Summary
Le présent protocole décrit une stratégie globale pour évaluer l’action pharmacologique et le mécanisme du salidroside dans l’inhibition de la prolifération et de la migration des cellules MCF-7.
Abstract
Le salidroside (Sal) contient des activités pharmacologiques anti-cancérigènes, anti-hypoxiques et anti-inflammatoires. Cependant, ses mécanismes sous-jacents anti-cancer du sein n’ont été qu’incomplètement élucidés. Par conséquent, ce protocole visait à décoder le potentiel de Sal dans la régulation de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 dans la prolifération maligne des cellules MCF-7 du cancer du sein humain. Tout d’abord, l’activité pharmacologique de Sal contre MCF-7 a été évaluée par des tests CCK-8 et des tests de grattage cellulaire. De plus, la résistance des cellules MCF-7 a été mesurée par des tests de migration et d’invasion de Matrigel. Pour les tests d’apoptose cellulaire et de cycle, les cellules MCF-7 ont été traitées par étapes avec l’annexine V-FITC/PI et les kits de détection de coloration du cycle cellulaire pour les analyses de cytométrie en flux, respectivement. Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de Ca2+ ont été examinés par coloration par immunofluorescence DCFH-DA et Fluo-4 AM. Les activités de Na+-K+-ATPase et de Ca2+-ATPase ont été déterminées à l’aide des kits commerciaux correspondants. Les niveaux d’expression des protéines et des gènes dans l’apoptose et la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ont été déterminés à l’aide d’analyses Western blot et qRT-PCR, respectivement. Nous avons constaté que le traitement par Sal limitait considérablement la prolifération, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 avec des effets dose-dépendants. Pendant ce temps, l’administration de Sal a également forcé de manière spectaculaire les cellules MCF-7 à subir l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire. Les tests d’immunofluorescence ont montré que Sal stimulait de manière observable la production de ROS et de Ca2+ dans les cellules MCF-7. D’autres données ont confirmé que Sal a favorisé les niveaux d’expression des protéines pro-apoptotiques, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivée et de leurs gènes correspondants. De manière constante, l’intervention de Sal a considérablement réduit l’expression des protéines Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α et FoxO1 et de leurs gènes correspondants. En conclusion, le Sal peut être utilisé comme composé potentiel dérivé d’herbes pour le traitement du cancer du sein, car il peut réduire la prolifération maligne, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 en inhibant la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduction
En tant que l’un des cancers les plus fréquemment diagnostiqués et des tumeurs malignes les plus courantes, les dernières statistiques indiquent que 2,3 millions de cas de cancer du sein sont apparus dans le monde en 2020, ce qui représente 11,7 % de tous les cas de cancer1. Les symptômes courants du cancer du sein comprennent la sensibilité et les picotements des seins, les bosses et la douleur mammaires, l’écoulement du mamelon, l’érosion ou l’enfoncement de la peau et l’hypertrophie des ganglions lymphatiques axillaires 1,2. Plus alarmant encore, le nombre de nouveaux cas et l’incidence globale du cancer du sein continuent d’augmenter à un rythme effréné chaque année, représentant 6,9 % des décès liés au cancer1. À l’heure actuelle, l’intervention contre le cancer du sein implique encore principalement la chimiothérapie, la chirurgie, la radiothérapie et un traitement complet. Bien que le traitement puisse réduire efficacement le taux de récidive et le taux de mortalité des patients, l’application d’un traitement à long terme entraîne souvent une multirésistance aux médicaments, une perte de cheveux sur de grandes surfaces, des nausées et des vomissements, ainsi qu’une charge mentale et psychologique grave 2,3. Notamment, le risque potentiel de métastases d’organes multiples du cancer du sein oblige également les gens à rechercher de nouvelles sources de traitement médicamenteux à base de plantes 4,5.
La signalisation médiée par la phosphoinositide 3 kinase (PI3K) est impliquée dans la croissance, la prolifération et la survie du cancer du sein par épissage qui affecte l’expression de plusieurs gènes6. En tant que protéine de détection de signal en aval de PI3K, de nombreuses preuves suggèrent que la protéine kinase B (AKT) pourrait se coupler avec la protéine cible de la rapamycine (mTOR) chez les mammifères pour augmenter davantage le cancer du sein 7,8,9. De plus, la désactivation de la signalisation PI3K/AKT/mTOR a également été revendiquée comme étant un élément clé dans les médicaments inhibant la prolifération maligne et stimulant l’apoptose dans le cancer du sein10,11,12. Il est bien connu qu’une hypoxie extrême dans le microenvironnement tumoral entraîne une augmentation massive du facteur 1 alpha inductible par l’hypoxie (HIF-1α), ce qui aggrave encore la progression du cancer du sein13,14,15. En parallèle, la stimulation AKT conduit également à une accumulation excessive de HIF-1α, limitant l’apoptose dans les échantillons de cancer du sein16,17. Il est intéressant de noter que l’activation de la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α a été confirmée comme étant impliquée dans la progression pathologique et les métastases dans une variété de cancers, y compris le cancer du poumon18, le cancer colorectal19, le cancer de l’ovaire20 et le cancer de la prostate21. En plus d’être orchestrée par HIF-1α, la surexpression du facteur de transcription 1 (FoxO1) est également déclenchée par la stimulation de la signalisation AKT, qui favorise l’arrêt du cycle et l’inhibition de l’apoptose dans les cellules cancéreuses du sein22,23. Ensemble, les preuves solides ci-dessus suggèrent que l’inhibition de la cascade de signalisation PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pourrait être une nouvelle cible potentielle pour le traitement médicamenteux du cancer du sein.
Il a été largement démontré que le salidroside (Sal) exerce des activités anticancéreuses24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 et des activités pharmacologiques immunostimulantes30. Il s’agit d’une poudre brun clair ou brune facilement soluble dans l’eau, est un type de glycoside phényléthanoïde et a une structure chimique de formule C14H 20 O7 et un poids moléculaire de300,331,32. Des études pharmacologiques modernes ont démontré que Sal peut favoriser l’apoptose des cellules cancéreuses gastriques en restreignant la signalisation PI3K-AKT-mTOR24. D’autres preuves suggèrent également que la suppression de la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α par le traitement Sal peut contribuer à l’apoptose des cellules cancéreuses en augmentant leur sensibilité aux agents chimiothérapeutiques25. Les preuves suggèrent également que Sal restreint la migration et l’invasion cellulaires et provoque l’arrêt du cycle en favorisant l’apoptose dans les cellules MCF-7 du cancer du sein humain33,34. Cependant, il reste à voir si Sal peut réguler la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 et inhiber la prolifération maligne des cellules MCF-7. Par conséquent, ce protocole visait à explorer les effets de Sal sur la migration, l’invasion, le cycle cellulaire et l’apoptose des cellules MCF-7 via la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Les stratégies de recherche intégrées comprenant des expériences conventionnelles, peu coûteuses et indépendantes, telles que les évaluations de la migration et de l’invasion cellulaires, la détection de l’apoptose et du cycle cellulaire par cytométrie en flux, la détermination des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de la fluorescence du Ca2+, etc., peuvent fournir une référence pour la conception globale des expériences pour la recherche anticancéreuse avec la phytothérapie traditionnelle. Le processus expérimental de cette étude est illustré à la figure 1.
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Protocol
Les cellules MCF-7 utilisées dans le cadre de la présente étude ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Culture cellulaire
- Cultivez les cellules MCF-7 dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C avec du DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline (10 000 U/mL)/streptomycine (10 000 μg/mL) (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Les cellules couvrant 90 % du fond de la boîte ont été utilisées pour l’expérience et réparties dans les groupes suivants : groupe témoin, groupe chlorhydrate de doxorubicine (DXR, 5 μM) et groupes Sal (20 μM, 40 μM et 80 μM), ou groupe témoin, groupe LY294002 (10 μM, un inhibiteur de PI3K), groupe Sal (80 μM) et groupe LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (voir le tableau des matériaux).
2. Test de viabilité cellulaire
REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent27.
- Ensemencer des cellules MCF-7 d’une densité de 8 x 104 cellules/puits dans des plaques de 96 puits, et incuber avec du Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM et 320 μM) pendant 24 h ou du Sal (20, 40, 80 μM) pendant 12 h/24 h/36 h/48 h pendant la nuit jusqu’à ce que les cellules soient adhérentes.
- Après le traitement, co-incuber les cellules MCF-7 avec 10 μL/puits de solution CCK-8 (voir le tableau des matériaux) pendant 2 h. Ensuite, mesurez la densité optique à 450 nm (OD450) à l’aide d’un lecteur automatique de microplaques.
3. Migration et invasion cellulaires
REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent35.
- Incuber 2 mL de 5 x 10 cellules de 6 cellules/mL ensemencées dans des plaques à 6 puits pour couvrir 90 % du fondde la boîte.
- Effectuez une enroulement linéaire par grattage le long du centre de la monocouche cellulaire à l’aide d’une pointe de pipette stérile. Acquérir des images à l’aide d’un microscope optique à 0 h, 24 h et 48 h.
- Utilisez le logiciel Image J pour mesurer la largeur des égratignures.
- Pour l’essai transwell, suspendre les cellules MCF-7 sans milieu sérique et semer dans la chambre transwell supérieure pré-enrobée avec ou sans Matrigel (voir le tableau des matériaux).
- Dans le fond de la chambre de transwell, utilisez le milieu complet DMEM comme inducteur chimique. Après 24 h, retirez les cellules de la chambre supérieure et fixez les cellules invasives et migratrices restantes dans du méthanol35.
- Colorer les cellules MCF-7 avec une solution cristalline de violet (voir le tableau des matériaux). Capturez les images à l’aide d’un microscope optique.
4. Évaluation de l’activité de la Na+-K+-ATPase et de laCa 2+-Mg2+-ATPase
- Utilisez une trousse d’acide bicinchoninique (BCA) pour mesurer la concentration de protéines dans les cellules MCF-7 lysées, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter des échantillons des cellules lysées dans leurs groupes correspondants dans les plaques à 96 puits. Après cela, ajoutez la solution de travail pour incuber à 37 °C pendant 5 min. Enfin, mesurez les valeurs de OD636 à l’aide d’un lecteur de microplaques multifonctionnel.
5. Analyse par cytométrie en flux de l’apoptose et du cycle cellulaire
REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent31.
- Digérer les cellules et les récolter pour les remettre en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant une coloration de 20 minutes avec de l’annexine V-FITC et de l’iodure de propidium (PI) (voir le tableau des matériaux), puis déterminer le nombre de cellules apoptotiques à l’aide d’un cytomètre en flux.
- Mélanger la solution d’échantillon remise en suspension avec la solution d’IP pendant une incubation de 30 minutes, suivie d’une détection à l’aide d’un cytomètre en flux.
6. Coloration par fluorescence DCFH-DA et Fluo-4 AM
REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent29.
- Incuber les cellules MCF-7 pendant 20 min à l’aide d’une sonde de fluorescence DCPH-DA de 10 μM (voir le tableau des matériaux) à 37 °C. Après avoir soigneusement éliminé l’excédent de DCFH-DA en lavant trois fois avec du PBS, testez l’intensité de fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 488 nm et 525 nm, respectivement, à l’aide d’un microscope à fluorescence.
- Incuber les cellules MCF-7 avec une solution de sonde fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (voir le tableau des matériaux) pendant 45 min à 37 °C. Après avoir été lavé trois fois avec du PBS, déterminez les valeurs d’intensité de fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 488 nm et 516 nm, respectivement, à l’aide d’un microscope à fluorescence.
7. Transfert Western
- Ajouter 2 mL de suspensions cellulaires 5 x 10 6 cellules/mL contenant différents médicaments dans des plaques à6 puits, et mettre en culture dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
NOTA : Les groupes pour l’analyse par transfert Western ont été établis comme suit : groupe témoin, groupe LY294002 (10 μM), groupe Sal (80 μM) et groupe LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (voir le tableau des matériaux). - Prélever les cellules et le surnageant, et centrifuger à 560 × g à 4 °C pendant 3 min. Jetez le surnageant et lavez-le deux fois avec du PBS pré-refroidi. Après chaque lavage, centrifuger les cellules à 560 × g à 4 °C pendant 3 min.
- Ajouter 50 μL de tampon de lyse à l’échantillon de cellule de l’étape 7.2 pour un bain de glace de 15 minutes. Centrifuger à 8550 × g à 4 °C pendant 10 min pour prélever l’échantillon de protéine surnageante.
- Après avoir détecté la concentration de protéines à l’aide d’une méthode BCA, mélanger l’échantillon de protéines à l’étape 7.3 avec un tampon de charge dans un rapport de 4 :1, dénaturer à 100 °C pendant 10 minutes dans un bain métallique et refroidir à température ambiante.
- Ajouter 20 μg de l’échantillon de protéines de l’étape 7.4, séparer les protéines de différents poids moléculaires35à l’aide de 10 % de SDS-PAGE (voir le tableau des matériaux), puis transférer sur des membranes PVDF de 0,22 μm. Après blocage avec 5 % de BSA, incuber les membranes avec les anticorps primaires correspondants pendant une nuit à 4 °C.
REMARQUE : La concentration diluée des anticorps primaires suivants est de 1 :1 000 : caspase-9/7/3 clivée (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 et β-actine (voir le tableau des matériaux). - Le lendemain, incuber les membranes avec des anticorps secondaires IgG anti-lapin de chèvre pendant 2 h à 37 °C. Développer les membranes à l’aide d’une solution chimiluminescente ECL et capturer des images à l’aide d’un système d’imagerie par transfert Western quantitatif sans contact (voir le tableau des matériaux).
8. qRT-PCR
- Effectuer une centrifugation pour recueillir des cellules MCF-7 à 560 x g à 4 °C pendant 3 min, et ajouter 500 μL de tampon RL1 dans 5 × 106 cellules. Soufflez et mélangez à plusieurs reprises avec une pipette jusqu’à ce qu’aucune masse cellulaire ne soit visible.
REMARQUE : Le tampon RL1 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). - Transférer les homogénats cellulaires de l’étape 8.1 dans la colonne de nettoyage de l’ADN intégrée dans le tube de prélèvement et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 2 min. Retirez la colonne de nettoyage de l’ADN et conservez le surnageant dans le tube de prélèvement.
REMARQUE : La colonne de nettoyage de l’ADN et le tube de prélèvement sont deux des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). - Ajouter 800 μL de tampon RL2 à 500 μL de surnageant de l’étape 8.2 et mélanger délicatement.
REMARQUE : Le tampon RL2 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). Ajouter 120 mL d’éthanol anhydre à 60 mL de tampon RL2 avant utilisation. - Transvaser 700 μL du mélange de l’étape 8.3 dans la colonne d’ARN uniquement intégrée dans le tube de prélèvement, et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min. Jetez le liquide usagé dans le tube de collecte.
REMARQUE : La colonne d’ARN uniquement est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). - Répétez l’étape 8.4 pour traiter le reste du mélange de l’étape 8.3.
- Ajouter 500 μL de tampon RW1 dans la colonne d’ARN seul et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min. Jetez le liquide usagé dans le tube de collecte.
REMARQUE : Le tampon RW1 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). - Ajouter 700 μL de tampon RW2 dans la colonne d’ARN seul et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min. Jetez le liquide usagé dans le tube de collecte. Répétez l’étape 8.7 une fois.
REMARQUE : Le tampon RW2 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). - Replacez la colonne d’ARN uniquement dans le tube de prélèvement et centrifugez à 8550 × g à 4 °C pendant 2 min pour éliminer le tampon RW2 restant.
- Transférez la colonne d’ARN uniquement dans un nouveau tube de collecte et versez 100 μL de ddH2O sans RNase préchauffé à 65 °C au centre de la membrane pour la colonne d’ARN uniquement. Placer à 25 °C pendant 2 min et recueillir la solution d’ARN par centrifugation à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min.
REMARQUE : Le ddH2O sans RNase est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). - Ajouter 4 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL d’amorce oligo(dT)18 , 1 μL d’amorce hexamère aléatoire, 1 μL d’amorce spécifique au gène (voir le tableau 1), 1 μL de mélange enzymatique et 5 μg de solution d’ARN de l’étape 8.9 dans une bandelette de 100 μL à 8 tubes. Complétez le système de réaction avec de l’eau exempte de RNase à 20 μL.
- Réglez les conditions de réaction du système comme suit : (1) : 95 °C, 30 s, 1 cycle ; (2) : 95 °C, 5 s, 50 cycles, 60 °C, 34 s ; (3) : 95 °C, 5 s, 1 cycle, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s ; et (4) : 42 °C, 30 s, 1 cycle. Exécutez la procédure qRT-PCR.
NOTE : Les niveaux d’expression relatifs des gènes cibles ont été analysés quantitativement par la méthode 2−ΔΔCT 36,37. Les informations d’amorce de chaque gène utilisé pour l’analyse qRT-PCR sont répertoriées dans le tableau 1.
9. Analyse statistique
- Exprimez les données sous la forme de la moyenne ±écart-type de trois expériences indépendantes.
- Analysez les comparaisons entre plusieurs groupes à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matériaux) avec une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d’un test de Tukey. Dans ce travail, P < 0,05 a été défini comme statistiquement significatif.
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Representative Results
Effets du Sal sur l’inhibition de la prolifération excessive et le retard de la cicatrisation des plaies dans les cellules MCF-7
Pour sonder le potentiel de Sal contre le cancer du sein, nous avons d’abord testé ses propriétés anticancéreuses à l’aide de tests de toxicité de prolifération cellulaire et de scratch de la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein humain. Ces cellules ont été co-incubées avec une série de concentrations de Sal (5-320 μM) pendant 24 h, et la prolifération cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test CCK-8. Un effet inhibiteur dose-dépendant du Sal sur la prolifération cellulaire a été observé, avec une baisse de 50% de la vitalité cellulaire à 40 μM (Figure 2A). Des concentrations de Sal de 20 μM, 40 μM et 80 μM ont ensuite été sélectionnées pour les points temporels subséquents et l’évaluation de la cicatrisation des plaies. Les résultats de la figure 2B montrent que Sal pourrait inhiber la vitalité des cellules MCF-7 au fil du temps, avec une diminution de 50 % de la vitalité des cellules MCF-7 après 24 h de co-incubation. La figure 2C-R montre l’effet inhibiteur du traitement au Sal sur la cicatrisation des cellules MCF-7, tel que déterminé par le test de grattage de la plaie. D’autres tests de grattage cellulaire ont également confirmé que 24 h de culture avec du Sal (20 μM, 40 μM et 80 μM) entravaient fortement le processus de cicatrisation des plaies (Figure 2C,D).
Suppression de la migration maligne et de l’invasion des cellules MCF-7 par Sal
La migration d’un grand nombre de cellules tumorales et la tendance à envahir les tissus paracancéreux sont reconnues comme des caractéristiques typiques des tumeurs malignes. Les effets de Sal sur la migration et l’invasion des cellules MCF-7 ont ensuite été testés à l’aide d’un système de transwell recouvert ou non de gel de matrice extracellulaire. Le traitement par Sal a considérablement réduit la migration indésirable (Figure 3A-F) et l’invasion (Figure 3G-L) des cellules MCF-7. Comme le montre la figure 3A, le traitement par Sal a étonnamment neutralisé la migration des cellules MCF-7. Presque unanimement, le processus d’invasion malveillante des cellules MCF-7 a été efficacement arrêté après l’incubation avec Sal (Figure 3B). Les données ci-dessus ont pleinement confirmé les avantages de Sal dans l’inhibition du cancer du sein.
Effets de Sal dans la promotion de l’apoptose et l’amélioration de l’arrêt du cycle dans les cellules MCF-7
L’immortalisation et la reproduction périodique des cellules cancéreuses offrent des possibilités d’aggravation et de propagation du cancer. Bien entendu, la promotion de l’apoptose et la suppression du cycle sont également devenues des stratégies acceptées pour prévenir le cancer. Les résultats de la cytométrie en flux suggèrent que le traitement par Sal augmente le nombre de cellules MCF-7 aux stades apoptotiques précoces et tardifs (Figure 4A). Pendant ce temps, par rapport au groupe témoin, le traitement par Sal a également fortement augmenté le nombre de cellules en phase G0/G1, tout en réduisant la proportion de cellules en phase S (Figure 4B). La promotion de l’apoptose et de l’arrêt du cycle peut servir d’action pharmacologique possible de Sal contre le cancer du sein.
Effet du Sal sur la stimulation de la surproduction intracellulaire de ROS et de Ca2+ dans les cellules MCF-7
La stimulation continue de la production intracellulaire de ROS et de Ca2+ peut inhiber efficacement la croissance des cellules tumorales. La figure 5A-E montre la teneur en ROS évaluée par coloration par immunofluorescence DCFH-DA. Les résultats quantitatifs pour le ROS sont présentés à la figure 5F. La coloration par immunofluorescence Fluo-4 AM a été utilisée pour détecter la concentration de Ca2+ (Figure 5G-K). La figure 5L montre les résultats quantitatifs pour le Ca2+. Les résultats du DCFH-DA ont montré que Sal améliorait significativement les signaux de fluorescence ROS par rapport au groupe témoin (Figure 5A). De manière constante, l’intervention de Sal a également nettement augmenté la production de Ca2+, comme en témoigne le signal de fluorescence Fluo-4 AM mis en évidence (Figure 5B). Ces résultats ont collectivement indiqué que les signaux ROS et Ca2+ pourraient être en partie impliqués dans l’activité anti-cancer du sein de Sal.
Effet de Sal dans l’induction de l’apoptose dans la voie mitochondriale des cellules MCF-7
Il existe de nombreuses preuves que l’apoptose induite par un dysfonctionnement mitochondrial détermine le destin ultime de nombreuses cellules tumorales. En déterminant si Sal intervient dans la régulation de la fonction mitochondriale et les effets favorisant l’apoptose dans les cellules MCF-7, il a d’abord été démontré que Sal limitait les vitalités enzymatiques de la Na+-K+-ATPase (Figure 6A) et de la Ca2+-ATPase (Figure 6B), indiquant ainsi son rôle potentiel dans la promotion du dysfonctionnement mitochondrial. Par la suite, les données du western blot et de la qRT-PCR ont montré que le traitement par Sal favorisait l’expression des protéines et des gènes des facteurs pro-apoptotiques CC-9 (Figure 6C, D, G), CC-7 (Figure 6C, E, H), CC-3 (Figure 6C, F, I), Bim (Figure 6C, J, M) et Bax (Figure 6C, L, O), tout en inhibant l’expression des protéines et des gènes de l’anti-apoptotique Bcl-2 (Figure 6C,K, N). Ces données démontrent partiellement qu’un dysfonctionnement mitochondrial dans les cellules MCF-7 couplé à l’apoptose peut être impliqué dans le mécanisme d’action de Sal contre le cancer du sein.
Effet de Sal sur la suppression de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 dans les cellules MCF-7
La voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1, en tant que voie cruciale de transduction du signal régulant la croissance tumorale, est impliquée dans la progression pathologique et la détérioration du cancer du sein. Les résultats du transfert Western ont montré que le traitement par Sal limitait considérablement les rapports p-PI3K/PI3K (Figure 7A,B) et p-AKT/AKT (Figure 7A,C). Pendant ce temps, l’expression protéique de mTOR (Figure 7A,D), HIF-1α (Figure 7A,E) et FoxO1 (Figure 7A,F) a également été considérablement supprimée par le traitement par Sal. D’autres analyses qRT-PCR ont également démontré que l’administration de Sal réduisait les niveaux d’expression génique de PI3K (Figure 7G), AKT (Figure 7H), mTOR (Figure 7I), HIF-1α (Figure 7J) et FoxO1 (Figure 7K). En conclusion, l’inhibition de l’activation de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pourrait être un mécanisme moléculaire potentiel de Sal contre le cancer du sein.
Figure 1 : Illustration schématique de l’action de Sal contre la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La toxicité de la prolifération cellulaire du MCF-7 et les propriétés de cicatrisation du Sal. (A) et (B) montrent les effets dose-temps du traitement par Sal sur l’activité des cellules du MCF-7. (C-R) Effet inhibiteur du traitement Sal sur la cicatrisation des plaies dans les cellules MCF-7, tel que déterminé par le test de grattage de la plaie. Les données ci-dessus sont illustrées par la moyenne ±écart-type, n = 3. ##p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Suppression de la migration maligne et de l’invasion des cellules MCF-7 par le traitement au Sal. Le traitement par Sal réduit considérablement la migration indésirable (A-F) et l’invasion (G-L) des cellules MCF-7. Les données ci-dessus sont illustrées par la moyenne ±écart-type, n = 3. <#p < 0,05 et ##p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Promotion de l’apoptose et suppression du cycle cellulaire par Sal. Les effets (A) de la promotion apoptotique et (B) de l’arrêt du cycle cellulaire de Sal sur les cellules MCF-7, tels que détectés par cytométrie en flux. Les données ci-dessus sont illustrées par la moyenne ±écart-type, n = 3. #p < 0,05 et ##p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Poussée de ROS et de Ca2+ dans les cellules MCF-7 causée par le traitement au Sal. (A-E) La teneur en ROS a été évaluée par coloration par immunofluorescence DCFH-DA. (F) Résultats quantitatifs pour ROS. (G-K) La coloration par immunofluorescence Fluo-4 AM a été utilisée pour détecter la concentration de Ca2+. (L) Résultats quantitatifs pour Ca2+. Les données ci-dessus sont illustrées par la moyenne ±écart-type, n = 3. #p < 0,05 et ##p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Effet du traitement par Sal sur l’induction d’un dysfonctionnement mitochondrial couplé à l’apoptose dans les cellules MCF-7. Les activités enzymatiques réduites de (A) Na+-K+-ATPase et (B) Ca2+-ATPase. (C) Bandes d’expression protéique représentatives et leurs résultats statistiques correspondants pour les gènes (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 et (L) Bax et pour les gènes (G) caspase-9, (H) caspase-7, (I) caspase-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 et (O) Bax. Les données ci-dessus sont illustrées par la moyenne ±écart-type, n = 3. #p < 0,05 et ##p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Suppression de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 par le traitement par Sal. (A) Bandes protéiques représentatives détectées par Western blot. Sal a réduit l’expression protéique de (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α et (F) FoxO1. Sal a atténué les niveaux d’expression génique de (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α et (K) FoxO1. Les données ci-dessus sont illustrées par la moyenne ±écart-type, n = 3. ##p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Stimulation de la production de ROS et de Ca2+ dans les cellules MCF-7 par Sal, accompagnée de l’inhibition de la transduction du signal PI3K. Avec l’implication de mTOR, la phosphorylation de l’AKT a été encore réduite après l’administration de Sal. Par conséquent, l’expression régulée à la baisse de HIF-1α et FoxO1 a bloqué la prolifération maligne périodique des cellules MCF-7. Pendant ce temps, l’apoptose améliorée des cellules MCF-7 a suggéré le potentiel anti-cancer du sein de Sal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Gène | N° d’adhésion GenBank | Séquence d’amorce (5'-3') | Longueur (bp) | |
| Caspase-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bim | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-actine | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, vers l’avant ; R, marche arrière. | ||||
Tableau 1 : Amorces utilisées pour la transcription inverse et la réaction en chaîne quantitative par polymérase.
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Discussion
Le cancer du sein touche des personnes de tous âges et entraîne un fardeau physique et mental incalculable ainsi qu’une grande pression économique1. Le cancer du sein, dont la morbidité et la mortalité augmentent chaque année, a également attiré l’attention du monde entier en termes de recherche de thérapies composées efficaces à base de plantes au-delà des traitements conventionnels 4,5. De manière prometteuse, un grand nombre de preuves ont révélé les effets anticancéreux de Sal24,25,38. Malheureusement, le rôle de Sal dans le cancer du sein et les mécanismes moléculaires sous-jacents restent encore largement inconnus. Cette étude met en évidence les effets inhibiteurs significatifs de Sal sur la prolifération, la migration et l’invasion de la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein humain. Par la suite, nous avons révélé le potentiel de Sal dans l’apoptose irritante et l’arrêt du cycle des cellules MCF-7. Pendant ce temps, ces données ont également montré que l’administration de Sal augmentait les niveaux de ROS et de Ca2+. Une exploration plus poussée des mécanismes moléculaires a démontré l’action favorisant l’apoptose de Sal dans le traitement du cancer du sein et l’effet de Sal sur la voie PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1.
Une prolifération maligne et incontrôlée peut accélérer le développement du cancer du sein et augmenter le risque de métastases lymphatiques39 et cérébrales40. À l’heure actuelle, des médicaments chimiothérapeutiques disponibles sur le marché sont progressivement apparus, mais ils présentent le problème d’une faible sensibilité pour le traitement du cancer du sein, obligeant ainsi les gens à rechercher des composés plus puissants ou de nouvelles combinaisons de médicaments 2,3. Les données de ce travail ont d’abord démontré que le traitement par Sal limitait la prolifération maligne des cellules MCF-7. Des tests subséquents de grattage cellulaire ont confirmé que l’incubation de Sal à 12 h et 24 h réduisait le taux de convergence des cellules MCF-7. Les tests de migration et d’invasion des cellules tumorales sont considérés comme des indicateurs sensibles pour le dépistage des médicaments antitumoraux24,25. Les données de ce travail suggèrent que Sal a fortement réduit le processus de migration et d’invasion des cellules MCF-7, conformément aux résultats précédents33,34. Le cycle cellulaire incontrôlé des cellules tumorales détermine le destin de l’immortalité cellulaire24. Par conséquent, la promotion de l’apoptose et l’interruption du cycle cellulaire sont devenues des indices reconnus et acceptés pour évaluer le potentiel anticancéreux des composés25. Dans ce travail, l’analyse par cytométrie en flux a indiqué que le traitement par Sal augmentait de manière signalée l’apoptose dans les cellules MCF-7, comme en témoigne une proportion accrue de cellules apoptotiques précoces et tardives. De plus, le rapport des cellules G0/G1 a été augmenté et la phase S du cycle cellulaire MCF-7 a été perturbée, ce qui indique les effets bloquant le cycle cellulaire de Sal sur les cellules cancéreuses du sein.
Le microenvironnement hypoxique léger des cellules cancéreuses du sein est associé à des limitations de la production de ROS et de Ca2+ ; ainsi, une accumulation excessive de ROS et de Ca2+ peut induire des événements apoptotiques dans les cellules cancéreuses du sein41. Les résultats de l’immunofluorescence dans ce travail ont prouvé que l’intervention de Sal a fortement stimulé la production de ROS et de Ca2+ , ce qui peut induire davantage l’apoptose des cellules MCF-7. De nouvelles preuves ont révélé que des niveaux élevés des protéines pro-apoptotiques Bax et Bim, ainsi que des niveaux réduits de la protéine anti-apoptotique Bcl-2, peuvent ouvrir temporairement et de force le passage de matériel à l’intérieur et à l’extérieur de la membrane mitochondriale, déclenchant ainsi l’apoptose programmée des cellules tumorales42. Dans cette étude, la co-incubation de Sal avec des cellules MCF-7 a significativement augmenté Bax et Bim tout en diminuant l’expression des protéines et des gènes de Bcl-2, suggérant ainsi ses effets pharmacologiques potentiels sur la promotion de l’apoptose dans les cellules cancéreuses du sein. Ces données suggèrent également que Sal induit distinctement l’expression des protéines CC-9, CC-7 et CC-3, qui sont des indicateurs clés en aval de la voie d’apoptose mitochondriale, et de leurs gènes correspondants. Les données ci-dessus suggèrent en partie que l’effet pro-apoptotique de Sal sur le cancer du sein pourrait être lié à l’activation de l’apoptose mitochondriale.
Des études de mécanismes moléculaires ont confirmé que la phosphorylation de PI3K peut induire davantage la phosphorylation de l’AKT et accélérer la croissance des cellules cancéreuses du sein 6,7. Dans l’intervalle, la grande accumulation de mTOR contribue également à la détérioration du cancer du sein en participant au processus de phosphorylation de l’AKT 8,9. D’une part, l’AKT phosphorylé stimule directement l’expression de FoxO1 pour favoriser le cycle cellulaire du cancer du sein et ralentir l’apoptose22,23. En parallèle, l’AKT activée active indirectement l’expression de HIF-1α pour produire FoxO1, ce qui entraîne une progression du cancer du sein et des métastases16,17. Par conséquent, l’inhibition de l’activation de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 pourrait être une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer du sein. Avec l’intervention de l’inhibiteur de PI3K LY294002, les données ont démontré que Sal supprimait de manière observable la phosphorylation de PI3K. En conjonction avec la régulation négative de l’expression de la protéine mTOR, Sal a également abaissé les niveaux d’expression de l’AKT phosphorylé. En conséquence, l’expression des protéines HIF-1α et FoxO1 a également été considérablement diminuée après le traitement par Sal. De même, les résultats de la qRT-PCR ont révélé que le traitement par Sal réduisait considérablement les niveaux de gènes PI3K, AKT, HIF-1α et FoxO1, contribuant ainsi à la promotion de l’arrêt du cycle et de l’apoptose des cellules MCF-7 (Figure 8). Collectivement, les données obtenues suggèrent que le Sal pourrait être un composé actif potentiel d’origine végétale naturelle ayant une action contre le cancer du sein. La promotion de l’apoptose des cellules MCF-7 et de l’inhibition du cycle cellulaire par le traitement par Sal a considérablement affaibli la capacité de migration et d’invasion des cellules cancéreuses du sein. Notamment, le mécanisme moléculaire d’action de Sal contre le cancer du sein peut être lié à l’inhibition de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1. Globalement, ce protocole intégrant de multiples méthodes expérimentales apporte une certaine valeur de référence pour la recherche et le développement de médicaments anti-cancer du sein.
Dans cette étude, il n’y a pas de preuve directe du mécanisme moléculaire de Sal contre le cancer du sein. Les souris knock-out PI3K, les lignées cellulaires de cancer du sein avec une expression élevée ou faible de la protéine PI3K et les techniques de résonance plasmonique de surface locale sont les prochaines étapes qui pourraient être utilisées pour confirmer les cibles moléculaires directes de Sal pour la prévention et le traitement du cancer du sein29,31.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Commission de la santé de la province du Sichuan (120025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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