Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Изучение фармакологического действия и молекулярного механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65634
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Настоящий протокол описывает комплексную стратегию оценки фармакологического действия и механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7.

Abstract

Салидрозид (Sal) обладает антиканцерогенной, антигипоксической и противовоспалительной фармакологической активностью. Тем не менее, лежащие в его основе механизмы борьбы с раком молочной железы были выяснены лишь до конца. Таким образом, этот протокол был направлен на расшифровку потенциала Sal в регуляции пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 в злокачественной пролиферации клеток MCF-7 рака молочной железы человека. Во-первых, фармакологическую активность Sal в отношении MCF-7 оценивали с помощью CCK-8 и клеточного скретч-анализа. Кроме того, резистентность клеток MCF-7 была измерена с помощью анализов миграции и инвазии Матригеля. Для клеточного апоптоза и циклических анализов клетки MCF-7 обрабатывали поэтапно с помощью аннексина V-FITC/PI и наборов для обнаружения окрашивания клеточного цикла для анализа проточной цитометрии, соответственно. Уровни активных форм кислорода (АФК) иCa2+ исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA и Fluo-4 AM. Активность Na+-K+-АТФазы и Ca2+-АТФазы определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов. Уровни экспрессии белков и генов в апоптозе и пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 дополнительно определяли с помощью вестерн-блоттинга и qRT-ПЦР-анализа соответственно. Мы обнаружили, что лечение Sal значительно ограничивало пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 с дозозависимыми эффектами. Между тем, введение Sal также резко заставляло клетки MCF-7 подвергаться апоптозу и остановке клеточного цикла. Иммунофлуоресцентные тесты показали, что Sal наблюдаемо стимулирует продукцию АФК иCa2+ в клетках MCF-7. Дальнейшие данные подтвердили, что Sal способствовал уровню экспрессии проапоптотических белков, Bax, Bim, расщепленной каспазы-9/7/3 и соответствующих им генов. Последовательно вмешательство Sal заметно снижало экспрессию белков Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α и FoxO1 и соответствующих им генов. В заключение, Sal может быть использован в качестве потенциального растительного соединения для лечения рака молочной железы, поскольку он может уменьшить злокачественную пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 путем ингибирования пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

Как один из наиболее часто диагностируемых видов рака и наиболее распространенных злокачественных новообразований, последние статистические данные показывают, что к 2020 году во всем мире возникло 2,3 миллиона случаев рака молочной железы, что составляет 11,7%всех случаев рака. Общие симптомы рака молочной железы включают болезненность и покалывание в груди, уплотнения и боль в груди, выделения из сосков, эрозию или впалую кожу, а также увеличение подмышечных лимфатических узлов 1,2. Еще большую тревогу вызывает тот факт, что число новых случаев заболевания и общая заболеваемость раком молочной железы продолжают расти с огромной скоростью каждый год, составляя 6,9% смертей, связанных с раком1. В настоящее время вмешательство при раке молочной железы по-прежнему в основном включает химиотерапию, хирургическое вмешательство, лучевую терапию и комплексное лечение. Несмотря на то, что лечение может эффективно снизить частоту рецидивов и смертность пациентов, длительное применение лечения часто приводит к множественной лекарственной устойчивости, выпадению волос на большой площади, тошноте и рвоте, а также серьезной психической и психологической нагрузке 2,3. Примечательно, что потенциальный риск метастазов в несколько органов при раке молочной железы также вынуждает людей искать новые растительные источники лекарственной терапии 4,5.

Фосфоинозитид-3-киназная (PI3K)-опосредованная передача сигналов участвует в росте, пролиферации и выживаемости рака молочной железы посредством сплайсинга, который влияет на экспрессию нескольких генов6. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что протеинкиназа B (AKT) может соединяться с мишенью рапамицина (mTOR) млекопитающих для дальнейшего увеличения заболеваемости раком молочной железы 7,8,9. Кроме того, деактивация передачи сигналов PI3K/AKT/mTOR также считается ключевым компонентом препаратов, ингибирующих злокачественную пролиферацию и стимулирующих апоптоз при раке молочной железы10,11,12. Хорошо известно, что крайняя гипоксия в микроокружении опухоли вызывает массивный всплеск гипоксически-индуцируемого фактора 1 альфа (HIF-1α), что еще больше ухудшает прогрессирование рака молочной железы13,14,15. Параллельно стимуляция AKT также приводит к избыточному накоплению HIF-1α, ограничивая апоптоз в образцах рака молочной железы16,17. Интересно, что было подтверждено, что активация передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α участвует в патологическом прогрессировании и метастазировании при различных видах рака, включая рак легких18, колоректальный рак19, рак яичников20 и рак простаты21. В дополнение к тому, что гиперэкспрессия фактора транскрипции 1 (FoxO1) раздвоенной головки также вызывается стимуляцией сигналов AKT, которая способствует остановке цикла и ингибированию апоптоза в клетках рака молочной железы22,23. В совокупности приведенные выше убедительные данные свидетельствуют о том, что ингибирование каскада передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 может быть потенциальной новой мишенью для лекарственной терапии при раке молочной железы.

Широко продемонстрировано, что салидрозид (Sal) обладает противораковой24,25, антигипоксией26,27,28,29 и иммуностимулирующей фармакологической активностью30. Это светло-коричневый или коричневый порошок, который легко растворяется в воде, является разновидностью фенилэтанового гликозида и имеет формулу химической структуры C14H 20 O7 и молекулярную массу300,331,32. Современные фармакологические исследования показали, что Sal может способствовать апоптозу клеток рака желудка, сдерживая передачу сигналов PI3K-AKT-mTOR24. Дальнейшие данные также свидетельствуют о том, что подавление передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α с помощью лечения Sal может способствовать апоптозу раковых клеток, повышая их чувствительность к химиотерапевтическим агентам25. Данные также свидетельствуют о том, что Sal ограничивает миграцию и инвазию клеток и вызывает остановку цикла, способствуя апоптозу в клетках MCF-7 рака молочной железы человека33,34. Тем не менее, еще предстоит выяснить, может ли Sal регулировать передачу сигналов PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 и ингибировать злокачественную пролиферацию клеток MCF-7. Таким образом, этот протокол был направлен на изучение влияния Sal на миграцию клеток MCF-7, инвазию, клеточный цикл и апоптоз через путь PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Интегрированные исследовательские стратегии, включающие традиционные, недорогие и независимые эксперименты, такие как оценка миграции и инвазии клеток, определение апоптоза и клеточного цикла с помощью проточной цитометрии, определение активных форм кислорода (АФК) и флуоресценцииCa2+ и т. д., могут служить ориентиром для общего планирования экспериментов по противораковым исследованиям с использованием традиционной фитотерапии. Экспериментальный процесс данного исследования показан на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Клетки MCF-7, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов).

1. Клеточная культура

  1. Культивирование клеток MCF-7 в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37 °C с DMEM, содержащим 10% FBS и 1% пенициллина (10 000 Ед/мл)/стрептомицина (10 000 мкг/мл) (см. таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, занимающие 90% дна чашки, были использованы для эксперимента и разделены на следующие группы: контрольная группа, группа доксорубицина гидрохлорида (DXR, 5 мкМ) и группы Sal (20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ) или контрольная группа, LY294002 (10 мкМ, ингибитор PI3K) группы, группа Sal (80 мкМ) и группа LY294002 (10 мкМ) + Sal (80 мкМ) (см. таблицу материалов).

2. Анализ жизнеспособности клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации об этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к предыдущему отчету27.

  1. Высевают клетки MCF-7 с плотностью 8 x 104 клетки/лунку в 96-луночные планшеты и инкубируют с Sal (10 мкМ, 20 мкМ, 40 мкМ, 80 мкМ, 160 мкМ и 320 мкМ) в течение 24 ч или Sal (20, 40, 80 мкМ) в течение 12 ч/24 ч/36 ч/48 ч в течение ночи до тех пор, пока клетки не слипнутся.
  2. После обработки проводят совместную инкубацию клеток MCF-7 с 10 мкл/лунку раствора CCK-8 (см. таблицу материалов) в течение 2 ч. Затем измерьте оптическую плотность на длине волны 450 нм (OD450) с помощью автоматического считывателя микропланшетов.

3. Миграция и инвазия клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к предыдущему отчету35.

  1. Инкубируйте 2 мл 5 x 10 клетокпо 6 клеток/мл, высеянных в 6-луночные планшеты, чтобы покрыть 90% дна чашки.
  2. Выполните линейную скретч-намотку по центру монослоя клетки стерильным наконечником пипетки. Получение изображений с помощью оптического микроскопа через 0 ч, 24 ч и 48 ч.
  3. Используйте программное обеспечение Image J для измерения ширины царапин.
  4. Для анализа на трансвелл суспендируйте клетки MCF-7 без сывороточной среды и затравите в верхней трансвелловой камере, предварительно покрытой Matrigel или без него (см. таблицу материалов).
  5. В нижней части трансвеллерной камеры используйте полную среду DMEM в качестве химического индуктора. Через 24 ч удаляют клетки в верхней камере, а оставшиеся инвазивные и мигрирующие клетки закрепляют в метаноле35.
  6. Окрасьте ячейки MCF-7 кристаллическим раствором фиалки (см. таблицу материалов). Сделайте снимки с помощью оптического микроскопа.

4. Оценка активности Na+-K+-АТФазы и Ca2+-Mg2+-АТФазы

  1. Используйте набор бицинхониновой кислоты (BCA) для измерения концентрации белка в лизированных клетках MCF-7, следуя инструкциям производителя (см. таблицу материалов).
    1. Добавьте образцы лизированных клеток в соответствующих группах в 96-луночные планшеты. После этого добавить рабочий раствор для дальнейшей инкубации при 37 °С в течение 5 мин. Наконец, измерьте значения OD636 с помощью многофункционального считывателя микропланшетов.

5. Анализ апоптоза и клеточного цикла методом проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к предыдущему отчету31.

  1. Переваривают клетки и собирают для ресуспендирования в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 минут окрашивания аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI) (см. таблицу материалов), а затем определяют количество апоптотических клеток с помощью проточного цитометра.
  2. Смешивают ресуспендированный раствор образца с раствором PI в течение 30 мин инкубации с последующим детектированием с помощью проточного цитометра.

6. Флуоресцентное окрашивание DCFH-DA и Fluo-4 AM

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к предыдущему отчету29.

  1. Инкубируйте клетки MCF-7 в течение 20 мин с помощью флуоресцентного зонда dcfh-da 10 мкМ (см. таблицу материалов) при 37 °C. После тщательного удаления излишков DCFH-DA путем трехкратной промывки PBS с помощью флуоресцентного микроскопа проверяют интенсивность флуоресценции на длинах волн возбуждения и излучения 488 нм и 525 нм соответственно.
  2. Инкубируют клетки MCF-7 с раствором флуоресцентного зонда Fluo-4 AM 5 мкМ (см. таблицу материалов) в течение 45 мин при 37 °C. После трехкратной промывки ФБС с помощью флуоресцентного микроскопа определяют значения интенсивности флуоресценции на длинах волн возбуждения и излучения 488 нм и 516 нм соответственно.

7. Вестерн-блоттинг

  1. Добавьте 2 мл клеточных суспензий 5 x 10 6 клеток/мл, содержащих различные лекарственные препараты, в6-луночные планшеты и культивируйте в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Группы для вестерн-блоттинг-анализа были установлены следующим образом: контрольная группа, LY294002 (10 мкМ) группа, группа Sal (80 мкМ) и группа LY294002 (10 мкМ) + Sal (80 мкМ) (см. таблицу материалов).
  2. Соберите клетки и надосадочную жидкость и центрифугируйте при 560 × г при 4 °C в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте предварительно охлажденным ПБС. После каждой промывки центрифугируйте клетки при 560 × г при 4 °C в течение 3 мин.
  3. Добавьте 50 мкл лизисного буфера к образцу клетки, начиная с шага 7.2, на 15-минутную ледяную баню. Центрифугу при 8550 × г при 4 °C в течение 10 мин для сбора образца надосадочной жидкости.
  4. После определения концентрации белка методом BCA образец белка на стадии 7.3 смешивают с загрузочным буфером в соотношении 4:1, денатурируют при 100 °C в течение 10 мин в металлической ванне и охлаждают до комнатной температуры.
  5. Добавьте 20 мкг образца белка из шага 7.4, отделите белки с разной молекулярной массой35с помощью 10% SDS-PAGE (см. таблицу материалов), а затем перенесите на мембраны PVDF размером 0,22 мкм. После закупорки 5% БСА инкубируют мембраны с соответствующими первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленная концентрация следующих первичных антител составляет 1:1000: расщепленная каспаза-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 и β-актин (см. таблицу материалов).
  6. На следующий день инкубируют мембраны с козьими антикроличьими вторичными антителами IgG в течение 2 ч при 37 °C. Проявите мембраны с использованием хемилюминесцентного раствора ECL и получите изображения с помощью бесконтактной количественной системы визуализации вестерн-блоттинга (см. таблицу материалов).

8. ОТ-ПЦР

  1. Проводят центрифугирование для сбора клеток MCF-7 при 560 x g при 4 °C в течение 3 мин и добавляют 500 мкл буфера RL1 в ячейки 5 × 106 . Продувайте и перемешивайте пипеткой до тех пор, пока не исчезнут клеточные массы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер RL1 является одним из компонентов общего набора для выделения РНК (см. таблицу материалов).
  2. Перенесите гомогенаты клеток на этапе 8.1 в колонку для очистки ДНК, встроенную в пробирку для сбора, и центрифугу при 8 550 × g при 4 °C в течение 2 мин. Снимите колонку для очистки ДНК и держите надосадочную жидкость в пробирке для сбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонка для очистки ДНК и пробирка для сбора являются двумя компонентами в наборе для выделения общей РНК (см. таблицу материалов).
  3. Добавьте 800 мкл буфера RL2 к 500 мкл надосадочной жидкости, начиная с шага 8.2, и осторожно перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер RL2 является одним из компонентов набора для выделения общей РНК (см. таблицу материалов). Добавьте 120 мл безводного этанола в 60 мл буфера RL2 перед использованием.
  4. Перенесите 700 мкл смеси со стадии 8.3 в колонку, содержащую только РНК, встроенную в сборную пробирку, и центрифугу при 8 550 × g при 4 °C в течение 1 мин. Выбросьте отработанную жидкость в сборную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонка только для РНК является одним из компонентов общего набора для выделения РНК (см. таблицу материалов).
  5. Повторите шаг 8.4, чтобы обработать оставшуюся смесь из шага 8.3.
  6. Добавьте 500 мкл буфера RW1 в колонку, содержащую только РНК, и центрифугируйте при 8 550 × г при 4 °C в течение 1 мин. Выбросьте отработанную жидкость в сборную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер RW1 является одним из компонентов набора для выделения общей РНК (см. таблицу материалов).
  7. Добавьте 700 мкл буфера RW2 в колонку, содержащую только РНК, и центрифугируйте при 8 550 × г при 4 ◦C в течение 1 мин. Выбросьте отработанную жидкость в сборную трубку. Повторите шаг 8.7 один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер RW2 является одним из компонентов набора для выделения общей РНК (см. таблицу материалов).
  8. Поместите колонку, содержащую только РНК, обратно в пробирку для сбора и центрифугируйте при 8550 × г при 4 °C в течение 2 мин, чтобы удалить оставшийся буфер RW2.
  9. Перенесите колонку, содержащую только РНК, в новую сборную пробирку и капните 100 мкл безРНКазного ddH2O, предварительно нагретого при 65 °C, в центр мембраны для колонки только с РНК. Помещают при 25 °C на 2 мин и собирают раствор РНК центрифугированием при 8 550 × г при 4 °C в течение 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свободный от РНКазы ddH2O является одним из компонентов в наборе для выделения общей РНК (см. таблицу материалов).
  10. Добавьте 4 мкл 5-кратного реакционного буфера, 1 мкл праймера олиго (dT)18 , 1 мкл случайного праймера гексамера, 1 мкл ген-специфического праймера (см. таблицу 1), 1 мкл смеси ферментов и 5 мкг раствора РНК со стадии 8.9 в полоску из 8 пробирок объемом 100 мкл. Дополнить реакционную систему водой, не содержащей РНКазы, до 20 мкл.
  11. Установите условия реакции системы следующим образом: (1): 95 °C, 30 с, 1 цикл; (2): 95 °C, 5 с, 50 циклов, 60 °C, 34 с; (3): 95 °C, 5 с, 1 цикл, 65 °C, 60 с, 97 °C, 1 с; и (4): 42 °C, 30 с, 1 цикл. Выполните процедуру qRT-PCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Относительные уровни экспрессии генов-мишеней были количественно проанализированы методом 2−ΔΔCT 36,37. Информация о праймерах каждого гена, используемого для анализа qRT-PCR, приведена в таблице 1.

9. Статистический анализ

  1. Выразите данные в виде среднего ± стандартного отклонения трех независимых экспериментов.
  2. Проанализируйте сравнения между несколькими группами с помощью программного обеспечения для построения графиков и анализа (см. таблицу материалов) с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. В данной работе P < 0,05 был определен как статистически значимый.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Влияние Sal на ингибирование избыточной пролиферации и замедление заживления ран в клетках MCF-7
Чтобы исследовать потенциал Sal против рака молочной железы, мы сначала проверили его противоопухолевые свойства, используя токсичность пролиферации клеток и скретч-анализы клеточной линии MCF-7 рака молочной железы человека. Эти клетки инкубировали с серией концентраций Sal (5-320 мкМ) в течение 24 ч, а пролиферацию клеток оценивали с помощью анализа CCK-8. Наблюдалось дозозависимое ингибирующее действие Sal на пролиферацию клеток со снижением жизнеспособности клеток на 50% при 40 мкМ (рис. 2А). Затем были выбраны концентрации Sal 20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ для последующей оценки заживления раны. Результаты, показанные на рисунке 2B, показывают, что Sal может ингибировать жизнеспособность клеток MCF-7 с течением времени, со снижением жизнеспособности клеток MCF-7 на 50% после 24 часов совместной инкубации. На рисунке 2C-R показано ингибирующее действие обработки Sal на заживление ран клеток MCF-7, определяемое с помощью анализа на царапины раны. Дальнейшие тесты на царапины клеток также подтвердили, что 24-часовое культивирование с Sal (20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ) резко затрудняет процесс заживления раны (рис. 2C, D).

Подавление злокачественной миграции и инвазии клеток MCF-7 с помощью Sal
Миграция большого количества опухолевых клеток и склонность к инвазии в парараковые ткани признаны типичными признаками злокачественных опухолей. Влияние Sal на миграцию и инвазию клеток MCF-7 было дополнительно проверено с использованием трансвелл-системы, покрытой гелем внеклеточного матрикса или без него. Лечение Sal значительно снижало нежелательную миграцию (рис. 3A-F) и инвазию (рис. 3G-L) клеток MCF-7. Как показано на рисунке 3А, лечение Sal удивительным образом нейтрализовало миграцию клеток MCF-7. Почти единогласно процесс вредоносной инвазии клеток MCF-7 был эффективно остановлен после инкубации с Sal (рис. 3B). Приведенные выше данные полностью подтвердили преимущества Sal в ингибировании рака молочной железы.

Эффекты Sal в продвижении апоптоза и усилении остановки цикла в клетках MCF-7
Иммортализация и периодическое размножение раковых клеток дают возможность раку ухудшаться и распространяться. Само собой разумеется, что стимулирование апоптоза и подавление цикла также стали общепринятыми стратегиями профилактики рака. Результаты проточной цитометрии свидетельствуют о том, что лечение Sal увеличивает количество клеток MCF-7 на ранней и поздней стадиях апоптоза (рис. 4А). Между тем, по сравнению с контрольной группой, лечение Sal также резко увеличило количество клеток в фазе G0/G1 при одновременном снижении доли клеток S-фазы (рис. 4B). Стимулирование апоптоза и остановки цикла может служить возможным фармакологическим действием Sal против рака молочной железы.

Влияние Sal на стимуляцию внутриклеточной гиперпродукции АФК иCa2+ в клетках MCF-7
Непрерывная стимуляция внутриклеточной АФК и выработкиCa2+ может эффективно подавлять рост опухолевых клеток. На рисунке 5A-E показано содержание АФК, оцененное с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA. Количественные результаты для АФК показаны на рисунке 5F. Для определения концентрации Ca2+ использовали иммунофлуоресцентное окрашивание Fluo-4 AM (рис. 5G-K). На рисунке 5L показаны количественные результаты дляCa2+. Результаты DCFH-DA показали, что Sal значительно усиливает сигналы флуоресценции АФК по сравнению с контрольной группой (рис. 5A). Последовательно, вмешательство Sal также отчетливо повышало продукцию Ca2+, о чем свидетельствует выделенный флуоресцентный сигнал Fluo-4 AM (рис. 5B). Эти результаты в совокупности указывают на то, что сигналы АФК иCa2+ могут быть частично вовлечены в антираковую активность Sal.

Влияние Sal на индуцирование апоптоза в митохондриальном пути клеток MCF-7
Существует множество доказательств того, что апоптоз, индуцированный митохондриальной дисфункцией, определяет конечную судьбу многих опухолевых клеток. При определении того, опосредует ли Sal регуляцию митохондриальной функции и эффекты, способствующие апоптозу в клетках MCF-7, было впервые продемонстрировано, что Sal ограничивает жизнеспособность ферментов Na+-K+-АТФазы (рис. 6A) и Ca2+-АТФазы (рис. 6B), что указывает на его потенциальную роль в стимулировании митохондриальной дисфункции. Впоследствии данные вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР показали, что лечение Sal способствовало экспрессии белков и генов проапоптотических факторов CC-9 (рис. 6C, D, G), CC-7 (рис. 6C, E, H), CC-3 (рис. 6C, F, I), Bim (рис. 6C, J, M) и Bax (рис. 6C, L, O), в то время как ингибировало экспрессию белка и генов антиапоптотического Bcl-2 (рис. 6C,К,Н). Эти данные частично демонстрируют, что митохондриальная дисфункция в клетках MCF-7 в сочетании с апоптозом может быть вовлечена в механизм действия Sal против рака молочной железы.

Влияние Sal на подавление пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 в клетках MCF-7
Путь PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1, как важнейший путь передачи сигнала, регулирующий рост опухоли, участвует в патологическом прогрессировании и ухудшении состояния рака молочной железы. Результаты вестерн-блоттинга показали, что обработка Sal заметно ограничивала соотношение p-PI3K/PI3K (рис. 7A, B) и p-AKT/AKT (рис. 7A, C). Между тем, экспрессия белков mTOR (рис. 7A,D), HIF-1α (рис. 7A,E) и FoxO1 (рис. 7A,F) также была заметно подавлена обработкой Sal. Дальнейший анализ ОТ-ПЦР также показал, что введение Sal снижает уровни экспрессии генов PI3K (рис. 7G), AKT (рис. 7H), mTOR (рис. 7I), HIF-1α (рис. 7J) и FoxO1 (рис. 7K). В заключение, ингибирование активации пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 может быть потенциальным молекулярным механизмом Sal против рака молочной железы.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация действия Sal против клеточной линии MCF-7 рака молочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Токсичность пролиферации клеток MCF-7 и ранозаживляющие свойства Sal. (A) и (B) показывают влияние дозы и времени обработки Sal на активность клеток MCF-7. (К-Р) Ингибирующее влияние обработки Sal на заживление ран в клетках MCF-7, определяемое с помощью анализа на царапины раны. Приведенные выше данные проиллюстрированы как среднее ± SD, n = 3. ##p < 0.01 по сравнению с контрольной группой. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Подавление злокачественной миграции и инвазии клеток MCF-7 с помощью лечения Sal. Лечение Sal значительно снижает нежелательную (A-F) миграцию и (G-L) инвазию клеток MCF-7. Приведенные выше данные проиллюстрированы как среднее ± SD, n = 3. <#p < 0,05 и ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Стимулирование апоптоза и подавление клеточного цикла Sal. (А) апоптотическая стимуляция и (Б) остановка клеточного цикла Sal на клетках MCF-7, выявленные с помощью проточной цитометрии. Приведенные выше данные проиллюстрированы как среднее ± SD, n = 3. #p < 0,05 и ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Всплеск АФК иCa2+ в клетках MCF-7, вызванный обработкой Sal. (А-Е) Содержание АФК оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA. (F) Количественные результаты для ROS. (Г-К) Для определения концентрации Ca2+ использовали иммунофлуоресцентное окрашивание Fluo-4 AM. (L) Количественные результаты дляCa2+. Приведенные выше данные проиллюстрированы как среднее ± SD, n = 3. #p < 0,05 и ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Влияние лечения Sal на индуцирование митохондриальной дисфункции в сочетании с апоптозом в клетках MCF-7. Снижена активность ферментов (А) Na+-К+-АТФазы и (В)Са2+-АТФазы. (C) Репрезентативные полосы экспрессии белков и соответствующие статистические результаты для (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 и (L) Bax белков и для (G) каспазы-9, (H) каспазы-7, (I) каспазы-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 и (O) Bax. Приведенные выше данные проиллюстрированы как среднее ± SD, n = 3. #p < 0,05 и ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Подавление пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 при лечении Sal . (A) Репрезентативные белковые полосы, обнаруженные с помощью вестерн-блоттинг-анализа. Sal снижал экспрессию белков (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α и (F) FoxO1. Sal подавлял уровни экспрессии генов (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α и (K) FoxO1. Приведенные выше данные проиллюстрированы как среднее ± SD, n = 3. # #p < 0.01 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Стимуляция продукции АФК иCa2+ в клетках MCF-7 с помощью Sal, сопровождающаяся ингибированием трансдукции сигнала PI3K. При участии mTOR фосфорилирование AKT было дополнительно снижено после введения Sal. Следовательно, пониженная экспрессия HIF-1α и FoxO1 блокировала периодическую злокачественную пролиферацию клеток MCF-7. Между тем, усиленный апоптоз клеток MCF-7 позволяет предположить потенциал Sal против рака молочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ген Присоединение к GenBank No Последовательность праймеров (5'-3') Длина (bp)
Каспаза-9 NM_001229 Ф, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG 92
Р, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC
Каспаза-7 Ф, AGTGACAGGTATGGGCGTTC 164
Р, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT
Каспаза-3 NM_001354777 Ф, CCAAAGATCATACATGGAAGCG 185
Р, CTGAATGTTTTTCCCTGAGGTTTG
Маркер начала информации NM_001204106 Ф, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA 130
Р, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG
БКЛ-2 NM_000633 Ф, GACTTCGCCGAGATGTCCAG 129
Р, ГААКТКАААГААГАГГККААТК
Бакс NM_001291428 Ф, CGAACTGGACAGTAACATGGAG 157
Р, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA
β-актин NM_031144 Ф, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA 172
Р, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA
F, вперед; R, реверс.

Таблица 1: Праймеры, используемые для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рак молочной железы поражает людей всех возрастов и вызывает неисчислимое физическое и психическое бремя, а также большое экономическое давление1. Рак молочной железы с его растущей заболеваемостью и смертностью с каждым годом также привлек внимание всего мира с точки зрения поиска эффективных комплексных методов лечения на растительной основе, выходящих за рамки традиционных методов лечения. Обнадеживает то, что большое количество доказательств показало противораковые эффекты Sal24,25,38. К сожалению, роль Sal в развитии рака молочной железы и лежащие в ее основе молекулярные механизмы до сих пор остаются в значительной степени неизвестными. В этом исследовании подчеркивается значительное ингибирующее действие Sal на пролиферацию, миграцию и инвазию клеточной линии MCF-7 рака молочной железы человека. Впоследствии мы выявили потенциал Sal в раздражающем апоптозе и остановке цикла клеток MCF-7. Между тем, эти данные также показали, что введение Sal повысило уровни АФК иCa2+. Дальнейшее изучение молекулярных механизмов продемонстрировало апоптоз-стимулирующее действие Sal в лечении рака молочной железы и влияние Sal на путь PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1.

Злокачественная и неконтролируемая пролиферация может ускорить развитие рака молочной железы и увеличить риск развития лимфатических39 и метастазов в головной мозг40. В настоящее время на рынке постепенно появляются доступные химиотерапевтические препараты, но они имеют низкую чувствительность для лечения рака молочной железы, что вынуждает людей искать более сильнодействующие соединения или новые комбинации лекарств 2,3. Данные в этой работе впервые продемонстрировали, что лечение Sal ограничивает злокачественную пролиферацию клеток MCF-7. Последующие клеточные скретч-анализы также подтвердили, что 12-часовая и 24-часовая инкубация Sal снижает скорость конвергенции клеток MCF-7. Тесты на миграцию опухолевых клеток и способность к инвазии рассматриваются как чувствительные индикаторы для скрининга противоопухолевых препаратов24,25. Данные в этой работе свидетельствуют о том, что Sal сильно снижает процесс миграции и инвазии клеток MCF-7, в соответствии с предыдущими выводами33,34. Неконтролируемый клеточный цикл опухолевых клеток определяет судьбу клеточного бессмертия24. Таким образом, стимуляция апоптоза и прерывание клеточного цикла стали признанными и принятыми показателями для оценки противоопухолевого потенциала соединений25. В этой работе анализ методом проточной цитометрии показал, что лечение Sal сигнально увеличивает апоптоз в клетках MCF-7, о чем свидетельствует увеличение доли ранних и поздних апоптотических клеток. Кроме того, соотношение клеток G0/G1 было увеличено, а S-фаза клеточного цикла MCF-7 была нарушена, что указывает на блокирующее клеточный цикл действие Sal на клетки рака молочной железы.

Слабое гипоксическое клеточное микроокружение рака молочной железы связано с ограничениями в продукции АФК иCa2+ ; таким образом, избыточное накопление АФК иCa2+ может индуцировать апоптотические события в клетках рака молочной железы41. Результаты иммунофлуоресценции в этой работе доказали, что вмешательство Sal значительно стимулировало продукцию АФК иCa2+ , что может в дальнейшем индуцировать апоптоз клеток MCF-7. Новые данные показали, что повышенные уровни проапоптотических белков Bax и Bim, а также пониженные уровни антиапоптотического белка Bcl-2 могут временно и принудительно открывать проход материала внутрь и из митохондриальной мембраны, тем самым запуская запрограммированный апоптоз опухолевыхклеток. В этом исследовании совместная инкубация Sal с клетками MCF-7 значительно увеличивала Bax и Bim при одновременном снижении экспрессии белка и гена Bcl-2, что позволяет предположить его потенциальное фармакологическое влияние на продвижение апоптоза в клетках рака молочной железы. Эти данные также свидетельствуют о том, что Sal отчетливо индуцировал экспрессию белков CC-9, CC-7 и CC-3, которые являются ключевыми индикаторами пути митохондриального апоптоза, и соответствующих им генов. Приведенные выше данные частично свидетельствуют о том, что проапоптотический эффект Sal при раке молочной железы может быть связан с активацией митохондриального апоптоза.

Исследования молекулярного механизма подтвердили, что фосфорилирование PI3K может дополнительно индуцировать фосфорилирование AKT и ускорять рост клеток рака молочной железы 6,7. В то же время большое накопление mTOR также способствует ухудшению состояния рака молочной железы, участвуя в процессе фосфорилирования AKT 8,9. С одной стороны, фосфорилированный АКТ напрямую стимулирует экспрессию FoxO1, способствуя клеточному циклу рака молочной железы и замедляя апоптоз22,23. Параллельно активированный AKT опосредованно активирует экспрессию HIF-1α с образованием FoxO1, что приводит к прогрессированию рака молочной железы и метастазированию16,17. Следовательно, ингибирование активации пути PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 может быть новой стратегией лечения рака молочной железы. При вмешательстве ингибитора PI3K LY294002 данные показали, что Sal наблюдаемо подавляет фосфорилирование PI3K. В сочетании с подавлением экспрессии белка mTOR, Sal также снижал уровни экспрессии фосфорилированного AKT. В результате, экспрессия белков HIF-1α и FoxO1 также была значительно снижена после лечения Sal. Аналогичным образом, результаты кОТ-ПЦР показали, что лечение Sal значительно снижало уровни генов PI3K, AKT, HIF-1α и FoxO1, способствуя остановке цикла и апоптозу клеток MCF-7 (рис. 8). В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что Sal может быть потенциальным активным соединением натурального растительного происхождения, обладающим действием против рака молочной железы. Стимуляция апоптоза клеток MCF-7 и ингибирование клеточного цикла при лечении Sal значительно ослабляли миграционную и инвазионную способность клеток рака молочной железы. Примечательно, что молекулярный механизм действия Sal против рака молочной железы может быть связан с ингибированием пути PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1. В целом, этот протокол, объединяющий несколько экспериментальных методов, обеспечивает определенную эталонную ценность для исследований и разработок препаратов против рака молочной железы.

В этом исследовании нет прямых доказательств молекулярного механизма Sal против рака молочной железы. Мыши с нокаутом PI3K, клеточные линии рака молочной железы с высокой или низкой экспрессией белка PI3K и методы локального поверхностного плазмонного резонанса являются следующими шагами, которые могут быть использованы для подтверждения прямых молекулярных мишеней Sal для профилактики и лечения рака молочной железы29,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Комиссией по здравоохранению провинции Сычуань (120025).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Tags

Салидрозид фармакологическое действие молекулярный механизм ингибирование пролиферации клеток MCF-7 ингибирование миграции клеток MCF-7 антиканцерогенное антигипоксическое противовоспалительное PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 путь CCK-8 анализ клеточный скретч-анализ миграционный анализ анализ инвазии матригеля анализ клеточного апоптоза анализ клеточного цикла активные формы кислорода (АФК) Ca2+ Na+-K+-АТФазная активность активность Ca2+-АТФазы уровни экспрессии белков уровни экспрессии генов вестерн-блоттинг-анализ Анализ QRT-ПЦР
Изучение фармакологического действия и молекулярного механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., … More

Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter