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Medicine

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65634
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung und des Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen.

Abstract

Salidrosid (Sal) enthält antikarzinogene, antihypoxische und entzündungshemmende pharmakologische Aktivitäten. Die zugrundeliegenden Anti-Brustkrebs-Mechanismen sind jedoch nur unvollständig aufgeklärt. Daher sollte dieses Protokoll das Potenzial von Sal bei der Regulierung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs bei der malignen Proliferation menschlicher Brustkrebs-MCF-7-Zellen entschlüsseln. Zunächst wurde die pharmakologische Aktivität von Sal gegen MCF-7 mittels CCK-8 und Zell-Scratch-Assays untersucht. Darüber hinaus wurde die Resistenz von MCF-7-Zellen durch Migrations- und Matrigel-Invasions-Assays gemessen. Für Zellapoptose und Zyklusassays wurden MCF-7-Zellen schrittweise mit Annexin V-FITC/PI bzw. Zellzyklus-Färbe-Detektionskits für Durchflusszytometrie-Analysen prozessiert. Die Gehalte an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ wurden mittels DCFH-DA und Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Aktivitäten von Na+-K+-ATPase undCa2+-ATPase wurden mit den entsprechenden kommerziellen Kits bestimmt. Die Protein- und Genexpressionsniveaus in der Apoptose und im PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg wurden mit Hilfe von Western-Blot- bzw. qRT-PCR-Analysen bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Sal-Behandlung die Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen mit dosisabhängigen Effekten signifikant einschränkte. In der Zwischenzeit zwang die Sal-Verabreichung auch MCF-7-Zellen auf dramatische Weise dazu, Apoptose und Zellzyklus-Arrest zu durchlaufen. Die Immunfluoreszenztests zeigten, dass Sal die Produktion von ROS und Ca2+ in MCF-7-Zellen beobachtbar stimulierte. Weitere Daten bestätigten, dass Sal die Expressionsniveaus der pro-apoptotischen Proteine Bax, Bim, gespaltener Caspase-9/7/3 und der entsprechenden Gene förderte. Konsequenterweise reduzierte die Sal-Intervention die Expression der Proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α und FoxO1 und ihrer entsprechenden Gene deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sal als potenzielle pflanzliche Verbindung zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann, da es die maligne Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen reduzieren kann, indem es den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg hemmt.

Introduction

Als eine der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und häufigsten bösartigen Erkrankungen zeigen die neuesten Statistiken, dass bis 2020 weltweit 2,3 Millionen Fälle von Brustkrebs aufgetreten sind, was 11,7 % aller Krebsfälle ausmacht1. Häufige Symptome von Brustkrebs sind Brustspannen und -kribbeln, Knoten und Schmerzen in der Brust, Ausfluss aus der Brustwarze, Erosion oder eingesunkene Haut und vergrößerte axilläre Lymphknoten 1,2. Noch alarmierender ist, dass die Zahl der Neuerkrankungen und die Gesamtinzidenz von Brustkrebs jedes Jahr mit einer überwältigenden Rate zunehmen und 6,9 % der krebsbedingten Todesfälle ausmachen1. Derzeit umfasst die Brustkrebsintervention noch hauptsächlich Chemotherapie, Operation, Strahlentherapie und eine umfassende Behandlung. Obwohl die Behandlung die Rezidivrate und die Mortalitätsrate der Patienten wirksam senken kann, führt die langfristige Anwendung der Behandlung häufig zu Multiresistenzen, großflächigem Haarausfall, Übelkeit und Erbrechen sowie zu schweren psychischen und psychischen Belastungen 2,3. Insbesondere das potenzielle Risiko von multiplen Organmetastasen durch Brustkrebs zwingt die Menschen auch dazu, nach neuen pflanzlichen Quellen für die medikamentöse Therapie zu suchen 4,5.

Die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-vermittelte Signalübertragung ist am Wachstum, der Proliferation und dem Überleben von Brustkrebs durch Spleißen beteiligt, das die Expression mehrerer Gene beeinflusst6. Als nachgeschaltetes signalsensitives Protein von PI3K deuten zahlreiche Hinweise darauf hin, dass die Proteinkinase B (AKT) mit dem Säugetier-Target of Rapamycin (mTOR)-Protein koppeln könnte, um Brustkrebs weiter zu erhöhen 7,8,9. Darüber hinaus wurde behauptet, dass die Deaktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs auch eine Schlüsselkomponente in Medikamenten ist, die die maligne Proliferation hemmen und die Apoptose bei Brustkrebs stimulieren10,11,12. Es ist bekannt, dass eine extreme Hypoxie in der Mikroumgebung des Tumors zu einem massiven Anstieg des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 alpha (HIF-1α) führt, der das Fortschreiten von Brustkrebs weiter verschlechtert13,14,15. Parallel dazu führt die AKT-Stimulation auch zu einer übermäßigen Akkumulation von HIF-1α, wodurch die Apoptose in Brustkrebsproben eingeschränktwird 16,17. Interessanterweise wurde bestätigt, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs an der pathologischen Progression und Metastasierung bei einer Vielzahl von Krebsarten beteiligt ist, darunter Lungenkrebs18, Darmkrebs19, Eierstockkrebs20 und Prostatakrebs21. Neben der Orchestrierung durch HIF-1α wird die Überexpression des Transkriptionsfaktors 1 (FoxO1) auch durch die Stimulation des AKT-Signals ausgelöst, die den Zyklusstillstand und die Hemmung der Apoptose in Brustkrebszellen fördert22,23. Zusammengenommen deuten die oben genannten soliden Beweise darauf hin, dass die Hemmung der Kaskade des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs ein potenzielles neues Ziel für die medikamentöse Therapie bei Brustkrebs sein könnte.

Es wurde allgemein nachgewiesen, dass Salidrosid (Sal) krebshemmende24,25, hypoxiehemmende 26,27,28,29 und immunstärkende pharmakologische Aktivitätenausübt 30. Es ist ein hellbraunes oder braunes Pulver, das leicht in Wasser löslich ist, eine Art Phenylethanoidglykosid ist und eine chemische Strukturformel vonC14H20O7und ein Molekulargewicht von300,331,32 aufweist. Moderne pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, dass Sal die Apoptose von Magenkrebszellen fördern kann, indem es den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg hemmt24. Weitere Hinweise deuten auch darauf hin, dass die Unterdrückung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs durch die Behandlung mit Sal zur Apoptose von Krebszellen beitragen kann, indem sie deren Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika erhöht25. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Sal die Zellmigration und -invasion einschränkt und einen Zyklusstillstand verursacht, indem es die Apoptose in den menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zellen fördert33,34. Es bleibt jedoch abzuwarten, ob Sal den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg regulieren und die maligne Proliferation von MCF-7-Zellen hemmen kann. Daher zielte dieses Protokoll darauf ab, die Auswirkungen von Sal auf die MCF-7-Zellmigration, -invasion, den Zellzyklus und die Apoptose über den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg zu untersuchen. Die integrierten Forschungsstrategien, die konventionelle, kostengünstige und unabhängige Experimente umfassen, wie z. B. Zellmigrations- und Invasionsbewertungen, Apoptose und Zellzyklusnachweis durch Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ Fluoreszenzbestimmung usw., können eine Referenz für das Gesamtdesign von Experimenten zur Krebsforschung mit traditioneller Pflanzenmedizin bieten. Der experimentelle Ablauf dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Protocol

Die für die vorliegende Studie verwendeten MCF-7-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Zellkultur

  1. Die MCF-7-Zellen werden in einer befeuchteten 5%igen CO2 -Atmosphäre bei 37 °C mit DMEM kultiviert, das 10 % FBS und 1 % Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) enthält (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Zellen, die 90 % des Bodens der Schale bedeckten, wurden für das Experiment verwendet und in die folgenden Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Doxorubicinhydrochloridgruppe (DXR, 5 μM) und Sal-Gruppe (20 μM, 40 μM und 80 μM) oder Kontrollgruppe, LY294002 (10 μM, ein Inhibitor von PI3K), Gruppe Sal (80 μM) und LY294002 Gruppe (10 μM) + Sal (80 μM) (siehe Materialtabelle).

2. Zellviabilitäts-Assay

HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht27.

  1. Säen Sie MCF-7-Zellen mit einer Dichte von 8 x 104 Zellen/Well in 96-Well-Platten und inkubieren Sie mit Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM und 320 μM) für 24 h oder Sal (20, 40, 80 μM) für 12 h/24 h/36 h/48 h über Nacht, bis die Zellen adhärent sind.
  2. Nach der Behandlung werden die MCF-7-Zellen 2 h lang mit 10 μl/Well CCK-8-Lösung (siehe Materialtabelle) co-inkubiert. Messen Sie dann die optische Dichte bei 450 nm (OD450) mit einem automatischen Mikroplatten-Reader.

3. Zellmigration und -invasion

HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht35.

  1. Inkubieren Sie 2 ml 5 x 10 6 Zellen/ml, die in 6-Well-Platten ausgesät sind, um 90 % des Bodens der Schale zu bedecken.
  2. Führen Sie eine lineare Kratzwunde entlang der Mitte der Zellmonoschicht mit einer sterilen Pipettenspitze durch. Erfassen Sie Bilder mit einem optischen Mikroskop bei 0 h, 24 h und 48 h.
  3. Verwenden Sie die Software Image J, um die Breite der Kratzwunden zu messen.
  4. Für den Transwell-Assay werden MCF-7-Zellen ohne Serummedium suspendiert und in der oberen Transwell-Kammer mit oder ohne Matrigel vorbeschichtet (siehe Materialtabelle).
  5. Verwenden Sie im Boden der Transwell-Kammer das DMEM-Komplettmedium als chemischen Induktor. Nach 24 Stunden werden die Zellen in der oberen Kammer entfernt und die verbleibenden invasiven und migrantischen Zellen in Methanol35 fixiert.
  6. Färben Sie die MCF-7-Zellen mit kristallvioletter Lösung (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie die Bilder mit einem optischen Mikroskop auf.

4. Aktivitätsbewertung von Na+-K+-ATPase und Ca 2+-Mg2+-ATPase

  1. Verwenden Sie ein Bicinchoninsäure-Kit (BCA), um die Proteinkonzentration in lysierten MCF-7-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen (siehe Materialtabelle).
    1. Proben der lysierten Zellen in ihren entsprechenden Gruppen werden in die 96-Well-Platten gegeben. Danach wird die Arbeitslösung zugegeben, um bei 37 °C für 5 Minuten weiter zu inkubieren. Messen Sie abschließend die Werte von OD636 mit einem multifunktionalen Mikroplatten-Reader.

5. Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose und des Zellzyklus

HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht31.

  1. Die Zellen werden verdaut und geerntet, um sie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für eine 20-minütige Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) zu resuspendieren (siehe Materialtabelle), und dann die Anzahl der apoptotischen Zellen mit einem Durchflusszytometer zu bestimmen.
  2. Mischen Sie die resuspendierte Probenlösung mit PI-Lösung für eine 30-minütige Inkubation, gefolgt von der Detektion mit einem Durchflusszytometer.

6. DCFH-DA und Fluo-4 AM Fluoreszenzfärbung

HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in einem früheren Bericht29.

  1. Inkubieren Sie die MCF-7-Zellen 20 Minuten lang mit einer 10 μM DCFH-DA-Fluoreszenzsonde (siehe Materialtabelle) bei 37 °C. Nach gründlicher Entfernung des überschüssigen DCFH-DA durch dreimaliges Waschen mit PBS wird die Fluoreszenzintensität bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm bzw. 525 nm mit einem Fluoreszenzmikroskop getestet.
  2. Inkubieren Sie die MCF-7-Zellen mit einer 5 μM Fluo-4 AM-Fluoreszenzsondenlösung (siehe Materialtabelle) für 45 Minuten bei 37 °C. Nach dreimaligem Waschen mit PBS werden die Fluoreszenzintensitätswerte bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm bzw. 516 nm mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.

7. Westlicher Fleck

  1. 2 ml 5 x 10 6 Zellen/ml Zellsuspensionen, die verschiedene Arzneimittel enthalten, in 6-Well-Platten geben und in einem 37 °C heißen 5%igenCO2-Inkubator 24 h lang kultivieren.
    HINWEIS: Die Gruppen für die Western-Blot-Analyse wurden wie folgt festgelegt: Kontrollgruppe, LY294002 (10 μM) Gruppe, Sal (80 μM) Gruppe und LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) Gruppe (siehe Materialtabelle).
  2. Die Zellen und der Überstand werden gesammelt und bei 560 × g bei 4 °C für 3 Minuten zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn zweimal mit vorgekühltem PBS. Nach jedem Waschgang zentrifugieren Sie die Zellen bei 560 × g bei 4 °C für 3 min.
  3. Geben Sie 50 μl Lysepuffer in die Zellprobe aus Schritt 7.2 für ein 15-minütiges Eisbad. Bei 8550 × g bei 4 °C für 10 min zentrifugieren, um die überstehende Proteinprobe zu entnehmen.
  4. Nach dem Nachweis der Proteinkonzentration mit einer BCA-Methode wird die Proteinprobe in Schritt 7.3 mit einem Beladungspuffer im Verhältnis 4:1 gemischt, bei 100 °C für 10 min in einem Metallbad denaturiert und auf Raumtemperatur abgekühlt.
  5. Geben Sie 20 μg der Proteinprobe aus Schritt 7.4 hinzu, trennen Sie die Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten35unter Verwendung von 10 % SDS-PAGE (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie dann auf 0,22 μm PVDF-Membranen. Nach Blockade mit 5% BSA werden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit den entsprechenden Primärantikörpern inkubiert.
    HINWEIS: Die verdünnte Konzentration der folgenden Primärantikörper beträgt 1:1.000: gespaltene Caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 und β-Aktin (siehe Materialtabelle).
  6. Am nächsten Tag werden die Membranen 2 h lang bei 37 °C mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper inkubiert. Entwickeln Sie die Membranen mit einer ECL-Chemilumineszenzlösung und nehmen Sie Bilder mit einem berührungslosen quantitativen Western-Blot-Bildgebungssystem auf (siehe Materialtabelle).

8. qRT-PCR

  1. Führen Sie eine Zentrifugation durch, um MCF-7-Zellen bei 560 x g bei 4 °C für 3 Minuten zu sammeln, und fügen Sie 500 μl Puffer RL1 in 5 × 106 Zellen hinzu. Blasen und mischen Sie wiederholt mit einer Pipette, bis keine Zellmassen mehr sichtbar sind.
    HINWEIS: Puffer RL1 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).
  2. Die Zellhomogenate in Schritt 8.1 werden in die in das Sammelröhrchen eingebettete DNA-Reinigungssäule überführt und bei 8.550 × g bei 4 °C für 2 min zentrifugiert. Entfernen Sie die DNA-Reinigungssäule und lassen Sie den Überstand im Sammelröhrchen.
    HINWEIS: Die DNA-Reinigungssäule und das Sammelröhrchen sind zwei der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).
  3. 800 μl Puffer RL2 zu 500 μl des Überstandes aus Schritt 8.2 geben und vorsichtig mischen.
    HINWEIS: Puffer RL2 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle). Vor Gebrauch 120 ml wasserfreies Ethanol zu 60 ml Puffer RL2 geben.
  4. 700 μl des Gemisches aus Schritt 8.3 werden in die reine RNA-Säule überführt, die in das Sammelröhrchen eingebettet ist, und bei 8.550 × g bei 4 °C für 1 Minute zentrifugiert. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen.
    HINWEIS: Die reine RNA-Säule ist eine der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).
  5. Wiederholen Sie Schritt 8.4, um das verbleibende Gemisch aus Schritt 8.3 zu verarbeiten.
  6. 500 μl Puffer RW1 in die reine RNA-Säule geben und bei 8.550 × g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen.
    HINWEIS: Puffer RW1 ist eine der Komponenten des gesamten RNA-Isolierungskits (siehe Materialtabelle).
  7. 700 μl Puffer RW2 in die reine RNA-Säule geben und bei 8.550 × g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit im Auffangröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 8.7 einmal.
    HINWEIS: Puffer RW2 ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).
  8. Die reine RNA-Säule wieder in das Sammelröhrchen geben und bei 8550 × g bei 4 °C 2 min zentrifugieren, um den verbleibenden Puffer RW2 zu entfernen.
  9. Übertragen Sie die reine RNA-Säule in ein neues Sammelröhrchen und tropfen Sie 100 μl RNase-freiesddH2O, das bei 65 °C vorgewärmt ist, in die Mitte der Membran für die reine RNA-Säule. Bei 25 °C für 2 min aufstellen und die RNA-Lösung durch Zentrifugieren bei 8.550 × g bei 4 °C für 1 min sammeln.
    HINWEIS: RNase-freies ddH2O ist eine der Komponenten im gesamten RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle).
  10. 4 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl Oligo (dT)18-Primer , 1 μl Random-Hexamer-Primer, 1 μl genspezifischer Primer (siehe Tabelle 1), 1 μl Enzymmischung und 5 μg der RNA-Lösung aus Schritt 8.9 in einen 100 μl 8-Röhrchen-Streifen geben. Ergänzen Sie das Reaktionssystem mit RNase-freiem Wasser auf 20 μl.
  11. Stellen Sie die Reaktionsbedingungen des Systems wie folgt ein: (1): 95 °C, 30 s, 1 Zyklus; (2): 95 °C, 5 s, 50 Zyklen, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 Zyklus, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; und (4): 42 °C, 30 s, 1 Zyklus. Führen Sie das qRT-PCR-Verfahren aus.
    ANMERKUNG: Die relativen Expressionsniveaus der Zielgene wurden quantitativ mit der 2−ΔΔCT-Methode 36,37 analysiert. Die Primer-Informationen jedes Gens, das für die qRT-PCR-Analyse verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

9. Statistische Analyse

  1. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten an.
  2. Analysieren Sie die Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle) mit einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Tukey-Test. In dieser Arbeit wurde P < 0,05 als statistisch signifikant definiert.

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Representative Results

Auswirkungen von Sal auf die Hemmung der übermäßigen Proliferation und die Verzögerung der Wundheilung in MCF-7-Zellen
Um das Potenzial von Sal gegen Brustkrebs zu untersuchen, testeten wir zunächst seine krebshemmenden Eigenschaften mit Hilfe von Zellproliferationstoxizität und Scratch-Assays der menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Diese Zellen wurden mit einer Konzentrationsreihe von Sal (5-320 μM) für 24 h co-inkubiert, und die Zellproliferation wurde mit einem CCK-8-Assay bewertet. Es wurde eine dosisabhängige hemmende Wirkung von Sal auf die Zellproliferation beobachtet, wobei die Zellvitalität bei 40 μM um 50 % abnahm (Abbildung 2A). Sal-Konzentrationen von 20 μM, 40 μM und 80 μM wurden dann für die nachfolgenden Zeitpunkte und die Bewertung der Wundheilung ausgewählt. Die Ergebnisse in Abbildung 2B zeigen, dass Sal die Vitalität von MCF-7-Zellen im Laufe der Zeit hemmen konnte, mit einer 50%igen Abnahme der MCF-7-Zellvitalität nach 24 Stunden Co-Inkubation. Abbildung 2C-R zeigt die hemmende Wirkung der Sal-Behandlung auf die Wundheilung von MCF-7-Zellen, wie sie durch den Wundkratz-Assay bestimmt wurde. Weitere Zell-Scratch-Tests bestätigten ebenfalls, dass 24 h Kultur mit Sal (20 μM, 40 μM und 80 μM) den Prozess der Wundheilung stark behinderten (Abbildung 2C,D).

Unterdrückung der malignen Migration und Invasion von MCF-7-Zellen durch Sal
Die Wanderung einer großen Anzahl von Tumorzellen und die Neigung zum Eindringen in Parakarzinomgewebe sind als typische Merkmale bösartiger Tumoren bekannt. Die Auswirkungen von Sal auf die Migration und Invasion von MCF-7-Zellen wurden weiter mit einem Transwell-System getestet, das mit oder ohne extrazelluläres Matrixgel beschichtet war. Die Sal-Behandlung reduzierte signifikant die unerwünschte Migration (Abbildung 3A-F) und Invasion (Abbildung 3G-L) von MCF-7-Zellen. Wie in Abbildung 3A gezeigt, neutralisierte die Behandlung mit Sal überraschenderweise die Migration von MCF-7-Zellen. Fast einstimmig wurde der bösartige Invasionsprozess von MCF-7-Zellen nach der Inkubation mit Sal effektiv abgeschaltet (Abbildung 3B). Die oben genannten Daten bestätigten die Vorteile von Sal bei der Hemmung von Brustkrebs in vollem Umfang.

Auswirkungen von Sal auf die Förderung der Apoptose und die Verbesserung des Zyklusarrests in MCF-7-Zellen
Die Immortalisierung und regelmäßige Vermehrung von Krebszellen bietet die Möglichkeit, dass sich Krebs verschlimmert und ausbreitet. Selbstverständlich ist auch die Förderung der Apoptose und der Zyklusunterdrückung zu akzeptierten Strategien zur Krebsprävention geworden. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie deuteten darauf hin, dass die Sal-Behandlung die Anzahl der MCF-7-Zellen in den frühen und späten apoptotischen Stadien erhöhte (Abbildung 4A). Im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte die Sal-Behandlung auch die Anzahl der Zellen in der G0/G1-Phase stark und reduzierte gleichzeitig den Anteil der S-Phase-Zellen (Abbildung 4B). Die Förderung der Apoptose und des Zyklusstillstands kann als mögliche pharmakologische Wirkung von Sal gegen Brustkrebs dienen.

Wirkung von Sal auf die Stimulierung der intrazellulären ROS- und Ca2+ -Überproduktion in MCF-7-Zellen
Durch die kontinuierliche Stimulation der intrazellulären ROS- undCa2+-Produktion kann das Wachstum von Tumorzellen wirksam gehemmt werden. Abbildung 5A-E zeigt den ROS-Gehalt, der durch DCFH-DA-Immunfluoreszenzfärbung bestimmt wurde. Die quantitativen Ergebnisse für ROS sind in Abbildung 5F dargestellt. Die Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung wurde verwendet, um die Ca2+ Konzentration zu detektieren (Abbildung 5G-K). Abbildung 5L zeigt die quantitativen Ergebnisse für Ca2+. Die DCFH-DA-Ergebnisse zeigten, dass Sal die ROS-Fluoreszenzsignale im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verbesserte (Abbildung 5A). Konsistenterweise erhöhte die Sal-Intervention auch die Ca2+-Produktion deutlich, was durch das hervorgehobene Fluoreszenzsignal Fluo-4 AM belegt wird (Abbildung 5B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ROS- und Ca2+-Signale teilweise an der Anti-Brustkrebs-Aktivität von Sal beteiligt sein könnten.

Wirkung von Sal bei der Induktion von Apoptose im mitochondrialen Signalweg von MCF-7-Zellen
Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass Apoptose, die durch mitochondriale Dysfunktion induziert wird, das endgültige Schicksal vieler Tumorzellen bestimmt. Bei der Bestimmung, ob Sal die Regulation der mitochondrialen Funktion und Apoptose-fördernde Effekte in MCF-7-Zellen vermittelt, wurde zunächst gezeigt, dass Sal die Enzymvitalität von Na+-K+-ATPase (Abbildung 6A) und Ca2+-ATPase (Abbildung 6B) einschränkt, was auf seine potenzielle Rolle bei der Förderung der mitochondrialen Dysfunktion hinweist. Anschließend zeigten Western-Blot- und qRT-PCR-Daten, dass die Sal-Behandlung die Protein- und Genexpression der pro-apoptotischen Faktoren CC-9 (Abbildung 6C,D,G), CC-7 (Abbildung 6C,E,H), CC-3 (Abbildung 6C,F,I), Bim (Abbildung 6C,J,M) und Bax (Abbildung 6C,L,O) förderte, während sie die Protein- und Genexpression von anti-apoptotischem Bcl-2 hemmte (Abbildung 6C,K,N). Diese Daten zeigen teilweise, dass eine mitochondriale Dysfunktion in MCF-7-Zellen in Verbindung mit Apoptose am Wirkmechanismus von Sal gegen Brustkrebs beteiligt sein könnte.

Wirkung von Sal auf die Unterdrückung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs in MCF-7-Zellen
Der PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg ist als entscheidender Signaltransduktionsweg, der das Tumorwachstum reguliert, an der pathologischen Progression und Verschlechterung von Brustkrebs beteiligt. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die Sal-Behandlung die Verhältnisse von p-PI3K/PI3K (Abbildung 7A,B) und p-AKT/AKT (Abbildung 7A,C) deutlich einschränkte. In der Zwischenzeit wurde auch die Proteinexpression von mTOR (Abbildung 7A,D), HIF-1α (Abbildung 7A,E) und FoxO1 (Abbildung 7A,F) durch die Sal-Behandlung deutlich unterdrückt. Weitere qRT-PCR-Analysen zeigten auch, dass die Verabreichung von Sal die Genexpressionsniveaus von PI3K (Abbildung 7G), AKT (Abbildung 7H), mTOR (Abbildung 7I), HIF-1α (Abbildung 7J) und FoxO1 (Abbildung 7K) reduzierte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hemmung der Aktivierung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs ein möglicher molekularer Mechanismus von Sal gegen Brustkrebs sein könnte.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Wirkung von Sal gegen die Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Toxizität der MCF-7-Zellproliferation und die Wundheilungseigenschaften von Sal. (A) und (B) zeigen die Dosis-Zeit-Effekte der Sal-Behandlung auf die MCF-7-Zellaktivität. (C-R) Hemmende Wirkung der Sal-Behandlung auf die Wundheilung in MCF-7-Zellen, bestimmt durch den Wundkratz-Assay. Die obigen Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3. ##p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Maßstabsleisten: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Unterdrückung der malignen Migration und Invasion von MCF-7-Zellen durch Sal-Behandlung. Die Sal-Behandlung reduziert signifikant die unerwünschte (A-F) Migration und (G-L) Invasion von MCF-7-Zellen. Die obigen Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3. <#p < 0,05 und ##p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Maßstabsleisten: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Förderung der Apoptose und Unterdrückung des Zellzyklus durch Sal. Die (A) apoptotische Förderung und (B) Zellzyklus-Arrest-Effekte von Sal auf MCF-7-Zellen, wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wurden. Die obigen Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3. #p < 0,05 und ##p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Anstieg von ROS und Ca2+ in MCF-7-Zellen durch Sal-Behandlung. (A-E) Der ROS-Gehalt wurde mittels DCFH-DA-Immunfluoreszenzfärbung bestimmt. (F) Quantitative Ergebnisse für ROS. (G-K) Die Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung wurde verwendet, um die Ca2+ Konzentration zu detektieren. (L) Quantitative Ergebnisse für Ca2+. Die obigen Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3. #p < 0,05 und ##p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Maßstabsleisten: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Wirkung der Sal-Behandlung auf die Induktion einer mitochondrialen Dysfunktion in Verbindung mit Apoptose in MCF-7-Zellen. Die reduzierte Enzymaktivität von (A) Na+-K+-ATPase und (B)Ca2+-ATPase. (C) Repräsentative Proteinexpressionsbanden und ihre entsprechenden statistischen Ergebnisse für die Gene (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 und (L) Bax sowie für die Gene (G) Caspase-9, (H) Caspase-7, (I) Caspase-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 und (O) Bax. Die obigen Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3. #p < 0,05 und ##p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Unterdrückung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs durch Sal-Behandlung . (A) Repräsentative Proteinbanden, die durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen wurden. Sal reduzierte die Proteinexpression von (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α und (F) FoxO1. Sal unterdrückte die Genexpressionsniveaus von (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α und (K) FoxO1. Die obigen Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3. # #p < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Stimulation der ROS- undCa2+ -Produktion in MCF-7-Zellen durch Sal, begleitet von der Hemmung der PI3K-Signaltransduktion. Unter Beteiligung von mTOR konnte die Phosphorylierung von AKT nach Sal-Verabreichung weiter reduziert werden. Folglich blockierte die herunterregulierte Expression von HIF-1α und FoxO1 die periodische maligne Proliferation von MCF-7-Zellen. In der Zwischenzeit deutete die verstärkte Apoptose von MCF-7-Zellen auf das Anti-Brustkrebs-Potenzial von Sal hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gen GenBank-Beitritts-Nr. Primer-Sequenz (5'-3') Länge (bp)
Kaspase-9 NM_001229 F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG 92
R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC
Caspase-7 F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC 164
R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTCTT
Caspase-3 NM_001354777 F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG 185
R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG
Bim NM_001204106 F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA 130
R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG
Bcl-2-KARTON NM_000633 F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG 129
R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC
Bax NM_001291428 F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG 157
R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA
β-Aktin NM_031144 F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA 172
R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA
F, vorwärts; R, umgekehrt.

Tabelle 1: Primer, die für die reverse Transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden.

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Discussion

Brustkrebs betrifft Menschen jeden Alters und verursacht unkalkulierbare körperliche und seelische Belastungen und einen großen wirtschaftlichen Druck1. Brustkrebs mit seiner von Jahr zu Jahr steigenden Morbidität und Mortalität hat auch weltweite Aufmerksamkeit auf sich gezogen, wenn es darum geht, wirksame pflanzliche Therapien zu finden, die über herkömmliche Behandlungen hinausgehen 4,5. Vielversprechend ist, dass eine große Anzahl von Beweisen die krebshemmende Wirkung von Sal24,25,38 enthüllt hat. Leider sind die Rolle von Sal bei Brustkrebs und die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen noch weitgehend unbekannt. Diese Studie unterstreicht die signifikanten hemmenden Wirkungen von Sal auf die Proliferation, Migration und Invasion der menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Anschließend zeigten wir das Potenzial von Sal bei der irritierenden Apoptose und dem Zyklusarrest von MCF-7-Zellen. In der Zwischenzeit zeigten diese Daten auch, dass die Verabreichung von Sal die ROS- und Ca2+-Spiegel erhöhte. Weitere Untersuchungen der molekularen Mechanismen zeigten die Apoptose-fördernde Wirkung von Sal in der Brustkrebsbehandlung und die Wirkung von Sal auf den PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-Signalweg.

Eine bösartige und unkontrollierte Vermehrung kann die Entstehung von Brustkrebs beschleunigen und das Risiko für Lymph-39 und Hirnmetastasen40 erhöhen. Derzeit sind nach und nach verfügbare Chemotherapeutika auf dem Markt erschienen, aber diese haben das Problem einer geringen Empfindlichkeit für die Behandlung von Brustkrebs, so dass die Menschen gezwungen sind, nach wirksameren Verbindungen oder neuartigen Medikamentenkombinationen zu suchen 2,3. Die Daten in dieser Arbeit zeigten zunächst, dass die Behandlung mit Sal die maligne Proliferation von MCF-7-Zellen einschränkte. Nachfolgende Zell-Scratch-Assays bestätigten außerdem, dass die 12-h- und 24-stündige Sal-Inkubation die Konvergenzrate von MCF-7-Zellen reduzierte. Tests auf die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen gelten als sensitive Indikatoren für das Screening von Anti-Tumor-Medikamenten24,25. Die Daten in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Sal den Prozess der MCF-7-Zellmigration und -invasion stark reduzierte, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt33,34. Der unkontrollierte Zellzyklus von Tumorzellen bestimmt das Schicksal der Zellunsterblichkeit24. Daher sind die Förderung der Apoptose und die Unterbrechung des Zellzyklus zu anerkannten und akzeptierten Indizes für die Bewertung des Antikrebspotenzials von Verbindungengeworden 25. In dieser Arbeit zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse, dass die Sal-Behandlung die Apoptose in MCF-7-Zellen deutlich erhöhte, was sich in einem erhöhten Anteil an frühen und späten apoptotischen Zellen zeigte. Darüber hinaus war das Verhältnis von G0/G1-Zellen erhöht und die S-Phase des MCF-7-Zellzyklus gestört, was auf die zellzyklusblockierende Wirkung von Sal auf Brustkrebszellen hinweist.

Die milde hypoxische Mikroumgebung von Brustkrebszellen ist mit Einschränkungen in der ROS- undCa2+ -Produktion verbunden; Daher kann eine übermäßige Akkumulation von ROS und Ca2+ apoptotische Ereignisse in Brustkrebszellen induzieren41. Die Immunfluoreszenzergebnisse in dieser Arbeit zeigten, dass die Sal-Intervention die Produktion von ROS und Ca2+ stark stimuliert, was die Apoptose von MCF-7-Zellen weiter induzieren könnte. Neue Erkenntnisse haben gezeigt, dass erhöhte Spiegel der pro-apoptotischen Proteine Bax und Bim sowie reduzierte Spiegel des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 den Durchgang von Material in und aus der Mitochondrienmembran vorübergehend und gewaltsam öffnen und so die programmierte Apoptose von Tumorzellen auslösenkönnen 42. In dieser Studie erhöhte die Co-Inkubation von Sal mit MCF-7-Zellen Bax und Bim signifikant und verringerte gleichzeitig die Protein- und Genexpression von Bcl-2, was auf seine potenziellen pharmakologischen Wirkungen auf die Förderung der Apoptose in Brustkrebszellen hindeutet. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass Sal die Expression der Proteine CC-9, CC-7 und CC-3, die wichtige nachgeschaltete Indikatoren des mitochondrialen Apoptosewegs sind, und ihrer entsprechenden Gene deutlich induziert. Die oben genannten Daten deuten teilweise darauf hin, dass die proapoptotische Wirkung von Sal auf Brustkrebs mit der Aktivierung der mitochondrialen Apoptose zusammenhängen könnte.

Molekulare Mechanismusstudien haben bestätigt, dass die Phosphorylierung von PI3K die AKT-Phosphorylierung weiter induzieren und das Wachstum von Brustkrebszellen beschleunigen kann 6,7. In der Zwischenzeit trägt die große Anreicherung von mTOR auch zur Verschlechterung von Brustkrebs bei, indem sie am AKT-Phosphorylierungsprozess beteiligt ist 8,9. Einerseits stimuliert phosphoryliertes AKT direkt die FoxO1-Expression, um den Brustkrebszellzyklus zu fördern und die Apoptose zu verlangsamen22,23. Parallel dazu aktiviert aktivierte AKT indirekt die HIF-1α-Expression zu FoxO1, was zu einer Progression des Brustkrebses und zur Metastasierung führt16,17. Folglich könnte die Hemmung der Aktivierung des PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-Signalwegs eine neue Strategie für die Behandlung von Brustkrebs sein. Mit der Intervention des PI3K-Inhibitors LY294002 zeigten die Daten, dass Sal die Phosphorylierung von PI3K beobachtbar unterdrückte. In Verbindung mit der Herunterregulierung der mTOR-Proteinexpression senkte Sal auch die Expressionsniveaus von phosphoryliertem AKT. Infolgedessen war die Expression der HIF-1α- und FoxO1-Proteine nach der Sal-Behandlung ebenfalls stark verringert. In ähnlicher Weise zeigten die qRT-PCR-Ergebnisse, dass die Sal-Behandlung die Genspiegel von PI3K, AKT, HIF-1α und FoxO1 stark verringerte, was zur Förderung des Zyklusarrests und der Apoptose von MCF-7-Zellen beitrug (Abbildung 8). Insgesamt deuten die erhaltenen Daten darauf hin, dass Sal ein potenzieller Wirkstoff natürlichen pflanzlichen Ursprungs mit Wirkung gegen Brustkrebs sein könnte. Die Förderung der Apoptose von MCF-7-Zellen und die Hemmung des Zellzyklus durch die Sal-Behandlung schwächte die Migrations- und Invasionsfähigkeit von Brustkrebszellen erheblich. Insbesondere könnte der molekulare Wirkmechanismus von Sal gegen Brustkrebs mit der Hemmung des PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1-Signalwegs zusammenhängen. Insgesamt bietet dieses Protokoll, das mehrere experimentelle Methoden integriert, einen gewissen Referenzwert für die Forschung und Entwicklung von Medikamenten gegen Brustkrebs.

In dieser Studie gibt es keine direkten Hinweise auf den molekularen Mechanismus von Sal gegen Brustkrebs. PI3K-Knockout-Mäuse, Brustkrebszelllinien mit hoher oder niedriger Expression des PI3K-Proteins und lokale Oberflächenplasmonenresonanztechniken sind die nächsten Schritte, die verwendet werden könnten, um die direkten molekularen Ziele von Sal für die Prävention und Behandlung von Brustkrebs zu bestätigen29,31.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Gesundheitskommission der Provinz Sichuan (120025) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018

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References

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Tags

Salidrosid pharmakologische Wirkung molekularer Mechanismus Hemmung der MCF-7-Zellproliferation Hemmung der MCF-7-Zellmigration antikarzinogen antihypoxisch entzündungshemmend PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg CCK-8-Assay Zell-Scratch-Assay Migrations-Assay Matrigel-Invasions-Assay Zellapoptose-Assay Zellzyklus-Assay reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Ca2+ Na+-K+-ATPase-Aktivität Proteinexpressionsniveaus Genexpressionsniveaus Western-Blot-Analyse QRT-PCR-Analyse
Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen
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Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., … More

Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).

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