptotico Bcl-2 (Figura 6C,K,N). Questi dati dimostrano parzialmente che la disfunzione mitocondriale nelle cellule MCF-7 accoppiata all'apoptosi può essere coinvolta nel meccanismo d'azione di Sal contro il cancro al seno.
Effetto di Sal sulla soppressione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 nelle cellule MCF-7
La via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1, in quanto via di trasduzione del segnale cruciale che regola la crescita del tumore, è coinvolta nella progressione patologica e nel deterioramento del carcinoma mammario. I risultati del western blot hanno mostrato che il trattamento con Sal ha limitato in modo evidente i rapporti di p-PI3K/PI3K (Figura 7A,B) e p-AKT/AKT (Figura 7A,C). Nel frattempo, anche l'espressione proteica di mTOR (Figura 7A,D), HIF-1α (Figura 7A,E) e FoxO1 (Figura 7A,F) è stata notevolmente soppressa dal trattamento con Sal. Un'ulteriore analisi qRT-PCR ha anche dimostrato che la somministrazione di Sal ha ridotto i livelli di espressione genica di PI3K (Figura 7G), AKT (Figura 7H), mTOR (Figura 7I), HIF-1α (Figura 7J) e FoxO1 (Figura 7K). In conclusione, l'inibizione dell'attivazione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 può essere un potenziale meccanismo molecolare di Sal contro il carcinoma mammario.
Figura 1: Illustrazione schematica dell'azione di Sal contro la linea cellulare MCF-7 del cancro al seno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Tossicità della proliferazione cellulare MCF-7 e proprietà di guarigione delle ferite di Sal. (A) e (B) mostrano gli effetti dose-tempo del trattamento con Sal sull'attività cellulare MCF-7. (C-R) Effetto inibitorio del trattamento con Sal sulla guarigione della ferita nelle cellule MCF-7, come determinato dal test del graffio della ferita. I dati di cui sopra sono illustrati come media ± DS, n = 3. ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Barre graduate: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Soppressione della migrazione maligna e dell'invasione delle cellule MCF-7 mediante trattamento con Sal. Il trattamento con Sal riduce significativamente la migrazione indesiderata (A-F) e l'invasione (G-L) delle cellule MCF-7. I dati di cui sopra sono illustrati come media ± DS, n = 3. <#p < 0,05 e ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Barre graduate: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Promozione dell'apoptosi e soppressione del ciclo cellulare da parte di Sal. Gli effetti (A) della promozione apoptotica e (B) dell'arresto del ciclo cellulare di Sal sulle cellule MCF-7, come rilevato dalla citometria a flusso. I dati di cui sopra sono illustrati come media ± DS, n = 3. #p < 0,05 e ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Aumento di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7 causato dal trattamento con Sal. (A-E) Il contenuto di ROS è stato valutato mediante colorazione in immunofluorescenza DCFH-DA. (F) Risultati quantitativi per i ROS. (G-K) La colorazione a immunofluorescenza Fluo-4 AM è stata impiegata per rilevare la concentrazione di Ca2+. (L) Risultati quantitativi per Ca2+. I dati di cui sopra sono illustrati come media ± DS, n = 3. #p < 0,05 e ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Barre graduate: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Effetto del trattamento con Sal sull'induzione della disfunzione mitocondriale associata all'apoptosi nelle cellule MCF-7. Le attività enzimatiche ridotte di (A) Na+-K+-ATPasi e (B) Ca2+-ATPasi. (C) Bande rappresentative di espressione proteica e i corrispondenti risultati statistici per (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 e (L) proteine Bax e per i geni (G) caspasi-9, (H) caspasi-7, (I) caspasi-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 e (O) Bax. I dati di cui sopra sono illustrati come media ± DS, n = 3. #p < 0,05 e ##p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Soppressione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 mediante trattamento con Sal . (A) Bande proteiche rappresentative rilevate mediante analisi western blot. Sal ha ridotto l'espressione proteica di (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α e (F) FoxO1. Sal ha attenuato i livelli di espressione genica di (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α e (K) FoxO1. I dati di cui sopra sono illustrati come media ± DS, n = 3. # #p < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Stimolazione della produzione di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7 da parte di Sal, accompagnata dall'inibizione della trasduzione del segnale PI3K. Con il coinvolgimento di mTOR, la fosforilazione di AKT è stata ulteriormente ridotta dopo la somministrazione di Sal. Di conseguenza, l'espressione sottoregolata di HIF-1α e FoxO1 ha bloccato la proliferazione maligna periodica delle cellule MCF-7. Nel frattempo, l'aumento dell'apoptosi delle cellule MCF-7 ha suggerito il potenziale anti-cancro al seno di Sal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gene | Adesione GenBank n. | Sequenza primer (5'-3') | Lunghezza (bp) | |
| Caspasi-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspasi-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Acl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-actina | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, in avanti; R, retromarcia. | ||||
Tabella 1: Primer utilizzati per la reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa.
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Discussion
Il cancro al seno colpisce individui di tutte le età e provoca un carico fisico e mentale incalcolabile e una grande pressione economica1. Il cancro al seno, con la sua morbilità e mortalità che aumentano ogni anno, ha anche attirato l'attenzione mondiale in termini di ricerca di terapie composte efficaci a base di erbe al di là dei trattamenti convenzionali 4,5. Promettentemente, un ampio corpo di prove ha rivelato gli effetti antitumorali di Sal24,25,38. Sfortunatamente, il ruolo di Sal nel cancro al seno e i meccanismi molecolari sottostanti rimangono ancora in gran parte sconosciuti. Questo studio evidenzia i significativi effetti inibitori di Sal sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione della linea cellulare MCF-7 del cancro al seno umano. Successivamente, abbiamo rivelato il potenziale di Sal nell'irritante apoptosi e nell'arresto del ciclo delle cellule MCF-7. Nel frattempo, questi dati hanno anche mostrato che la somministrazione di Sal ha aumentato i livelli di ROS e Ca2+. Un'ulteriore esplorazione dei meccanismi molecolari ha dimostrato l'azione di promozione dell'apoptosi di Sal nel trattamento del carcinoma mammario e l'effetto di Sal sulla via PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1.
La proliferazione maligna e incontrollata può accelerare lo sviluppo del cancro al seno e aumentare il rischio di metastasi linfatiche39 e cerebrali40. Attualmente, i farmaci chemioterapici disponibili sul mercato sono gradualmente apparsi, ma questi hanno il problema della bassa sensibilità per il trattamento del cancro al seno, costringendo così le persone a cercare composti più potenti o nuove combinazioni di farmaci 2,3. I dati di questo lavoro hanno dimostrato in primo luogo che il trattamento con Sal ha limitato la proliferazione maligna delle cellule MCF-7. I successivi saggi di scratch cellulare hanno ulteriormente confermato che l'incubazione di Sal di 12 ore e 24 ore ha ridotto il tasso di convergenza delle cellule MCF-7. I test per la capacità di migrazione e invasione delle cellule tumorali sono considerati indicatori sensibili per lo screening dei farmaci antitumorali24,25. I dati di questo lavoro hanno suggerito che Sal ha fortemente ridotto il processo di migrazione e invasione delle cellule MCF-7, in linea con i risultati precedenti33,34. Il ciclo cellulare incontrollato delle cellule tumorali determina il destino dell'immortalità cellulare24. Pertanto, la promozione dell'apoptosi e l'interruzione del ciclo cellulare sono diventati indici riconosciuti e accettati per la valutazione del potenziale antitumorale dei composti25. In questo lavoro, l'analisi della citometria a flusso ha indicato che il trattamento con Sal ha aumentato l'apoptosi nelle cellule MCF-7, come evidenziato da una maggiore proporzione di cellule apoptotiche precoci e tardive. Inoltre, il rapporto tra cellule G0 / G1 è aumentato e la fase S del ciclo cellulare MCF-7 è stata disturbata, indicando gli effetti di blocco del ciclo cellulare di Sal sulle cellule del cancro al seno.
Il microambiente delle cellule di carcinoma mammario ipossico lieve è associato a limitazioni nella produzione di ROS e Ca2+ ; pertanto, un eccessivo accumulo di ROS e Ca2+ può indurre eventi apoptotici nelle cellule di carcinoma mammario41. I risultati dell'immunofluorescenza in questo lavoro hanno dimostrato che l'intervento di Sal ha stimolato notevolmente la produzione di ROS e Ca2+ , che può indurre ulteriormente l'apoptosi delle cellule MCF-7. Evidenze emergenti hanno rivelato che livelli elevati delle proteine pro-apoptotiche Bax e Bim, così come livelli ridotti della proteina anti-apoptotica Bcl-2, possono aprire temporaneamente e forzatamente il passaggio di materiale dentro e fuori la membrana mitocondriale, innescando così l'apoptosi programmata delle cellule tumorali42. In questo studio, la co-incubazione di Sal con le cellule MCF-7 ha aumentato significativamente Bax e Bim diminuendo l'espressione proteica e genica di Bcl-2, suggerendo così i suoi potenziali effetti farmacologici sulla promozione dell'apoptosi nelle cellule di cancro al seno. Questi dati hanno anche suggerito che Sal induce distintamente l'espressione delle proteine CC-9, CC-7 e CC-3, che sono indicatori chiave a valle della via dell'apoptosi mitocondriale, e dei loro geni corrispondenti. I dati di cui sopra suggeriscono in parte che l'effetto proapoptotico di Sal sul cancro al seno potrebbe essere correlato all'attivazione dell'apoptosi mitocondriale.
Studi sui meccanismi molecolari hanno confermato che la fosforilazione di PI3K può indurre ulteriormente la fosforilazione di AKT e accelerare la crescita delle cellule di cancro al seno 6,7. Nel frattempo, il grande accumulo di mTOR contribuisce anche al deterioramento del cancro al seno partecipando al processo di fosforilazione di AKT 8,9. Da un lato, l'AKT fosforilato stimola direttamente l'espressione di FoxO1 per promuovere il ciclo cellulare del cancro al seno e rallentare l'apoptosi22,23. Parallelamente, l'AKT attivato attiva indirettamente l'espressione di HIF-1α per produrre FoxO1, con conseguente progressione del cancro al seno e metastasi16,17. Di conseguenza, l'inibizione dell'attivazione della via PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 può essere una nuova strategia per il trattamento del cancro al seno. Con l'intervento dell'inibitore di PI3K LY294002, i dati hanno dimostrato che Sal ha soppresso in modo osservabile la fosforilazione di PI3K. In concomitanza con la sottoregolazione dell'espressione della proteina mTOR, Sal ha anche abbassato i livelli di espressione di AKT fosforilato. Di conseguenza, anche l'espressione delle proteine HIF-1α e FoxO1 è risultata notevolmente diminuita dopo il trattamento con Sal. Allo stesso modo, i risultati della qRT-PCR hanno rivelato in modo conforme che il trattamento con Sal ha ridotto ampiamente i livelli genici di PI3K, AKT, HIF-1α e FoxO1, contribuendo alla promozione dell'arresto del ciclo e dell'apoptosi delle cellule MCF-7 (Figura 8). Collettivamente, i dati ottenuti suggeriscono che il Sal potrebbe essere un potenziale composto attivo di origine naturale a base di erbe con azione contro il cancro al seno. La promozione dell'apoptosi cellulare MCF-7 e dell'inibizione del ciclo cellulare mediante trattamento con Sal ha notevolmente indebolito la capacità di migrazione e invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, il meccanismo molecolare d'azione di Sal contro il carcinoma mammario può essere correlato all'inibizione della via PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1. Nel complesso, questo protocollo che integra più metodi sperimentali fornisce un certo valore di riferimento per la ricerca e lo sviluppo di farmaci anti-cancro al seno.
In questo studio, non ci sono prove dirette del meccanismo molecolare di Sal contro il cancro al seno. Topi knockout per PI3K, linee cellulari di carcinoma mammario con alta o bassa espressione della proteina PI3K e tecniche di risonanza plasmonica di superficie locale sono i prossimi passi che potrebbero essere utilizzati per confermare i bersagli molecolari diretti di Sal per la prevenzione e il trattamento del cancro al seno29,31.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione sanitaria della provincia di Sichuan (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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