Summary
O presente protocolo descreve uma estratégia abrangente para avaliar a ação farmacológica e o mecanismo do salidrosídeo na inibição da proliferação e migração de células MCF-7.
Abstract
Salidrosídeo (Sal) contém atividades farmacológicas anticarcinogênicas, anti-hipóxicas e anti-inflamatórias. No entanto, seus mecanismos subjacentes contra o câncer de mama foram apenas incompletamente elucidados. Assim, este protocolo pretendeu decodificar o potencial do Sal na regulação da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 na proliferação maligna de células MCF-7 de câncer de mama humano. Primeiramente, a atividade farmacológica do Sal contra MCF-7 foi avaliada por CCK-8 e ensaios de arranhão celular. Além disso, a resistência das células MCF-7 foi medida por ensaios de migração e invasão de Matrigel. Para ensaios de apoptose celular e ciclo, as células MCF-7 foram processadas em etapas com anexina V-FITC/PI e kits de detecção de ciclo celular para análises por citometria de fluxo, respectivamente. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e Ca2+ foram examinados pelas colorações de imunofluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM. As atividades da Na+-K+-ATPase e da Ca2+-ATPase foram determinadas utilizando os kits comerciais correspondentes. Os níveis de expressão gênica e proteica na apoptose e na via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 foram posteriormente determinados usando análises de western blot e qRT-PCR, respectivamente. Descobrimos que o tratamento com Sal restringiu significativamente a proliferação, migração e invasão de células MCF-7 com efeitos dose-dependentes. Enquanto isso, a administração do Sal também forçou dramaticamente as células MCF-7 a sofrer apoptose e parada do ciclo celular. Os testes de imunofluorescência mostraram que o Sal estimulou observavelmente a produção de ROS e Ca2+ em células MCF-7. Dados adicionais confirmaram que Sal promoveu os níveis de expressão de proteínas pró-apoptóticas, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivada e seus genes correspondentes. Consistentemente, a intervenção com Sal reduziu proeminentemente a expressão das proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e seus genes correspondentes. Em conclusão, o Sal pode ser usado como um potencial composto derivado de ervas para o tratamento do câncer de mama, pois pode reduzir a proliferação, migração e invasão malignas de células MCF-7 inibindo a via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduction
Como um dos cânceres mais comumente diagnosticados e malignidades mais comuns, as estatísticas mais recentes indicam que 2,3 milhões de casos de câncer de mama surgiram em todo o mundo até 2020, representando 11,7% de todos os casos de câncer1. Os sintomas comuns do câncer de mama incluem sensibilidade mamária e formigamento, nódulos e dor mamária, secreção mamilar, erosão ou pele afundada e linfonodos axilares aumentados 1,2. Ainda mais alarmante, o número de novos casos e a incidência geral de câncer de mama continuam a aumentar a uma taxa avassaladora a cada ano, sendo responsáveis por 6,9% das mortes relacionadas ao câncer1. Atualmente, a intervenção contra o câncer de mama ainda envolve principalmente quimioterapia, cirurgia, radioterapia e tratamento abrangente. Embora o tratamento possa efetivamente reduzir a taxa de recorrência e a taxa de mortalidade dos pacientes, a aplicação do tratamento em longo prazo frequentemente produz resistência a múltiplas drogas, queda de cabelo em grandes áreas, náuseas e vômitos e grave sobrecarga mental e psicológica 2,3. Notavelmente, o risco potencial de metástases de múltiplos órgãos do câncer de mama também força as pessoas a procurar novas fontes fitoterápicas de terapia medicamentosa 4,5.
A sinalização mediada pela fosfoinositida 3 quinase (PI3K) está implicada no crescimento, proliferação e sobrevida do câncer de mama por meio de splicing que afeta a expressão de múltiplos genes6. Como uma proteína sensível ao sinal a jusante da PI3K, numerosas evidências sugerem que a proteína quinase B (AKT) poderia acoplar-se ao alvo mamífero da proteína rapamicina (mTOR) para aumentar ainda mais o câncer de mama 7,8,9. Além disso, a desativação da sinalização PI3K/AKT/mTOR também tem sido reivindicada como um componente-chave em drogas que inibem a proliferação maligna e estimulam a apoptose no câncer de mama10,11,12. Sabe-se que a hipóxia extrema no microambiente tumoral força um aumento maciço do fator 1 alfa induzível por hipóxia (HIF-1α), o que piora ainda mais a progressão do câncer de mama13,14,15. Paralelamente, a estimulação com AKT também leva ao acúmulo excessivo de HIF-1α, limitando a apoptose em amostras de câncer de mama16,17. Curiosamente, a ativação da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α foi confirmada como envolvida na progressão patológica e metástase em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de pulmão18, câncer colorretal19, câncer de ovário20 e câncer de próstata21. Além de ser orquestrada pelo HIF-1α, a superexpressão do fator de transcrição cabeça bifurcada 1 (FoxO1) também é desencadeada pela estimulação da sinalização AKT, que promove a parada do ciclo e a inibição da apoptose em células do câncer de mama22,23. Juntas, as evidências sólidas acima sugerem que a inibição da cascata da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pode ser um novo alvo potencial para a terapia medicamentosa no câncer de mama.
O salidrosídeo (Sal) tem demonstrado amplamente exercer atividades farmacológicas antineoplásicas 24,25, anti-hipóxia26,27,28,29 e imunoestimulantes 30. É um pó marrom claro ou marrom que é facilmente solúvel em água, é um tipo de glicosídeo feniletanóide, e tem uma fórmula de estrutura química de C14H 20 O7 e um peso molecular de300,331,32. Investigações farmacológicas modernas têm demonstrado que o Sal pode promover a apoptose de células do câncer gástrico restringindo a sinalização PI3K-AKT-mTOR24. Outras evidências também sugerem que a supressão da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α pelo tratamento com Sal pode contribuir para a apoptose de células cancerosas, aumentando sua sensibilidade a agentes quimioterápicos25. Evidências também sugerem que o Sal restringe a migração e invasão celular e causa a parada do ciclo por promover apoptose nas células MCF-7 do câncer de mama humano33,34. No entanto, resta saber se o Sal pode regular a sinalização PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inibir a proliferação maligna de células MCF-7. Portanto, este protocolo teve como objetivo explorar os efeitos do Sal na migração, invasão, ciclo celular e apoptose de células MCF-7 via via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. As estratégias de pesquisa integradas que incluem experimentos convencionais, de baixo custo e independentes, como avaliações de migração e invasão celular, apoptose e detecção do ciclo celular por citometria de fluxo, determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e fluorescência de Ca2+, etc., podem fornecer uma referência para o planejamento geral de experimentos para pesquisa anticâncer com a medicina fitoterápica tradicional. O processo experimental deste estudo é mostrado na Figura 1.
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Protocol
As células MCF-7 utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Cultura celular
- Cultivar as células MCF-7 em atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C com DMEM contendo FBS a 10% e penicilina a 1% (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As células que cobrem 90% do fundo da placa foram empregadas para o experimento e divididas nos seguintes grupos: grupo controle, grupo cloridrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) e grupo Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM), ou grupo controle, grupo LY294002 (10 μM, um inibidor da PI3K), grupo Sal (80 μM) e grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver Tabela de Materiais).
2. Ensaio de viabilidade celular
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior27.
- Semear células MCF-7 com densidade de 8 x 104 células/poço em placas de 96 poços e incubar com Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM e 320 μM) por 24 h ou Sal (20, 40, 80 μM) por 12 h/24 h/36 h/48 h durante a noite até que as células estejam aderentes.
- Após o tratamento, co-incubar as células MCF-7 com 10 μL/poço de solução de CCK-8 (ver Tabela de Materiais) por 2 h. Em seguida, meça a densidade óptica a 450 nm (OD450) com um leitor automático de microplacas.
3. Migração e invasão celular
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior35.
- Incubar 2 mL de células de 5 x 10 6 células/mL semeadas em placas de6 poços para cobrir 90% do fundo da placa.
- Execute uma ferida de arranhão linear ao longo do centro da monocamada celular com uma ponta de pipeta estéril. Adquirir imagens em microscópio óptico às 0 h, 24 h e 48 h.
- Use o software Image J para medir a largura das feridas de arranhões.
- Para o ensaio de transwell, suspender as células MCF-7 sem meio de soro e semear na câmara de transwell superior pré-revestida com ou sem Matrigel (ver Tabela de Materiais).
- No fundo da câmara de transwell, use meio completo DMEM como indutor químico. Após 24 h, remover as células da câmara superior e fixar as células invasoras e migrantes remanescentes em metanol35.
- Manchar as células MCF-7 com solução de cristal violeta (ver Tabela de Materiais). Capture as imagens usando um microscópio óptico.
4. Avaliação da atividade da Na+-K+-ATPase e Ca 2+-Mg2+-ATPase
- Use um kit de ácido bicinconínico (BCA) para medir a concentração de proteína em células MCF-7 lisadas, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Adicione amostras das células lisadas em seus grupos correspondentes nas placas de 96 poços. Depois disso, adicione a solução de trabalho para incubar ainda mais a 37 °C durante 5 min. Finalmente, meça os valores de OD636 com um leitor de microplacas multifuncional.
5. Análise por citometria de fluxo da apoptose e do ciclo celular
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior31.
- Digerir as células e colher para ressuspender em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por uma coloração de 20 minutos com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, determinar o número de células apoptóticas usando um citômetro de fluxo.
- Misturar a solução da amostra ressuspensa com a solução de PI durante uma incubação de 30 minutos, seguida da detecção com um citómetro de fluxo.
6. Coloração por fluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM
NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior29.
- Incubar as células MCF-7 durante 20 minutos com uma sonda de fluorescência de 10 μM DCFH-DA (ver Tabela de Materiais) a 37 °C. Depois de remover completamente o excesso de DCFH-DA lavando três vezes com PBS, teste a intensidade da fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 525 nm, respectivamente, usando um microscópio de fluorescência.
- Incubar as células MCF-7 com uma solução de sonda fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (ver Tabela de Materiais) durante 45 minutos a 37 °C. Após a lavagem com PBS três vezes, determinar os valores de intensidade de fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 516 nm, respectivamente, usando um microscópio de fluorescência.
7. Mancha ocidental
- Adicionar 2 mL de suspensões de células 5 x 106 células/mL contendo diferentes fármacos em placas de 6 poços e cultura em estufa a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
NOTA: Os grupos para a análise de western blot foram definidos da seguinte forma: grupo controle, grupo LY294002 (10 μM), grupo Sal (80 μM) e grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver Tabela de Materiais). - Recolher as células e o sobrenadante e centrifugar a 560 × g a 4 °C durante 3 min. Descarte o sobrenadante e lave duas vezes com PBS pré-resfriado. Após cada lavagem, centrifugar as células a 560 × g a 4 °C durante 3 min.
- Adicionar 50 μL de tampão de lise à amostra celular do passo 7.2 para um banho de gelo de 15 minutos. Centrifugar a 8550 × g a 4 °C durante 10 min para recolher a amostra de proteína sobrenadante.
- Depois de detectar a concentração de proteínas usando um método BCA, misturar a amostra de proteína na etapa 7.3 com tampão de carga na proporção de 4:1, desnaturar a 100 °C por 10 min em banho de metal e resfriar até a temperatura ambiente.
- Adicionar 20 μg da amostra de proteínas do passo 7.4, separar as proteínas com diferentes pesos moleculares35usando 10% SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, transferir para membranas de PVDF de 0,22 μm. Após o bloqueio com BSA a 5%, incubar as membranas com os anticorpos primários correspondentes durante a noite a 4 °C.
NOTA: A concentração diluída dos seguintes anticorpos primários é de 1:1.000: caspase-9/7/3 clivada (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 e β-actina (ver Tabela de Materiais). - No dia seguinte, incubar as membranas com anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho por 2 h a 37 °C. Desenvolva as membranas usando uma solução quimioluminescente ECL e capture imagens usando um sistema de imagem western blot quantitativo sem contato (consulte a Tabela de Materiais).
8. qRT-PCR
- Realizar centrifugação para coletar células MCF-7 a 560 x g a 4 °C por 3 min e adicionar 500 μL de tampão RL1 em 5 × 106 células. Sopre e misture repetidamente com uma pipeta até que nenhuma massa celular seja visível.
NOTA: O tampão RL1 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). - Transferir os homogeneizados celulares na etapa 8.1 para a coluna de limpeza de DNA embutida no tubo de coleta e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 2 min. Remova a coluna de limpeza de DNA e mantenha o sobrenadante no tubo de coleta.
NOTA: A coluna de limpeza de ADN e o tubo de recolha são dois dos componentes do kit de isolamento de ARN total (ver Tabela de Materiais). - Adicionar 800 μL de tampão RL2 a 500 μL do sobrenadante do passo 8.2 e misturar delicadamente.
NOTA: O tampão RL2 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar 120 mL de etanol anidro a 60 mL de tampão RL2 antes de usar. - Transferir 700 μL da mistura do passo 8.3 para a coluna somente de RNA embutida no tubo de coleta e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta.
NOTA: A coluna somente de RNA é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). - Repetir o passo 8.4 para processar a mistura restante do passo 8.3.
- Adicionar 500 μL de tampão RW1 à coluna somente de RNA e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta.
NOTA: O buffer RW1 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). - Adicionar 700 μL de tampão RW2 à coluna somente de RNA e centrifugar a 8.550 × g a 4 ◦C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta. Repita a etapa 8.7 uma vez.
NOTA: O tampão RW2 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). - Coloque a coluna somente de RNA de volta no tubo de coleta e centrifugar a 8550 × g a 4 °C por 2 min para remover o tampão RW2 restante.
- Transfira a coluna somente de RNA para um novo tubo de coleta e goteje 100 μL de ddH2O livre de RNase pré-aquecido a 65 °C no centro da membrana para a coluna somente de RNA. Colocar a 25 °C durante 2 min e recolher a solução de ARN por centrifugação a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min.
NOTA: DDH2O livre de RNase é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). - Adicionar 4 μL de tampão de reacção 5x, 1 μL de primer oligo (dT)18 , 1 μL de primer hexâmero aleatório, 1 μL de primer gene-específico (ver Tabela 1), 1 μL de mistura enzimática e 5 μg da solução de ARN do passo 8.9 numa tira de 8 tubos de 100 μL. Completar o sistema de reação com água livre de RNase a 20 μL.
- Definir as condições de reação do sistema da seguinte forma: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 ciclos, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; e (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Execute o procedimento qRT-PCR.
NOTA: Os níveis de expressão relativa dos genes-alvo foram analisados quantitativamente pelo método 2−ΔΔCT 36,37. As informações dos primers de cada gene utilizado para a análise do qRT-PCR estão listadas na Tabela 1.
9. Análise estatística
- Expresse os dados como média ± desvio padrão de três experimentos independentes.
- Analise as comparações entre múltiplos grupos usando gráficos e softwares de análise (veja a Tabela de Materiais) com uma análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida de um teste de Tukey. Neste trabalho, P < 0,05 foi definido como estatisticamente significante.
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Representative Results
Efeitos do Sal na inibição do excesso de proliferação e retardo da cicatrização de feridas em células MCF-7
Para sondar o potencial do Sal contra o câncer de mama, primeiro testamos suas propriedades anticancerígenas usando ensaios de toxicidade de proliferação celular e arranhões da linhagem celular MCF-7 do câncer de mama humano. Essas células foram co-incubadas com uma série de concentração de Sal (5-320 μM) por 24 h, e a proliferação celular foi avaliada usando um ensaio CCK-8. Observou-se efeito inibitório dose-dependente do Sal sobre a proliferação celular, com declínio de 50% na vitalidade celular a 40 μM (Figura 2A). Concentrações de sal de 20 μM, 40 μM e 80 μM foram então selecionadas para os momentos subsequentes e avaliação da cicatrização das feridas. Os resultados da Figura 2B mostram que o Sal pode inibir a vitalidade das células MCF-7 ao longo do tempo, com uma diminuição de 50% na vitalidade das células MCF-7 após 24 h de co-incubação. A Figura 2C-R mostra o efeito inibitório do tratamento com Sal na cicatrização de células MCF-7, determinado pelo ensaio de arranhão da ferida. Outros testes de raspagem celular também confirmaram que 24 h de cultura com Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM) prejudicaram acentuadamente o processo de cicatrização de feridas (Figura 2C,D).
Supressão da migração maligna e invasão de células MCF-7 pelo Sal
A migração de grande número de células tumorais e a tendência a invadir tecidos paracancerosos são reconhecidas como características típicas de tumores malignos. Os efeitos do Sal sobre a migração e invasão de células MCF-7 foram posteriormente testados usando um sistema transwell revestido com ou sem gel de matriz extracelular. O tratamento com sal reduziu significativamente a migração indesejável (Figura 3A-F) e a invasão (Figura 3G-L) das células MCF-7. Como mostrado na Figura 3A, o tratamento com Sal surpreendentemente neutralizou a migração de células MCF-7. Quase unanimemente, o processo de invasão maliciosa das células MCF-7 foi efetivamente interrompido após a incubação com Sal (Figura 3B). Os dados acima confirmaram plenamente as vantagens do Sal na inibição do câncer de mama.
Efeitos do Sal na promoção de apoptose e aumento da parada do ciclo em células MCF-7
A imortalização e a reprodução periódica das células cancerosas oferecem oportunidades para que o câncer se agrave e se espalhe. Naturalmente, a promoção da apoptose e supressão do ciclo também se tornaram estratégias aceitas para a prevenção do câncer. Os resultados da citometria de fluxo sugeriram que o tratamento com Sal aumentou o número de células MCF-7 nos estágios apoptóticos precoce e tardio (Figura 4A). Enquanto isso, em comparação com o grupo controle, o tratamento com Sal também aumentou acentuadamente o número de células na fase G0/G1, enquanto reduziu a proporção de células na fase S (Figura 4B). A promoção da apoptose e parada do ciclo pode servir como possível ação farmacológica do Sal contra o câncer de mama.
Efeito do Sal na estimulação da superprodução intracelular de ROS e Ca2+ em células MCF-7
A estimulação contínua da produção intracelular de ROS e Ca2+ pode inibir efetivamente o crescimento de células tumorais. A Figura 5A-E mostra o conteúdo de ROS avaliado pela coloração de imunofluorescência DCFH-DA. Os resultados quantitativos para ROS são mostrados na Figura 5F. A imunofluorescência por fluo-4 AM foi empregada para detectar a concentração de Ca2+ (Figura 5G-K). A Figura 5L mostra os resultados quantitativos para Ca2+. Os resultados de DCFH-DA mostraram que o Sal aumentou significativamente os sinais de fluorescência das ROS em comparação com o grupo controle (Figura 5A). Consistentemente, a intervenção com Sal também elevou nitidamente a produção de Ca2+, evidenciada pelo sinal de fluorescência Fluo-4 AM destacado (Figura 5B). Esses resultados indicaram coletivamente que os sinais de ROS e Ca2+ podem estar parcialmente envolvidos na atividade anticâncer de mama do Sal.
Efeito do Sal na indução de apoptose na via mitocondrial de células MCF-7
Há abundantes evidências de que a apoptose induzida pela disfunção mitocondrial determina o destino final de muitas células tumorais. Ao determinar se o Sal medeia a regulação da função mitocondrial e os efeitos promotores de apoptose em células MCF-7, foi demonstrado pela primeira vez que o Sal restringia as vitalidades enzimáticas da Na+-K+-ATPase (Figura 6A) e da Ca2+-ATPase (Figura 6B), indicando assim seu potencial papel na promoção da disfunção mitocondrial. Posteriormente, os dados de western blot e qRT-PCR mostraram que o tratamento com Sal promoveu a expressão gênica e proteica dos fatores pró-apoptóticos CC-9 (Figura 6C,D,G), CC-7 (Figura 6C,E,H), CC-3 (Figura 6C,F,I), Bim (Figura 6C,J,M) e Bax (Figura 6C,L,O), enquanto inibiu a expressão gênica e proteica do antiapoptótico Bcl-2 (Figura 6C,K,N). Estes dados demonstram parcialmente que a disfunção mitocondrial em células MCF-7 associada à apoptose pode estar envolvida no mecanismo de ação do Sal contra o câncer de mama.
Efeito do Sal na supressão da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 em células MCF-7
A via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1, como uma via crucial de transdução de sinal regulando o crescimento tumoral, está envolvida na progressão patológica e deterioração do câncer de mama. Os resultados do western blot mostraram que o tratamento com Sal limitou proeminentemente as proporções de p-PI3K/PI3K (Figura 7A,B) e p-AKT/AKT (Figura 7A,C). Enquanto isso, a expressão proteica de mTOR (Figura 7A,D), HIF-1α (Figura 7A,E) e FoxO1 (Figura 7A,F) também foi notavelmente suprimida pelo tratamento com Sal. Uma análise adicional de qRT-PCR também demonstrou que a administração de Sal reduziu os níveis de expressão gênica de PI3K (Figura 7G), AKT (Figura 7H), mTOR (Figura 7I), HIF-1α (Figura 7J) e FoxO1 (Figura 7K). Em conclusão, a inibição da ativação da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pode ser um potencial mecanismo molecular do Sal contra o câncer de mama.
Figura 1: Ilustração esquemática da ação do Sal contra a linhagem celular MCF-7 do câncer de mama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A toxicidade da proliferação celular MCF-7 e as propriedades cicatrizantes do Sal (A) e (B) mostram os efeitos dose-tempo do tratamento com Sal sobre a atividade celular do MCF-7. (C-R) Efeito inibitório do tratamento com Sal na cicatrização de feridas em células MCF-7, determinado pelo ensaio de arranhão da ferida. Os dados acima são ilustrados como a média ± DP, n = 3. ##p < 0,01 vs. o grupo controle. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Supressão da migração maligna e invasão de células MCF-7 pelo tratamento com Sal. O tratamento com sal reduz significativamente a migração indesejável (A-F) e a invasão (G-L) das células MCF-7. Os dados acima são ilustrados como a média ± DP, n = 3. <#p < 0,05 e ##p < 0,01 versus o grupo controle. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Promoção da apoptose e supressão do ciclo celular pelo Sal. Os efeitos (A) de promoção apoptótica e (B) de parada do ciclo celular do Sal em células MCF-7, detectados por citometria de fluxo. Os dados acima são ilustrados como a média ± DP, n = 3. #p < 0,05 e ##p < 0,01 vs. o grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Surto de ROS e Ca2+ em células MCF-7 causado pelo tratamento com Sal. (A-E) O conteúdo de ROS foi avaliado pela coloração de imunofluorescência DCFH-DA. (F) Resultados quantitativos para ROS. (G-K) A coloração de imunofluorescência fluo-4 AM foi empregada para detectar a concentração de Ca2+. (L) Resultados quantitativos para Ca2+. Os dados acima são ilustrados como a média ± DP, n = 3. #p < 0,05 e ##p < 0,01 vs. o grupo controle. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeito do tratamento com Sal na indução de disfunção mitocondrial associada à apoptose em células MCF-7. As atividades enzimáticas reduzidas da (A) Na+-K+-ATPase e (B) Ca2+-ATPase. (C) Bandas representativas de expressão proteica e seus resultados estatísticos correspondentes para as proteínas (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 e (L) Bax e para os genes (G) caspase-9, (H) caspase-7, (I) caspase-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 e (O) Bax. Os dados acima são ilustrados como a média ± DP, n = 3. #p < 0,05 e ##p < 0,01 vs. o grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Supressão da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pelo tratamento com Sal . (A) Bandas proteicas representativas detectadas pela análise de western blot. O sal reduziu a expressão proteica de (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α e (F) FoxO1. Sal atenuou os níveis de expressão gênica de (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α e (K) FoxO1. Os dados acima são ilustrados como a média ± DP, n = 3. # #p < 0,01 vs. o grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Estimulação da produção de ROS e Ca2+ em células MCF-7 pelo Sal, acompanhada da inibição da transdução do sinal PI3K. Com o envolvimento do mTOR, a fosforilação da AKT foi ainda mais reduzida após a administração de Sal. Consequentemente, a expressão diminuída de HIF-1α e FoxO1 bloqueou a proliferação maligna periódica de células MCF-7. Enquanto isso, a apoptose aumentada de células MCF-7 sugeriu o potencial anti-câncer de mama do Sal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gene | Adesão ao GenBank nº. | Sequência de primers (5'-3') | Comprimento (pb) | |
| Caspase-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-actina | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, para frente; R, reverso. | ||||
Tabela 1: Primers utilizados para a transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase quantitativa.
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Discussion
O câncer de mama acomete indivíduos de todas as idades e causa incalculável sobrecarga física e mental e grande pressão econômica1. O câncer de mama, com sua crescente morbidade e mortalidade a cada ano, também tem atraído a atenção mundial na busca de terapias compostas fitoterápicas eficazes além dos tratamentos convencionais 4,5. De forma promissora, um grande corpo de evidências tem revelado os efeitos anticancerígenos do Sal24,25,38. Infelizmente, o papel do Sal no câncer de mama e os mecanismos moleculares subjacentes ainda permanecem em grande parte desconhecidos. Este estudo destaca os efeitos inibitórios significativos do Sal na proliferação, migração, e invasão da linhagem celular MCF-7 do câncer de mama humano. Posteriormente, revelamos o potencial do Sal em apoptose irritante e parada cíclica de células MCF-7. Por outro lado, estes dados também mostraram que a administração de Sal aumentou os níveis de ROS e Ca2+. Uma maior exploração dos mecanismos moleculares demonstrou a ação promotora de apoptose do Sal no tratamento do câncer de mama e o efeito do Sal na via PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1.
A proliferação maligna e descontrolada pode acelerar o desenvolvimento do câncer de mama e aumentar o risco de metástases linfáticas39 e cerebrais40. Atualmente, os quimioterápicos disponíveis no mercado têm surgido gradativamente, mas estes apresentam a questão da baixa sensibilidade para o tratamento do câncer de mama, obrigando as pessoas a buscarem compostos mais potentes ou novas combinações de fármacos 2,3. Os dados deste trabalho demonstraram pela primeira vez que o tratamento com Sal limitou a proliferação maligna de células MCF-7. Ensaios subsequentes de arranhão celular confirmaram ainda que a incubação de Sal de 12 h e 24 h reduziu a taxa de convergência das células MCF-7. Testes para migração e invasão de células tumorais são considerados indicadores sensíveis para o rastreamento de drogasantitumorais24,25. Os dados deste trabalho sugerem que o Sal reduziu fortemente o processo de migração e invasão celular MCF-7, em concordância com achados anteriores33,34. O ciclo celular descontrolado das células tumorais determina o destino da imortalidade celular24. Portanto, a promoção da apoptose e a interrupção do ciclo celular tornaram-se índices reconhecidos e aceitos para avaliar o potencial anticâncer de compostos25. Neste trabalho, a análise por citometria de fluxo indicou que o tratamento com Sal aumentou significativamente a apoptose em células MCF-7, como evidenciado por um aumento na proporção de células apoptóticas precoces e tardias. Além disso, a proporção de células G0/G1 foi aumentada, e a fase S do ciclo celular MCF-7 foi perturbada, indicando os efeitos bloqueadores do ciclo celular do Sal sobre as células do câncer de mama.
O microambiente de células de câncer de mama hipóxico leve está associado a limitações na produção de ROS e Ca2+ ; assim, o acúmulo excessivo de ERO e Ca2+ pode induzir eventos apoptóticos em células de câncer de mama41. Os resultados de imunofluorescência neste trabalho provaram que a intervenção com Sal estimulou grandemente a produção de ROS e Ca2+ , o que pode induzir ainda mais a apoptose das células MCF-7. Evidências emergentes têm revelado que níveis elevados das proteínas pró-apoptóticas Bax e Bim, bem como níveis reduzidos da proteína antiapoptótica Bcl-2, podem abrir temporária e forçosamente a passagem de material para dentro e para fora da membrana mitocondrial, desencadeando assim apoptose programada de células tumorais42. Neste estudo, a co-incubação de Sal com células MCF-7 aumentou significativamente Bax e Bim, enquanto diminuiu a expressão gênica e proteica de Bcl-2, sugerindo assim seus potenciais efeitos farmacológicos na promoção de apoptose em células de câncer de mama. Esses dados também sugeriram que Sal induziu distintamente a expressão das proteínas CC-9, CC-7 e CC-3, que são indicadores-chave a jusante da via da apoptose mitocondrial e seus genes correspondentes. Os dados acima sugerem, em parte, que o efeito pró-apoptótico do Sal no câncer de mama pode estar relacionado à ativação da apoptose mitocondrial.
Estudos de mecanismos moleculares têm confirmado que a fosforilação da PI3K pode induzir ainda mais a fosforilação da AKT e acelerar o crescimento de células de câncer de mama 6,7. Nesse ínterim, o grande acúmulo de mTOR também contribui para a deterioração do câncer de mama por participar do processo de fosforilação da AKT 8,9. Por um lado, a AKT fosforilada estimula diretamente a expressão de FoxO1 para promover o ciclo celular do câncer de mama e retardar a apoptose22,23. Paralelamente, a AKT ativada indiretamente ativa a expressão de HIF-1α para produzir FoxO1, resultando em progressão do câncer de mama e metástase16,17. Consequentemente, a inibição da ativação da via PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 pode ser uma nova estratégia para o tratamento do câncer de mama. Com a intervenção do LY294002 inibidor da PI3K, os dados demonstraram que o Sal suprimindo observavelmente a fosforilação da PI3K. Em conjunto com a regulação negativa da expressão da proteína mTOR, Sal também reduziu os níveis de expressão de AKT fosforilada. Como resultado, a expressão das proteínas HIF-1α e FoxO1 também diminuiu amplamente após o tratamento com Sal. Da mesma forma, os resultados da qRT-PCR revelaram que o tratamento com Sal diminuiu extensivamente os níveis gênicos de PI3K, AKT, HIF-1α e FoxO1, contribuindo para a promoção de parada do ciclo e apoptose das células MCF-7 (Figura 8). Coletivamente, os dados obtidos sugerem que o Sal pode ser um potencial composto ativo de origem herbácea natural com ação contra o câncer de mama. A promoção da apoptose celular MCF-7 e a inibição do ciclo celular pelo tratamento com Sal enfraqueceram muito a capacidade de migração e invasão das células do câncer de mama. Notavelmente, o mecanismo molecular de ação do Sal contra o câncer de mama pode estar relacionado à inibição da via PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1. De modo geral, este protocolo que integra múltiplos métodos experimentais fornece um certo valor de referência para a pesquisa e desenvolvimento de drogas anticâncer de mama.
Neste estudo, não há evidência direta do mecanismo molecular do Sal contra o câncer de mama. Camundongos knockout da PI3K, linhagens celulares de câncer de mama com alta ou baixa expressão da proteína PI3K e técnicas de ressonância plasmônica de superfície local são os próximos passos que poderão ser utilizados para confirmar os alvos moleculares diretos do Sal para a prevenção e tratamento do câncer demama29,31.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Comissão de Saúde da Província de Sichuan (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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