Summary
Detta protokoll beskriver en omfattande strategi för att utvärdera den farmakologiska effekten och mekanismen för salidosid för att hämma MCF-7-cellproliferation och migration.
Abstract
Salidrosid (Sal) innehåller anticancerframkallande, antihypoxiska och antiinflammatoriska farmakologiska aktiviteter. Dess underliggande mekanismer mot bröstcancer har dock bara klarlagts ofullständigt. Därför avsåg detta protokoll att avkoda Sals potential för att reglera PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen i den maligna proliferationen av humana bröstcancer MCF-7-celler. Först utvärderades den farmakologiska aktiviteten av Sal mot MCF-7 med CCK-8 och cellskrapanalyser. Dessutom mättes resistensen hos MCF-7-celler genom migrations- och Matrigel-invasionsanalyser. För cellapoptos och cykelanalyser bearbetades MCF-7-celler i steg med annexin V-FITC/PI respektive cellcykelfärgningsdetektionskit för flödescytometrianalyser. Nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) och Ca2+ undersöktes med DCFH-DA och Fluo-4 AM immunofluorescensfärgning. Aktiviteterna för Na+-K+-ATPas och Ca2+-ATPas bestämdes med hjälp av motsvarande kommersiella kit. Protein- och genuttrycksnivåerna i apoptos och PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen bestämdes ytterligare med hjälp av western blot- respektive qRT-PCR-analyser. Vi fann att Sal-behandling signifikant begränsade proliferation, migration och invasion av MCF-7-celler med dosberoende effekter. Samtidigt tvingade Sal-administrationen också dramatiskt MCF-7-celler att genomgå apoptos och cellcykelstopp. Immunofluorescenstesterna visade att Sal observerbart stimulerade ROS- och Ca2+-produktionen i MCF-7-celler. Ytterligare data bekräftade att Sal främjade uttrycksnivåerna av pro-apoptotiska proteiner, Bax, Bim, klyvt kaspas-9/7/3 och deras motsvarande gener. Konsekvent minskade Sal-interventionen tydligt uttrycket av proteinerna Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α och FoxO1 och deras motsvarande gener. Sammanfattningsvis kan Sal användas som en potentiell örthärledd förening för behandling av bröstcancer, eftersom det kan minska den maligna proliferationen, migrationen och invasionen av MCF-7-celler genom att hämma PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen.
Introduction
Som en av de vanligaste cancerdiagnoserna och de vanligaste maligniteterna visar den senaste statistiken att 2,3 miljoner fall av bröstcancer uppstod runt om i världen år 2020, vilket motsvarar 11,7 % av alla cancerfall1. Vanliga symtom på bröstcancer är ömhet och stickningar i brösten, knölar och smärta i bröstvårtorna, rinnande bröstvårtor, erosion eller insjunken hud samt förstorade lymfkörtlari armhålan 1,2. Ännu mer alarmerande är att antalet nya fall och den totala förekomsten av bröstcancer fortsätter att öka i en överväldigande takt varje år och står för 6,9 % av de cancerrelateradedödsfallen1. För närvarande omfattar bröstcancerintervention fortfarande främst kemoterapi, kirurgi, strålbehandling och omfattande behandling. Även om behandling effektivt kan minska återfallsfrekvensen och dödligheten hos patienter, orsakar långvarig behandlingstillämpning ofta multiresistens, håravfall på stora områden, illamående och kräkningar samt allvarlig mental och psykologisk börda 2,3. Den potentiella risken för multipla organmetastaser från bröstcancer tvingar också människor att söka nya växtbaserade källor för läkemedelsbehandling 4,5.
Fosfoinositid 3-kinas (PI3K)-medierad signalering är inblandad i tillväxt, proliferation och överlevnad av bröstcancer genom splitsning som påverkar uttrycket av flera gener6. Som ett nedströms signalavkännande protein av PI3K tyder många bevis på att proteinkinas B (AKT) kan kopplas till däggdjursmålet för rapamycin (mTOR) protein för att ytterligare öka bröstcancer 7,8,9. Dessutom har inaktiveringen av PI3K/AKT/mTOR-signalering också påståtts vara en nyckelkomponent i läkemedel som hämmar malign proliferation och stimulerar apoptos vid bröstcancer10,11,12. Det är välkänt att extrem hypoxi i tumörens mikromiljö tvingar fram en massiv ökning av hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF-1α), vilket ytterligare förvärrar utvecklingen av bröstcancer13,14,15. Parallellt leder AKT-stimulering också till överdriven ackumulering av HIF-1α, vilket begränsar apoptos i bröstcancerprover16,17. Intressant nog har aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering bekräftats vara involverad i patologisk progression och metastasering i en mängd olika cancerformer, inklusive lungcancer18, kolorektal cancer19, äggstockscancer20 och prostatacancer21. Förutom att orkestreras av HIF-1α, utlöses överuttryck av transkriptionsfaktor 1 (FoxO1) med gaffelhuvud också av AKT-signalstimulering, vilket främjar cykelstopp och hämning av apoptos i bröstcancerceller22,23. Sammantaget tyder ovanstående solida bevis på att hämningen av kaskaden av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan vara ett potentiellt nytt mål för läkemedelsbehandling vid bröstcancer.
Salidroside (Sal) har i stor utsträckning visat sig utöva anti-cancer24,25, anti-hypoxi26,27,28,29 och immunstärkande farmakologiska aktiviteter30. Det är ett ljusbrunt eller brunt pulver som är lättlösligt i vatten, är en typ av fenyletanoidglykosid och har en kemisk strukturformel på C14H 20 O7 och en molekylvikt på300,331,32. Moderna farmakologiska undersökningar har visat att Sal kan främja apoptos av magcancerceller genom att begränsa PI3K-AKT-mTOR-signalering24. Ytterligare bevis tyder också på att undertryckandet av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering genom Sal-behandling kan bidra till apoptos av cancerceller genom att öka deras känslighet för kemoterapeutiska medel25. Bevis tyder också på att Sal begränsar cellmigration och invasion och orsakar cykelstopp genom att främja apoptos i den humana bröstcancern MCF-7-celler33,34. Det återstår dock att se om Sal kan reglera PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering och hämma den maligna proliferationen av MCF-7-celler. Därför syftade detta protokoll till att utforska effekterna av Sal på MCF-7-cellmigration, invasion, cellcykel och apoptos via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen. De integrerade forskningsstrategierna som omfattar konventionella, billiga och oberoende experiment, såsom cellmigration och invasionsbedömningar, apoptos och cellcykeldetektion genom flödescytometri, reaktiva syrearter (ROS) och Ca2+ fluorescensbestämning, etc., kan ge en referens för den övergripande utformningen av experiment för anti-cancerforskning med traditionell örtmedicin. Den experimentella processen för denna studie visas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MCF-7-cellerna som användes för denna studie erhölls från en kommersiell källa (se materialtabellen).
1. Cellodling
- Odla MCF-7-cellerna i en fuktad 5 % CO2 atmosfär vid 37 °C med DMEM innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin (10 000 E/ml)/streptomycin (10 000 μg/ml) (se materialtabellen).
OBS: Cellerna som täckte 90 % av skålens botten användes för experimentet och delades in i följande grupper: kontrollgrupp, doxorubicinhydrokloridgrupp (DXR, 5 μM) och Sal-grupp (20 μM, 40 μM och 80 μM), eller kontrollgrupp, LY294002 (10 μM, en hämmare av PI3K), Sal (80 μM) grupp och LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grupp (se materialtabellen).
2. Analys av cellviabilitet
OBS: För detaljer om denna procedur, se en tidigare rapport27.
- Frö MCF-7-celler med en densitet på 8 x 104 celler/brunn i 96-brunnars plattor och inkubera med Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM och 320 μM) i 24 timmar eller Sal (20, 40, 80 μM) i 12 timmar/24 timmar/36 timmar/48 timmar över natten tills cellerna är vidhäftande.
- Efter behandling saminkuberas MCF-7-cellerna med 10 μl/brunn CCK-8-lösning (se materialtabellen) i 2 timmar. Mät sedan den optiska densiteten vid 450 nm (OD450) med en automatisk mikroplattläsare.
3. Cellmigration och invasion
OBS: För detaljer om denna procedur, se en tidigare rapport35.
- Inkubera 2 ml 5 x 106 celler/ml celler sådda i 6-hålsplattor för att täcka 90 % av skålens botten.
- Utför ett linjärt skrapsår längs mitten av cellmonolagret med en steril pipettspets. Ta bilder med ett optiskt mikroskop vid 0 timmar, 24 timmar och 48 timmar.
- Använd programvaran Image J för att mäta bredden på rissåren.
- För transwell-analysen, suspendera MCF-7-celler utan serummedium och frö i den övre brunnskammaren förbelagd med eller utan Matrigel (se materialtabellen).
- I botten av brunnskammaren, använd DMEM komplett medium som en kemisk inducerare. Efter 24 timmar tar du bort cellerna i den övre kammaren och fixerar de återstående invasiva cellerna och migrantcellerna i metanol35.
- Färga MCF-7-cellerna med kristallviolett lösning (se materialtabellen). Ta bilderna med ett optiskt mikroskop.
4. Aktivitetsutvärdering av Na+-K+-ATPas och Ca 2+-Mg2+-ATPas
- Använd ett bikoninsyrakit (BCA) för att mäta proteinkoncentrationen i lyserade MCF-7-celler, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabellen).
- Tillsätt prover av de lyserade cellerna i deras motsvarande grupper i plattorna med 96 brunnar. Tillsätt sedan arbetslösningen för att inkubera den ytterligare vid 37 °C i 5 minuter. Mät slutligen värdena på OD636 med en multifunktionell mikroplattläsare.
5. Flödescytometrianalys av apoptos och cellcykeln
OBS: För detaljer om denna procedur, se en tidigare rapport31.
- Smält cellerna och skörda för att återsuspendera i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under en 20 minuters färgning med annexin V-FITC och propidiumjodid (PI) (se materialtabellen), och bestäm sedan antalet apoptotiska celler med hjälp av en flödescytometer.
- Blanda den omsuspenderade provlösningen med PI-lösning under en inkubation på 30 minuter, varefter det detekteras med en flödescytometer.
6. DCFH-DA och Fluo-4 AM fluorescensfärgning
OBS: För detaljer om denna procedur, se en tidigare rapport29.
- Inkubera MCF-7-cellerna i 20 minuter med en 10 μM DCFH-DA-fluorescenssond (se materialtabellen) vid 37 °C. Efter att noggrant ha avlägsnat överskottet av DCFH-DA genom att tvätta tre gånger med PBS, testa fluorescensintensiteten vid excitations- och emissionsvåglängder på 488 nm respektive 525 nm med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
- Inkubera MCF-7-cellerna med en 5 μM Fluo-4 AM fluorescerande sondlösning (se materialtabellen) i 45 minuter vid 37 °C. Efter tvätt med PBS tre gånger, bestäm fluorescensintensitetsvärdena vid excitations- och emissionsvåglängder på 488 nm respektive 516 nm med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
7. Västra blotet
- Tillsätt 2 ml 5 x 106 celler/ml cellsuspensioner innehållande olika läkemedel i 6-brunnsplattor och odla i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 24 timmar.
OBS: Grupperna för western blot-analysen ställdes in enligt följande: kontrollgrupp, LY294002 (10 μM) grupp, Sal (80 μM) grupp och LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grupp (se materialtabellen). - Samla upp cellerna och supernatanten och centrifugera vid 560 × g vid 4 °C i 3 minuter. Kassera supernatanten och tvätta två gånger med förkyld PBS. Efter varje tvätt centrifugeras cellerna vid 560 × g vid 4 °C i 3 minuter.
- Tillsätt 50 μL lysbuffert till cellprovet från steg 7.2 för ett 15 minuters isbad. Centrifugera vid 8550 × g vid 4 °C i 10 minuter för att samla upp supernatantproteinprovet.
- Efter att ha detekterat proteinkoncentrationen med hjälp av en BCA-metod, blanda proteinprovet i steg 7.3 med belastningsbuffert i förhållandet 4:1, denaturera vid 100 °C i 10 minuter i ett metallbad och svalna till rumstemperatur.
- Tillsätt 20 μg av proteinprovet från steg 7.4, separera proteinerna med olika molekylvikter35med hjälp av 10 % SDS-PAGE (se materialtabellen) och överför sedan till 0,22 μm PVDF-membran. Efter blockering med 5 % BSA, inkubera membranen med motsvarande primära antikroppar över natten vid 4 °C.
OBS: Den utspädda koncentrationen av följande primära antikroppar är 1:1 000: klyvt kaspas-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 och β-aktin (se materialtabellen). - Nästa dag inkuberas membranen med getantikanin IgG sekundär antikropp i 2 timmar vid 37 °C. Utveckla membranen med hjälp av en ECL-kemiluminiscenslösning och ta bilder med hjälp av ett kontaktlöst kvantitativt western blot-avbildningssystem (se materialtabellen).
8. qRT-PCR
- Utför centrifugering för att samla MCF-7-celler vid 560 x g vid 4 °C i 3 minuter och tillsätt 500 μL buffert RL1 till 5 × 106 celler. Blås och blanda upprepade gånger med en pipett tills inga cellmassor är synliga.
OBS: Buffert RL1 är en av komponenterna i det totala RNA-isoleringssatsen (se materialtabellen). - Överför cellhomogenaten i steg 8.1 till DNA-rengöringskolonnen som är inbäddad i uppsamlingsröret och centrifugera vid 8 550 × g vid 4 °C i 2 minuter. Ta bort DNA-rengöringskolonnen och behåll supernatanten i uppsamlingsröret.
OBS: DNA-rengöringskolonnen och uppsamlingsröret är två av komponenterna i det totala RNA-isoleringskitet (se materialtabellen). - Tillsätt 800 μL buffert RL2 till 500 μL av supernatanten från steg 8.2 och blanda försiktigt.
OBS: Buffert RL2 är en av komponenterna i det totala RNA-isoleringssatsen (se materialtabellen). Tillsätt 120 ml vattenfri etanol till 60 ml buffert RL2 före användning. - Överför 700 μl av blandningen från steg 8.3 till den RNA-kolonn som är inbäddad i uppsamlingsröret och centrifugera vid 8 550 × g vid 4 °C i 1 minut. Kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret.
OBS: Kolumnen med endast RNA är en av komponenterna i det totala RNA-isoleringssatsen (se materialtabellen). - Upprepa steg 8.4 för att bearbeta den återstående blandningen från steg 8.3.
- Tillsätt 500 μl buffert RW1 till RNA-kolonnen och centrifugera vid 8 550 × g vid 4 °C i 1 minut. Kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret.
OBS: Buffert RW1 är en av komponenterna i det totala RNA-isoleringssatsen (se materialtabellen). - Tillsätt 700 μl buffert RW2 till RNA-kolonnen och centrifugera vid 8 550 × g vid 4 ◦C i 1 min. Kassera avfallsvätskan i uppsamlingsröret. Upprepa steg 8.7 en gång.
OBS: Buffert RW2 är en av komponenterna i det totala RNA-isoleringssatsen (se materialtabellen). - Sätt tillbaka RNA-kolonnen i uppsamlingsröret och centrifugera vid 8550 × g vid 4 °C i 2 minuter för att avlägsna den återstående bufferten RW2.
- Överför RNA-kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör och droppa 100 μl RNasfrittddH2O förvärmt vid 65 °C i mitten av membranet för enbart RNA-kolonnen. Placera vid 25 °C i 2 minuter och samla upp RNA-lösningen genom centrifugering vid 8 550 × g vid 4 °C i 1 minut.
OBS: RNasfri ddH2O är en av komponenterna i det totala RNA-isoleringssatsen (se materialtabellen). - Tillsätt 4 μl 5x reaktionsbuffert, 1 μl oligo (dT)18 primer, 1 μl slumpmässig hexamerprimer, 1 μl genspecifik primer (se tabell 1), 1 μl enzymblandning och 5 μg RNA-lösning från steg 8.9 i en 100 μL 8-rörsremsa. Komplettera reaktionssystemet med RNasfritt vatten till 20 μL.
- Ställ in systemets reaktionsförhållanden enligt följande: (1): 95 °C, 30 s, 1 cykel; (2): 95 °C, 5 s, 50 cykler, 60 °C, 34 s. (3): 95 °C, 5 s, 1 cykel, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s. och (4): 42 °C, 30 s, 1 cykel. Utför qRT-PCR-proceduren.
OBS: De relativa uttrycksnivåerna för målgenerna analyserades kvantitativt med 2−ΔΔCT-metoden 36,37. Primerinformationen för varje gen som används för qRT-PCR-analysen anges i tabell 1.
9. Statistisk analys
- Uttryck data som medelvärdet ± standardavvikelsen för tre oberoende experiment.
- Analysera jämförelserna mellan flera grupper med hjälp av graf- och analysprogram (se materialtabellen) med en envägsanalys av varians (ANOVA) följt av ett Tukey-test. I detta arbete definierades P < 0,05 som statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av Sal på att hämma överskottsproliferation och fördröja sårläkning i MCF-7-celler
För att undersöka Sals potential mot bröstcancer testade vi först dess anticanceregenskaper med hjälp av cellproliferationstoxicitet och repanalyser av den humana bröstcancercellinjen MCF-7. Dessa celler saminkuberades med en koncentrationsserie av Sal (5-320 μM) under 24 timmar, och cellproliferationen utvärderades med hjälp av en CCK-8-analys. En dosberoende hämmande effekt av Sal på cellproliferation observerades, med en 50-procentig minskning av cellvitaliteten vid 40 μM (Figur 2A). Salkoncentrationer på 20 μM, 40 μM och 80 μM valdes sedan för efterföljande tidpunkter och sårläkningsutvärdering. Resultaten i figur 2B visar att Sal kan hämma vitaliteten hos MCF-7-celler över tid, med en 50% minskning av MCF-7-cellens vitalitet efter 24 timmars saminkubation. Figur 2C-R visar den hämmande effekten av Sal-behandling på sårläkningen av MCF-7-celler, som bestäms av sårskrapanalysen. Ytterligare cellskrapningstester bekräftade också att 24 timmars odling med Sal (20 μM, 40 μM och 80 μM) kraftigt hindrade sårläkningsprocessen (Figur 2C,D).
Undertryckande av malign migration och invasion av MCF-7-celler av Sal
Migrationen av ett stort antal tumörceller och tendensen att invadera paracancervävnader erkänns som typiska egenskaper hos maligna tumörer. Effekterna av Sal på migration och invasion av MCF-7-celler testades ytterligare med hjälp av ett transwell-system belagt med eller utan extracellulär matrixgel. Sal-behandling minskade signifikant den oönskade migrationen (Figur 3A-F) och invasionen (Figur 3G-L) av MCF-7-celler. Som framgår av figur 3A neutraliserade behandling med Sal överraskande migrationen av MCF-7-celler. Nästan enhälligt stängdes den skadliga invasionsprocessen av MCF-7-celler effektivt av efter inkubation med Sal (Figur 3B). Ovanstående data bekräftade till fullo fördelarna med Sal för att hämma bröstcancer.
Effekter av Sal för att främja apoptos och förbättra cykelstopp i MCF-7-celler
Immortalisering och periodisk reproduktion av cancerceller ger möjligheter för cancer att förvärras och spridas. Som en självklarhet har främjandet av apoptos och cykelundertryckning också blivit accepterade strategier för att förebygga cancer. Resultaten av flödescytometri tydde på att Sal-behandling ökade antalet MCF-7-celler i de tidiga och sena apoptotiska stadierna (Figur 4A). Jämfört med kontrollgruppen ökade Sal-behandlingen också kraftigt antalet celler i G0/G1-fasen, samtidigt som andelen S-fasceller minskade (Figur 4B). Främjandet av apoptos och cykelstillestånd kan fungera som den möjliga farmakologiska verkan av Sal mot bröstcancer.
Effekt av Sal på stimulering av intracellulär ROS och Ca2+ överproduktion i MCF-7-celler
Den kontinuerliga stimuleringen av intracellulär ROS- och Ca2+-produktion kan effektivt hämma tillväxten av tumörceller. Figur 5A-E visar ROS-halten bedömd med DCFH-DA immunofluorescensfärgning. De kvantitativa resultaten för ROS visas i figur 5F. Immunofluorescensfärgning av fluo-4 AM användes för att detektera koncentrationen av Ca2+ (Figur 5G-K). Figur 5L visar de kvantitativa resultaten för Ca2+. DCFH-DA-resultaten visade att Sal signifikant förbättrade ROS-fluorescenssignalerna jämfört med kontrollgruppen (Figur 5A). Konsekvent förhöjde Sal-interventionen också tydligt Ca2+-produktionen, vilket framgår av den markerade Fluo-4 AM-fluorescenssignalen (figur 5B). Sammantaget indikerade dessa resultat att ROS- och Ca2+-signaler delvis kan vara involverade i Sals anti-bröstcanceraktivitet.
Effekt av Sal för att inducera apoptos i mitokondriell väg för MCF-7-celler
Det finns rikligt med bevis för att apoptos inducerad av mitokondriell dysfunktion avgör det slutliga ödet för många tumörceller. För att avgöra om Sal förmedlar mitokondriell funktionsreglering och apoptosfrämjande effekter i MCF-7-celler, visades det först att Sal begränsade enzymvitaliteten hos Na+-K+-ATPas (Figur 6A) och Ca2+-ATPas (Figur 6B), vilket indikerar dess potentiella roll för att främja mitokondriell dysfunktion. Därefter visade western blot- och qRT-PCR-data att Sal-behandling främjade protein- och genuttrycket av de pro-apoptotiska faktorerna CC-9 (Figur 6C,D,G), CC-7 (Figur 6C,E,H), CC-3 (Figur 6C,F,I), Bim (Figur 6C,J,M) och Bax (Figur 6C,L,O), medan den hämmade proteinet och genuttrycket av anti-apoptotisk Bcl-2 (Figur 6C,K,N). Dessa data visar delvis att mitokondriell dysfunktion i MCF-7-celler i kombination med apoptos kan vara involverad i Sals verkningsmekanism mot bröstcancer.
Effekt av Sal på undertryckandet av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen i MCF-7-celler
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen, som är en avgörande signaltransduktionsväg som reglerar tumörtillväxt, är involverad i den patologiska progressionen och försämringen av bröstcancer. Western blot-resultaten visade att Sal-behandling på ett framträdande sätt begränsade kvoterna mellan p-PI3K/PI3K (Figur 7A,B) och p-AKT/AKT (Figur 7A,C). Samtidigt undertrycktes proteinuttrycket av mTOR (Figur 7A,D), HIF-1α (Figur 7A,E) och FoxO1 (Figur 7A,F) också märkbart av Sal-behandling. Ytterligare qRT-PCR-analys visade också att Sal-administrering minskade genuttrycksnivåerna av PI3K (Figur 7G), AKT (Figur 7H), mTOR (Figur 7I), HIF-1α (Figur 7J) och FoxO1 (Figur 7K). Sammanfattningsvis kan hämningen av aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen vara en potentiell molekylär mekanism för Sal mot bröstcancer.
Figur 1: Schematisk illustration av Sals verkan mot bröstcancerns MCF-7-cellinje. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: MCF-7-cellproliferationstoxicitet och sårläkningsegenskaper hos Sal. (A) och (B) visar dostidseffekter av Sal-behandling på MCF-7-cellaktivitet. (C-R) Hämmande effekt av Sal-behandling på sårläkning i MCF-7-celler, som bestäms av sårskrapningsanalysen. Ovanstående data illustreras som medelvärdet ± SD, n = 3. ##p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Skalstreck: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Undertryckande av den maligna migrationen och invasionen av MCF-7-celler genom Sal-behandling. Sal-behandling minskar signifikant den oönskade (A-F) migrationen och (G-L) invasionen av MCF-7-celler. Ovanstående data illustreras som medelvärdet ± SD, n = 3. <#p < 0,05 och ##p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Skalstreck: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Främjande av apoptos och undertryckande av cellcykeln av Sal. (A) apoptotisk främjande och (B) cellcykelstoppeffekter av Sal på MCF-7-celler, som detekteras med flödescytometri. Ovanstående data illustreras som medelvärdet ± SD, n = 3. #p < 0,05 och ##p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ökning av ROS och Ca2+ i MCF-7-celler orsakade av Sal-behandling. (A-E) ROS-halten bedömdes med DCFH-DA immunofluorescensfärgning. (F) Kvantitativa resultat för ROS. (G-K) Fluo-4 AM immunofluorescensfärgning användes för att detektera Ca2+-koncentrationen. (L) Kvantitativa resultat för Ca2+. Ovanstående data illustreras som medelvärdet ± SD, n = 3. #p < 0,05 och ##p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Skalstreck: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Effekt av Sal-behandling på inducering av mitokondriell dysfunktion i kombination med apoptos i MCF-7-celler. Den reducerade enzymaktiviteten hos (A) Na+-K+-ATPas och (B) Ca2+-ATPas. (C) Representativa proteinuttrycksband och deras motsvarande statistiska resultat för (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 och (L) Bax-proteiner och för (G) kaspas-9, (H) kaspas-7, (I) kaspas-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 och (O) Bax-gener. Ovanstående data illustreras som medelvärdet ± SD, n = 3. #p < 0,05 och ##p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Undertryckande av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen genom Sal-behandling . (A) Representativa proteinband påvisade genom western blot-analys. Sal reducerade proteinuttrycket av (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α och (F) FoxO1. Sal dämpade genuttrycksnivåerna av (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α och (K) FoxO1. Ovanstående data illustreras som medelvärdet ± SD, n = 3. # #p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Stimulering av ROS- och Ca2+ -produktion i MCF-7-celler med Sal, åtföljd av hämning av PI3K-signaltransduktion. Med inblandning av mTOR reducerades fosforyleringen av AKT ytterligare efter Sal-administrering. Följaktligen blockerade det nedreglerade uttrycket av HIF-1α och FoxO1 den periodiska maligna proliferationen av MCF-7-celler. Samtidigt antydde den förbättrade apoptosen av MCF-7-celler Sals anti-bröstcancerpotential. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Gen | GenBank anslutning nr. | Primer-sekvens (5'-3') | Längd (bp) | |
| Caspase-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-aktin | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, framåt; R, omvänt. | ||||
Tabell 1: Primers som används för den omvända transkriptionen-kvantitativa polymeraskedjereaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bröstcancer drabbar individer i alla åldrar och orsakar oöverskådlig fysisk och psykisk börda och stor ekonomisk press1. Bröstcancer, med dess ökande sjuklighet och dödlighet varje år, har också väckt uppmärksamhet över hela världen när det gäller att söka effektiva växtbaserade sammansatta terapier utöver konventionella behandlingar 4,5. Lovande nog har en stor mängd bevis avslöjat anti-cancereffekterna av Sal24,25,38. Tyvärr är Sals roll i bröstcancer och de underliggande molekylära mekanismerna fortfarande till stor del okända. Denna studie belyser de betydande hämmande effekterna av Sal på proliferation, migration och invasion av den humana bröstcancercellinjen MCF-7. Därefter avslöjade vi potentialen hos Sal i irriterande apoptos och cykelstopp av MCF-7-celler. Samtidigt visade dessa data också att Sal-administrering ökade nivåerna av ROS och Ca2+. Ytterligare utforskning av de molekylära mekanismerna visade den apoptosfrämjande effekten av Sal vid behandling av bröstcancer och effekten av Sal på PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-vägen.
Malign och okontrollerad spridning kan påskynda utvecklingen av bröstcancer och öka risken för lymfatisk39 och hjärnmetastaser40. För närvarande har tillgängliga kemoterapeutiska läkemedel på marknaden gradvis dykt upp, men dessa har problemet med låg känslighet för behandling av bröstcancer, vilket tvingar människor att söka mer potenta föreningar eller nya läkemedelskombinationer 2,3. Data i detta arbete visade först att Sal-behandling begränsade den maligna proliferationen av MCF-7-celler. Efterföljande cellskrapningsanalyser bekräftade vidare att 12 timmar och 24 timmars Sal-inkubation minskade konvergenshastigheten för MCF-7-celler. Tester för tumörcellers migration och invasionsförmåga betraktas som känsliga indikatorer för screening av antitumörläkemedel24,25. Data i detta arbete tyder på att Sal kraftigt minskade processen för MCF-7-cellmigration och invasion, i linje med tidigare fynd33,34. Tumörcellernas okontrollerade cellcykel avgör ödet för cellodödlighet24. Därför har främjande av apoptos och avbrott i cellcykeln blivit erkända och accepterade index för att utvärdera anticancerpotentialen hos föreningar25. I detta arbete indikerade flödescytometrianalys att Sal-behandling signalerade ökad apoptos i MCF-7-celler, vilket framgår av en ökad andel tidiga och sena apoptotiska celler. Dessutom ökade förhållandet mellan G0/G1-celler och S-fasen av MCF-7-cellcykeln stördes, vilket indikerar de cellcykelblockerande effekterna av Sal på bröstcancerceller.
Den milda hypoxiska bröstcancercellernas mikromiljö är förknippad med begränsningar i ROS- och Ca2+ -produktionen; således kan överdriven ROS- och Ca2+ -ackumulering inducera apoptotiska händelser i bröstcancerceller41. Immunofluorescensresultaten i detta arbete visade att Sal-intervention i hög grad stimulerade ROS- och Ca2+ -produktion, vilket ytterligare kan inducera apoptos av MCF-7-celler. Nya bevis har visat att förhöjda nivåer av de pro-apoptotiska proteinerna Bax och Bim, liksom minskade nivåer av det anti-apoptotiska proteinet Bcl-2, tillfälligt och med våld kan öppna passagen av material in och ut ur mitokondriemembranet, vilket utlöser programmerad apoptos av tumörceller42. I denna studie ökade saminkubationen av Sal med MCF-7-celler signifikant Bax och Bim samtidigt som proteinet och genuttrycket av Bcl-2 minskade, vilket tyder på dess potentiella farmakologiska effekter på att främja apoptos i bröstcancerceller. Dessa data tydde också på att Sal tydligt inducerade uttrycket av CC-9-, CC-7- och CC-3-proteiner, som är viktiga nedströmsindikatorer för mitokondriell apoptosväg, och deras motsvarande gener. Ovanstående data tyder delvis på att den proapoptotiska effekten av Sal på bröstcancer kan vara relaterad till aktiveringen av mitokondriell apoptos.
Molekylära mekanismstudier har bekräftat att fosforyleringen av PI3K ytterligare kan inducera AKT-fosforylering och påskynda tillväxten av bröstcancerceller 6,7. Under tiden bidrar den stora ackumuleringen av mTOR också till försämringen av bröstcancer genom att delta i AKT-fosforyleringsprocessen 8,9. Å ena sidan stimulerar fosforylerad AKT direkt FoxO1-uttryck för att främja bröstcancercellcykeln och bromsa apoptos22,23. Parallellt aktiverar aktiverad AKT indirekt HIF-1α-uttryck för att ge FoxO1, vilket resulterar i bröstcancerprogression och metastasering16,17. Följaktligen kan hämning av aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-signalvägen vara en ny strategi för behandling av bröstcancer. Med ingripande av PI3K-hämmaren LY294002 visade data att Sal observerbart undertryckte fosforyleringen av PI3K. I samband med nedregleringen av mTOR-proteinuttrycket sänkte Sal också uttrycksnivåerna av fosforylerad AKT. Som ett resultat minskade HIF-1α- och FoxO1-proteinuttrycket också kraftigt efter Sal-behandling. På samma sätt visade qRT-PCR-resultaten att Sal-behandling i hög grad minskade gennivåerna av PI3K, AKT, HIF-1α och FoxO1, vilket bidrog till främjandet av cykelstopp och apoptos av MCF-7-celler (Figur 8). Sammantaget tyder de erhållna uppgifterna på att Sal kan vara en potentiell aktiv förening av naturligt växtbaserat ursprung med verkan mot bröstcancer. Främjandet av MCF-7-cellapoptos och cellcykelhämning genom Sal-behandling försvagade kraftigt bröstcancercellernas migrations- och invasionsförmåga. Noterbart är att den molekylära verkningsmekanismen för Sal mot bröstcancer kan vara relaterad till hämningen av PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-vägen. Sammantaget ger detta protokoll som integrerar flera experimentella metoder ett visst referensvärde för forskning och utveckling av läkemedel mot bröstcancer.
I denna studie finns det inga direkta bevis för den molekylära mekanismen för Sal mot bröstcancer. PI3K knockout-möss, bröstcancercellinjer med högt eller lågt uttryck av PI3K-proteinet och lokala ytplasmonresonanstekniker är nästa steg som kan användas för att bekräfta de direkta molekylära målen för Sal för förebyggande och behandling av bröstcancer29,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av hälsokommissionen i Sichuanprovinsen (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
