Summary
يوضح هذا البروتوكول عزل الألياف المفردة من العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد وتصنيف نوع الألياف وفقا لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) باستخدام تقنية النشاف النقطية. يمكن بعد ذلك تحليل عينات الألياف MHC I و II المحددة بشكل أكبر بحثا عن الاختلافات الخاصة بنوع الألياف في تعبير البروتين باستخدام النشاف الغربي.
Abstract
يمكن استخدام التقنية الموصوفة هنا لتحديد أشكال متماثلة محددة من سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) في أجزاء من ألياف العضلات الفردية باستخدام النشاف النقطي ، ويشار إليها فيما يلي باسم اكتشاف سلسلة الأوسينالثقيلة الخاصة بي بواسطة Dot Blotting لتحديد معرفنوع الألياف العضلية (MyDoBID). يصف هذا البروتوكول عملية تجفيف العضلات الهيكلية البشرية بالتجميد وعزل أجزاء من ألياف العضلات المفردة. باستخدام MyDoBID ، يتم تصنيف الألياف من النوع الأول والثاني مع الأجسام المضادة الخاصة ب MHCI و IIa ، على التوالي. ثم يتم دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف لكل خزعة.
يتم تحديد البروتين الكلي في كل عينة بواسطة الرحلان الكهربائي لثنائي الصوديوم - كبريتات بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وتقنية الجل المنشط بالأشعة فوق البنفسجية. يتم التحقق من صحة نوع الألياف من العينات باستخدام النشاف الغربي. كما تم وصف أهمية إجراء تطبيع تحميل البروتين لتعزيز اكتشاف البروتين المستهدف عبر البقع الغربية المتعددة. تشمل فوائد دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف مقارنة بالبقع الغربية أحادية الألياف ، تعدد استخدامات العينات ، وزيادة إنتاجية العينة ، واستثمار وقت أقصر ، وتدابير توفير التكاليف ، كل ذلك مع الاحتفاظ بمعلومات قيمة خاصة بنوع الألياف والتي غالبا ما يتم تجاهلها باستخدام عينات العضلات المتجانسة. الغرض من البروتوكول هو تحقيق تحديد دقيق وفعال للألياف من النوع الأول والنوع الثاني المعزولة من عينات العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد.
يتم دمج هذه الألياف الفردية لاحقا لإنشاء عينات خاصة بنوع الألياف من النوع الأول والنوع الثاني. علاوة على ذلك ، تم توسيع البروتوكول ليشمل تحديد ألياف النوع IIx ، باستخدام الأكتين كعلامة للألياف التي كانت سلبية ل MHCI و MHCIIa ، والتي تم تأكيدها على أنها ألياف IIx بواسطة النشاف الغربي. ثم يتم استخدام كل عينة خاصة بنوع الألياف لتحديد التعبير عن البروتينات المستهدفة المختلفة باستخدام تقنيات النشاف الغربية.
Introduction
العضلات الهيكلية هي نسيج غير متجانس ، مع خصائص التمثيل الغذائي وانقباض الخلوية المتميزة التي تعتمد على ما إذا كانت الخلية (الألياف) هي نشل بطيء (النوع الأول) أو نشل سريع (النوع الثاني). يمكن التعرف على نوع الألياف من خلال فحص الأشكال المتساوية لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) ، والتي تختلف عن بعضها البعض بعدة طرق ، بما في ذلك وقت الانكماش وسرعة التقصير ومقاومة التعب1. تشمل الأشكال المتساوية الرئيسية MHC النوع الأول والنوع IIa والنوع IIb والنوع IIx وتكون ملامحها الأيضية إما مؤكسدة (النوع الأول و IIa) أو تحلل السكر (IIx ، IIb) 1. تختلف نسبة أنواع الألياف هذه في نوع العضلات وبين الأنواع. تم العثور على النوع IIb على نطاق واسع في عضلات القوارض. لا تحتوي عضلات الإنسان على أي ألياف من النوع IIb وتتكون في الغالب من ألياف MHC من النوع الأول و IIa ، مع نسبة صغيرة من ألياف IIx2. تختلف ملامح تعبير البروتين بين أنواع الألياف المختلفة ويمكن تغييرها مع الشيخوخة3 ، وممارسة4،5 ، والمرض6.
غالبا ما يتم تجاهل قياس الاستجابات الخلوية في أنواع مختلفة من الألياف العضلية الهيكلية أو غير ممكن بسبب فحص تجانس العضلات (مزيج من جميع أنواع الألياف). تسمح اللطخة الغربية أحادية الألياف بفحص البروتينات المتعددة في ألياف العضلات الفردية7. تم استخدام هذه المنهجية سابقا لإنتاج خصائص ألياف مفردة جديدة وغنية بالمعلومات لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام مستحضرات متجانسة. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على منهجية اللطخة الغربية الأصلية أحادية الألياف ، بما في ذلك الطبيعة التي تستغرق وقتا طويلا ، وعدم القدرة على توليد نسخ متماثلة للعينات ، واستخدام كواشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) باهظة الثمن والحساسة. إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة ، فإن هذه الطريقة محدودة بشكل أكبر بسبب القيود الزمنية للحاجة إلى عزل الألياف الفردية في إطار زمني محدود (أي 1-2 ساعة). لحسن الحظ ، يتم تخفيف هذا التقييد عن طريق عزل شرائح الألياف المفردة من الأنسجة المجففةبالتجميد 8. ومع ذلك ، فإن جمع الألياف من العينات المجففة بالتجميد محدود بحجم وجودة الأنسجة المأخوذة.
تم توضيح تحديد نوع الألياف باستخدام طريقة النشافالنقطي 9 بشكل كبير وتوسيعه في هذا البروتوكول الشامل. في السابق ، ثبت أن أقل من ~ 2-10 ملغ من الأنسجة العضلية ذات الوزن الرطب كافية للتجفيف بالتجميد وتحليل البروتين أحادي الألياف MHC9. استخدم Christensen et al.9 30٪ من قطعة ألياف ~ 1 مم للكشف عن شكل MHC الموجود عن طريق النشاف النقطي ، وهو ما أكده النشاف الغربي. أظهر هذا العمل أنه من خلال استبدال النشاف الغربي بالنشاف النقطي ، تم تخفيض التكاليف الإجمالية بمقدار ~ 40 ضعفا (ل 50 قطعة ألياف). ثم تم "تجميع" الألياف في عينات من النوع الأول والنوع الثاني ، مما سمح بالتكرار التجريبي9. ومع ذلك ، كان هناك قيد هو أنه تم الحصول على عينتين فقط من نوع الألياف: النوع الأول (MHCI إيجابي) والنوع الثاني (الألياف الإيجابية MHCII) ، مع عينات من النوع الثاني تحتوي على خليط من MHCIIa و MHCIIx 6,10. والجدير بالذكر أن البروتوكول الحالي يوضح كيف يمكن تحديد الألياف النقية من النوع IIx ويوفر سير عمل مفصل للغاية (ملخص في الشكل 1) ، بما في ذلك استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمشكلات البروتوكول الشائعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات من العضلات البشرية من الأوعية الجانبية من n = 3 (2 ذكور ، 1 أنثى) ، تتراوح أعمارهم بين 70-74 سنة تحت ظروف معقمة باستخدام التخدير الموضعي (Xylocaine) وإبرة Bergstrom المعدلة للشفط اليدوي11،12. كانت العينات مجموعة فرعية من دراسة سابقة وافقت عليها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة فيكتوريا (HRETH11/221) وأجريت وفقا لإعلان هلسنكي13. قدم المشاركون موافقة خطية مستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة. التفاصيل الكاملة لجميع المواد المطلوبة لهذا البروتوكول موضحة في جدول المواد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير قائمة باستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها التي تعالج مشكلات البروتوكول الشائعة في الجدول 1.
1. تجميد التجفيف
- مع الاحتفاظ بعينات العضلات المأخوذة مجمدة على الثلج الجاف ، قم بوزن أنبوب مجمد فارغ على الميزان.
- تزن بسرعة ما لا يقل عن 10 ملغ من الأنسجة المجمدة الوزن الرطب. سجل الوزن لأقرب منزلة عشرية.
- قم بإيداع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد مسبقا والذي يحتوي على 3-4 ثقوب مثقوبة في الغطاء وضعه في دورق صغير به 2-3 كريات من الثلج الجاف.
- اتبع تعليمات تشغيل الشركة المصنعة للمجفف بالتجميد.
- تأكد من إغلاق جميع الصمامات الموجودة في مجفف التجميد وقم بتشغيل مجفف التجميد.
- استخدم لوحة التحكم للتحقق من أن نقطة ضبط الفراغ مبرمجة لظروف التجفيف بالتجميد المثلى للأنسجة البشرية ، 0.12 مليبار (ملي بار) (الشكل 2).
- اضغط يدويا على مجفف التجميد وانتظر حتى تبرد الحجرة إلى -40 درجة مئوية.
- بمجرد أن تصل الحجرة إلى درجة الحرارة هذه ، قم بإزالة الغطاء ، ثم الحجرة الزجاجية ، وضع الدورق (مع عينة العضلات) على المسرح المعدني.
- استبدل الحجرة الزجاجية والغطاء. أغلق صمام تحرير الفراغ الموجود على الغطاء وانتظر حتى يتحول ضوء مقياس الفراغ إلى اللون الأخضر للتأكد من أن المجفف مغلق بالفراغ.
- قم بتجميد وتجفيف عينات العضلات لمدة 48 ساعة. بمجرد اكتمال التجفيف بالتجميد ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ عن طريق الضغط على زر التفريغ وافتح صمام تحرير الفراغ على الغطاء.
- قم بإزالة غطاء الغرفة وجمع العينة المجففة بالتجميد. وزن الأنسجة وتسجيل الوزن لأقرب منزلة عشرية.
- حساب النسبة المئوية لفقدان الوزن ؛ ~ انخفاض الوزن بنسبة 75٪ يشير إلى أن الأنسجة قد تم تجفيفها بالتجميد بنجاح (في هذا العمل ، يعني ± SD ، 76 ± 9٪ ، n = 11 عينة عضلية).
- اضغط على AUTO لإيقاف تشغيل مضخة التفريغ والفريزر. اسمح للوحدة بالوصول إلى درجة الحرارة المحيطة.
- قم بتنظيف ملفات التبريد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة واستنزاف السائل المتراكم من المجمع.
ملاحظة: يمكن أن يبدأ جمع الألياف على الفور. عندما لا يتم استخدام الأنسجة لعزل الألياف ، احتفظ بالعينة المجففة بالتجميد عند -80 درجة مئوية في حاوية محكمة الغلق مع حبات مجففة. تنبيه: الثلج الجاف خطير (الفئة 9) ؛ ارجع إلى MSDS للحصول على المعالجة الآمنة الموصى بها.
2. جمع الألياف
- إعداد جمع الألياف
- قم بتسمية ما لا يقل عن 50 أنبوبا ميكروفيا (الألياف من 1 إلى 50) وماصة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتغيير طبيعة كل أنبوب.
- قم بإعداد منطقة التجميع بزوجين من ملقط تشريح الأنسجة الدقيقة ، والأنسجة الخالية من النسالة ، ومصباح الطاولة ، والمجهر المجسم (مع المرحلة السوداء لأعلى) ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي الموضوعة على الطاولة.
- ضع عينة العضلات المجففة بالتجميد على غطاء طبق بتري. ضع الغطاء على مرحلة المجهر التشريحي.
- شاهد فيديو تشريح الألياف المفردة. مارس البروتوكول الكامل من جمع الألياف إلى تحديد نوع الألياف المفردة مرتين على الأقل قبل البدء في الدراسة.
- قبل جمع الألياف ، احسب الحجم الإجمالي المطلوب لعينة نوع الألياف من كل خزعة على النحو التالي. على سبيل المثال ، إذا كان حجم البداية لألياف واحدة = 10 ميكرولتر والحجم المتبقي بعد MyDoBID هو (1 ألياف × 10 ميكرولتر) - 1 ميكرولتر مستخدم في النشاف النقطي = 9 ميكرولتر (حجم العينة) ، احسب إجمالي حجم العينة المطلوب بضرب حجم العينة (ميكرولتر) في العدد الإجمالي للبقع الغربية التي سيتم تشغيلها ومضاعفة هذا المبلغ لحساب التكرار: (9 ميكرولتر × 4 بقع غربية) × 2 = 72 ميكرولتر. احسب عدد الألياف المطلوبة لكل عينة مكتوبة بقسمة حجم العينة النهائي المطلوب (ميكرولتر) على حجم العينة لكل عينة خاصة بنوع الألياف (على سبيل المثال ، 72 ميكرولتر ÷ 9 ميكرولتر = 8 ألياف لكل عينة خاصة بنوع الألياف). لتحقيق ذلك ، اجمع ما مجموعه 50 ألياف.
ملاحظة: حجم العينة المطلوب هو الحد الأدنى لتركيز البروتين المطلوب لتشغيل كل من MyDoBID والنشاف الغربي إذا كانت كمية البروتين المحملة تعادل ~ 3 مم من الألياف (~ 12 ميكروغرام من الوزن الرطب) لكل عينة (انظر الملف التكميلي 1 للحصول على التفاصيل). ومع ذلك ، فإن هذا الحجم لا يأخذ في الاعتبار ما إذا كانت المواد الهلامية المتكررة مطلوبة لبروتين معين. تنبيه: الملقط حاد. تعامل معها بعناية لتجنب خطر ثقب الجلد.
- عزل أحادي الألياف
- على قطعة صغيرة من الورق 5 سم × 1 سم ، استخدم مسطرة لرسم خط 1 سم. ضع علامة على كل 1 مم على هذا الخط.
- أدخل هذا تحت غطاء طبق بتري كدليل لتقدير طول الألياف التي تم جمعها.
- ضع عينة العضلات المجففة بالتجميد تحت المجهر المجسم عند تكبير منخفض (x 7.5). استخدم زوجا واحدا من ملقط تشريح الأنسجة الدقيقة لتثبيت العضلات المجففة بالتجميد في مكانها ومع البدء الآخر في فصل حزم صغيرة من الألياف (كما هو موضح في الفيديو).
- اعزل حزمة واحدة من الألياف واستمر في التباعد حتى يتم عزل أجزاء الألياف المفردة من الحزمة.
- اجمع ما لا يقل عن 50 أليافا لا يقل طولها عن ~ 1 مم.
- انقل الألياف إلى مساحة فارغة على طبق بتري. افحص الأجزاء أحادية الألياف تحت التكبير العالي (x 50). تأكد من أنها ألياف واحدة عن طريق فصل الألياف في النهاية. إذا انكسرت الألياف بدلا من الانفصال ، فهي ألياف واحدة.
- تمسخ الألياف
- باستخدام الملقط ، اجمع الألياف برفق وضعها مباشرة في المخزن المؤقت لتغيير طبيعة الملقط (لا تدع الملقط يواجه المخزن المؤقت).
- افحص الملقط تحت المجهر للتأكد من إزالة الألياف بنجاح. أغلق الأنبوب واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب بإحكام على المقعد ثلاث مرات لضمان انتقال الألياف إلى المخزن المؤقت.
- امسح الملقط نظيفا باستخدام منديل خال من النسالة قبل الانتقال إلى الألياف التالية. كرر هذه العملية حتى يتم جمع جميع الألياف.
- دوامة عينات الألياف وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان عند 2500 × جم لسحب العينة إلى قاع الأنبوب.
ملاحظة: يتم توقيت مدة الطرد المركزي (5 ثوان) من البداية (0 × جم) حتى تصل السرعة إلى ~ 2500 × جم. - اترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. قم بتجميد العينات ثم إذابتها قبل الاستخدام.
3. نقطة النشاف
- إعداد الغشاء وتفعيله
- قم بقياس وتسمية وقطع غشاء واحد من البولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF) (حجم مسام 0.2 ميكرومتر) ليناسب 50 عينة (~ 10.5 سم × 5.5 سم).
- ضع علامة على الحد الأيسر عدديا من أعلى إلى أسفل (من 1 إلى 10) والحد العلوي أبجديا من اليسار إلى اليمين (A إلى E) متباعدا بمقدار 1 سم.
- قم بإعداد أربع أوراق من ورق الترشيح بأبعاد 12.5 سم × 7.5 سم.
- كومة ورقتين معا لتشكيل كومة. قم بنقع كومة ورق الترشيح مسبقا في مخزن مؤقت للنقل 1x.
- ضع الغشاء في وعاء. صب 95٪ إيثانول على الغشاء ، مع حجم كاف لغمر الغشاء بالكامل (10-15 مل). هياج على الروك لمدة 1 دقيقة.
- تذكر الإيثانول ، واغمر الغشاء في مخزن مؤقت لنقل 1x (~ 15 مل) ، والصخور لمدة 2 دقيقة أخرى.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام كل من الإيثانول ومخزن النقل المؤقت في تجارب النشاف النقطي المستقبلية حتى يتشكل الترسيب (يتغير بعد ستة استخدامات). - ضع كومة ورق الترشيح المبللة بمخزن مؤقت للنقل على سطح متحرك مسطح مثل غطاء كبير وقم بتسويتها باستخدام الأسطوانة. ضع غشاء PVDF على المكدس باستخدام مانع هلام أو ملاقط.
- ضع ورقة واحدة من ورق الترشيح الجاف أعلى الغشاء وحرك الأسطوانة فوق ورق الترشيح لامتصاص أي مخزن مؤقت زائد على سطح الغشاء. قم بإزالة ورق الترشيح العلوي دون فرك الغشاء.
تنبيه: الميثانول (الفئة 3 ، المخاطر الفرعية 6.1) والإيثانول (الفئة 3) خطران. ارجع إلى ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) للحصول على توصيات المناولة الآمنة.
- امتصاص العينة إلى الغشاء
- قم بإذابة عينات الألياف ، وقم بإجراء جهاز طرد مركزي قصير (5 ثوان) في درجة حرارة الغرفة كما في الخطوة 2.3.4 واخلط العينة جيدا.
- دون لمس الغشاء بطرف الماصة ، قم ببطء بإيداع قطرة ~ 1 ميكرولتر من كل عينة على الغشاء في المنطقة المخصصة. أبعاد المنطقة المعينة لكل عينة ألياف هي ~ 1 سم × 1 سم. استهدف تحديد العينة في وسط هذه المنطقة.
- اترك قطرات العينة تنقع عبر الغشاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. تأكد من عدم بقاء مخزن مؤقت للعينة وامتصاصه بالكامل.
- باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ارفع الغشاء بعناية عن كومة ورق الترشيح الرطبة ، وضعه على ورقة جافة واحدة من ورق الترشيح ، وقم بتجفيف الغشاء لمدة 5 دقائق على الأقل.
- بمجرد أن تتحول بقع العينة إلى اللون الأبيض تماما ، أعد تنشيط الغشاء.
- إعادة تنشيط الغشاء وحظره
- أعد تنشيط الغشاء بتكرار الخطوتين 3.1.5 و 3.1.6.
- ضع الغشاء في محلول الغسيل واشطفه لمدة 5 دقائق بالتأرجح. تخلص من المخزن المؤقت للغسيل.
- احتضان الغشاء في العازلة المانعة لمدة 30 دقيقة أثناء التأرجح.
- اشطف الغشاء 3x بمحلول غسيل حتى يختفي المخزن المؤقت من الغيوم.
- اترك الغشاء في الغسيل النهائي على الروك.
4. وضع العلامات المناعية
- الكشف عن MHCIIa
- قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي MHCIIa عند 1 في 200 في 10 مل من المخزن المؤقت لألبومين مصل الأبقار (BSA).
- تخلص من المخزن المؤقت للغسيل من الغشاء ثم صب الجسم المضاد MHCIIa المخفف على الغشاء.
- ضع الحاوية (مع الغشاء في MHCIIa) على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- تذكر الجسم المضاد MHCIIa وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء مع عازلة حجب لمدة 2 دقيقة على الروك.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام جميع الأجسام المضادة الأولية حتى خمسة أضعاف طالما ظل المخزن المؤقت واضحا. - شطف مرتين أكثر. 5 دقائق في كل مرة ؛ ثلاث غسلات في المجموع.
- تمييع الفأر الغلوبولين المناعي G الفجل بيروكسيديز (IgG-HRP) الجسم المضاد الثانوي في 1 في 20000 في 10 مل من العازلة حجب وإضافة إلى الغشاء.
- تخلص من المخزن المؤقت للغسيل واحتضان الغشاء في الماوس IgG-HRP الثانوي مع هزاز لمدة 1 ساعة.
- تخلص من الثانوية واغسل الغشاء في محلول الغسيل (2 ، 5 ، 5 دقائق).
- اترك الغشاء منقوعا في الغسيل النهائي حتى يصبح جاهزا للتصوير.
- قم بتشغيل جهاز التصوير الهلامي، وانتظر 15 دقيقة حتى يصل جهاز التصوير إلى درجة حرارة التشغيل المطلوبة، ثم افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد).
- في نافذة البرنامج ، انقر فوق بروتوكول قناة واحدة جديد (الشكل 3 أ). للحصول على صورة ضوء أبيض للغشاء ، ضمن التطبيقات | البقع | انقر فوق القياس اللوني (الشكل 3 ب).
- انقر على منطقة الهلام. تمت برمجة كل خيار لأبعاد محددة لتناسب حجم أنواع الجل المختلفة. حدد الخيار المناسب لتناسب أبعاد الغشاء على أفضل وجه (الشكل 3C).
- قم بإعداد ECL عن طريق الجمع بين كواشف اللومينول والبيروكسيديز بنسبة 1: 1. اصنع حجما كافيا من خليط ECL لتغطية الغشاء بأكمله ، وعادة ما يكون الحجم الإجمالي مطلوبا من 800-1000 ميكرولتر.
- ضع الغشاء على صينية بلاستيكية شفافة كبيرة وقم بتفريق خليط ECL على الغشاء.
- ضع الغشاء على لوحة التصوير.
- انقر فوق Position Gel (الزر الأصفر) لعرض الكاميرا الحية. انقر مع الاستمرار واسحب زر التكبير / التصغير لزيادة مساحة التصوير في الغشاء. في هذه المرحلة ، قم بتصويب موضع الغشاء إذا لزم الأمر.
- انقر فوق تشغيل البروتوكول (الزر الأخضر) وانتظر حتى يتم إنتاج صورة لونية للغشاء. احفظ هذه الصورة للمساعدة في مطابقة النقاط مع عينة الألياف المقابلة.
- بدون تحريك الغشاء ، قم بتغيير التطبيق على البرنامج بالنقر فوق خيار تجميع 2 × 2 (Chemi High Resolution) (الشكل 3D).
- ضمن التعرض للصور والبرامج ، قم بتحسين وقت التعرض ، انقر فوق نطاقات باهتة (الشكل 3E) | وضع تراكم الإشارة.
- ضمن الإعداد ، اكتب 1 ثانية للصورة الأولى ، و 30 ثانية للصورة الأخيرة ، و 30 صورة إجمالية (الشكل 3F).
- انقر فوق تشغيل البروتوكول.
- احفظ صورة في المراحل التالية: قبل تشبع الإشارة (جميع النقاط المرئية سوداء) ، تشبع الإشارة الأولي (تبدأ بعض النقاط في التشبع) ، والبقع المفرطة التشبع (جميع البقع ذات الإشارة القوية المكتشفة مشبعة).
- احفظ جميع الصور المطلوبة قبل إنهاء تراكم الإشارة. أخرج الغشاء من جهاز التصوير.
- باستخدام محرر الجل ، ضع الغشاء مرة أخرى في الحاوية باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
- الكشف عن MHCI
- صب المخزن المؤقت للغسيل وعالج الغشاء بمحلول تجريد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (تأكد من غمر الغشاء تماما).
- تذكر المخزن المؤقت للتجريد واشطف الغشاء في محلول الغسيل لمدة 5 دقائق مع التأرجح.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت للتجريد 10 مرات قبل التخلص منه. - اسكب المخزن المؤقت للغسيل وهذه المرة ضع الجسم المضاد الأساسي MHCI المخفف بتركيز يبدأ من 1 في 200 (النطاق: 1 في 200 إلى 1 في 500). صخرة الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة في الجسم المضاد الأولي MHCI ، تذكر الجسم المضاد واغسل الغشاء كما في الخطوتين 4.1.4 و 4.1.5.
- تمييع الجسم المضاد الثانوي IgM HRP للفأر في حجب المخزن المؤقت عند 1 في 20,000. اسكب المخزن المؤقت المانع من الغشاء واحتضانه في الماوس IgM الثانوي كما في الخطوة 4.1.7.
- تم اكتشاف غسل والتقاط الصور MHCI كما في الخطوات من 4.1.8 إلى 4.1.24.
تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت للتجريد على الفوسفين العضوي 3-5٪ (الفئة 8). ارجع إلى MSDS للحصول على توصيات التعامل الآمن.
- الكشف عن MHCIIx المحتملة باستخدام الأكتين
- قم بتجريد الغشاء مرة أخرى (الخطوتان 4.2.1 و 4.2.2).
- كرر القسم 4.1 ، هذه المرة بتطبيق الجسم المضاد الأولي للأكتين المخفف عند 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA ثم الجسم المضاد الثانوي HRP للأرانب المخفف عند 1 في 20000 في المخزن المؤقت للحظر.
5. تحديد نوع الألياف
- تحليل إشارات MHCI و MHCIIa و Actin
- تعرف على لوحة شدة الإشارة (الشكل 4 أ). دون الخطوات من 5.1.2 إلى 5.1.4.
- تشير شدة الإشارة المشبعة نوعيا إلى أن اكتشاف البروتين قوي.
- يشير المعتدل إلى أن البروتين المستهدف موجود على مستوى متوسط.
- تشير الإشارة الخافتة إلى وجود القليل من البروتين المستهدف.
- استخدم لوحة شدة الإشارة لتصنيف الألياف ذات شدة الإشارة "المشبعة" أو "المعتدلة" أو "الخافتة" (الشكل 4 أ).
- قم بإجراء تحديد نوع الألياف من خلال مقارنة نتائج MHCIIa و MHCI أولا (الشكل 4B ، البقع اليسرى والوسطى).
- سجل الألياف ذات شدة الإشارة المشبعة أو المعتدلة لشكل isoform MHC واحد فقط.
- إذا كانت إشارة الشكل المتماثل MHC "باهتة" ، فاترك الألياف بدون علامة (انظر الشكل 4B).
- أخيرا ، حيث يتم ملاحظة الأكتين (شدة إشارة معتدلة أو مشبعة) في الألياف مع عدم اكتشاف MHCI أو IIa ، قم بتسجيله كألياف محتملة من النوع IIx (الشكل 4B ، اللطخة اليمنى).
- سجل الألياف بإشارة متساوية الشكل MHC خافتة ولكن تم اكتشاف الأكتين (كثافة معتدلة أو مشبعة) على أنها غير معروفة.
- تجاهل العينات التي تحتوي على اكتشاف خافت أو معدوم (لم يتم جمع الألياف) لجميع البروتينات المستهدفة الثلاثة (الشكل 4C).
- سجل أي ألياف حيث يتم اكتشاف كل من إشارات MHCI و MHCII بإشارة "مشبعة" أو معتدلة. هذه العينات ليست للاستخدام في التحضير الخاص بنوع الألياف.
- تحضير عينات خاصة بنوع الألياف
- قم بإعداد عينة منفصلة من النوع الأول والنوع الثاني لكل خزعة. بالنسبة لعينة من النوع الثاني ، اجمع الحد الأدنى المطلوب من الألياف (المحسوبة في الخطوة 2.1.5) التي يتم فيها اكتشاف MHCIIa عند مستويات مشبعة أو معتدلة.
- في أنبوب منفصل يسمى النوع الأول ، كرر هذه العملية للألياف التي يتم فيها اكتشاف MHCI (الشكل 4D).
- استخدم أليافا ذات كثافة إشارة معتدلة إذا لم يكن هناك ما يكفي من الألياف ذات الإشارات المشبعة.
- الجمع بين أي ألياف IIx المحتملة.
- استخدم على الفور عينات خاصة بنوع الألياف للنشاف الغربي أو قم بتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
6. تأكيد نوع الألياف لطخة الغربية
- استخدم 10 ميكرولتر من كل عينة خاصة بنوع الألياف ، (الحد الأدنى لحجم العينة المطلوب ، انظر الخطوة 2.1.5).
- افصل العينات باستخدام الجل مسبق الصب المحدد عبر SDS-PAGE وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- استخدم جهاز تصوير جل للكشف عن البروتين الموجود في الجل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- ضع الجل في مخزن مؤقت لنقل 1x بارد لمدة 10 دقائق.
- نقل البروتينات الرطبة إلى غشاء نيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر (9.5 سم × 13.5 سم) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- بعد النقل ، شطف الغشاء لفترة وجيزة مع H2O عالية النقاء في وعاء. اسكب الماء فائق النقاء.
- أضف 10 مل من محلول محسن إشارة الأجسام المضادة إلى الغشاء والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- تذكر محلول محسن إشارة الأجسام المضادة واغسل 5x (5 ثوان لكل غسلة) باستخدام H2O عالي النقاء.
ملاحظة: يمكن استخدام محلول محسن إشارة الأجسام المضادة 5x قبل التخلص منه. - اسكب الغسيل الأخير ، وأضف محلول الحجب ، والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- استخدم شفرة مشرط نظيف أو مقص لقطع أفقيا عبر الغشاء بوزن جزيئي يضمن وجود البروتينات التي تبلغ 180 كيلو دالتون وما فوق في الجزء العلوي من الغشاء.
- استخدم هذا القسم العلوي لمزيد من تأكيد نوع الألياف.
- استخدم الجزء الذي يقل عن 180 كيلو دالتون للكشف عن البروتينات المستهدفة المختلفة.
- في الجزء العلوي من الغشاء ، اتبع القسم 4.1 مع الجسم المضاد الثانوي MHCIIx الأساسي والفأر Immunoglobulin M (IgM) HRP.
- قم بتجريد الغشاء (كما هو موضح في القسمين 4.2.1 و 4.2.2) قبل تكرار العملية باستخدام الجسم المضاد الثانوي MHCIIa IgG IgG الأساسي والفأر.
- تجريد مرة أخرى وأخيرا تطبيق MHCI IgM الأساسي والماوس IgM HRP الأجسام المضادة الثانوية.
ملاحظة: هذه الخطوة نوعية وبالتالي فإن أي فقدان للبروتين بسبب تجريد الغشاء ليس مصدر قلق. - قارن الإشارة المكتشفة عبر الأشكال المتماثلة المختلفة ل MHC (كما هو موضح في الشكل 5B). عندما يتم الكشف عن شدة الإشارة عند مستويات معتدلة إلى مشبعة في العينة المتوقعة (MHCI - النوع الأول ، MHCIIa - النوع الثاني و MHCIIx - النوع IIx) ، سيتم تسجيل العينات الخاصة بنوع الألياف على أنها موثوقة للاستخدام في الدراسات المستقبلية.
- سجل العينة على أنها غير موثوقة عند اكتشاف أكثر من شكل متساو MHC في العينة.
تنبيه: يحتوي محلول محسن الأجسام المضادة على هيدروكسيد الصوديوم 50٪. ارجع إلى MSDS للحصول على توصيات التعامل الآمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد الألياف العضلية الفردية MHCI و MHCIIa و MHCIIx باستخدام النشاف النقطي
تتمثل إحدى ميزات MyDoBID في تصنيف شدة إشارة MHC و Actin المتغيرة في ألياف معينة (الشكل 4A). تم تحديد نوع الألياف من خلال وجود أو عدم وجود أشكال متماثلة MHCI و IIa (الشكل 4B). لم تظهر ستة ألياف أي اكتشاف ل MHC أو الأكتين ، مما يشير إلى عدم وجود ألياف تم جمعها. كانت نتائج هذه اللطخة النقطية المحددة هي تحديد 22 أليافا من النوع الثاني و 7 ألياف من النوع الأول و 3 ألياف محتملة من النوع IIx. تم تصنيف 2 عينات مجهولة الهوية و 6 عينات على أنها "خالية من الألياف" تم جمعها (الشكل 4B ، C). تم تحديد الألياف التي لم يكن لديها أي إشارة MHCI أو MHCIIa قابلة للكشف حتى الآن كانت إيجابية للأكتين كألياف محتملة من النوع IIx من خلال عملية الإزالة. باستخدام لوحة شدة الإشارة لتصنيف قوة إشارة MHCI و IIa ، تم دمج الألياف "المعتدلة" أو "المشبعة" لإنتاج عينات من النوع الأول أو الثاني ، على التوالي. لم يتم تضمين الألياف التي لم يتم التعرف عليها أو التي كانت باهتة أو لم يتم اكتشاف أكتين في التحليل اللاحق وتم التخلص منها (الشكل 4D).
تأكيد كتابة الألياف باستخدام النشاف الغربي
تم التحقق من صحة العينات الخاصة بنوع الألياف باستخدام النشاف الغربي والأجسام المضادة الخاصة ب MHC (الشكل 5). تم تشغيل عينات الألياف من النوع الأول والنوع الثاني من خزعة فردية واحدة جنبا إلى جنب مع عينة من النوع IIx ، والتي كانت عينة من ألياف النوع IIx المحتملة من شخصين بسبب انخفاض أعداد ألياف النوع IIx الموجودة في كل خزعة. أكدت بيانات اللطخة الغربية أن تحديد نوع الألياف كان ناجحا.
الشكل 1: ملخص سير العمل الذي يحدد تحضير العينة ، وكتابة الألياف ، وتأكيد اللطخة الغربية لخصوصية الألياف . (أ) تجفف الأنسجة البشرية بالتجميد لمدة 48 ساعة. (ب ، ج) يتم عزل شرائح الألياف المفردة تحت مجهر تشريح. (د) يتم تغيير طبيعة الألياف، و(ه) بعد 1 ساعة، تخزن عند -80 درجة مئوية. (و) ترتيب حضانة الأجسام المضادة الأولية. (ز) تم مسح الألياف بالنقاط وتحديد نوع الألياف باستخدام MHCIIa (النوع الثاني) و MHCI (النوع الأول) والأكتين (IIx؟ ، الألياف المحتملة من النوع IIx). (ح) ثم تم تجميع الألياف. (I) يتم تحليل العينات الخاصة بنوع الألياف جنبا إلى جنب مع منحنى المعايرة عبر SDS PAGE والنشاف الغربي. (ي) التحقق من تحديد نوع الألياف باستخدام النشاف الغربي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شاشة العرض ولوحة التحكم لنظام التجفيف بالتجميد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إعدادات التصوير لالتقاط الضوء الأبيض للغشاء متبوعا بالكشف الكيميائي عن البروتينات المستهدفة. لتصوير الغشاء تحت الضوء الأبيض، حدد (A) قناة مفردة جديدة متبوعة ب (B) البقع | تطبيق قياس الألوان . ( C) بناء على حجم الجل المستخدم، حدد منطقة التصوير المناسبة، ثم التقط صورة بالضوء الأبيض بالضغط على بروتوكول التشغيل. (د) دون تحريك الغشاء، كرر الخطوة (ب ) ولكن هذه المرة، اختر البقع | كيمي مرحبا القرار. قبل الضغط على تشغيل، اختر (E) تعريض الصورة لتحسين النطاقات الخافتة و(F) قم بإعداد وضع تراكم الإشارة وفي المقام الأول، اضبط وقت التعرض لكل ثانية لمدة 30 ثانية مع تحديد وحدات البكسل المشبعة بالتمييز . اضغط على بروتوكول التشغيل واسمح بإكمال التشغيل قبل تحديد أفضل الصور لحفظها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد نوع الألياف. (أ) تم تحديد أنواع الألياف بالنسبة لجميع الألياف الأخرى على الغشاء ، مصنفة بواسطة لوحة شدة الإشارة لكل شكل متساوي MHC تم اكتشافه (على سبيل المثال ، إشارة MHCI: مشبعة ومعتدلة وخافتة). (ب) باستخدام اللوحة الموجودة في (A) ، حدد الجسم المضاد MHCIIa ألياف النوع الثاني (اللطخة الزرقاء اليسرى) ، وبعد تجريد الغشاء ، حدد الجسم المضاد MHCI ألياف النوع الأول (لطخة حمراء ومتوسطة). تم استخدام الجسم المضاد للأكتين لتحديد ألياف IIx المحتملة إذا تم اكتشاف إشارة أكتين إيجابية في الألياف حيث لم يتم اكتشاف إشارة MHCI أو IIa سابقة (لطخة خضراء يمنية). يتم تمييز الألياف التي لم تتبع هذه الإرشادات باللون الأرجواني (مجهول الهوية). وأخيرا، أشارت العينات السلبية لإشارة الأكتين إلى أنه لم يتم جمع أي ألياف ("لا توجد ألياف"). (ج) جدول يوضح وسم الألياف المقابل لموضع العينة على البقع النقطية الموضحة في (ب). (د) مخطط اختيار الألياف لإعداد عينات خاصة بنوع الألياف. كان الهدف هو جمع 10 ألياف مشبعة لكل نوع من أنواع الألياف. هنا ، بالنسبة للألياف من النوع الثاني ، تم تحديد ثمانية ألياف مشبعة وتجميعها. بالنسبة للألياف من النوع الأول ، كان هناك أقل من 10 ألياف مشبعة ، لذلك تم أيضا اختيار الألياف ذات قوة الإشارة المعتدلة. بالنسبة للألياف من النوع IIx ، تم تحديد اثنين من الألياف وتجميعها. إذا تم تحديد أقل من 10 ألياف (مشبعة ومعتدلة) ، فقد يكون من الضروري جمع المزيد من الألياف. ملاحظة: إشارة الأكتين الموضحة في (B) لم تصل إلى التشبع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأكيد اللطخة الغربية لتحديد نوع الألياف. تم إجراء تحديد نوع الألياف وفقا للشكل 4 لإنشاء عينات من النوع الأول (~ 10 ألياف) والنوع الثاني (~ 10 ألياف). نظرا لعدم وجود ألياف IIx تم تحديدها من نفس الخزعة ، فقد تم إنتاج عينة IIx الموضحة هنا من أكثر من عينة عضلية واحدة (n = 2 فرد). يتم تحليل حصة صغيرة من كل عينة خاصة بالألياف عن طريق النشاف الغربي لتأكيد تحديد نوع الألياف. يشار إلى علامات الوزن الجزيئي (kDa) على اليسار ، ويتم التقاطها تحت الضوء الأبيض دون تحريك الغشاء. يتم الكشف عن البروتينات المستهدفة في تسلسل MHCIIx و MHCIIa و MHCI ، مع الميوسين من الجل المنشط بالأشعة فوق البنفسجية الذي يشير بصريا إلى كمية البروتين المحملة لكل عينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمشكلات البروتوكول الشائعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: حساب كتلة الألياف المجففة بالتجميد باستخدام منحنى المعايرة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جمع الألياف
بناء على عدة سنوات من الخبرة ، يمكن لمعظم الباحثين إتقان هذه التقنية. ومع ذلك ، تؤدي الممارسة إلى جمع الألياف بشكل أسرع وأكثر كفاءة للتحليلات النهائية. لتكون قادرا على عزل 30 قطعة ألياف مفردة بجودة التجميع ، يوصى بجمع 50 قطعة ألياف لكل عينة. يوصى بدراسة فيديو جمع الألياف بعناية وبعد إجراء جلستين تدريبيتين (~ 50 ألياف لكل جلسة) لتحقيق معيار معقول. تخضع جميع الألياف التي تم جمعها ل MyDoBID لتحديد نوع الألياف ، مما سيكشف عن مدى فعالية تنفيذ التقنية. سينظر إلى هذا على أنه عدد منخفض من إشارة MHC "بدون ألياف" أو "خافتة" تم اكتشافها في عينات الألياف (انظر قسم البروتوكول 5.1).
من المعروف أن العضلات يمكن أن تحتوي على ألياف هجينة ، حيث يوجد كل من MHCI و MHCIIa ، أو MHCIIa و IIx 2,14. أحد قيود MyDoBID هو أنه لا يمكن التأكد من وجود ألياف هجينة لأن العينة الإيجابية لكل من الأجسام المضادة MHCI و MHCIIa يمكن أن تكون إما أليافا هجينة أو أنه تم جمع ألياف. علاوة على ذلك ، لا يمكن ل MyDoBID اكتشاف MHCIIa بشكل منفصل عن MHCIIa / IIx الهجينة لأن الجسم المضاد الأساسي MHCIIa سيكتشف وجود MHCIIa في كل من ألياف IIa و IIa / IIx. لهذه الأسباب ، لم يتم تحديد وإعداد عينات من الألياف الهجينة ، وتم تجاهل العينات التي تحتوي على إشارات MHCI و MHCIIa التي تقع خارج النطاقات الموصوفة في لوحة شدة الإشارة (الشكل 4A). هناك قيد آخر هو أنه لا يمكن تحديد نسبة أنواع الألياف العضلية في العينة باستخدام MyDoBID ، وتطبيق التحليلات الكيميائية المناعية التقليدية ضروري لتحديد توزيع نوعالألياف 2.
نقطة النشاف
تعتمد لوحة شدة الإشارة ومعرف نوع الألياف على العينة بأكملها التي يتم تمثيلها في الحجم الصغير المطبق على غشاء النشاف النقطي. لتحقيق ذلك ، يتم خلط العينة جيدا عن طريق التقليب قبل تحميلها على الغشاء. تنتقل جميع الألياف التي تحتوي على شكل متساوي MHC واحد فقط إلى الخطوة التالية من التجميع. في هذه المرحلة ، من المهم ألا تنتقل أي ألياف تحتوي على أكثر من MHC إلى هذه الخطوة التالية المتمثلة في الجمع بين العينات. إذا كانت العينة ملوثة ، فيجب التخلص من العينة المجمعة بالكامل ويجب على الباحث العودة إلى جمع الألياف وتكرار خطوات عزل الألياف ونشاف النقاط.
وضع العلامات المناعية
في السابق تم الإبلاغ عن أن 5 دقائق هي وقت كاف لمنع المواقع غير المحددة على الغشاء للكشف عن MHCI و MHCIIa9. يتطلب تطوير التقنية إلى MyDoBID استخدام جسم مضاد أكتين. وجد أن وقت الكتلة البالغ 5 دقائق يحتاج إلى زيادة إلى 30 دقيقة ، كما ورد6 ، للحصول على غشاء بخلفية قليلة ، حيث أدى الحجب لمدة 5 دقائق إلى خلفية غشاء أغمق. يعد حجب الوقت أحد الاعتبارات في أي تقنية للكشف المناعي ، مثل النشاف الغربي أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، ويجب تعديله حسب الاقتضاء.
تجريد الغشاء
لا يمكن استخدام التجريد للتحليلات الكمية15 لأنه يزيل أيضا البروتينات ذات الأهمية ولكن يمكن استخدامه في MyDoBID لأنه اختبار نوعي. الغرض من التجريد هو إزالة الأجسام المضادة المرتبطة من سطح الغشاء ، مما يسمح باستخدام جسم مضاد جديد بأقل قدر من التداخل من الجسم المضاد السابق. في MyDoBID ، هناك خيار لتطبيق العينة عبر غشاءين ، حيث يتم الكشف عن أشكال MHC المختلفة على أغشية منفصلة. إذا كان هذا النهج مفضلا ، فتجنب التعامل مع أنبوب العينة أكثر من مرة عن طريق تحميل البقع في نفس الوقت. سيضمن ذلك أن وقت التجفيف بين كل بقعة عينة متشابه (~ فرق 5 ثوان) والخطوات اللاحقة التي يتم إجراؤها في وقت واحد في حاويات منفصلة. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الخيار سيزيد من الوقت والعينة والاستهلاك الاستهلاكي.
يتم تطبيق الأجسام المضادة للكشف أولا عن ألياف MHCIIa ، تليها MHCI ، لأن الجسم المضاد MHCI يعطي دائما إشارة ساطعة للغاية ، والتي سيكون من الصعب تجريدها من MHCIIa. يتم التعبير عن الأكتين بشكل متجانس في ألياف العضلات الهيكلية ويستخدم للتأكد من أن جزءا من الألياف قد تم تطبيقه بنجاح على الغشاء كما هو موضح أعلاه.
التصوير وتحديد نوع الألياف وإعداد عينات خاصة بنوع الألياف
تم تطوير أداة جديدة في هذا البروتوكول للمساعدة في تحديد نوع الألياف واختيار العينات لإنشاء عينات خاصة بنوع الألياف (الشكل 4 أ). يستخدم المثال الموضح في لوحة شدة الإشارة لتعريف شدة إشارة MHCI على النحو التالي: (i) مشبع أو (ii) معتدل أو (iii) باهت. لتجميع الألياف في عينات خاصة بنوع الألياف ، يتم اختيار الألياف التي تظهر شدة الإشارة المشبعة أولا ، وإذا لزم الأمر ، تتم إضافة ألياف ذات كثافة إشارة معتدلة. عند تحضير عينات من النوع الأول والثاني ، عادة ما يكون هناك ما يكفي من الألياف "المشبعة" و "المعتدلة" بحيث يمكن التخلص من الألياف المصنفة على أنها "باهتة" أو غير محددة.
حداثة استخدام الأكتين بدلا من الجسم المضاد MHCIIx لتحديد ألياف النوع IIx النقية
في السابق ، لتحديد ألياف IIx النقية ، تمت مقارنة إشارة MHCIIx بشكل شخصي بإشارة MHCI و MHCIIa على بقعة نقطية ، ومن خلال عملية الإزالة ، تم تحديد الألياف التي لا تحتوي على إشارة MHCI أو IIa ، ولكن مع إشارة MHCIIx ، على أنها IIx نقية. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ مشكلات عند استخدام اثنين من الأجسام المضادة الأولية IgM الماوس (MHCIIx و MHCI) على نفس الغشاء. على الرغم من تجريد الغشاء بين الأجسام المضادة الأولية ، يمكن اكتشاف إشارة الأجسام المضادة المتبقية. استخدام الجسم المضاد الأولي للأرانب المضادة للأكتين يمنع حدوث هذه المشكلة. هنا استخدمنا الأكتين لتأكيد أنه تم جمع الألياف وفي غياب كل من MHCI و MHCIIa ، يشير إلى وجود ألياف IIx. ثم يتم تأكيد ألياف IIx المحتملة عن طريق النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد الخاص ب MHCIIx (انظر الشكل 5 في هذه الورقة والشكل 2 في9). تم عرض الجسم المضاد 6H116 للكشف عن النطاق المنفصل كهربائيا المقابل ل MHCIIx في العضلات الهيكلية للفئران وتسمية ألياف النوع IIx في المقاطع العرضية للفأر والجرذ والعضلات البشرية2.
تأكيد نوع الألياف لطخة الغربية
من أفضل الممارسات تشغيل جميع العينات الخاصة بنوع الألياف من نفس الخزعة على نفس الجل. نظرا لأن الجسم المضاد MHCI يتطلب نفس الجسم المضاد الثانوي مثل MHCIIx ، يجب فصل عينات النوع الأول والثاني بممر واحد على الأقل على هلام معين ، كما هو موضح في الشكل 5. نظرا لأن محتوى البروتين سيختلف عبر العينات الخاصة بنوع الألياف بسبب حجم الألياف المتغير ، يجب استخدام الجل الأول لتحديد حجم العينة التي يجب تحميلها في عمليات تشغيل الهلام اللاحقة للحصول على كميات مماثلة من البروتين عبر جميع العينات. للقيام بذلك ، يتم تحديد البروتين الكلي في عينة معينة باستخدام تقنية التصوير الهلامي المنشط بالأشعة فوق البنفسجية لتصور جميع نطاقات البروتين التي تم فصلها في الجل بواسطة SDS-PAGE قبل النقل. يتم تحديد البروتين الكلي في كل عينة من صورة الهلام واستخدامه لتصحيح التحميل غير المتكافئ في تشغيل اللطخة الغربية التالية ، بشرط تشغيل منحنى معايرة لعدة كتل معروفة من الأنسجة العضلية الهيكلية جنبا إلى جنب مع العينات الخاصة بنوع الألياف3،4،6،17. ليست هناك حاجة أيضا لاستخدام بروتين "التدبير المنزلي" مثل الأكتين لتحديد البروتين الكلي ، والذي يتطلب أيضا منحنى المعايرة الخاص به15. هذه التقنية هي طريقة دقيقة وموفرة للوقت لتحديد البروتين الكلي ويمكن إجراؤها باستخدام عينة قليلة جدا (أي ~ 1/5th من الألياف9) دون الحاجة إلى كواشف إضافية أو معايير بروتين مع تعظيم جميع أقسام الغشاء للكشف عن البروتينات ذات الأهمية.
عندما يتعلق الأمر بوضع العلامات المناعية أثناء خطوة اللطخة الغربية ، يتم تطبيق الجسم المضاد MHCIIx أولا بسبب الوفرة المنخفضة نسبيا ل MHCIIx مقارنة بأشكال MHC الأخرى. بمجرد أن يصبح الغشاء جاهزا للكشف عن الأجسام المضادة MHCI ، سيكون قد خضع لخطوتين من التجريد (أي بعد اكتشاف MHCIIx و MHCIIa). وبالتالي ، يجب الكشف عن اكتشاف MHCI في المقام الأول في عينة من النوع الأول ، مع الحد الأدنى من الإشارة المتبقية المكتشفة من الأجسام المضادة MHC السابقة (الشكل 5). يستخدم النشاف الغربي لتأكيد نقاء كل عينة خاصة بنوع الألياف باستخدام جميع الأجسام المضادة الثلاثة MHC على نفس جزء الغشاء. ومع ذلك ، سيتم القضاء على الحاجة إلى التجريد إذا تم رفع الأجسام المضادة MHCI أو MHCIIx في أنواع مضيفة مختلفة مثل الأرانب أو الماعز.
التطبيقات
يمكن استخدام المنهجية الموصوفة هنا لكتابة الألياف لشرائح الألياف المفردة من العضلات الهيكلية الطازجة أو المجففة بالتجميد لفحص تعبير البروتين النوعي من نوع الألياف في العضلات الهيكلية البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام عينات العضلات الطازجة ، يمكن استخدام ألياف سليمة أو ذات بشرة ميكانيكية6. يسمح استخدام الألياف الجلدية بإجراء مزيد من الفحص لتعبير البروتين في المقصورات تحت الخلوية مثل تلك الموجودة في مقصورات السيتوسول والغشاء. تم استخدام هذا التطبيق سابقا لقياس كمية الجليكوجين المرتبطة مقابل غير المنضمة في شرائح الألياف ذات البشرة الميكانيكية من الأفراد الأصحاء ومرضى السكري6. الأهم من ذلك ، MyDoBID مفيد للتجارب التي تستخدم عينات مشوهة فقط ولن تكون مناسبة للدراسات التي تتطلب البروتينات في حالتها الأصلية. في حين أنه من الممكن إجراء تحليلات أخرى مثل المقايسات الأنزيمية أو النهج البروتينية في المحلول في ظل الظروف الأصلية ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين بحيث يمكن إزالة جزء من الألياف لتحديد شكل MHC باستخدام MyDoBID.
باختصار ، يمكن تحديد النوع الأول والنوع الثاني والنوع IIx بنجاح من خلال تطبيق تقنية مباشرة مع المواد الاستهلاكية المتاحة بسهولة والتي يشيع استخدامها في النشاف الغربي. نقوم بتضمين معلومات عملية شاملة ، حيث عند الانتهاء بنجاح ستنتج عينات خاصة بنوع الألياف تتمتع بأفضل جودة وسلامة وموثوقية ممكنة للدراسات المستقبلية. هذه التقنية هي النهج العملي والمفضل لإجراء التحليل الكيميائي الحيوي للعضلات الهيكلية الخاصة بالألياف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم تطوير الأجسام المضادة ضد MHC I (A4.840) و MHCIIa (A4.74) المستخدمة في هذه الدراسة من قبل الدكتور H. M. Blau وتم تطوير الجسم المضاد ضد MHCIIx (6H1) من قبل الدكتور C. A. Lucas وتم الحصول عليه من بنك الدراسات التنموية Hybridoma (DSHB) ، وذلك بفضل رعاية المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وتحتفظ به جامعة أيوا ، قسم العلوم البيولوجية (أيوا سيتي ، IA). نشكر Victoria L. Wyckelsma على تقديم عينات العضلات البشرية لهذه الدراسة. تم الحصول على غالبية الصور في الشكل 1 من BioRender.com.
التمويل:
ولم تتلق هذه الدراسة أي تمويل خارجي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J.
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
