Summary
본 프로토콜은 MCF-7 세포 증식 및 이동을 억제하는 살리드로사이드의 약리학적 작용 및 기전을 평가하기 위한 포괄적인 전략을 설명합니다.
Abstract
Salidroside (Sal)는 항 발암성, 항 저산소 및 항 염증 약리 활성을 포함합니다. 그러나, 그것의 근본적인 반대로 유방암 기계장치는 단지 불완전하게 해명되었다. 따라서 이 프로토콜은 인간 유방암 MCF-7 세포의 악성 증식에서 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 조절하는 Sal의 잠재력을 해독하기 위한 것입니다. 먼저, MCF-7에 대한 Sal의 약리활성을 CCK-8 및 세포 스크래치 분석으로 평가하였다. 또한, MCF-7 세포의 내성은 이동 및 Matrigel 침습 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 사멸 및 주기 분석을 위해 MCF-7 세포는 각각 유세포 분석을 위해 annexin V-FITC/PI 및 세포 주기 염색 검출 키트를 사용하여 단계적으로 처리되었습니다. 활성 산소종(ROS) 및 Ca2+의 수준은 DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 면역형광 염색으로 검사되었습니다. Na+-K+-ATPase 및 Ca2+-ATPase의 활성은 해당 상용 키트를 사용하여 측정하였다. 세포사멸 및 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 단백질 및 유전자 발현 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석을 사용하여 추가로 측정되었습니다. Sal 치료는 용량 의존적 효과로 MCF-7 세포의 증식, 이동 및 침입을 유의하게 제한한다는 것을 발견했습니다. 한편, Sal 투여는 MCF-7 세포가 세포사멸(apoptosis)과 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 겪도록 극적으로 강제했다. 면역형광 검사는 Sal이 MCF-7 세포에서 ROS 및 Ca2+ 생산을 관찰할 수 있게 자극하는 것으로 나타났습니다. 추가 데이터는 Sal이 pro-apoptotic 단백질, Bax, Bim, 절단된 caspase-9/7/3 및 해당 유전자의 발현 수준을 촉진한다는 것을 확인했습니다. 일관되게 Sal 중재는 Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α 및 FoxO1 단백질과 해당 유전자의 발현을 현저하게 감소시켰습니다. 결론적으로, Sal은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 억제하여 MCF-7 세포의 악성 증식, 이동 및 침입을 줄일 수 있기 때문에 유방암 치료를 위한 잠재적인 허브 유래 화합물로 사용할 수 있습니다.
Introduction
가장 흔하게 진단되는 암 및 가장 흔한 악성 종양 중 하나인 유방암은 최신 통계에 따르면 2020년까지 전 세계적으로 230만 건의 유방암이 발생하여 전체암 사례의 11.7%를 차지합니다1. 유방암의 일반적인 증상으로는 유방 압통과 따끔거림, 유방 덩어리 및 통증, 유두 분비물, 미란 또는 함몰된 피부, 겨드랑이 림프절 비대증등이 있다 1,2. 더욱 우려스러운 것은 유방암의 신규 발병 건수와 전체 발병률이 매년 압도적인 비율로 계속 증가하여 암 관련 사망의 6.9%를 차지한다는 것입니다1. 현재 유방암 중재는 여전히 주로 화학 요법, 수술, 방사선 요법 및 포괄적 인 치료를 포함합니다. 치료는 환자의 재발률과 사망률을 효과적으로 낮출 수 있지만, 장기간의 치료는 종종 다제내성, 대면적 탈모, 메스꺼움 및 구토, 심각한 정신적, 심리적 부담을 유발한다 2,3. 특히, 유방암으로 인한 다발성 장기 전이의 잠재적 위험으로 인해 사람들은 약물 요법의 새로운 약초 공급원을 찾게 된다 4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) 매개 신호전달은 여러 유전자의 발현에 영향을 미치는 스플라이싱을 통해 유방암의 성장, 증식 및 생존에 관여한다6. PI3K의 다운스트림 신호 감지 단백질인 단백질 키나아제 B(AKT)가 포유류 표적인 라파마이신(mTOR) 단백질과 결합하여 유방암을 더욱 증가시킬 수 있다는 수많은 증거가 있습니다 7,8,9. 또한, PI3K/AKT/mTOR 신호전달의 비활성화는 유방암에서 악성 증식을 억제하고 세포사멸을 자극하는 약물의 핵심 성분이라고 주장되어 왔다10,11,12. 종양 미세환경에서의 극심한 저산소증은 저산소증 유발 인자 1 알파(HIF-1α)의 급증을 강요하며, 이는 유방암의 진행을 더욱 악화시킨다는 것은 잘 알려져 있다13,14,15. 동시에, AKT 자극은 또한 HIF-1α의 과도한 축적을 유도하여, 유방암 샘플에서 세포사멸을 제한한다16,17. 흥미롭게도, PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 활성화는 폐암18, 대장암19, 난소암20, 전립선암21을 포함한 다양한 암에서 병리학적 진행 및 전이에 관여하는 것으로 확인되었다. HIF-1α에 의해 조율되는 것 외에도 갈래 머리 전사 인자 1(FoxO1) 과발현은 AKT 신호 자극에 의해 유발되며, 이는 주기 정지 및 유방암 세포의 세포 사멸 억제를 촉진합니다22,23. 위의 확실한 증거는 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달의 캐스케이드 억제가 유방암에서 약물 요법을 위한 잠재적인 새로운 표적이 될 수 있음을 시사합니다.
Salidroside (Sal)는 항암 24,25, 항 저산소증26,27,28,29 및 면역 강화 약리 활성30을 발휘하는 것으로 널리 입증되었습니다. 물에 쉽게 용해되는 밝은 갈색 또는 갈색 분말이며 페닐에탄노이드 배당체의 일종이며 화학 구조식은 C14H 20 O7이고 분자량은300.331,32입니다. 현대의 약리학적 연구는 Sal이 PI3K-AKT-mTOR 신호전달을 억제함으로써 위암 세포의 세포사멸을 촉진할 수 있음을 입증했다24. 추가 증거는 또한 Sal 치료에 의한 PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 억제가 화학요법제에 대한 암세포의 감수성을 향상시킴으로써 암세포의 세포사멸에 기여할 수 있음을 시사한다25. 증거는 또한 Sal이 세포 이동 및 침입을 제한하고 인간 유방암 MCF-7 세포33,34에서 세포 사멸을 촉진하여 주기 정지를 유발한다는 것을 시사합니다. 그러나 Sal이 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달을 조절하고 MCF-7 세포의 악성 증식을 억제할 수 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 통해 MCF-7 세포 이동, 침입, 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 Sal의 효과를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 세포 이동 및 침습 평가, 유세포 분석에 의한 세포 사멸 및 세포 주기 검출, 활성 산소 종(ROS) 및 Ca2+ 형광 측정 등과 같은 기존의 저비용 및 독립적인 실험으로 구성된 통합 연구 전략은 전통 한약을 사용한 항암 연구를 위한 전반적인 실험 설계에 대한 참고 자료를 제공할 수 있습니다. 이 연구의 실험 과정은 그림 1에 나와 있습니다.
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Protocol
본 연구에 사용된 MCF-7 세포는 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).
1. 세포 배양
- 10% FBS 및 1% 페니실린(10,000U/mL)/스트렙토마이신(10,000μg/mL)을 함유한 DMEM을 사용하여 37°C에서 가습된 5%CO2 분위기에서 MCF-7 세포를 배양합니다( 재료 표 참조).
참고: 접시 바닥의 90%를 차지하는 세포를 실험에 사용하고 대조군, 독소루비신 염산염 그룹(DXR, 5μM) 및 Sal 그룹(20μM, 40μM 및 80μM) 또는 대조군, LY294002(10μM, PI3K 억제제) 그룹, Sal(80μM) 그룹 및 LY294002(10μM) + Sal(80μM) 그룹( 재료 표 참조).
2. 세포 생존율 분석
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서27을 참조하십시오.
- 96웰 플레이트에 8 x 104 세포/웰 밀도의 MCF-7 세포를 파종하고 세포가 부착될 때까지 Sal(10μM, 20μM, 40μM, 80μM, 160μM 및 320μM)로 24시간 동안 또는 Sal(20, 40, 80μM)로 12시간/24시간/36시간/48시간 동안 배양합니다.
- 처리 후 MCF-7 세포를 10μL/웰의 CCK-8 용액( 재료 표 참조)과 2시간 동안 공동 배양합니다. 그런 다음 자동 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm(OD450)에서 광학 밀도를 측정합니다.
3. 세포 이동 및 침입
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서35를 참조하십시오.
- 접시 바닥의 90%를 덮도록 6웰 플레이트에 파종한 5 x 106 cells/mL 세포 2mL를 배양합니다.
- 멸균 피펫 팁으로 세포 단층의 중심을 따라 선형 스크래치 감기를 수행합니다. 광학 현미경을 사용하여 0시간, 24시간, 48시간에서 이미지를 획득합니다.
- Image J 소프트웨어를 사용하여 긁힌 상처의 너비를 측정합니다.
- 트랜스웰 분석의 경우, 혈청 배지 없이 MCF-7 세포를 현탁시키고 Matrigel을 사용하거나 사용하지 않고 사전 코팅된 상부 트랜스웰 챔버에 파종합니다( 재료 표 참조).
- transwell 약실의 바닥에서는, 화학 유도자로 DMEM 완전한 매체를 이용하십시오. 24시간 후, 상부 챔버에서 세포를 제거하고, 메탄올35에 잔류하는 침습성 및 이주성 세포를 고정시킨다.
- MCF-7 세포를 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색합니다( 재료 표 참조). 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
4. Na+-K+-ATPase 및 Ca 2+-Mg2+-ATPase의 활성 평가
- 비신코닌산(BCA) 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 용해된 MCF-7 세포의 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
- 용해된 세포의 샘플을 해당 그룹에 96웰 플레이트에 추가합니다. 그 후, 작업 용액을 추가하여 37 °C에서 5 분 동안 추가로 배양합니다. 마지막으로 다기능 마이크로플레이트 리더로 OD636 의 값을 측정합니다.
5. 세포사멸 및 세포주기의 유세포 분석
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서31을 참조하십시오.
- 세포를 분해하고 인산염 완충 식염수(PBS)에서 20분 동안 annexin V-FITC 및 propidium iodide(PI)로 염색한 다음( 재료 표 참조) 유세포 분석기를 사용하여 자가사멸 세포의 수를 측정합니다.
- 재현탁된 샘플 용액을 PI 용액과 혼합하여 30분 동안 배양한 후 유세포 분석기로 검출합니다.
6. DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 형광 염색
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서29를 참조하십시오.
- 37°C에서 10μM DCFH-DA 형광 프로브( 재료 표 참조)를 사용하여 MCF-7 세포를 20분 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척하여 잉여 DCFH-DA를 완전히 제거한 후 형광 현미경을 사용하여 각각 488nm 및 525nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 강도를 테스트합니다.
- MCF-7 세포를 5μM Fluo-4 AM 형광 프로브 용액( 재료 표 참조)으로 37°C에서 45분 동안 배양합니다. PBS로 세 번 세척한 후 형광 현미경을 사용하여 각각 488nm 및 516nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 강도 값을 결정합니다.
7. 웨스턴 블롯
- 다양한 약물이 포함된 2mL의 5 x 10 6 cells/mL 세포 현탁액을6 웰 플레이트에 추가하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
참고: 웨스턴 블롯 분석을 위한 그룹은 대조군, LY294002(10μM)군, Sal(80μM)군 및 LY294002(10μM)+Sal(80μM)군으로 설정되었습니다( 재료 표 참조). - 세포와 상층액을 수집하고 4°C에서 560× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 미리 냉각된 PBS로 두 번 세척하십시오. 세척할 때마다 4°C에서 560× g 으로 3분 동안 세포를 원심분리합니다.
- 7.2단계의 세포 샘플에 50μL 용해 완충액을 추가하여 15분 동안 얼음 목욕을 합니다. 4°C에서 8550× g 으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 단백질 샘플을 수집합니다.
- BCA 방법을 사용하여 단백질 농도를 검출한 후 7.3단계의 단백질 샘플을 로딩 버퍼와 4:1의 비율로 혼합하고 금속 수조에서 100°C에서 10분 동안 변성시킨 후 실온으로 냉각합니다.
- 단계 7.4에서 단백질 표본의 20 μg를 추가하고, 10% SDS-PAGE를 사용하여 다른 분자량35를 가진 단백질을 분리하고십시오 ( 물자의 표 보십시오), 그 후에 0.22 μm PVDF 막으로 옮깁니다. 5% BSA로 막힌 후 4°C에서 하룻밤 동안 해당 1차 항체로 멤브레인을 배양합니다.
참고: 절단된 카스파제-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 및 β-actin과 같은 1차 항체의 희석 농도는 1:1,000입니다( 재료 표 참조). - 다음날 37°C에서 2시간 동안 염소 항토끼 IgG 2차 항체로 막을 배양합니다. ECL 화학발광 용액을 사용하여 멤브레인을 개발하고 비접촉식 정량적 웨스턴 블롯 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).
8. qRT-PCR (영문)
- 원심분리를 수행하여 4°C에서 560 x g 에서 3분 동안 MCF-7 세포를 수집하고 500μL 완충액 RL1을 5 × 106 세포에 추가합니다. 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 피펫으로 불고 반복적으로 혼합합니다.
참고: Buffer RL1은 total RNA isolation kit의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). - 8.1 단계의 세포 균질액을 수집 튜브에 내장된 DNA 세척 컬럼으로 옮기고 4°C에서 8,550× g 으로 2분 동안 원심분리합니다. DNA 세척 컬럼을 제거하고 상층액을 수집 튜브에 보관합니다.
참고: DNA 세척 컬럼과 수집 튜브는 전체 RNA 분리 키트의 두 가지 구성 요소입니다( 재료 표 참조). - 8.2단계에서 상층액 500μL에 800μL 완충액 RL2를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
참고: Buffer RL2는 total RNA isolation kit의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). 사용하기 전에 120mL의 무수 에탄올을 60mL의 완충액 RL2에 첨가합니다. - 단계 8.3에서 혼합물 700μL를 수집 튜브에 내장된 RNA 전용 컬럼으로 옮기고 4°C에서 1분 동안 8,550× g 으로 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오.
참고: RNA 전용 컬럼은 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). - 8.4단계를 반복하여 8.3단계에서 나머지 혼합물을 처리합니다.
- RNA 전용 컬럼에 500μL의 완충액 RW1을 추가하고 4°C에서 8,550× g 으로 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오.
참고: 버퍼 RW1은 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). - RNA 전용 컬럼에 700μL의 완충액 RW2를 추가하고 4 ◦C에서 8,550× g 으로 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오. 8.7단계를 한 번 반복합니다.
참고: 완충액 RW2는 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). - RNA 전용 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣고 4°C에서 8550× g 으로 2분 동안 원심분리하여 나머지 완충액 RW2를 제거합니다.
- RNA 전용 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 65°C에서 예열된 100μL의 RNase-free ddH2O를 RNA 전용 컬럼용 멤브레인 중앙으로 떨어뜨립니다. 25°C에서 2분간 방치하고, 4°C에서 8,550× g 에서 1분간 원심분리하여 RNA 용액을 채취합니다.
참고: RNase-free ddH2O는 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). - 4 μL의 5x 반응 완충액, 1 μL의 올리고(dT)18 프라이머, 1 μL의 무작위 헥사머 프라이머, 1 μL의 유전자 특이적 프라이머(표 1 참조), 1 μL의 효소 혼합물 및 8.9단계의 RNA 용액 5 μg을 100 μL 8-튜브 스트립에 추가합니다. RNase가 없는 물로 반응 시스템을 20μL까지 보충합니다.
- 시스템의 반응 조건을 다음과 같이 설정하십시오 : (1) : 95 °C, 30 s, 1 사이클; (2): 95°C, 5초, 50주기, 60°C, 34초; (3): 95°C, 5초, 1주기, 65°C, 60초, 97°C, 1초; 및 (4): 42°C, 30초, 1사이클. qRT-PCR 프로시저를 실행합니다.
참고: 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2−ΔΔCT 방법36,37에 의해 정량적으로 분석되었습니다. qRT-PCR 분석에 사용되는 각 유전자의 프라이머 정보는 표 1에 기재되어 있다.
9. 통계 분석
- 데이터를 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표현합니다.
- 그래프 및 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 단방향 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 검정을 사용하여 여러 그룹 간의 비교를 분석합니다. 이 연구에서 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 정의되었습니다.
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Representative Results
MCF-7 세포의 과잉 증식 억제 및 상처 치유 지연에 대한 Sal의 효과
유방암에 대한 Sal의 잠재력을 조사하기 위해 먼저 인간 유방암 MCF-7 세포주의 세포 증식 독성 및 스크래치 분석을 사용하여 항암 특성을 테스트했습니다. 이들 세포를 24시간 동안 일련의 Sal(5-320μM) 농도와 함께 공동 배양하고, CCK-8 분석을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 세포 증식에 대한 Sal의 용량 의존적 억제 효과가 관찰되었으며, 40μM에서 세포 활력이 50% 감소했습니다(그림 2A). 그런 다음 20μM, 40μM 및 80μM의 Sal 농도를 후속 시점 및 상처 치유 평가를 위해 선택했습니다. 그림 2B의 결과는 Sal이 시간이 지남에 따라 MCF-7 세포의 활력을 억제할 수 있음을 보여주며, 24시간의 공동 배양 후 MCF-7 세포 활력이 50% 감소합니다. 그림 2C-R은 상처 스크래치 분석에 의해 결정된 MCF-7 세포의 상처 치유에 대한 Sal 치료의 억제 효과를 보여줍니다. 추가 세포 스크래치 테스트에서도 Sal(20μM, 40μM 및 80μM)로 24시간 동안 배양하면 상처 치유 과정이 급격히 방해받는 것으로 확인되었습니다(그림 2C,D).
Sal에 의한 MCF-7 세포의 악성 이동 및 침입 억제
많은 수의 종양 세포의 이동과 파라암 조직을 침범하는 경향은 악성 종양의 전형적인 특징으로 인식되고 있습니다. MCF-7 세포의 이동 및 침입에 대한 Sal의 효과는 세포외 매트릭스 겔의 유무에 관계없이 코팅된 트랜스웰 시스템을 사용하여 추가로 테스트되었습니다. Sal 처리는 MCF-7 세포의 바람직하지 않은 이동(그림 3A-F) 및 침입(그림 3G-L)을 현저히 감소시켰습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 Sal을 사용한 처리는 놀랍게도 MCF-7 세포의 이동을 중화시켰습니다. 거의 만장일치로, MCF-7 세포의 악의적 침습 과정은 Sal로 배양한 후 효과적으로 중단되었습니다(그림 3B). 위의 데이터는 유방암 억제에 대한 Sal의 이점을 완전히 확인했습니다.
MCF-7 세포에서 세포사멸을 촉진하고 주기 정지를 강화하는 Sal의 효과
암세포의 불멸화와 주기적인 증식은 암이 악화되고 전이될 수 있는 기회를 제공합니다. 당연히, 세포사멸과 주기 억제의 촉진은 또한 암을 예방하기 위한 전략으로 받아들여지고 있다. 유세포 분석의 결과는 Sal 처리가 초기 및 후기 자가사멸 단계에서 MCF-7 세포의 수를 증가시킨다는 것을 시사했습니다(그림 4A). 한편, 대조군과 비교했을 때, Sal 처리는 G0/G1 상의 세포 수를 급격히 증가시키는 반면, S상 세포의 비율은 감소시켰다(그림 4B). 세포자멸사(apoptosis)와 주기 정지(cycle arrest)의 촉진은 유방암에 대한 Sal의 가능한 약리학적 작용으로 작용할 수 있다.
MCF-7 세포에서 세포 내 ROS 및 Ca2+ 과잉 생산 자극에 대한 Sal의 효과
세포 내 ROS 및 Ca2+ 생성의 지속적인 자극은 종양 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있습니다. 그림 5A-E는 DCFH-DA 면역형광 염색으로 평가한 ROS 함량을 보여줍니다. ROS의 정량적 결과는 그림 5F에 나와 있습니다. Ca2+ 농도를 검출하기 위해 Fluo-4 AM 면역형광 염색을 사용했습니다(그림 5G-K). 그림 5L은 Ca2+에 대한 정량적 결과를 보여줍니다. DCFH-DA 결과는 Sal이 대조군에 비해 ROS 형광 신호를 크게 향상시켰다는 것을 보여주었습니다(그림 5A). 일관되게 Sal 개입은 또한 강조된 Fluo-4 AM 형광 신호에 의해 입증된 Ca2+ 생성을 뚜렷하게 증가시켰습니다(그림 5B). 이러한 결과는 ROS 및 Ca2+ 신호가 Sal의 항유방암 활성에 부분적으로 관여할 수 있음을 총체적으로 나타냈습니다.
MCF-7 세포의 미토콘드리아 경로에서 세포사멸 유도에 대한 Sal의 효과
미토콘드리아 기능 장애에 의해 유도된 세포사멸이 많은 종양 세포의 궁극적인 운명을 결정한다는 풍부한 증거가 있습니다. Sal이 MCF-7 세포에서 미토콘드리아 기능 조절 및 세포사멸 촉진 효과를 매개하는지 여부를 결정함에 있어 Sal이 Na+-K+-ATPase(그림 6A) 및 Ca 2+-ATPase(그림 6B)의 효소 활력을 제한한다는 것이 먼저 입증되어 미토콘드리아 기능 장애를 촉진하는 잠재적인 역할을 나타냅니다. 그 후, 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 데이터는 Sal 처리가 세포사멸 방지 인자인 CC-9(그림 6C,D,G), CC-7(그림 6C,E,H), CC-3(그림 6C,F,I), Bim(그림 6C,J,M) 및 Bax(그림 6C,L,O)의 단백질 및 유전자 발현을 촉진하는 반면, 항세포사멸 Bcl-2의 단백질 및 유전자 발현을 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 6C,K,N)입니다. 이 데이터는 세포사멸과 결합된 MCF-7 세포의 미토콘드리아 기능 장애가 유방암에 대한 Sal의 작용 메커니즘에 관여할 수 있음을 부분적으로 보여줍니다.
MCF-7 세포에서 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 억제에 대한 Sal의 효과
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로는 종양 성장을 조절하는 중요한 신호 전달 경로로서 유방암의 병리학적 진행 및 악화에 관여합니다. 웨스턴 블롯 결과는 Sal 처리가 p-PI3K/PI3K(그림 7A,B) 및 p-AKT/AKT(그림 7A,C)의 비율을 현저하게 제한하는 것으로 나타났습니다. 한편, mTOR(그림 7A,D), HIF-1α(그림 7A,E) 및 FoxO1(그림 7A,F)의 단백질 발현도 Sal 처리에 의해 현저하게 억제되었습니다. 추가 qRT-PCR 분석은 또한 Sal 투여가 PI3K(그림 7G), AKT(그림 7H), mTOR(그림 7I), HIF-1α(그림 7J) 및 FoxO1(그림 7K)의 유전자 발현 수준을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 결론적으로, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 활성화 억제는 유방암에 대한 Sal의 잠재적인 분자 메커니즘일 수 있습니다.
그림 1: 유방암 MCF-7 세포주에 대한 Sal의 작용에 대한 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Sal의 MCF-7 세포 증식 독성 및 상처 치유 특성. (A) 및 (B)는 MCF-7 세포 활성에 대한 Sal 처리의 투여 시간 효과를 보여줍니다. (씨-알) 상처 스크래치 분석에 의해 결정된 MCF-7 세포의 상처 치유에 대한 Sal 치료의 억제 효과. 위의 데이터는 SD± 평균, n = 3으로 표시됩니다. ##p < 0.01 대 대조군. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Sal 처리에 의한 MCF-7 세포의 악성 이동 및 침입 억제. Sal 처리는 MCF-7 세포의 바람직하지 않은 (A-F) 이동 및 (G-L) 침입을 현저히 감소시킵니다. 위의 데이터는 SD± 평균, n = 3으로 표시됩니다. 대조군 대비 <#p < 0.05 및 ##p < 0.01. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Sal에 의한 세포사멸 촉진 및 세포주기 억제. 유세포 분석으로 검출된 MCF-7 세포에 대한 Sal의 (A) 자가사멸 촉진 및 (B) 세포주기 정지 효과. 위의 데이터는 SD± 평균, n = 3으로 표시됩니다. 대조군 대비 #p < 0.05 및 ##p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Sal 처리로 인한 MCF-7 세포의 ROS 및 Ca2+의 급증. (A-E) ROS 함량은 DCFH-DA 면역형광 염색으로 평가하였다. (F) ROS에 대한 정량적 결과. (지케이) Ca2+ 농도를 검출하기 위해 Fluo-4 AM 면역형광 염색을 사용했습니다. (L) Ca2+에 대한 정량적 결과. 위의 데이터는 SD± 평균, n = 3으로 표시됩니다. 대조군 대비 #p < 0.05 및 ##p < 0.01. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: MCF-7 세포에서 세포사멸과 결합된 미토콘드리아 기능 장애 유도에 대한 Sal 치료의 효과. (A) Na+-K+-ATPase 및 (B) Ca2+-ATPase의 감소된 효소 활성. (C) 대표적인 단백질 발현 밴드 및 (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 및 (L) Bax 단백질 및 (G) 카스파제-9, (H) 카스파제-7, (I) 카스파제-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 및 (O) Bax 유전자에 대한 해당 통계 결과. 위의 데이터는 SD± 평균, n = 3으로 표시됩니다. 대조군 대비 #p < 0.05 및 ##p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: Sal 처리에 의한 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로 억제 . (A) 웨스턴 블롯 분석으로 검출된 대표적인 단백질 띠. Sal은 (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α 및 (F) FoxO1의 단백질 발현을 감소시켰습니다. Sal은 (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α 및 (K) FoxO1의 유전자 발현 수준을 억제했습니다. 위의 데이터는 SD± 평균, n = 3으로 표시됩니다. # #p < 0.01 vs. 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: PI3K 신호 전달 억제를 동반한 Sal에 의한 MCF-7 세포의 ROS 및 Ca2+ 생산 자극. mTOR의 참여로 AKT의 인산화는 Sal 투여 후 더욱 감소되었습니다. 결과적으로, HIF-1α 및 FoxO1의 하향 조절된 발현은 MCF-7 세포의 주기적인 악성 증식을 차단했습니다. 한편, MCF-7 세포의 향상된 세포사멸은 Sal의 항유방암 가능성을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | GenBank 가입 번호 | 프라이머 서열(5'-3') | 길이(bp) | |
| Caspase-9 (카스파제-9) | NM_001229 | F, 가카가가트크그카아아아카가그 | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Caspase-7 (카스파제-7) | 에프, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| 아르 자형, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Caspase-3 (카스파제-3) | NM_001354777 | 에프, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| 빔 | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| 아르 자형, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 재질 보기 | NM_000633 | 에프, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| 백스 | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-액틴 | NM_031144 | 에프, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, 앞으로; R, 역순. | ||||
표 1: 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머.
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Discussion
유방암은 모든 연령대의 개인에게 영향을 미치며 헤아릴 수 없는 신체적, 정신적 부담과 큰 경제적 압박을 유발합니다1. 매년 이환율과 사망률이 증가하는 유방암은 기존 치료법을 넘어 효과적인 한방 기반 복합 요법을 찾는 측면에서 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다 4,5. 유망하게도, Sal24,25,38의 항암 효과가 밝혀진 많은 증거가 있습니다. 불행히도, 유방암에서 Sal의 역할과 근본적인 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려져 있지 않습니다. 이 연구는 인간 유방암 MCF-7 세포주의 증식, 이동 및 침입에 대한 Sal의 상당한 억제 효과를 강조합니다. 그 후, 우리는 MCF-7 세포의 자극적인 세포사멸 및 주기 정지에 대한 Sal의 잠재력을 밝혔습니다. 한편, 이러한 데이터는 Sal 투여가 ROS 및 Ca2+의 수준을 증가시켰다는 것을 보여주었습니다. 분자 메커니즘에 대한 추가 탐구는 유방암 치료에서 Sal의 세포 사멸 촉진 작용과 PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 경로에 대한 Sal의 효과를 입증했습니다.
악성 및 통제되지 않은 증식은 유방암의 발병을 가속화하고 림프액39 및 뇌전이40의 위험을 증가시킬 수 있다. 현재 시중에 나와 있는 화학요법 약물이 점진적으로 등장하고 있지만, 유방암 치료에 대한 민감도가 낮기 때문에 사람들은 더 강력한 화합물이나 새로운 약물 조합을 찾게 된다 2,3. 이 연구의 데이터는 Sal 치료가 MCF-7 세포의 악성 증식을 제한한다는 것을 먼저 입증했습니다. 후속 세포 스크래치 분석에서는 12시간 및 24시간 Sal 배양이 MCF-7 세포의 수렴 속도를 감소시킨다는 것을 추가로 확인했습니다. 종양 세포 이동 및 침습 능력에 대한 검사는 항종양 약물 스크리닝을 위한 민감한 지표로 간주된다24,25. 이 연구의 데이터는 Sal이 MCF-7 세포 이동 및 침입 과정을 이전 발견33,34과 일치하게 크게 감소시켰다는 것을 시사했습니다. 종양 세포의 통제되지 않은 세포 주기는 세포 불멸성의 운명을 결정한다24. 따라서, 세포사멸 촉진 및 세포주기 중단은 화합물25의 항암 잠재력을 평가하기 위한 지표로 인식되고 받아들여지고 있다. 이 연구에서 유세포 분석 결과 Sal 처리는 MCF-7 세포의 세포사멸을 현저하게 증가시켰으며, 이는 초기 및 후기 자가사멸 세포의 비율이 증가한 것으로 입증되었습니다. 또한, G0/G1 세포의 비율이 증가하고, MCF-7 세포주기의 S기가 교란되어, 유방암 세포에 대한 Sal의 세포주기 차단 효과를 나타낸다.
경미한 저산소성 유방암 세포 미세환경은 ROS 및 Ca2+ 생산의 제한과 관련이 있습니다. 따라서, 과도한 ROS 및 Ca2+ 축적은 유방암 세포에서 자가사멸 사건을 유도할 수 있다41. 이 연구의 면역형광 결과는 Sal 개입이 ROS 및 Ca2+ 생성을 크게 자극하여 MCF-7 세포의 세포 사멸을 더욱 유도할 수 있음을 입증했습니다. 새로운 증거에 의하면 항-세포사멸 단백질인 Bcl-2의 감소된 수준뿐만 아니라, pro-apoptotic 단백질인 Bax 및 Bim의 높은 수준이 미토콘드리아 막 안팎으로 물질의 통로를 일시적으로 그리고 강제로 열 수 있고, 따라서 종양 세포의 프로그램된 세포자멸사를 촉발할 수 있다는 것이 밝혀졌다42. 이 연구에서 Sal과 MCF-7 세포의 공동 배양은 Bcl-2의 단백질 및 유전자 발현을 감소시키면서 Bax와 Bim을 크게 증가시켜 유방암 세포의 세포 사멸을 촉진하는 잠재적인 약리학적 효과를 시사합니다. 이 데이터는 또한 Sal이 미토콘드리아 세포사멸 경로의 주요 다운스트림 지표인 CC-9, CC-7 및 CC-3 단백질과 해당 유전자의 발현을 뚜렷하게 유도했음을 시사했습니다. 위의 데이터는 유방암에 대한 Sal의 proapoptotic 효과가 미토콘드리아 apoptosis의 활성화와 관련될 수 있음을 부분적으로 시사합니다.
분자 메커니즘 연구는 PI3K의 인산화가 AKT 인산화를 더욱 유도하고 유방암 세포의 성장을 가속화할 수 있음을 확인했습니다 6,7. 한편, mTOR의 대량 축적은 AKT 인산화 과정(8,9)에 참여하여 유방암의 악화에 기여한다. 한편, 인산화된 AKT는 FoxO1 발현을 직접 자극하여 유방암 세포 주기를 촉진하고 세포사멸을 늦춥니다22,23. 동시에, 활성화된 AKT는 HIF-1α 발현을 간접적으로 활성화하여 FoxO1을 생성하고, 그 결과 유방암 진행 및 전이가 일어난다16,17. 결과적으로, PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 경로의 활성화 억제는 유방암 치료를 위한 새로운 전략이 될 수 있습니다. PI3K 억제제 LY294002의 개입으로 데이터는 Sal이 PI3K의 인산화를 관찰 가능하게 억제한다는 것을 보여주었습니다. mTOR 단백질 발현의 하향 조절과 함께 Sal은 인산화된 AKT의 발현 수준도 낮췄습니다. 그 결과, HIF-1α 및 FoxO1 단백질 발현도 Sal 처리 후 크게 감소했습니다. 마찬가지로, qRT-PCR 결과는 Sal 처리가 PI3K, AKT, HIF-1α 및 FoxO1의 유전자 수준을 광범위하게 감소시켜 MCF-7 세포의 주기 정지 및 세포 사멸을 촉진하는 데 기여한다는 것을 순응적으로 보여주었습니다(그림 8). 종합적으로, 얻어진 자료는 Sal가 유방암에 대하여 활동을 가진 자연적인 초본 근원의 잠재적인 활동적인 화합물일 수 있었다는 것을 건의합니다. Sal 치료에 의한 MCF-7 세포 사멸 및 세포주기 억제의 촉진은 유방암 세포의 이동 및 침입 능력을 크게 약화시켰다. 특히, 유방암에 대한 Sal의 분자 작용 메커니즘은 PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 경로의 억제와 관련될 수 있습니다. 전반적으로, 여러 실험 방법을 통합한 이 프로토콜은 항유방암 약물의 연구 및 개발을 위한 특정 참조 값을 제공합니다.
이 연구에서는 유방암에 대한 Sal의 분자 메커니즘에 대한 직접적인 증거는 없습니다. PI3K 녹아웃 마우스, PI3K 단백질의 발현이 높거나 낮은 유방암 세포주 및 국소 표면 플라즈몬 공명 기술은 유방암의 예방 및 치료를 위한 Sal의 직접적인 분자 표적을 확인하는 데 사용할 수 있는 다음 단계입니다29,31.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 쓰촨성 건강위원회(120025)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
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