Summary
El presente protocolo describe una estrategia integral para evaluar la acción farmacológica y el mecanismo del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7.
Abstract
El salidrósido (Sal) contiene actividades farmacológicas anticancerígenas, antihipóxicas y antiinflamatorias. Sin embargo, sus mecanismos subyacentes contra el cáncer de mama solo se han dilucidado de manera incompleta. Por lo tanto, este protocolo pretendía decodificar el potencial de Sal en la regulación de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 en la proliferación maligna de células MCF-7 de cáncer de mama humano. En primer lugar, se evaluó la actividad farmacológica de la Sal frente a MCF-7 mediante ensayos de CCK-8 y scratch celular. Además, la resistencia de las células MCF-7 se midió mediante ensayos de migración e invasión de Matrigel. Para los ensayos de apoptosis y ciclo celular, las células MCF-7 se procesaron en pasos con anexina V-FITC/PI y kits de detección de tinción de ciclo celular para análisis de citometría de flujo, respectivamente. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y Ca2+ se examinaron mediante tinción de inmunofluorescencia DCFH-DA y Fluo-4 AM. Las actividades de Na+-K+-ATPasa y Ca2+-ATPasa se determinaron utilizando los kits comerciales correspondientes. Los niveles de expresión de proteínas y genes en la apoptosis y la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 se determinaron mediante análisis de Western blot y qRT-PCR, respectivamente. Encontramos que el tratamiento con Sal restringió significativamente la proliferación, migración e invasión de las células MCF-7 con efectos dependientes de la dosis. Mientras tanto, la administración de Sal también obligó drásticamente a las células MCF-7 a sufrir apoptosis y detención del ciclo celular. Las pruebas de inmunofluorescencia mostraron que Sal estimuló de forma observable la producción de ROS y Ca2+ en las células MCF-7. Otros datos confirmaron que Sal promovió los niveles de expresión de las proteínas proapoptóticas, Bax, Bim, caspasa-9/7/3 escindida y sus genes correspondientes. Consistentemente, la intervención de Sal redujo de manera prominente la expresión de las proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α y FoxO1 y sus genes correspondientes. En conclusión, la sal se puede utilizar como un compuesto potencial derivado de hierbas para tratar el cáncer de mama, ya que puede reducir la proliferación, migración e invasión maligna de las células MCF-7 al inhibir la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduction
Como uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y las neoplasias malignas más comunes, las últimas estadísticas indican que en 2020 surgieron 2,3 millones de casos de cáncer de mama en todo el mundo, lo que representa el 11,7% de todos los casos de cáncer1. Los síntomas comunes del cáncer de mama incluyen sensibilidad y hormigueo en los senos, bultos y dolor en los senos, secreción del pezón, erosión o piel hundida y agrandamiento de los ganglios linfáticos axilares 1,2. Y lo que es aún más alarmante, el número de nuevos casos y la incidencia general del cáncer de mama siguen aumentando a un ritmo abrumador cada año, y representan el 6,9% de las muertes relacionadas con el cáncer1. En la actualidad, la intervención del cáncer de mama sigue siendo principalmente quimioterapia, cirugía, radioterapia y tratamiento integral. A pesar de que el tratamiento puede reducir eficazmente la tasa de recurrencia y la tasa de mortalidad de los pacientes, la aplicación del tratamiento a largo plazo a menudo causa la aparición de multirresistencia, pérdida de cabello en grandes áreas, náuseas y vómitos, y una grave carga mental y psicológica 2,3. En particular, el riesgo potencial de metástasis de múltiples órganos por cáncer de mama también obliga a las personas a buscar nuevas fuentes herbales de terapia farmacológica 4,5.
La señalización mediada por la fosfoinositida 3 quinasa (PI3K) está implicada en el crecimiento, la proliferación y la supervivencia del cáncer de mama a través del empalme que afecta a la expresión de múltiples genes6. Como proteína de detección de señales aguas abajo de PI3K, numerosas evidencias sugieren que la proteína quinasa B (AKT) podría acoplarse con la proteína diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) para aumentar aún más el cáncer de mama 7,8,9. Además, también se ha afirmado que la desactivación de la señalización de PI3K/AKT/mTOR es un componente clave en los fármacos que inhiben la proliferación maligna y estimulan la apoptosis en el cáncer de mama10,11,12. Es bien sabido que la hipoxia extrema en el microambiente tumoral obliga a un aumento masivo del factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α), lo que empeora aún más la progresión del cáncer de mama13,14,15. Paralelamente, la estimulación de AKT también conduce a una acumulación excesiva de HIF-1α, limitando la apoptosis en muestras de cáncer de mama16,17. Curiosamente, se ha confirmado que la activación de la señalización PI3K-AKT-HIF-1α está involucrada en la progresión patológica y la metástasis en una variedad de cánceres, incluidos el cáncer de pulmón18, el cáncer colorrectal19, el cáncer de ovario20 y el cáncer de próstata21. Además de ser orquestada por HIF-1α, la sobreexpresión del factor de transcripción de cabeza bifurcada 1 (FoxO1) también es desencadenada por la estimulación de la señalización AKT, que promueve la detención del ciclo y la inhibición de la apoptosis en las células de cáncer de mama22,23. En conjunto, la evidencia sólida anterior sugiere que la inhibición de la cascada de señalización PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 puede ser una nueva diana potencial para el tratamiento farmacológico en el cáncer de mama.
Se ha demostrado ampliamente que el salidrósido (Sal) ejerce actividades anticancerígenas 24,25, antihipoxia26,27,28,29 y potenciadoras del sistema inmunológico30. Es un polvo de color marrón claro o marrón que es fácilmente soluble en agua, es un tipo de glucósido feniletanoide y tiene una fórmula de estructura química de C14H 20 O7 y un peso molecular de300.331,32. Las investigaciones farmacológicas modernas han demostrado que la Sal puede promover la apoptosis de las células cancerosas gástricas al restringir la señalización PI3K-AKT-mTOR24. Otras evidencias también sugieren que la supresión de la señalización de PI3K-AKT-HIF-1α por el tratamiento con Sal puede contribuir a la apoptosis de las células cancerosas al mejorar su sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos25. La evidencia también sugiere que la Sal restringe la migración e invasión celular y causa la detención del ciclo al promover la apoptosis en las células MCF-7 del cáncer de mama humano33,34. Sin embargo, queda por ver si Sal puede regular la señalización de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inhibir la proliferación maligna de las células MCF-7. Por lo tanto, este protocolo tuvo como objetivo explorar los efectos de Sal en la migración, invasión, ciclo celular y apoptosis de las células MCF-7 a través de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Las estrategias de investigación integradas que comprenden experimentos convencionales, de bajo costo e independientes, como las evaluaciones de migración e invasión celular, la apoptosis y la detección del ciclo celular por citometría de flujo, la determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y fluorescencia de Ca2+, etc., pueden proporcionar una referencia para el diseño general de experimentos para la investigación anticancerígena con la medicina herbal tradicional. El proceso experimental de este estudio se muestra en la Figura 1.
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Protocol
Las células MCF-7 utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Cultivo celular
- Cultivar las células MCF-7 en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C con DMEM que contenga un 10% de FBS y un 1% de penicilina (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver la Tabla de Materiales).
NOTA: Las células que cubren el 90% del fondo de la placa se emplearon para el experimento y se asignaron a los siguientes grupos: grupo control, grupo clorhidrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) y grupos Sal (20 μM, 40 μM y 80 μM), o grupo control, grupo LY294002 (10 μM, un inhibidor de PI3K), grupo Sal (80 μM) y grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver la Tabla de Materiales).
2. Ensayo de viabilidad celular
NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase un informe anterior27.
- Siembre células MCF-7 con una densidad de 8 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos e incube con Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM y 320 μM) durante 24 h o Sal (20, 40, 80 μM) durante 12 h/24 h/36 h/48 h durante la noche hasta que las células estén adheridas.
- Después del tratamiento, co-incubar las células MCF-7 con 10 μL/pocillo de solución de CCK-8 (ver la Tabla de Materiales) durante 2 h. A continuación, mida la densidad óptica a 450 nm (OD450) con un lector automático de microplacas.
3. Migración e invasión celular
NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase un informe anterior35.
- Incubar 2 ml de 5 x 10 6 células/ml de células sembradas en placas de6 pocillos para cubrir el 90% del fondo de la placa.
- Realice una herida de raspado lineal a lo largo del centro de la monocapa celular con una punta de pipeta estéril. Adquisición de imágenes con un microscopio óptico a las 0 h, 24 h y 48 h.
- Utilice el software Image J para medir el ancho de las heridas por arañazo.
- Para el ensayo transwell, suspenda las células MCF-7 sin medio sérico y siembre en la cámara transwell superior previamente recubierta con o sin Matrigel (consulte la Tabla de materiales).
- En el fondo de la cámara de transpozo, utilice el medio completo DMEM como inductor químico. Después de 24 h, retire las células de la cámara superior y fije las células invasoras y migratorias restantes en metanol35.
- Tiñir las células MCF-7 con una solución de violeta cristalina (consulte la Tabla de materiales). Capture las imágenes con un microscopio óptico.
4. Evaluación de la actividad de Na+-K+-ATPasa y Ca 2+-Mg2+-ATPasa
- Utilice un kit de ácido bicinconínico (BCA) para medir la concentración de proteínas en las células MCF-7 lisadas, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Agregue muestras de las células lisadas en sus grupos correspondientes en las placas de 96 pocillos. Después de eso, agregue la solución de trabajo para incubar a 37 °C durante 5 minutos. Por último, mida los valores de OD636 con un lector de microplacas multifuncional.
5. Análisis por citometría de flujo de la apoptosis y el ciclo celular
NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, sírvase consultar un informe anterior31.
- Digiera las células y recoja para resuspenderlas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante una tinción de 20 minutos con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) (consulte la Tabla de materiales), y luego determine el número de células apoptóticas utilizando un citómetro de flujo.
- Mezcle la solución de muestra resuspendida con la solución PI durante una incubación de 30 minutos, seguida de la detección con un citómetro de flujo.
6. Tinción de fluorescencia DCFH-DA y Fluo-4 AM
NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase un informe anterior29.
- Incubar las células MCF-7 durante 20 min con una sonda de fluorescencia DCFH-DA de 10 μM (ver la Tabla de Materiales) a 37 °C. Después de eliminar completamente el excedente de DCFH-DA lavando tres veces con PBS, pruebe la intensidad de fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 525 nm, respectivamente, utilizando un microscopio de fluorescencia.
- Incubar las células MCF-7 con una solución de sonda fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (véase la Tabla de materiales) durante 45 min a 37 °C. Después de lavar con PBS tres veces, determine los valores de intensidad de fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 516 nm, respectivamente, utilizando un microscopio de fluorescencia.
7. Western blot
- Añadir 2 mL de suspensiones celulares de 5 x 10 6 células/mL que contengan diferentes fármacos en placas de6 pocillos y cultivar en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 24 h.
NOTA: Los grupos para el análisis de Western blot se establecieron de la siguiente manera: grupo control, grupo LY294002 (10 μM), grupo Sal (80 μM) y grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver la Tabla de Materiales). - Recoger las células y el sobrenadante, y centrifugar a 560 × g a 4 °C durante 3 min. Deseche el sobrenadante y lávelo dos veces con PBS preenfriado. Después de cada lavado, centrifugar las células a 560 × g a 4 °C durante 3 min.
- Añadir 50 μL de tampón de lisis a la muestra celular del paso 7.2 para un baño de hielo de 15 minutos. Centrifugar a 8550 × g a 4 °C durante 10 min para recoger la muestra de proteína sobrenadante.
- Después de detectar la concentración de proteína mediante un método BCA, mezcle la muestra de proteína en el paso 7.3 con tampón de carga en una proporción de 4:1, desnaturalice a 100 °C durante 10 min en un baño de metal y enfríe a temperatura ambiente.
- Añadir 20 μg de la muestra de proteína del paso 7.4, separar las proteínas con diferentes pesos moleculares35utilizando SDS-PAGE al 10% (ver la Tabla de Materiales), y luego transferir a membranas de PVDF de 0,22 μm. Después del bloqueo con BSA al 5%, incubar las membranas con los anticuerpos primarios correspondientes durante la noche a 4 °C.
NOTA: La concentración diluida de los siguientes anticuerpos primarios es de 1:1.000: caspasa-9/7/3 escindida (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 y β-actina (véase la tabla de materiales). - Al día siguiente, incubar las membranas con el anticuerpo secundario IgG anticonejo de cabra durante 2 h a 37 °C. Desarrollar las membranas utilizando una solución quimioluminiscente ECL y capturar imágenes utilizando un sistema cuantitativo de imágenes Western blot sin contacto (ver la Tabla de Materiales).
8. qRT-PCR
- Realice la centrifugación para recolectar células MCF-7 a 560 x g a 4 °C durante 3 min, y agregue 500 μL de tampón RL1 en 5 × 106 celdas. Soplar y mezclar repetidamente con una pipeta hasta que no se vean masas celulares.
NOTA: El tampón RL1 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). - Transfiera los homogeneizados celulares en el paso 8.1 a la columna de limpieza de ADN incrustada en el tubo de recolección y centrifugue a 8.550 × g a 4 °C durante 2 min. Retire la columna de limpieza de ADN y mantenga el sobrenadante en el tubo de recolección.
NOTA: La columna de limpieza de ADN y el tubo de recolección son dos de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). - Añadir 800 μL de tampón RL2 a 500 μL del sobrenadante del paso 8.2 y mezclar suavemente.
NOTA: El tampón RL2 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). Añadir 120 mL de etanol anhidro a 60 mL de tampón RL2 antes de usar. - Transfiera 700 μL de la mezcla del paso 8.3 a la columna de ARN solo incrustada en el tubo de recolección y centrifugue a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. Deseche el líquido residual en el tubo de recolección.
NOTA: La columna de solo ARN es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). - Repita el paso 8.4 para procesar la mezcla restante del paso 8.3.
- Añadir 500 μL de tampón RW1 a la columna de ARN y centrifugar a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. Deseche el líquido residual en el tubo de recolección.
NOTA: El tampón RW1 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). - Añadir 700 μL de tampón RW2 a la columna de ARN solamente y centrifugar a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. Deseche el líquido residual en el tubo de recolección. Repita el paso 8.7 una vez.
NOTA: El tampón RW2 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). - Vuelva a colocar la columna de ARN solo en el tubo de recolección y centrifugue a 8550 × g a 4 °C durante 2 min para eliminar el tampón RW2 restante.
- Transfiera la columna de ARN solo a un nuevo tubo de recolección y gotee 100 μL de ddH2O libre de ARNasa precalentado a 65 °C en el centro de la membrana para la columna de ARN solo. Colocar a 25 °C durante 2 min y recoger la solución de ARN por centrifugación a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min.
NOTA: La ddH2O libre de ARNasa es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). - Agregue 4 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de cebador oligo (dT)18 , 1 μL de cebador hexámero aleatorio, 1 μL de cebador específico de gen (ver Tabla 1), 1 μL de mezcla de enzimas y 5 μg de la solución de ARN del paso 8.9 en una tira de 8 tubos de 100 μL. Complementar el sistema de reacción con agua libre de RNasa a 20 μL.
- Establezca las condiciones de reacción del sistema de la siguiente manera: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 ciclos, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; y (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Ejecute el procedimiento qRT-PCR.
NOTA: Los niveles relativos de expresión de los genes diana se analizaron cuantitativamente por el método 2−ΔΔCT 36,37. La información del cebador de cada gen utilizado para el análisis de qRT-PCR se muestra en la Tabla 1.
9. Análisis estadístico
- Exprese los datos como la media ± la desviación estándar de tres experimentos independientes.
- Analice las comparaciones entre múltiples grupos utilizando un software de gráficos y análisis (consulte la Tabla de Materiales) con un análisis de varianza de un factor (ANOVA) seguido de una prueba de Tukey. En este trabajo, P < 0,05 se definió como estadísticamente significativo.
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Representative Results
Efectos de la sal en la inhibición del exceso de proliferación y el retraso de la cicatrización de heridas en células MCF-7
Para probar el potencial de la Sal contra el cáncer de mama, primero probamos sus propiedades anticancerígenas mediante ensayos de toxicidad de proliferación celular y arañazos de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama humano. Estas células se co-incubaron con una serie de concentraciones de Sal (5-320 μM) durante 24 h, y la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo CCK-8. Se observó un efecto inhibidor dependiente de la dosis de Sal sobre la proliferación celular, con una disminución del 50% en la vitalidad celular a 40 μM (Figura 2A). A continuación, se seleccionaron concentraciones de sal de 20 μM, 40 μM y 80 μM para los puntos temporales posteriores y la evaluación de la cicatrización de la herida. Los resultados de la Figura 2B muestran que Sal podría inhibir la vitalidad de las células MCF-7 a lo largo del tiempo, con una disminución del 50% en la vitalidad de las células MCF-7 después de 24 h de co-incubación. La figura 2C-R muestra el efecto inhibidor del tratamiento con Sal en la cicatrización de heridas de células MCF-7, según lo determinado por el ensayo de raspado de heridas. Otras pruebas de raspado celular también confirmaron que 24 h de cultivo con Sal (20 μM, 40 μM y 80 μM) dificultaron drásticamente el proceso de cicatrización de la herida (Figura 2C, D).
Supresión de la migración maligna e invasión de células MCF-7 por Sal
La migración de un gran número de células tumorales y la tendencia a invadir los tejidos paracancerosos se reconocen como características típicas de los tumores malignos. Los efectos del Sal sobre la migración e invasión de las células MCF-7 se probaron más a fondo utilizando un sistema transwell recubierto con o sin gel de matriz extracelular. El tratamiento con sal redujo significativamente la migración indeseable (Figura 3A-F) y la invasión (Figura 3G-L) de las células MCF-7. Como se muestra en la Figura 3A, el tratamiento con Sal neutralizó sorprendentemente la migración de las células MCF-7. Casi unánimemente, el proceso de invasión maliciosa de las células MCF-7 se cerró efectivamente después de la incubación con Sal (Figura 3B). Los datos anteriores confirmaron plenamente las ventajas de la Sal en la inhibición del cáncer de mama.
Efectos de la sal en la promoción de la apoptosis y la mejora de la detención del ciclo en las células MCF-7
La inmortalización y la reproducción periódica de las células cancerosas brindan oportunidades para que el cáncer empeore y se propague. Por supuesto, la promoción de la apoptosis y la supresión del ciclo también se han convertido en estrategias aceptadas para prevenir el cáncer. Los resultados de la citometría de flujo sugirieron que el tratamiento con Sal aumentó el número de células MCF-7 en las etapas apoptóticas temprana y tardía (Figura 4A). Mientras tanto, en comparación con el grupo control, el tratamiento con Sal también aumentó drásticamente el número de células en la fase G0/G1, al tiempo que redujo la proporción de células en fase S (Figura 4B). La promoción de la apoptosis y la detención del ciclo puede servir como la posible acción farmacológica de Sal contra el cáncer de mama.
Efecto de la sal en la estimulación de la sobreproducción intracelular de ROS yCa2+ en células MCF-7
La estimulación continua de la producción intracelular de ROS y Ca2+ puede inhibir eficazmente el crecimiento de las células tumorales. La Figura 5A-E muestra el contenido de ROS evaluado mediante tinción de inmunofluorescencia DCFH-DA. Los resultados cuantitativos de ROS se muestran en la Figura 5F. Se empleó la tinción de inmunofluorescencia Fluo-4 AM para detectar la concentración de Ca2+ (Figura 5G-K). La Figura 5L muestra los resultados cuantitativos para Ca2+. Los resultados de DCFH-DA mostraron que Sal mejoró significativamente las señales de fluorescencia de ROS en comparación con el grupo de control (Figura 5A). Consistentemente, la intervención de Sal también elevó claramente la producción de Ca2+, evidenciada por la señal de fluorescencia Fluo-4 AM resaltada (Figura 5B). Estos resultados indicaron colectivamente que las señales de ROS y Ca2+ podrían estar parcialmente involucradas en la actividad anticáncer de mama de Sal.
Efecto de la sal en la inducción de la apoptosis en la vía mitocondrial de las células MCF-7
Existe abundante evidencia de que la apoptosis inducida por la disfunción mitocondrial determina el destino final de muchas células tumorales. Al determinar si la Sal media la regulación de la función mitocondrial y los efectos promotores de la apoptosis en las células MCF-7, primero se demostró que la Sal restringía las vitalidades enzimáticas de la Na+-K+-ATPasa (Figura 6A) y la Ca2+-ATPasa (Figura 6B), lo que indica su papel potencial en la promoción de la disfunción mitocondrial. Posteriormente, los datos de Western blot y qRT-PCR mostraron que el tratamiento con Sal promovió la expresión proteica y génica de los factores proapoptóticos CC-9 (Figura 6C, D, G), CC-7 (Figura 6C, E, H), CC-3 (Figura 6C, F, I), Bim (Figura 6C, J, M) y Bax (Figura 6C, L, O), mientras que inhibió la expresión proteica y génica de Bcl-2 antiapoptótico (Figura 6C,K,N). Estos datos demuestran parcialmente que la disfunción mitocondrial en las células MCF-7 junto con la apoptosis pueden estar implicadas en el mecanismo de acción de la Sal contra el cáncer de mama.
Efecto del Sal en la supresión de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 en células MCF-7
La vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1, como vía crucial de transducción de señales que regula el crecimiento tumoral, está implicada en la progresión patológica y el deterioro del cáncer de mama. Los resultados del western blot mostraron que el tratamiento con Sal limitó de manera prominente las proporciones de p-PI3K/PI3K (Figura 7A, B) y p-AKT/AKT (Figura 7A, C). Mientras tanto, la expresión proteica de mTOR (Figura 7A, D), HIF-1α (Figura 7A, E) y FoxO1 (Figura 7A, F) también se suprimió notablemente con el tratamiento con Sal. Un análisis adicional de qRT-PCR también demostró que la administración de Sal redujo los niveles de expresión génica de PI3K (Figura 7G), AKT (Figura 7H), mTOR (Figura 7I), HIF-1α (Figura 7J) y FoxO1 (Figura 7K). En conclusión, la inhibición de la activación de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 puede ser un potencial mecanismo molecular de Sal contra el cáncer de mama.
Figura 1: Ilustración esquemática de la acción de Sal contra la línea celular MCF-7 de cáncer de mama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La toxicidad de la proliferación celular MCF-7 y las propiedades cicatrizantes de Sal. (A) y (B) muestran los efectos dosis-tiempo del tratamiento con Sal sobre la actividad celular MCF-7. (C-R) Efecto inhibidor del tratamiento con Sal sobre la cicatrización de heridas en células MCF-7, según lo determinado por el ensayo de rascado de heridas. Los datos anteriores se ilustran como la media ± DE, n = 3. ##p < 0,01 frente al grupo de control. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Supresión de la migración maligna e invasión de células MCF-7 por tratamiento con Sal. El tratamiento con sal reduce significativamente la migración indeseable (A-F) y la invasión (G-L) de las células MCF-7. Los datos anteriores se ilustran como la media ± DE, n = 3. <#p < 0,05 y ##p < 0,01 frente al grupo control. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Promoción de la apoptosis y supresión del ciclo celular por Sal. Los efectos de (A) promoción apoptótica y (B) detención del ciclo celular de Sal en células MCF-7, detectados por citometría de flujo. Los datos anteriores se ilustran como la media ± DE, n = 3. #p < 0,05 y ##p < 0,01 frente al grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aumento de ROS y Ca2+ en células MCF-7 causado por el tratamiento con Sal. (A-E) El contenido de ROS se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia DCFH-DA. (F) Resultados cuantitativos para ROS. (G-K) Se empleó la tinción de inmunofluorescencia Fluo-4 AM para detectar la concentración de Ca2+. (L) Resultados cuantitativos para Ca2+. Los datos anteriores se ilustran como la media ± DE, n = 3. #p < 0,05 y ##p < 0,01 frente al grupo de control. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Efecto del tratamiento con Sal en la inducción de la disfunción mitocondrial junto con la apoptosis en células MCF-7. La reducción de las actividades enzimáticas de (A) Na+-K+-ATPasa y (B) Ca2+-ATPasa. (C) Bandas representativas de expresión de proteínas y sus correspondientes resultados estadísticos para las proteínas (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 y (L) Bax y para los genes (G) caspasa-9, (H) caspasa-7, (I) caspasa-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 y (O) Bax. Los datos anteriores se ilustran como la media ± DE, n = 3. #p < 0,05 y ##p < 0,01 frente al grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Supresión de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 mediante tratamiento con Sal . (A) Bandas de proteínas representativas detectadas por análisis de Western blot. Sal redujo la expresión proteica de (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α y (F) FoxO1. La sal atenuó los niveles de expresión génica de (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α y (K) FoxO1. Los datos anteriores se ilustran como la media ± DE, n = 3. # #p < 0,01 frente al grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Estimulación de la producción de ROS y Ca2+ en células MCF-7 por Sal, acompañada de la inhibición de la transducción de señales PI3K. Con la participación de mTOR, la fosforilación de AKT se redujo aún más después de la administración de Sal. En consecuencia, la expresión regulada a la baja de HIF-1α y FoxO1 bloqueó la proliferación maligna periódica de las células MCF-7. Mientras tanto, la apoptosis mejorada de las células MCF-7 sugirió el potencial anticancerígeno de Sal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gen | Accesión GenBank no. | Secuencia de cebadores (5'-3') | Longitud (pb) | |
| Caspasa-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspasa-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspasa-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-actina | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, hacia adelante; R, reverso. | ||||
Tabla 1: Cebadores utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa.
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Discussion
El cáncer de mama afecta a personas de todas las edades y causa una carga física y mental incalculable y una gran presión económica1. El cáncer de mama, con su creciente morbilidad y mortalidad cada año, también ha atraído la atención mundial en cuanto a la búsqueda de terapias compuestas eficaces a base de hierbas más allá de los tratamientos convencionales 4,5. De manera prometedora, una gran cantidad de evidencia ha revelado los efectos anticancerígenos de Sal24,25,38. Desafortunadamente, el papel de la sal en el cáncer de mama y los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo en gran medida desconocidos. Este estudio destaca los importantes efectos inhibidores del Sal en la proliferación, migración e invasión de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama humano. Posteriormente, revelamos el potencial de la sal en la apoptosis irritante y la detención del ciclo de las células MCF-7. Mientras tanto, estos datos también mostraron que la administración de Sal aumentó los niveles de ROS yCa2+. La exploración adicional de los mecanismos moleculares demostró la acción promotora de la apoptosis de la Sal en el tratamiento del cáncer de mama y el efecto de la Sal en la vía PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1.
La proliferación maligna e incontrolada puede acelerar el desarrollo del cáncer de mama y aumentar el riesgo de metástasis linfáticas39 y cerebrales40. En la actualidad, los fármacos quimioterapéuticos disponibles en el mercado han ido apareciendo paulatinamente, pero estos tienen el problema de la baja sensibilidad para el tratamiento del cáncer de mama, lo que obliga a las personas a buscar compuestos más potentes o combinaciones de fármacos novedosas 2,3. Los datos de este trabajo demostraron por primera vez que el tratamiento con Sal limitaba la proliferación maligna de las células MCF-7. Los ensayos posteriores de raspado celular confirmaron además que la incubación de Sal de 12 h y 24 h redujo la tasa de convergencia de las células MCF-7. Las pruebas de migración e invasión de células tumorales se consideran indicadores sensibles para el cribado de fármacos antitumorales24,25. Los datos de este trabajo sugirieron que Sal redujo fuertemente el proceso de migración e invasión de células MCF-7, en línea con hallazgos previos33,34. El ciclo celular descontrolado de las células tumorales determina el destino de la inmortalidad celular24. Por lo tanto, la promoción de la apoptosis y la interrupción del ciclo celular se han convertido en índices reconocidos y aceptados para evaluar el potencial anticancerígeno de los compuestos25. En este trabajo, el análisis de citometría de flujo indicó que el tratamiento con Sal aumentó notablemente la apoptosis en las células MCF-7, como lo demuestra una mayor proporción de células apoptóticas tempranas y tardías. Además, la proporción de células G0/G1 aumentó y se alteró la fase S del ciclo celular MCF-7, lo que indica los efectos de bloqueo del ciclo celular de Sal en las células de cáncer de mama.
El microambiente de células de cáncer de mama hipóxico leve se asocia con limitaciones en la producción de ROS y Ca2+ ; por lo tanto, la acumulación excesiva de ROS y Ca2+ puede inducir eventos apoptóticos en las células de cáncer de mama41. Los resultados de inmunofluorescencia en este trabajo demostraron que la intervención con Sal estimuló en gran medida la producción de ROS y Ca2+ , lo que puede inducir aún más la apoptosis de las células MCF-7. La evidencia emergente ha revelado que los niveles elevados de las proteínas proapoptóticas Bax y Bim, así como los niveles reducidos de la proteína antiapoptótica Bcl-2, pueden abrir temporal y forzosamente el paso de material dentro y fuera de la membrana mitocondrial, desencadenando así la apoptosis programada de las células tumorales42. En este estudio, la co-incubación de Sal con células MCF-7 aumentó significativamente Bax y Bim al tiempo que disminuyó la expresión proteica y génica de Bcl-2, lo que sugiere sus posibles efectos farmacológicos en la promoción de la apoptosis en células de cáncer de mama. Estos datos también sugirieron que Sal indujo claramente la expresión de las proteínas CC-9, CC-7 y CC-3, que son indicadores clave de la vía de apoptosis mitocondrial, y sus genes correspondientes. Los datos anteriores sugieren en parte que el efecto proapoptótico de la sal sobre el cáncer de mama podría estar relacionado con la activación de la apoptosis mitocondrial.
Los estudios de mecanismos moleculares han confirmado que la fosforilación de PI3K puede inducir aún más la fosforilación de AKT y acelerar el crecimiento de las células de cáncer de mama 6,7. Mientras tanto, la gran acumulación de mTOR también contribuye al deterioro del cáncer de mama al participar en el proceso de fosforilación de AKT 8,9. Por un lado, la AKT fosforilada estimula directamente la expresión de FoxO1 para promover el ciclo celular del cáncer de mama y ralentizar la apoptosis22,23. Paralelamente, la AKT activada activa indirectamente la expresión de HIF-1α para producir FoxO1, lo que resulta en progresión del cáncer de mama y metástasis16,17. En consecuencia, la inhibición de la activación de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 puede ser una estrategia novedosa para el tratamiento del cáncer de mama. Con la intervención del inhibidor de PI3K LY294002, los datos demostraron que Sal suprimía de forma observable la fosforilación de PI3K. Junto con la regulación a la baja de la expresión de la proteína mTOR, Sal también redujo los niveles de expresión de AKT fosforilado. Como resultado, la expresión de las proteínas HIF-1α y FoxO1 también disminuyó enormemente después del tratamiento con Sal. Del mismo modo, los resultados de la qRT-PCR revelaron que el tratamiento con Sal disminuyó ampliamente los niveles genéticos de PI3K, AKT, HIF-1α y FoxO1, lo que contribuyó a la promoción de la detención del ciclo y la apoptosis de las células MCF-7 (Figura 8). En conjunto, los datos obtenidos sugieren que la Sal podría ser un potencial compuesto activo de origen herbal natural con acción contra el cáncer de mama. La promoción de la apoptosis de las células MCF-7 y la inhibición del ciclo celular mediante el tratamiento con Sal debilitó en gran medida la capacidad de migración e invasión de las células de cáncer de mama. En particular, el mecanismo de acción molecular de Sal contra el cáncer de mama puede estar relacionado con la inhibición de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1. En general, este protocolo que integra múltiples métodos experimentales proporciona un cierto valor de referencia para la investigación y el desarrollo de fármacos contra el cáncer de mama.
En este estudio, no hay evidencia directa del mecanismo molecular de la Sal contra el cáncer de mama. Los ratones knockout de PI3K, las líneas celulares de cáncer de mama con alta o baja expresión de la proteína PI3K y las técnicas de resonancia de plasmones de superficie local son los próximos pasos que podrían utilizarse para confirmar las dianas moleculares directas de Sal para la prevención y el tratamiento del cáncer de mama29,31.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Comisión de Salud de la Provincia de Sichuan (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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