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Medicine

MCF-7 सेल प्रसार और प्रवासन को रोकने में सैलिड्रोसाइड की औषधीय क्रिया और आणविक तंत्र की खोज

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65634
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एमसीएफ -7 सेल प्रसार और प्रवासन को रोकने में औषधीय कार्रवाई और सैलिड्रोसाइड के तंत्र के मूल्यांकन के लिए एक व्यापक रणनीति का वर्णन करता है।

Abstract

Salidroside (Sal) में एंटी-कार्सिनोजेनिक, एंटी-हाइपोक्सिक और एंटी-इंफ्लेमेटरी औषधीय गतिविधियां होती हैं। हालांकि, इसके अंतर्निहित स्तन विरोधी कैंसर तंत्र को केवल अपूर्ण रूप से स्पष्ट किया गया है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानव स्तन कैंसर MCF-3 कोशिकाओं के घातक प्रसार में PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग को विनियमित करने में Sal की क्षमता को डिकोड करना है। सबसे पहले, एमसीएफ -7 के खिलाफ सैल की औषधीय गतिविधि का मूल्यांकन सीसीके -8 और सेल स्क्रैच परख द्वारा किया गया था। इसके अलावा, एमसीएफ -7 कोशिकाओं के प्रतिरोध को प्रवासन और मैट्रिगेल आक्रमण परख द्वारा मापा गया था। सेल एपोप्टोसिस और चक्र परख के लिए, एमसीएफ -7 कोशिकाओं को क्रमशः प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई और सेल चक्र-धुंधला पहचान किट के साथ चरणों में संसाधित किया गया था। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और सीए2+ के स्तर की जांच डीसीएफएच-डीए और फ्लो -4 एएम इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा की गई थी। Na+-K+-ATPase और Ca2+-ATPase की गतिविधियों को संबंधित वाणिज्यिक किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एपोप्टोसिस और PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग में प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति के स्तर को क्रमशः पश्चिमी धब्बा और qRT-PCR विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। हमने पाया कि सैल उपचार ने खुराक पर निर्भर प्रभावों के साथ एमसीएफ -7 कोशिकाओं के प्रसार, प्रवास और आक्रमण को काफी प्रतिबंधित कर दिया। इस बीच, सैल प्रशासन ने नाटकीय रूप से एमसीएफ -7 कोशिकाओं को एपोप्टोसिस और सेल चक्र गिरफ्तारी से गुजरने के लिए मजबूर किया। इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षणों से पता चला है कि सैल ने एमसीएफ -7 कोशिकाओं में आरओएस और सीए2+ उत्पादन को उत्तेजित किया है। आगे के आंकड़ों ने पुष्टि की कि सैल ने प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन, बैक्स, बिम, क्लीव्ड कैसपेज़-9/7/3 और उनके संबंधित जीन के अभिव्यक्ति स्तर को बढ़ावा दिया। लगातार, सैल हस्तक्षेप ने Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, और FoxO1 प्रोटीन और उनके संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को प्रमुखता से कम कर दिया। अंत में, सैल का उपयोग स्तन कैंसर के इलाज के लिए एक संभावित जड़ी-बूटी-व्युत्पन्न यौगिक के रूप में किया जा सकता है, क्योंकि यह PI7K-AKT-HIF-3α-FoxO1 मार्ग को बाधित करके MCF-1 कोशिकाओं के घातक प्रसार, प्रवास और आक्रमण को कम कर सकता है।

Introduction

सबसे अधिक निदान किए जाने वाले कैंसर और सबसे आम विकृतियों में से एक के रूप में, नवीनतम आंकड़े बताते हैं कि 2020 तक दुनिया भर में स्तन कैंसर के 2.3 मिलियन मामले सामने आए, जो सभी कैंसरके मामलों का 11.7% है। स्तन कैंसर के सामान्य लक्षणों में स्तन कोमलता और झुनझुनी, स्तन गांठ और दर्द, निप्पल निर्वहन, कटाव या धँसी हुई त्वचा, और बढ़े हुए एक्सिलरी लिम्फ नोड्स 1,2 शामिल हैं। इससे भी अधिक खतरनाक, नए मामलों की संख्या और स्तन कैंसर की समग्र घटनाओं में हर साल भारी दर से वृद्धि जारी है, जो कैंसर सेसंबंधित मौतों का 6.9% है। वर्तमान में, स्तन कैंसर के हस्तक्षेप में अभी भी मुख्य रूप से कीमोथेरेपी, सर्जरी, रेडियोथेरेपी और व्यापक उपचार शामिल हैं। यद्यपि उपचार रोगियों की पुनरावृत्ति दर और मृत्यु दर को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है, दीर्घकालिक उपचार आवेदन अक्सर मल्टीड्रग प्रतिरोध, बड़े क्षेत्र के बालों के झड़ने, मतली और उल्टी, और गंभीर मानसिक और मनोवैज्ञानिक बोझ 2,3का उत्पादन करता है। विशेष रूप से, स्तन कैंसर से कई अंग मेटास्टेस का संभावित जोखिम भी लोगों को ड्रग थेरेपी 4,5 के उपन्यास हर्बल स्रोतों की तलाश करने के लिए मजबूर करता है।

फॉस्फोइनोसाइटाइड 3 किनेज (PI3K)-मध्यस्थता सिग्नलिंग को स्तन कैंसर के विकास, प्रसार और अस्तित्व में स्प्लिसिंग के माध्यम से फंसाया जाता है जो कई जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है6. PI3K के डाउनस्ट्रीम सिग्नल-सेंसिंग प्रोटीन के रूप में, कई सबूत बताते हैं कि प्रोटीन किनेज बी (AKT) स्तन कैंसर 7,8,9 को और बढ़ाने के लिए रैपामाइसिन (एमटीओआर) प्रोटीन के स्तनधारी लक्ष्य के साथ जुड़ सकता है। इसके अलावा, PI3K/AKT/mTOR सिग्नलिंग को निष्क्रिय करने का दावा भी घातक प्रसार को रोकने और स्तन कैंसर10,11,12में एपोप्टोसिस को उत्तेजित करने वाली दवाओं में एक प्रमुख घटक होने का दावा किया गया है। यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि ट्यूमर microenvironment में चरम हाइपोक्सिया हाइपोक्सिया-inducible कारक 1 अल्फा (HIF-1α), जो आगे स्तन कैंसर13,14,15 की प्रगति बिगड़ती में भारी वृद्धि बलों. समानांतर में, AKT उत्तेजना भी HIF-1α के अत्यधिक संचय की ओर जाता है, स्तन कैंसर के नमूनों16,17 में apoptosis सीमित. दिलचस्प बात यह है कि PI3K-AKT-HIF-1α सिग्नलिंग की सक्रियता को फेफड़ों के कैंसर18, कोलोरेक्टल कैंसर19, डिम्बग्रंथि के कैंसर20 और प्रोस्टेट कैंसर21 सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर में पैथोलॉजिकल प्रगति और मेटास्टेसिस में शामिल होने की पुष्टि की गई है। HIF-1α द्वारा ऑर्केस्ट्रेटेड होने के अलावा, फोर्क्ड हेड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 1 (फॉक्सओ 1) ओवरएक्सप्रेशन भी AKT सिग्नलिंग उत्तेजना से ट्रिगर होता है, जो चक्र गिरफ्तारी और स्तन कैंसर कोशिकाओं22,23में एपोप्टोसिस के निषेध को बढ़ावा देता है। साथ में, उपरोक्त ठोस सबूत बताते हैं कि PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 सिग्नलिंग के झरने का निषेध स्तन कैंसर में ड्रग थेरेपी के लिए एक संभावित उपन्यास लक्ष्य हो सकता है।

Salidroside (सैल) व्यापक रूप से विरोधी कैंसर 24,25, विरोधी हाइपोक्सिया26,27,28,29, और प्रतिरक्षा बढ़ाने औषधीय गतिविधियों30 लागू करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. यह एक हल्का भूरा या भूरा पाउडर है जो पानी में आसानी से घुलनशील होता है, फेनिलथानोइड ग्लाइकोसाइड का एक प्रकार है, और इसमें सी14एच 20 ओ7 का रासायनिक संरचना सूत्र और300.331,32 का आणविक भार होता है। आधुनिक औषधीय जांच से पता चला है कि सैल PI3K-AKT-mTOR सिग्नलिंग24 को रोककर गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं के apoptosis को बढ़ावा दे सकते हैं. आगे के सबूत यह भी बताते हैं कि सैल उपचार द्वारा PI3K-AKT-HIF-1α सिग्नलिंग का दमन कीमोथेरेपी एजेंटों25 के प्रति उनकी संवेदनशीलता को बढ़ाकर कैंसर कोशिकाओं के एपोप्टोसिस में योगदान कर सकता है। साक्ष्य यह भी पता चलता है कि सैल सेल माइग्रेशन और आक्रमण को प्रतिबंधित करता है और मानव स्तन कैंसर एमसीएफ -7 कोशिकाओं33,34 में एपोप्टोसिस को बढ़ावा देकर चक्र गिरफ्तारी का कारण बनता है। हालांकि, यह देखा जाना बाकी है कि क्या सैल PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 सिग्नलिंग को विनियमित कर सकता है और MCF-7 कोशिकाओं के घातक प्रसार को रोक सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग के माध्यम से MCF-7 सेल माइग्रेशन, आक्रमण, सेल चक्र और एपोप्टोसिस पर सैल के प्रभावों का पता लगाना है। एकीकृत अनुसंधान रणनीतियों में पारंपरिक, कम लागत वाली और स्वतंत्र प्रयोग शामिल हैं, जैसे कि सेल माइग्रेशन और आक्रमण आकलन, एपोप्टोसिस और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल चक्र का पता लगाना, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) और सीए2+ प्रतिदीप्ति निर्धारण, आदि, पारंपरिक हर्बल दवा के साथ कैंसर विरोधी कैंसर अनुसंधान के लिए प्रयोगों के समग्र डिजाइन के लिए एक संदर्भ प्रदान कर सकते हैं। इस अध्ययन की प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्रा 1 में दिखाया गया है.

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Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग की जाने वाली एमसीएफ -7 कोशिकाओं को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)।

1. सेल संस्कृति

  1. संस्कृति एमसीएफ -7 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र 5% सीओ2 वातावरण में डीएमईएम के साथ 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन (10,000 यू / एमएल) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: डिश के नीचे के 90% को कवर करने वाली कोशिकाओं को प्रयोग के लिए नियोजित किया गया था और निम्नलिखित समूहों में सौंपा गया था: नियंत्रण समूह, डॉक्सोरूबिसिन हाइड्रोक्लोराइड समूह (डीएक्सआर, 5 माइक्रोन), और सैल समूह (20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, और 80 माइक्रोन), या नियंत्रण समूह, LY294002 (10 माइक्रोन, पीआई 3 के एक अवरोधक) समूह, साल (80 माइक्रोन) समूह, और LY294002 (10 माइक्रोन) + सैल (80 माइक्रोन) समूह ( सामग्री की तालिकादेखें)।

2. सेल व्यवहार्यता परख

नोट: इस प्रक्रिया के विवरण के लिए, कृपया पिछली रिपोर्ट27 देखें।

  1. बीज एमसीएफ -7 कोशिकाओं के घनत्व के साथ 8 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 96-अच्छी प्लेटों में, और सैल (10 माइक्रोन, 20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, 80 माइक्रोन, 160 माइक्रोन, और 320 माइक्रोन) के साथ सेते हैं।
  2. उपचार के बाद, 2 घंटे के लिए सीसीके -8 समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 10 माइक्रोन / अच्छी तरह से एमसीएफ -7 कोशिकाओं को सह-सेते हैं। फिर, एक स्वचालित माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 450 एनएम (ओडी450) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।

3. सेल माइग्रेशन और आक्रमण

नोट: इस प्रक्रिया के विवरण के लिए, कृपया पिछली रिपोर्ट35 देखें।

  1. पकवान के नीचे के 90% को कवर करने के लिए 6-अच्छी प्लेटों में वरीयता प्राप्त 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल कोशिकाओं के 2 एमएल सेते हैं।
  2. एक बाँझ विंदुक टिप के साथ सेल monolayer के केंद्र के साथ एक रैखिक खरोंच घाव प्रदर्शन. 0 घंटे, 24 घंटे, और 48 घंटे में एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करें।
  3. खरोंच घावों की चौड़ाई को मापने के लिए छवि J सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  4. ट्रांसवेल परख के लिए, एमसीएफ -7 कोशिकाओं को बिना सीरम माध्यम के निलंबित करें, और ऊपरी ट्रांसवेल कक्ष में बीज को मैट्रिगेल के साथ या बिना पूर्व-लेपित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. ट्रांसवेल कक्ष के तल में, एक रासायनिक inducer के रूप में DMEM पूरा माध्यम का उपयोग करें. 24 घंटे के बाद, ऊपरी कक्ष में कोशिकाओं को हटा दें, और मेथनॉल35 में शेष आक्रामक और प्रवासी कोशिकाओं को ठीक करें।
  6. क्रिस्टल वायलेट समाधान के साथ एमसीएफ -7 कोशिकाओं को दाग दें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा.

4. Na+-K+-ATPase और Ca 2+-Mg2+-ATPase का गतिविधि मूल्यांकन

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, lysed MCF-7 कोशिकाओं में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए एक bicinchoninic एसिड (BCA) किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. 96 अच्छी तरह से प्लेटों में उनके इसी समूहों में lysed कोशिकाओं के नमूने जोड़ें. उसके बाद, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे सेते करने के लिए काम कर रहे समाधान जोड़ें. अंत में, एक बहुक्रियाशील माइक्रोप्लेट रीडर के साथ आयुध डिपो636 के मूल्यों को मापें।

5. एपोप्टोसिस और सेल चक्र का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण

नोट: इस प्रक्रिया के विवरण के लिए, कृपया पिछली रिपोर्ट31 देखें।

  1. कोशिकाओं को पचाना, और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में एनेक्सिन वी-एफआईटीसी और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) ( सामग्री की तालिका) के साथ 20 मिनट धुंधला होने के लिए फिर से निलंबित करने के लिए फसल, और फिर प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके एपोप्टोटिक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
  2. एक 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए पीआई समाधान के साथ resuspended नमूना समाधान मिश्रण, एक प्रवाह cytometer के साथ पता लगाने के बाद.

6. DCFH-DA और Fluo-4 AM प्रतिदीप्ति धुंधला हो जाना

नोट: इस प्रक्रिया के विवरण के लिए, कृपया पिछली रिपोर्ट29 देखें।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 माइक्रोन डीसीएफएच-डीए प्रतिदीप्ति जांच ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 20 मिन के लिए एमसीएफ -7 कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ तीन बार धोकर अधिशेष डीसीएफएच-डीए को अच्छी तरह से हटाने के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, क्रमशः 488 एनएम और 525 एनएम की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का परीक्षण करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 5 माइक्रोन फ्लो -4 एएम फ्लोरोसेंट जांच समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एमसीएफ -7 कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। तीन बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, क्रमशः 488 एनएम और 516 एनएम की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों का निर्धारण.

7. पश्चिमी धब्बा

  1. एमएल सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें जिसमें विभिन्न दवाएं 6-अच्छी प्लेटों में होती हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस में संस्कृति, 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
    नोट: पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए समूह निम्नानुसार सेट किए गए थे: नियंत्रण समूह, LY294002 (10 माइक्रोन) समूह, साल (80 माइक्रोन) समूह, और LY294002 (10 माइक्रोन) + साल (80 माइक्रोन) समूह ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए, और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 560 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और पूर्व ठंडा पीबीएस के साथ दो बार धो लें. प्रत्येक धोने के बाद, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 560 × ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  3. 15 मिनट बर्फ स्नान के लिए चरण 7.2 से सेल नमूने में 50 माइक्रोन लाइसिस बफर जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला प्रोटीन नमूना इकट्ठा करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
  4. बीसीए विधि का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का पता लगाने के बाद, 4: 1 के अनुपात में लोडिंग बफर के साथ चरण 7.3 में प्रोटीन नमूना मिलाएं, धातु स्नान में 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर प्रकृति को नष्ट करें, और कमरे के तापमान को ठंडा करें।
  5. चरण 7.4 से प्रोटीन नमूने के 20 माइक्रोग्राम जोड़ें, 10% एसडीएस-पेज (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके विभिन्न आणविक भार35के साथ प्रोटीन को अलग करें, और फिर 0.22 माइक्रोन पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें। 5% बीएसए के साथ रुकावट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इसी प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    नोट: निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी की पतला एकाग्रता 1:1,000 है: क्लीव्ड कैसपेज़-9/7/3 (CC-9/7/3), बिम, बैक्स, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1, और β-actin ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  6. अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। एक ईसीएल chemiluminescent समाधान का उपयोग झिल्ली का विकास, और एक संपर्क रहित मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा इमेजिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर छवियों पर कब्जा.

8. क्यूआरटी-पीसीआर

  1. 3 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 560 x ग्राम पर एमसीएफ -7 कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन करें, और 5 × 106 कोशिकाओं में 500 माइक्रोन बफर आरएल 1 जोड़ें। उड़ा और कोई सेल जनता दिखाई दे रहे हैं जब तक एक विंदुक के साथ बार-बार मिश्रण.
    नोट: बफर आरएल 1 कुल आरएनए अलगाव किट में घटकों में से एक है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. संग्रह ट्यूब में एम्बेडेड डीएनए सफाई स्तंभ के लिए चरण 8.1 में सेल homogenates स्थानांतरण, और 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र. डीएनए सफाई स्तंभ निकालें, और संग्रह ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला रखें.
    नोट: डीएनए-सफाई कॉलम और संग्रह ट्यूब कुल आरएनए अलगाव किट में दो घटक हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. चरण 8.2 से सतह पर तैरनेवाला के 800 माइक्रोन बफर आरएल 2 से 500 माइक्रोन जोड़ें, और धीरे से मिलाएं।
    नोट: बफर आरएल 2 कुल आरएनए अलगाव किट में घटकों में से एक है ( सामग्री की तालिकादेखें)। उपयोग करने से पहले बफर आरएल 2 के 60 एमएल में निर्जल इथेनॉल के 120 एमएल जोड़ें।
  4. संग्रह ट्यूब में एम्बेडेड आरएनए-केवल कॉलम में चरण 8.3 से मिश्रण के 700 माइक्रोन को स्थानांतरित करें, और 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल त्यागें।
    नोट: आरएनए-केवल कॉलम कुल आरएनए अलगाव किट में घटकों में से एक है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. चरण 8.3 से शेष मिश्रण को संसाधित करने के लिए चरण 8.4 दोहराएं।
  6. आरएनए-केवल कॉलम में बफर आरडब्ल्यू 1 के 500 माइक्रोन जोड़ें, और 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल त्यागें।
    नोट: बफर आरडब्ल्यू 1 कुल आरएनए अलगाव किट में घटकों में से एक है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. आरएनए-केवल कॉलम में बफर आरडब्ल्यू 2 के 700 माइक्रोन जोड़ें, और 1 मिनट के लिए 4 ◦ सी पर 8,550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। संग्रह ट्यूब में अपशिष्ट तरल त्यागें। चरण 8.7 को एक बार दोहराएं।
    नोट: बफर आरडब्ल्यू 2 कुल आरएनए अलगाव किट में घटकों में से एक है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  8. संग्रह ट्यूब में वापस आरएनए-केवल स्तंभ रखें, और शेष बफर RW2 को हटाने के लिए 2 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
  9. आरएनए-केवल कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें, और आरएनए-मुक्त डीडीएच2ओ के 100 माइक्रोन को केवल आरएनए-कॉलम के लिए झिल्ली के केंद्र में 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें। 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,550 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा शाही सेना समाधान इकट्ठा करें।
    नोट: RNase-मुक्त ddH2O कुल RNA आइसोलेशन किट के घटकों में से एक है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  10. 5x प्रतिक्रिया बफर के 4 माइक्रोन, ओलिगो (डीटी) 18 प्राइमर के 1 माइक्रोन, यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमर के 1 माइक्रोन, जीन-विशिष्ट प्राइमर के 1 माइक्रोन (तालिका 1 देखें), एंजाइम मिश्रण के 1 माइक्रोन, और आरएनए समाधान के 5 माइक्रोन को चरण 8.9 से 100 माइक्रोन 8-ट्यूब पट्टी में जोड़ें। RNase मुक्त पानी के साथ प्रतिक्रिया प्रणाली को 20 μL तक पूरक करें।
  11. सिस्टम की प्रतिक्रिया की स्थिति निम्नानुसार सेट करें: (1): 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस, 1 चक्र; (2): 95 डिग्री सेल्सियस, 5 सेकंड, 50 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस, 34 एस; (3): 95 डिग्री सेल्सियस, 5 सेकंड, 1 चक्र, 65 डिग्री सेल्सियस, 60 सेकंड, 97 डिग्री सेल्सियस, 1 सेकंड; और (4): 42 डिग्री सेल्सियस, 30 एस, 1 चक्र। क्यूआरटी-पीसीआर प्रक्रिया निष्पादित करें।
    नोट: लक्ष्य जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर मात्रात्मक 2−ΔΔCT विधि36,37 द्वारा विश्लेषण किया गया. क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक जीन की प्राइमर जानकारी तालिका 1में सूचीबद्ध है।

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± मानक विचलन के रूप में डेटा को व्यक्त करें।
  2. रेखांकन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके कई समूहों के बीच तुलना का विश्लेषण विचरण (एनोवा) के एक तरफ़ा विश्लेषण के साथ एक टुकी के परीक्षण के बाद करें। इस काम में, पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में परिभाषित किया गया था।

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Representative Results

एमसीएफ -7 कोशिकाओं में अतिरिक्त प्रसार को रोकने और घाव भरने में देरी पर एसएएल के प्रभाव
स्तन कैंसर के खिलाफ एसएएल की क्षमता की जांच करने के लिए, हमने पहले मानव स्तन कैंसर एमसीएफ -7 सेल लाइन के सेल प्रसार विषाक्तता और खरोंच परख का उपयोग करके इसके एंटीकैंसर गुणों का परीक्षण किया। इन कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सैल (5-320 माइक्रोन) की एकाग्रता श्रृंखला के साथ सह-ऊष्मायन किया गया था, और सेल प्रसार का मूल्यांकन सीसीके -8 परख का उपयोग करके किया गया था। सेल प्रसार पर सैल की एक खुराक पर निर्भर निरोधात्मक प्रभाव 40 माइक्रोन(चित्रा 2ए)पर सेल जीवन शक्ति में 50% गिरावट के साथ देखा गया था। 20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, और 80 माइक्रोन की साल सांद्रता को बाद के समय बिंदुओं और घाव भरने के मूल्यांकन के लिए चुना गया था। चित्रा 2 बी में परिणाम बताते हैं कि सैल समय के साथ एमसीएफ -7 कोशिकाओं की जीवन शक्ति को बाधित कर सकता है, सह-इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद एमसीएफ -7 सेल जीवन शक्ति में 50% की कमी के साथ। चित्रा 2 सी-आर एमसीएफ -7 कोशिकाओं के घाव भरने पर एसएएल उपचार के निरोधात्मक प्रभाव को दर्शाता है, जैसा कि घाव खरोंच परख द्वारा निर्धारित किया गया है। आगे सेल स्क्रैच परीक्षणों ने यह भी पुष्टि की कि सैल (20 माइक्रोन, 40 माइक्रोन, और 80 माइक्रोन) के साथ संस्कृति के 24 घंटे ने घाव भरने की प्रक्रिया में तेजी से बाधा डाली (चित्र 2सी, डी)।

सैल द्वारा घातक प्रवास और एमसीएफ -7 कोशिकाओं के आक्रमण का दमन
बड़ी संख्या में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास और पैराकैंसर ऊतकों पर आक्रमण करने की प्रवृत्ति को घातक ट्यूमर की विशिष्ट विशेषताओं के रूप में पहचाना जाता है। एमसीएफ -7 कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण पर एसएएल के प्रभावों को बाह्य मैट्रिक्स जेल के साथ या बिना लेपित ट्रांसवेल सिस्टम का उपयोग करके आगे परीक्षण किया गया था। सैल उपचार ने एमसीएफ-7 कोशिकाओं के अवांछनीय प्रवासन (चित्रा 3ए-एफ) और आक्रमण (चित्रा 3जी-एल) को काफी कम कर दिया। जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, सैल के साथ उपचार ने आश्चर्यजनक रूप से एमसीएफ -7 कोशिकाओं के प्रवास को बेअसर कर दिया। लगभग सर्वसम्मति से, एमसीएफ -7 कोशिकाओं की दुर्भावनापूर्ण आक्रमण प्रक्रिया सैल (चित्रा 3 बी) के साथ इनक्यूबेशन के बाद प्रभावी ढंग से बंद कर दी गई थी। उपरोक्त आंकड़ों ने स्तन कैंसर को रोकने में सैल के फायदों की पूरी तरह से पुष्टि की।

एपोप्टोसिस को बढ़ावा देने और एमसीएफ -7 कोशिकाओं में चक्र गिरफ्तारी को बढ़ाने में एसएएल के प्रभाव
कैंसर कोशिकाओं का अमरता और आवधिक प्रजनन कैंसर को खराब होने और फैलने के अवसर प्रदान करता है। बेशक, एपोप्टोसिस और चक्र दमन को बढ़ावा देना भी कैंसर को रोकने के लिए स्वीकृत रणनीति बन गया है। प्रवाह साइटोमेट्री के परिणामों ने सुझाव दिया कि सैल उपचार ने प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक चरणों(चित्रा 4ए)में एमसीएफ-7 कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की। इस बीच, नियंत्रण समूह के साथ तुलना में, सैल उपचार ने एस चरण कोशिकाओं(चित्रा 4बी)के अनुपात को कम करते हुए जी0/जी1 चरण में कोशिकाओं की संख्या में भी तेजी से वृद्धि की। एपोप्टोसिस और चक्र गिरफ्तारी का प्रचार स्तन कैंसर के खिलाफ सैल की संभावित औषधीय कार्रवाई के रूप में काम कर सकता है।

एमसीएफ -7 कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस और सीए2+ ओवरप्रोडक्शन को उत्तेजित करने पर एसएएल का प्रभाव
इंट्रासेल्युलर आरओएस और सीए2+ उत्पादन की निरंतर उत्तेजना ट्यूमर कोशिकाओं के विकास को प्रभावी ढंग से रोक सकती है। चित्रा 5 ए-ई डीसीएफएच-डीए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा मूल्यांकन की गई आरओएस सामग्री दिखाता है। आरओएस के लिए मात्रात्मक परिणाम चित्रा 5 एफ में दिखाए गए हैं। फ्लुओ -4 एएम इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला सीए2 + एकाग्रता (चित्रा 5 जी-के) का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था। चित्रा 5L सीए2 + के लिए मात्रात्मक परिणाम दिखाता है। डीसीएफएच-डीए परिणामों से पता चला है कि सैल ने नियंत्रण समूह(चित्रा 5ए)की तुलना में आरओएस प्रतिदीप्ति संकेतों को काफी बढ़ाया है। लगातार, सैल हस्तक्षेप ने भी स्पष्ट रूप से सीए2+ उत्पादन को ऊंचा कर दिया, जो हाइलाइट किए गए फ्लू -4 एएम प्रतिदीप्ति संकेत(चित्रा 5बी)द्वारा प्रमाणित है। इन परिणामों ने सामूहिक रूप से संकेत दिया कि आरओएस और सीए2+ सिग्नल सैल की स्तन कैंसर विरोधी गतिविधि में आंशिक रूप से शामिल हो सकते हैं।

एमसीएफ -7 कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल मार्ग में एपोप्टोसिस को प्रेरित करने में एसएएल का प्रभाव
प्रचुर मात्रा में सबूत हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से प्रेरित एपोप्टोसिस कई ट्यूमर कोशिकाओं के अंतिम भाग्य को निर्धारित करता है। यह निर्धारित करने में कि क्या सैल एमसीएफ -7 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन विनियमन और एपोप्टोसिस-प्रचार प्रभावों की मध्यस्थता करता है, यह पहली बार प्रदर्शित किया गया था कि सैल ने ना +-के + -एटीपीस (चित्रा 6ए)और सीए2+-एटीपीस (चित्रा 6बी)के एंजाइम जीवन शक्ति को प्रतिबंधित कर दिया है, इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को बढ़ावा देने में इसकी संभावित भूमिका का संकेत मिलता है। इसके बाद, पश्चिमी धब्बा और क्यूआरटी-पीसीआर डेटा से पता चला है कि सैल उपचार ने प्रो-एपोप्टोटिक कारकों सीसी-9(चित्रा 6सी,डी,जी),सीसी-7(चित्रा 6सी,ई,एच)सीसी-3(चित्रा 6सी,एफ,आई)की प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया,बीआईएम(चित्रा 6सी,जे,एम), और बैक्स(चित्रा 6सी,एल,ओ), जबकि यह प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति को बाधित करता है एंटी-एपोप्टोटिक बीसीएल-2(चित्रा 6सी)चित्रा 6सी,के, एन)। ये आंकड़े आंशिक रूप से प्रदर्शित करते हैं कि एपोप्टोसिस के साथ मिलकर एमसीएफ -7 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन स्तन कैंसर के खिलाफ सैल की कार्रवाई के तंत्र में शामिल हो सकता है।

MCF-3 कोशिकाओं में PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग के दमन पर सैल का प्रभाव
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग, ट्यूमर के विकास को विनियमित करने वाले एक महत्वपूर्ण सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्ग के रूप में, स्तन कैंसर की पैथोलॉजिकल प्रगति और गिरावट में शामिल है। पश्चिमी धब्बा परिणामों से पता चला है कि साल उपचार प्रमुखता से पी-पीआई 3 के/पीआई 3 के (चित्रा 7 ए, बी) और पी-एकेटी/एकेटी(चित्रा 7 ए, सी) के अनुपात को सीमित करता है। इस बीच, एमटीओआर(चित्रा 7ए,डी)एचआईएफ-1α(चित्रा 7ए,ई)और फॉक्सओ1(चित्रा 7ए,एफ)की प्रोटीन अभिव्यक्ति भी सैल उपचार द्वारा विशेष रूप से दबा दी गई थी। आगे क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण ने यह भी प्रदर्शित किया कि सैल प्रशासन ने पीआई3के(चित्रा 7जी),एकेटी(चित्रा 7एच)एमटीओआर(चित्रा 7आई)एचआईएफ-1α(चित्रा 7जे)और फॉक्सओ1(चित्रा 7के)के जीन अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर दिया है। अंत में, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग के सक्रियण का निषेध स्तन कैंसर के खिलाफ सैल का एक संभावित आणविक तंत्र हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्तन कैंसर एमसीएफ -7 सेल लाइन के खिलाफ सैल की कार्रवाई का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमसीएफ -7 सेल प्रसार विषाक्तता और सैल के घाव भरने के गुण (ए) और (बी) एमसीएफ -7 सेल गतिविधि पर एसएएल उपचार के खुराक-समय प्रभाव दिखाते हैं। (सीआर) एमसीएफ -7 कोशिकाओं में घाव भरने पर एसएएल उपचार का निरोधात्मक प्रभाव, जैसा कि घाव खरोंच परख द्वारा निर्धारित किया गया है। उपरोक्त डेटा को एसडी, एन = 3 ± माध्य के रूप में चित्रित किया गया है। ##p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सैल उपचार द्वारा एमसीएफ -7 कोशिकाओं के घातक प्रवास और आक्रमण का दमन। एसएएल उपचार एमसीएफ -7 कोशिकाओं के अवांछनीय (ए-एफ) प्रवास और (जीएल) आक्रमण को काफी कम कर देता है। उपरोक्त डेटा को एसडी, एन = 3 ± माध्य के रूप में चित्रित किया गया है। <#p < 0.05 और ##p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सैल द्वारा सेल चक्र के एपोप्टोसिस और दमन को बढ़ावा देना। (ए) एपोप्टोटिक पदोन्नति और (बी) एमसीएफ -7 कोशिकाओं पर सैल के सेलचक्र गिरफ्तारी प्रभाव, जैसा कि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया है। उपरोक्त डेटा को एसडी, एन = 3 ± माध्य के रूप में चित्रित किया गया है। #p < 0.05 और ##p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एसएएल उपचार के कारण एमसीएफ -7 कोशिकाओं में आरओएस और सीए2+ की वृद्धि। (एई) आरओएस सामग्री का मूल्यांकन डीसीएफएच-डीए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा किया गया था। (एफ) आरओएस के लिए मात्रात्मक परिणाम। (जी-के) Fluo-4 AM इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला Ca2+ एकाग्रता का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था। (एल) सीए2 + के लिए मात्रात्मक परिणाम। उपरोक्त डेटा को एसडी, एन = 3 ± माध्य के रूप में चित्रित किया गया है। #p < 0.05 और ##p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एमसीएफ -7 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस के साथ मिलकर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को प्रेरित करने पर एसएएल उपचार का प्रभाव। (ए) ना + -के + -एटीपीस और (बी) सीए2 + -एटीपीस की कम एंजाइम गतिविधियां। (सी) प्रतिनिधि प्रोटीन अभिव्यक्ति बैंड और (डी) सीसी -9, (ई) सीसी -7, (एफ) सीसी -3, (जे) बिम, (के) बीसीएल -2, और (एल) बैक्स प्रोटीन के लिए उनके संबंधित सांख्यिकीय परिणाम और (जी) कैस्पेज़ -9, (एच) कैसपेज़ -7, (आई) कैसपेज़ -3, (एम) बिम, (एन) बीसीएल -2, और (ओ) बैक्स जीन। उपरोक्त डेटा को एसडी, एन = 3 ± माध्य के रूप में चित्रित किया गया है। #p < 0.05 और ##p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एसएएल उपचार द्वारा PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 मार्ग का दमन । (ए) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा पता लगाया गया प्रतिनिधि प्रोटीन बैंड। सैल ने (बी) पी-पीआई 3 के / पीआई 3 के, (सी) पी-एकेटी / एकेटी, (डी) एमटीओआर, (ई) एचआईएफ -1α, और (एफ) फॉक्सओ 1 की प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम कर दिया। (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α, और (K) FoxO1 के जीन अभिव्यक्ति स्तरों को कम कर दिया। उपरोक्त डेटा को एसडी, एन = 3 ± माध्य के रूप में चित्रित किया गया है। # #p < 0.01 बनाम नियंत्रण समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: पीआई 3 के सिग्नल ट्रांसडक्शन के निषेध के साथ, सैल द्वारा एमसीएफ -7 कोशिकाओं में आरओएसऔर सीए 2+ उत्पादन की उत्तेजना। एमटीओआर की भागीदारी के साथ, साल प्रशासन के बाद एकेटी के फॉस्फोराइलेशन को और कम कर दिया गया था। नतीजतन, HIF-1α और FoxO1 की डाउनरेगुलेटेड अभिव्यक्ति ने MCF-7 कोशिकाओं के आवधिक घातक प्रसार को अवरुद्ध कर दिया। इस बीच, एमसीएफ -7 कोशिकाओं के बढ़े हुए एपोप्टोसिस ने सैल की स्तन कैंसर विरोधी क्षमता का सुझाव दिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीन जेनबैंक परिग्रहण सं. प्राइमर अनुक्रम (5'-3') लंबाई (बीपी)
Caspase-9 (Caspase-9) NM_001229 एफ, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG 92
आर, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC
Caspase-7 (Caspase-7) एफ, AGTGACAGGTATGGGCGTTC 164
आर, CGGCATTTGTATGGTCCTCTCTT
Caspase-3 (कैस्पासे-3) NM_001354777 एफ, CCAAAGATCATACATAGGAGCG 185
R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG
बिम NM_001204106 एफ, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA 130
आर, सीटीकैटएगटगाएएएजीजीजीजी
बीसीएल -2 NM_000633 एफ, GACTTCGCCGAGATGTCCAG 129
आर, GAACTCAAAGAAGAAGGCCACAATC
बक्सा NM_001291428 एफ, CGAACTGGACAGTAACATGGAG 157
आर, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA
β-एक्टिन NM_031144 एफ, AATCTGGCACCACCACCTTCTACAA 172
R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA
एफ, आगे; आर, रिवर्स।

तालिका 1: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

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Discussion

स्तन कैंसर सभी उम्र के व्यक्तियों को प्रभावित करता है और अतुलनीय शारीरिक और मानसिक बोझ और महान आर्थिक दबाव का कारण बनताहै। स्तन कैंसर, इसकी बढ़ती रुग्णता और मृत्यु दर के साथ हर साल, भी पारंपरिक उपचार 4,5 से परे प्रभावी हर्बल आधारित यौगिक चिकित्सा की मांग के मामले में दुनिया भर का ध्यान आकर्षित किया है. आशाजनक रूप से, सबूतों के एक बड़े शरीर ने सैल24,25,38 के कैंसर विरोधी प्रभावों का खुलासा किया है। दुर्भाग्य से, स्तन कैंसर और अंतर्निहित आणविक तंत्र में सैल की भूमिका अभी भी काफी हद तक अज्ञात है। यह अध्ययन मानव स्तन कैंसर एमसीएफ -7 सेल लाइन के प्रसार, प्रवास और आक्रमण पर एसएएल के महत्वपूर्ण निरोधात्मक प्रभावों पर प्रकाश डालता है। इसके बाद, हमने एमसीएफ -7 कोशिकाओं के परेशान एपोप्टोसिस और चक्र गिरफ्तारी में एसएएल की क्षमता का खुलासा किया। इस बीच, इन आंकड़ों से यह भी पता चला कि साल प्रशासन ने आरओएस और सीए2+ के स्तर में वृद्धि की। आणविक तंत्र के आगे के अन्वेषण ने स्तन कैंसर के उपचार में सैल की एपोप्टोसिस-प्रचार कार्रवाई और PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 मार्ग पर सैल के प्रभाव का प्रदर्शन किया।

घातक और अनियंत्रित प्रसार स्तन कैंसर के विकास में तेजी ला सकता है और लसीका39 और मस्तिष्क मेटास्टेस40 के जोखिम को बढ़ा सकता है। वर्तमान में, बाजार पर उपलब्ध कीमोथेरेपी दवाएं धीरे-धीरे दिखाई दी हैं, लेकिन इनमें स्तन कैंसर के इलाज के लिए कम संवेदनशीलता का मुद्दा है, इस प्रकार लोगों को अधिक शक्तिशाली यौगिकों या उपन्यास दवासंयोजनों 2,3 की तलाश करने के लिए मजबूर किया जाता है। इस काम के डेटा ने पहले प्रदर्शित किया कि एसएएल उपचार ने एमसीएफ -7 कोशिकाओं के घातक प्रसार को सीमित कर दिया। बाद में सेल स्क्रैच परख ने आगे पुष्टि की कि 12 घंटे और 24-एच साल इनक्यूबेशन एमसीएफ -7 कोशिकाओं की अभिसरण दर को कम कर दिया है। ट्यूमर सेल प्रवास और आक्रमण क्षमता के लिए टेस्ट विरोधी ट्यूमर दवाओं24,25 स्क्रीनिंग के लिए संवेदनशील संकेतक के रूप में माना जाता है. इस काम में डेटा ने सुझाव दिया कि सैल ने एमसीएफ -7 सेल माइग्रेशन और आक्रमण की प्रक्रिया को दृढ़ता से कम कर दिया, पिछले निष्कर्षों33,34 के अनुरूप। ट्यूमर कोशिकाओं के अनियंत्रित सेल चक्र सेल अमरता24 के भाग्य को निर्धारित करता है. इसलिए, एपोप्टोसिस पदोन्नति और सेल चक्र रुकावट यौगिकों25 की एंटीकैंसर क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए मान्यता प्राप्त और स्वीकृत सूचकांक बन गए हैं। इस काम में, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ने संकेत दिया कि सैल उपचार ने एमसीएफ -7 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को संकेत दिया, जैसा कि प्रारंभिक और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं के बढ़े हुए अनुपात से प्रमाणित है। इसके अलावा, G0/G1 कोशिकाओं का अनुपात बढ़ गया था, और MCF-7 सेल चक्र का S चरण परेशान था, जो स्तन कैंसर कोशिकाओं पर सैल के सेल चक्र-अवरुद्ध प्रभावों को दर्शाता है।

हल्के हाइपोक्सिक स्तन कैंसर सेल माइक्रोएन्वायरमेंट आरओएस और सीए2 + उत्पादन में सीमाओं से जुड़ा हुआ है; इस प्रकार, अत्यधिक आरओएस और सीए2+ संचय स्तन कैंसर कोशिकाओं41 में एपोप्टोटिक घटनाओं को प्रेरित कर सकते हैं. इस काम में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के परिणामों ने साबित कर दिया कि सैल हस्तक्षेप ने आरओएस और सीए2+ उत्पादन को बहुत उत्तेजित किया, जो एमसीएफ -7 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को और प्रेरित कर सकता है। उभरते सबूत से पता चला है कि समर्थक apoptotic प्रोटीन Bax और बिम के ऊंचा स्तर, साथ ही विरोधी apoptotic प्रोटीन बीसीएल -2 के कम स्तर, अस्थायी रूप से और जबरन में और mitochondrial झिल्ली के बाहर सामग्री के पारित होने को खोल सकते हैं, इस प्रकार ट्यूमर कोशिकाओं42 के क्रमादेशित apoptosis ट्रिगर. इस अध्ययन में, एमसीएफ -7 कोशिकाओं के साथ एसएएल के सह-इनक्यूबेशन ने बीसीएल -2 के प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति को कम करते हुए बैक्स और बिम में काफी वृद्धि की, इस प्रकार स्तन कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को बढ़ावा देने पर इसके संभावित औषधीय प्रभावों का सुझाव दिया। इन आंकड़ों ने यह भी सुझाव दिया कि सैल ने स्पष्ट रूप से सीसी -9, सीसी -7, और सीसी -3 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जो माइटोकॉन्ड्रियल एपोप्टोसिस मार्ग के प्रमुख डाउनस्ट्रीम संकेतक हैं, और उनके संबंधित जीन। उपरोक्त आंकड़े आंशिक रूप से सुझाव देते हैं कि स्तन कैंसर पर सैल का प्रोपोप्टोटिक प्रभाव माइटोकॉन्ड्रियल एपोप्टोसिस की सक्रियता से संबंधित हो सकता है।

आणविक तंत्र अध्ययन ने पुष्टि की है कि PI3K का फॉस्फोराइलेशन AKT फॉस्फोराइलेशन को और प्रेरित कर सकता है और स्तन कैंसर कोशिकाओं 6,7के विकास में तेजी ला सकता है। इस बीच, एमटीओआर का बड़ा संचय भी एकेटी फॉस्फोराइलेशन प्रक्रिया 8,9 में भाग लेकर स्तन कैंसर की गिरावट में योगदान देता है। एक ओर, फॉस्फोराइलेटेड एकेटी सीधे स्तन कैंसर कोशिका चक्र को बढ़ावा देने और एपोप्टोसिस22,23 को धीमा करने के लिए फॉक्सओ 1 अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है। समानांतर में, सक्रिय AKT अप्रत्यक्ष रूप से FoxO1 उपज के लिए HIF-1α अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप स्तन कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस16,17 होता है। नतीजतन, PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 मार्ग के सक्रियण का निषेध स्तन कैंसर के उपचार के लिए एक नई रणनीति हो सकती है। PI3K अवरोधक LY294002 के हस्तक्षेप के साथ, डेटा ने प्रदर्शित किया कि सैल ने PI3K के फॉस्फोराइलेशन को दबा दिया। एमटीओआर प्रोटीन अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन के संयोजन के साथ, सैल ने फॉस्फोराइलेटेड एकेटी के अभिव्यक्ति स्तर को भी कम कर दिया। नतीजतन, एचआईएफ -1α और फॉक्सओ 1 प्रोटीन अभिव्यक्ति इसी तरह सैल उपचार के बाद काफी कम हो गई थी। इसी तरह, क्यूआरटी-पीसीआर परिणामों ने अनुरूप रूप से खुलासा किया कि सैल उपचार ने बड़े पैमाने पर पीआई 3 के, एकेटी, एचआईएफ -1α, और फॉक्सओ 1 के जीन स्तर को कम कर दिया, जो चक्र गिरफ्तारी और एमसीएफ -7 कोशिकाओं (चित्रा 8) के एपोप्टोसिस को बढ़ावा देने में योगदान देता है। सामूहिक रूप से, प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि सैल स्तन कैंसर के खिलाफ कार्रवाई के साथ प्राकृतिक हर्बल मूल का एक संभावित सक्रिय यौगिक हो सकता है। सैल उपचार द्वारा एमसीएफ -7 सेल एपोप्टोसिस और सेल चक्र निषेध के प्रचार ने स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण क्षमता को बहुत कमजोर कर दिया। विशेष रूप से, स्तन कैंसर के खिलाफ सैल की कार्रवाई का आणविक तंत्र PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 मार्ग के निषेध से संबंधित हो सकता है। कुल मिलाकर, कई प्रयोगात्मक तरीकों को एकीकृत करने वाला यह प्रोटोकॉल स्तन कैंसर रोधी दवाओं के अनुसंधान और विकास के लिए एक निश्चित संदर्भ मूल्य प्रदान करता है।

इस अध्ययन में, स्तन कैंसर के खिलाफ सैल के आणविक तंत्र का कोई प्रत्यक्ष प्रमाण नहीं है। PI3K नॉकआउट चूहों, PI3K प्रोटीन की उच्च या निम्न अभिव्यक्ति के साथ स्तन कैंसर सेल लाइनें, और स्थानीय सतह प्लास्मोन अनुनाद तकनीक अगले कदम हैं जिनका उपयोग स्तन कैंसर 29,31की रोकथाम और उपचार के लिए सैल के प्रत्यक्ष आणविक लक्ष्यों की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सिचुआन प्रांत (120025) के स्वास्थ्य आयोग द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018

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References

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