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Biochemistry

मानव कंकाल की मांसपेशी की फाइबर प्रकार की पहचान

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल डॉट ब्लॉटिंग तकनीक का उपयोग करके मायोसिन हेवी चेन (एमएचसी) आइसोफॉर्म के अनुसार फ्रीज-सूखे मानव कंकाल की मांसपेशियों और फाइबर-प्रकार वर्गीकरण से एकल-फाइबर अलगाव को प्रदर्शित करता है। पहचाने गए एमएचसी I और II फाइबर नमूनों को पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति में फाइबर प्रकार-विशिष्ट अंतर के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है।

Abstract

यहां वर्णित तकनीक का उपयोग डॉट ब्लॉटिंग का उपयोग करके व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर के खंडों में विशिष्ट मायोसिन हेवी चेन (एमएचसी) आइसोफॉर्म की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिसे बाद में मांसपेशी फाइबर प्रकार (MyDoBID) के आईडीएनटिफिकेशन के लिए DoT Bलोटिंग द्वारा माईओसिन हेवी चेन डिटेक्शन के रूप में संदर्भित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल मानव कंकाल की मांसपेशियों को फ्रीज-सुखाने और एकल मांसपेशी फाइबर के खंडों को अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। MyDoBID का उपयोग करते हुए, टाइप I और II फाइबर को क्रमशः एमएचसीआई- और आईआईए-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ वर्गीकृत किया जाता है। वर्गीकृत फाइबर को तब प्रत्येक बायोप्सी के लिए फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूनों में जोड़ा जाता है।

प्रत्येक नमूने में कुल प्रोटीन सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) और यूवी-सक्रिय जेल तकनीक द्वारा निर्धारित किया जाता है। पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके फाइबर प्रकार के नमूने मान्य हैं। कई पश्चिमी धब्बों में लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने को बढ़ाने के लिए प्रोटीन लोडिंग सामान्यीकरण करने का महत्व भी वर्णित है। एकल-फाइबर पश्चिमी धब्बों की तुलना में फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूनों में वर्गीकृत फाइबर को समेकित करने के लाभों में नमूना बहुमुखी प्रतिभा, नमूना थ्रूपुट में वृद्धि, कम समय का निवेश और लागत-बचत उपाय शामिल हैं, जबकि मूल्यवान फाइबर प्रकार-विशिष्ट जानकारी को बनाए रखा जाता है जिसे अक्सर होमोजिनाइज्ड मांसपेशी नमूनों का उपयोग करके अनदेखा किया जाता है। प्रोटोकॉल का उद्देश्य फ्रीज-सूखे मानव कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों से अलग टाइप 1 और टाइप 2 फाइबर की सटीक और कुशल पहचान प्राप्त करना है।

इन व्यक्तिगत तंतुओं को बाद में टाइप 1 और टाइप 2 फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने बनाने के लिए जोड़ा जाता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को टाइप आईआईएक्स फाइबर की पहचान को शामिल करने के लिए विस्तारित किया गया है, जिसमें एक्टिन का उपयोग उन तंतुओं के लिए मार्कर के रूप में किया जाता है जो एमएचसीआई और एमएचसीआईआईए के लिए नकारात्मक थे, जिन्हें पश्चिमी सोख्ता द्वारा आईआईएक्स फाइबर के रूप में पुष्टि की जाती है। प्रत्येक फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूना तब पश्चिमी सोख्ता तकनीकों का उपयोग करके विभिन्न लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी एक विषम ऊतक है, जिसमें अलग-अलग सेलुलर चयापचय और सिकुड़ा हुआ गुण होते हैं जो इस बात पर निर्भर करते हैं कि कोशिका (फाइबर) धीमी चिकोटी (प्रकार 1) या तेज ट्विच (टाइप II) है या नहीं। फाइबर प्रकार को मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी) आइसोफॉर्म की जांच करके पहचाना जा सकता है, जो संकुचन समय, छोटा होने की गति और थकान प्रतिरोध1 सहित कई तरीकों से एक दूसरे से भिन्न होते हैं। प्रमुख एमएचसी आइसोफॉर्म में टाइप I, टाइप IIA, टाइप IIB और टाइप IIx शामिल हैं और उनके चयापचय प्रोफाइल या तो ऑक्सीडेटिव (टाइप I और IIA) या ग्लाइकोलाइटिक (IIx, IIB)1 हैं। इन फाइबर प्रकारों का अनुपात मांसपेशियों के प्रकार और प्रजातियों के बीच भिन्न होता है। टाइप आईआईबी व्यापक रूप से कृंतक मांसपेशियों में पाया जाता है। मानव मांसपेशियों में किसी भी प्रकार के आईआईबी फाइबर नहीं होते हैं और मुख्य रूप से एमएचसी आइसोफॉर्म टाइप 1 और आईआईए फाइबर होते हैं, जिसमें आईआईएक्स फाइबर2 का एक छोटा अनुपात होता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल विभिन्न फाइबर प्रकारों के बीच भिन्न होते हैंऔर उम्र बढ़ने 3, व्यायाम4, 5, और रोग6 के साथ बदल सकते हैं।

विभिन्न कंकाल की मांसपेशी फाइबर प्रकारों में सेलुलर प्रतिक्रियाओं को मापना अक्सर मांसपेशियों के होमोजेनेट्स (सभी फाइबर प्रकारों का मिश्रण) की परीक्षा के कारण अनदेखा या संभव नहीं होता है। एकल-फाइबर पश्चिमी धब्बा व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर7 में कई प्रोटीन की जांच के लिए अनुमति देता है। इस पद्धति का उपयोग पहले उपन्यास और सूचनात्मक एकल-फाइबर विशेषताओं का उत्पादन करने के लिए किया गया है जो होमोजेनेट तैयारी का उपयोग करके प्राप्त करना संभव नहीं था। हालांकि, मूल एकल-फाइबर पश्चिमी धब्बा पद्धति की कुछ सीमाएं हैं, जिनमें समय लेने वाली प्रकृति, नमूना प्रतिकृति उत्पन्न करने में असमर्थता और महंगे, संवेदनशील एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) अभिकर्मकों का उपयोग शामिल है। यदि ताजा ऊतक का उपयोग किया जा रहा है, तो यह विधि सीमित समय सीमा (यानी, 1-2 घंटे) के भीतर व्यक्तिगत फाइबर को अलग करने की आवश्यकता की समय की कमी के कारण सीमित है। सौभाग्य से, फ्रीज-सूखे ऊतक8 से एकल-फाइबर खंडों को अलग करके इस संयम को कम किया जाता है। हालांकि, फ्रीज-सूखे नमूनों से फाइबर संग्रह बायोप्सी ऊतक के आकार और गुणवत्ता से सीमित है।

डॉट ब्लॉटिंग विधि9 का उपयोग करके फाइबर प्रकार की पहचान को इस व्यापक प्रोटोकॉल में काफी विस्तृत और विस्तारित किया गया है। पहले, यह प्रदर्शित किया गया है कि गीले वजन की मांसपेशियों के ऊतकों के ~ 2-10 मिलीग्राम के रूप में कम से कम फ्रीज-सुखाने और एकल-फाइबर एमएचसी आइसोफॉर्म प्रोटीन विश्लेषण9 के लिए पर्याप्त है। क्रिस्टेंसन एट अल.9 ने डॉट ब्लॉटिंग द्वारा मौजूद एमएचसी आइसोफॉर्म का पता लगाने के लिए ~ 1 मिमी फाइबर सेगमेंट के 30% का उपयोग किया, जिसकी पुष्टि पश्चिमी सोख्ता द्वारा की गई थी। इस काम से पता चला कि डॉट ब्लॉटिंग के साथ पश्चिमी सोख्ता को प्रतिस्थापित करके, समग्र लागत ~ 40 गुना (50 फाइबर सेगमेंट के लिए) कम हो गई थी। फाइबर को तब टाइप 1 और टाइप 2 नमूनों में "पूल" किया गया था, जिसने प्रयोगात्मक प्रतिकृति9 के लिए अनुमति दी थी। फिर भी, एक सीमा यह थी कि केवल दो फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने प्राप्त किए गए थे: टाइप I (एमएचसीआई पॉजिटिव) और टाइप II (एमएचसीआईआई पॉजिटिव फाइबर), टाइप II नमूनों में एमएचसीआईआईए और एमएचसीआईआईएक्स 6,10 का मिश्रण था। विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल दर्शाता है कि शुद्ध प्रकार आईआईएक्स फाइबर की पहचान कैसे की जा सकती है और एक अत्यधिक विस्तृत वर्कफ़्लो प्रदान करता है (चित्रा 1 में संक्षेप में), जिसमें सामान्य प्रोटोकॉल मुद्दों के लिए समस्या निवारण रणनीतियाँ शामिल हैं।

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Protocol

स्थानीय संज्ञाहरण (जाइलोकेन) और मैनुअल सक्शन11,12 के लिए संशोधित बर्गस्ट्रॉम सुई का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में 70-74 वर्ष की आयु के एन = 3 (2 पुरुष, 1 महिला) से विशाल पार्श्व से मानव मांसपेशियों के नमूने प्राप्त किए गए थे। नमूने विक्टोरिया यूनिवर्सिटी ह्यूमन रिसर्च एथिक्स कमेटी (HRETH11/221) द्वारा अनुमोदित पिछले अध्ययन का एक उप-समूह थे और हेलसिंकी13 की घोषणा के अनुसार आयोजित किए गए थे। प्रतिभागियों ने इस अध्ययन में भाग लेने के लिए लिखित, सूचित सहमति प्रदान की। इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सभी सामग्रियों का पूर्ण विवरण सामग्री की तालिका में दिखाया गया है। इसके अलावा, सामान्य प्रोटोकॉल मुद्दों को संबोधित करने वाली समस्या निवारण रणनीतियों की एक सूची तालिका 1 में प्रदान की गई है।

1. फ्रीज सुखाने

  1. बायोप्सी की गई मांसपेशियों के नमूनों को सूखी बर्फ पर जमे हुए रखते समय, तराजू पर एक खाली जमे हुए ट्यूब को तौलें और टारें।
  2. जल्दी से कम से कम 10 मिलीग्राम गीले वजन वाले जमे हुए ऊतक का वजन करें। वजन को एक दशमलव स्थान पर रिकॉर्ड करें।
  3. ऊतक को प्रीकूल्ड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जमा करें जिसमें ढक्कन में 3-4 छेद छेद किए गए हैं और इसे सूखी बर्फ के 2-3 छर्रों के साथ एक छोटे बीकर में रखें।
  4. फ्रीज-ड्रायर निर्माता के ऑपरेटिंग निर्देशों का पालन करें।
  5. सुनिश्चित करें कि फ्रीज ड्रायर पर सभी वाल्व बंद हैं और फ्रीज ड्रायर चालू करें।
  6. यह जांचने के लिए नियंत्रण कक्ष का उपयोग करें कि वैक्यूम सेट बिंदु मानव ऊतक के लिए इष्टतम फ्रीज-सुखाने की स्थिति के लिए प्रोग्राम किया गया है, 0.12 मिलीबार (mBar) (चित्रा 2)।
  7. फ्रीज ड्रायर पर मैनुअल दबाएं और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कक्ष -40 डिग्रीसेल्सियस तक ठंडा न हो जाए।
  8. एक बार जब कक्ष उस तापमान तक पहुंच जाता है, तो ढक्कन को हटा दें, फिर ग्लास चैंबर, और बीकर (मांसपेशियों के नमूने के साथ) को धातु के चरण पर रखें।
  9. ग्लास चैंबर और ढक्कन को बदलें। ढक्कन पर वैक्यूम रिलीज वाल्व बंद करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि वैक्यूम स्केल लाइट हरा न हो जाए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ड्रायर वैक्यूम सील है।
  10. 48 घंटे के लिए मांसपेशियों के नमूनों को फ्रीज-ड्राई करें। एक बार फ्रीज सुखाने के बाद, वैक्यूम बटन दबाकर वैक्यूम पंप बंद करें और ढक्कन पर वैक्यूम रिलीज वाल्व खोलें।
  11. कक्ष के ढक्कन को हटा दें और फ्रीज-सूखे नमूने एकत्र करें। ऊतक का वजन करें और वजन को एक दशमलव स्थान पर रिकॉर्ड करें।
  12. वजन के प्रतिशत हानि की गणना करें; ~ वजन में 75% की कमी इंगित करती है कि ऊतक सफलतापूर्वक फ्रीज-सूख गया है (इस काम में, एसडी ± औसत, 76 ± 9%, एन = 11 मांसपेशियों के नमूने)।
  13. वैक्यूम पंप और फ्रीजर को बंद करने के लिए ऑटो दबाएं। इकाई को परिवेश के तापमान तक पहुंचने दें।
  14. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कूलिंग कॉइल को साफ करें और कलेक्टर से संचित तरल निकालें।
    नोट: फाइबर संग्रह तुरंत शुरू हो सकता है। जब फाइबर अलगाव के लिए ऊतक का उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो फ्रीज-सूखे नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर एक सील कंटेनर में डेसिकेटर मोतियों के साथ रखें।  चेतावनी: सूखी बर्फ खतरनाक है (कक्षा 9); अनुशंसित सुरक्षित हैंडलिंग के लिए MSDS देखें।

2. फाइबर संग्रह

  1. फाइबर संग्रह की तैयारी
    1. प्रत्येक ट्यूब को कम से कम 50 माइक्रोफ्यूज ट्यूब (फाइबर 1 से 50) और पिपेट 10 μL डिनेचरिंग बफर लेबल करें।
    2. संग्रह क्षेत्र को दो जोड़े बारीक ऊतक विच्छेदन बल, लिंट-मुक्त ऊतक, एक बेंचटॉप लैंप, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (काले चरण के साथ), एक भंवर और एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज के साथ तैयार करें।
    3. फ्रीज-सूखे मांसपेशियों के नमूने को पेट्री डिश ढक्कन पर रखें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर ढक्कन रखें।
    4. एकल-फाइबर विच्छेदन का वीडियो देखें। एक अध्ययन शुरू करने से पहले फाइबर संग्रह से एकल-फाइबर प्रकार की पहचान तक पूर्ण प्रोटोकॉल का कम से कम दो बार अभ्यास करें।
    5. फाइबर संग्रह से पहले, प्रत्येक बायोप्सी से फाइबर प्रकार के नमूने के लिए आवश्यक कुल मात्रा की गणना निम्नानुसार करें। उदाहरण के लिए, यदि 1 फाइबर की प्रारंभिक मात्रा = 10 μL और MyDoBID के बाद शेष मात्रा (1 फाइबर × 10 μL) - 1 μL डॉट ब्लॉटिंग के लिए उपयोग की जाने वाली = 9 μL (नमूना मात्रा) है, तो नमूना मात्रा (μL) को चलाए जाने वाले पश्चिमी धब्बों की कुल संख्या से गुणा करके आवश्यक कुल नमूना मात्रा की गणना करें और अतिरेक के लिए इस राशि को दोगुना करें: (9 μL × 4 पश्चिमी धब्बे) × 2 = 72 μL. प्रति फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने (जैसे, 72 μL ÷ 9 μL = 8 फाइबर प्रति फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूना) द्वारा आवश्यक अंतिम नमूना मात्रा (μL) को विभाजित करके प्रति टाइप किए गए नमूने की संख्या की गणना करें। इसे प्राप्त करने के लिए, कुल 50 फाइबर एकत्र करें।
      नोट: आवश्यक नमूना मात्रा MyDoBID और पश्चिमी सोख्ता दोनों को चलाने के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रोटीन एकाग्रता है यदि लोड किए गए प्रोटीन की मात्रा प्रत्येक नमूने के लिए ~ 3 मिमी फाइबर (~ 12 μg गीले वजन) के बराबर है (विवरण के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। हालांकि, यह मात्रा इस बात पर कारक नहीं है कि किसी दिए गए प्रोटीन के लिए दोहराए जाने वाले जैल की आवश्यकता है या नहीं।  चेतावनी: बल तेज हैं; त्वचा पंचर के जोखिम से बचने के लिए उन्हें देखभाल के साथ संभालें।
  2. एकल-फाइबर अलगाव
    1. कागज के एक छोटे से टुकड़े पर 5 सेमी x 1 सेमी, 1 सेमी रेखा खींचने के लिए एक शासक का उपयोग करें। उस लाइन पर हर 1 मिमी चिह्नित करें।
    2. एकत्र किए गए फाइबर की लंबाई का अनुमान लगाने के लिए एक गाइड के रूप में पेट्री डिश ढक्कन के नीचे इसे डालें।
    3. फ्रीज-सूखे मांसपेशियों के नमूने को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे कम आवर्धन (एक्स 7.5) पर रखें। फ्रीज-सूखे मांसपेशियों को पकड़ने के लिए ठीक ऊतक विच्छेदन बल की एक जोड़ी का उपयोग करें और दूसरे के साथ फाइबर के छोटे बंडलों को अलग करना शुरू करें (जैसा कि वीडियो में देखा गया है)।
    4. फाइबर के एक बंडल को अलग करें और तब तक अलग करना जारी रखें जब तक कि एकल फाइबर सेगमेंट बंडल से अलग न हो जाएं।
    5. कम से कम 50 फाइबर इकट्ठा करें जो लंबाई में कम से कम ~ 1 मिमी हैं।
    6. फाइबर को पेट्री डिश पर एक खाली जगह पर ले जाएं। उच्च आवर्धन (x 50) के तहत एकल-फाइबर खंडों का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि यह अंत में फाइबर को अलग करके एक एकल फाइबर है। यदि फाइबर अलग होने के बजाय टूट जाता है, तो यह एक एकल फाइबर है।
  3. तंतुओं का विकृतीकरण
    1. बल का उपयोग करके, धीरे से फाइबर इकट्ठा करें और इसे सीधे एलिकोट डिनेचरिंग बफर में रखें (बल को बफर का सामना न करने दें)।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे बल की जांच करें कि फाइबर को सफलतापूर्वक हटा दिया गया है। ट्यूब को बंद करें और ट्यूब के निचले हिस्से को बेंच पर तीन बार मजबूती से टैप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फाइबर बफर में चला जाता है।
    3. अगले फाइबर पर जाने से पहले लिंट-मुक्त ऊतक का उपयोग करके फोर्सप्स को साफ करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी फाइबर एकत्र न हो जाएं।
    4. फाइबर के नमूने को भंवर करें और ट्यूब के तल पर नमूना खींचने के लिए 2,500 × ग्राम पर 5 सेकंड के लिए संक्षिप्त रूप से सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन अवधि (5 एस) शुरू (0 × ग्राम) से समय है जब तक कि गति ~ 2,500 × ग्राम तक नहीं पहुंच जाती है।
    5. नमूने को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज करें और फिर उपयोग करने से पहले नमूने को पिघलाएं।

3. डॉट ब्लोटिंग

  1. झिल्ली की तैयारी और सक्रियण
    1. 50 नमूने (~ 10.5 सेमी x 5.5 सेमी) फिट करने के लिए एक पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (0.2 μm छिद्र आकार) को मापने, लेबल करने और आकार में काटें।
    2. बाईं सीमा को संख्यात्मक रूप से ऊपर से नीचे (1 से 10) तक चिह्नित करें और शीर्ष सीमा को बाएं से दाएं (ए से ई) वर्णानुक्रम में 1 सेमी अलग रखें।
    3. 12.5 सेमी x 7.5 सेमी के आयाम के साथ फिल्टर पेपर की चार शीट तैयार करें।
    4. एक ढेर बनाने के लिए दो चादरों को एक साथ ढेर करें। फ़िल्टर पेपर स्टैक को 1x ट्रांसफर बफर में प्रीसोख दें।
    5. झिल्ली को एक कंटेनर में रखें। झिल्ली पर 95% इथेनॉल डालें, जिसमें झिल्ली को पूरी तरह से डुबोने के लिए पर्याप्त मात्रा (10-15 एमएल) हो। 1 मिनट के लिए रॉकर पर आंदोलन करें।
    6. इथेनॉल को याद करें, झिल्ली को 1x स्थानांतरण बफर (~ 15 एमएल) में डुबोएं, और आगे 2 मिनट के लिए चट्टान दें।
      नोट: इथेनॉल और ट्रांसफर बफर दोनों को भविष्य के डॉट ब्लॉटिंग प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है जब तक कि अवसादन रूप (छह उपयोगों के बाद परिवर्तन)।
    7. ट्रांसफर बफर-भिगोए हुए फिल्टर पेपर स्टैक को एक फ्लैट मूवेबल सतह जैसे कि एक बड़े ढक्कन पर रखें और रोलर के साथ चपटा करें। जेल रिलीजर या चिमटी का उपयोग करके स्टैक पर पीवीडीएफ झिल्ली रखें।
    8. झिल्ली के शीर्ष पर सूखे फिल्टर पेपर की एक शीट रखें और झिल्ली की सतह पर किसी भी अतिरिक्त बफर को भिगोने के लिए रोलर को फिल्टर पेपर पर ले जाएं। झिल्ली को रगड़े बिना शीर्ष फिल्टर पेपर को हटा दें।
      चेतावनी: मेथनॉल (कक्षा 3, उप-जोखिम 6.1) और इथेनॉल (कक्षा 3) खतरनाक हैं। सुरक्षित हैंडलिंग अनुशंसाओं के लिए सामग्री सुरक्षा डेटापत्रक (MSDS) देखें।
  2. झिल्ली के लिए नमूना अवशोषण।
    1. फाइबर के नमूनों को पिघलाएं, चरण 2.3.4 में कमरे के तापमान पर एक संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूज (5 एस) करें और नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. पिपेट टिप के साथ झिल्ली को छूने के बिना, धीरे-धीरे निर्दिष्ट क्षेत्र में झिल्ली पर प्रत्येक नमूने की ~ 1 μL बूंद जमा करें। प्रति फाइबर नमूने के निर्दिष्ट क्षेत्र के आयाम ~ 1 सेमी x 1 सेमी हैं। इस क्षेत्र के केंद्र में नमूने को देखने का लक्ष्य रखें।
    3. नमूना बूंदों को कम से कम 15 मिनट के लिए झिल्ली के माध्यम से भिगोने दें। सुनिश्चित करें कि कोई नमूना बफर नहीं रहता है और पूरी तरह से अवशोषित होता है।
    4. प्लास्टिक ट्वीज़र्स का उपयोग करके, नम फिल्टर पेपर स्टैक से झिल्ली को सावधानीपूर्वक उठाएं, इसे फ़िल्टर पेपर की एक सूखी शीट पर रखें, और कम से कम 5 मिनट के लिए झिल्ली को निर्जलित करें।
    5. एक बार जब नमूना धब्बे पूरी तरह से सफेद हो जाते हैं, तो झिल्ली को फिर से सक्रिय करें।
  3. झिल्ली पुनर्सक्रियन और ब्लॉक
    1. चरण 3.1.5 और 3.1.6 को दोहराकर झिल्ली को पुन: सक्रिय करें।
    2. झिल्ली को वॉश बफर में रखें और रॉकिंग के साथ 5 मिनट के लिए कुल्ला करें। वॉश बफर को छोड़ दें।
    3. रॉकिंग करते समय 30 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    4. झिल्ली को वॉश बफर के साथ 3 x कुल्ला करें जब तक कि बफर अब बादल न हो।
    5. रॉकर पर अंतिम धोने में झिल्ली छोड़ दें।

4. इम्यूनोलेबलिंग

  1. एमएचसीआईआईए का पता लगाना
    1. बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) बफर के 10 एमएल में 200 में से 1 पर एमएचसीआईआईए प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
    2. झिल्ली से वॉश बफर को छोड़ दें और फिर झिल्ली पर पतला एमएचसीआईआईए एंटीबॉडी डालें।
    3. कंटेनर (एमएचसीआईआईए में झिल्ली के साथ) को रॉकर पर 2 घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर रखें।
    4. एमएचसीआईआईए एंटीबॉडी को याद करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। रॉकर पर 2 मिनट के लिए ब्लॉकिंग बफर के साथ झिल्ली को धो लें।
      नोट: जब तक बफर स्पष्ट रहता है, तब तक सभी प्राथमिक एंटीबॉडी का पांच बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    5. दो बार और कुल्ला करें; हर बार 5 मिनट; कुल मिलाकर तीन धोने।
    6. पतला माउस इम्युनोग्लोबुलिन जी हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (आईजीजी-एचआरपी) द्वितीयक एंटीबॉडी 20,000 में से 1 पर 10 एमएल ब्लॉकिंग बफर में और झिल्ली में जोड़ता है।
    7. वॉश बफर को छोड़ दें और 1 घंटे के लिए रॉकिंग के साथ माउस आईजीजी-एचआरपी सेकेंडरी में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    8. द्वितीयक को छोड़ दें और झिल्ली को वॉश बफर (2, 5, 5 मिनट) में धो लें।
    9. इमेजिंग के लिए तैयार होने तक झिल्ली को अंतिम धोने में भिगोने दें।
    10. जेल इमेजर चालू करें, इमेजर को आवश्यक ऑपरेटिंग तापमान तक पहुंचने के लिए 15 मिनट प्रतीक्षा करें, और फिर इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    11. सॉफ़्टवेयर विंडो में, नया एकल चैनल प्रोटोकॉल (चित्रा 3A) क्लिक करें। झिल्ली की एक सफेद प्रकाश छवि के लिए, अनुप्रयोगों के तहत | धब्बे | क्लिक करें कलरिमेट्रिक (चित्रा 3 बी)।
    12. जेल क्षेत्र पर क्लिक करें; प्रत्येक विकल्प को विभिन्न जेल प्रकारों के आकार को फिट करने के लिए विशिष्ट आयामों के लिए प्रोग्राम किया गया है। झिल्ली के आयामों को सर्वोत्तम रूप से फिट करने के लिए उपयुक्त विकल्प का चयन करें (चित्रा 3 सी)।
    13. 1: 1 अनुपात में ल्यूमिनोल और पेरोक्सीडेज अभिकर्मकों के संयोजन से ईसीएल तैयार करें। पूरे झिल्ली को कवर करने के लिए ईसीएल मिश्रण की पर्याप्त मात्रा बनाएं, आमतौर पर 800-1,000 μL की कुल मात्रा की आवश्यकता होती है।
    14. झिल्ली को एक बड़ी स्पष्ट प्लास्टिक ट्रे पर रखें और ईसीएल मिश्रण को झिल्ली पर फैलाएं।
    15. झिल्ली को इमेजिंग प्लेट पर रखें।
    16. लाइव कैमरा दृश्य के लिए स्थिति जेल (पीला बटन) पर क्लिक करें। झिल्ली के इमेजिंग क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए ज़ूम बटन को दबाए रखें और खींचें पर क्लिक करें। इस बिंदु पर, यदि आवश्यक हो तो झिल्ली की स्थिति को सीधा करें।
    17. प्रोटोकॉल चलाएँ (हरा बटन) क्लिक करें और झिल्ली की रंगीन छवि उत्पन्न होने की प्रतीक्षा करें. डॉट्स को संबंधित फाइबर नमूने से मिलान करने में सहायता के लिए इस छवि को सहेजें।
    18. झिल्ली को हिलाए बिना, 2 x 2 बिनिंग (केमी हाई रिज़ॉल्यूशन) (चित्रा 3 डी) के विकल्प पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर पर एप्लिकेशन बदलें।
    19. छवि एक्सपोज़र और सॉफ़्टवेयर के तहत, एक्सपोज़र समय को अनुकूलित करें, बेहोश बैंड (चित्रा 3 ई) पर क्लिक करें | सिग्नल संचय मोड।
    20. सेटअप के तहत, पहली छवि के लिए 1 एस, अंतिम छवि के लिए 30 एस और 30 कुल छवियां (चित्रा 3 एफ) टाइप करें।
    21. प्रोटोकॉल चलाएँ क्लिक करें.
    22. निम्नलिखित चरणों में एक छवि सहेजें: सिग्नल संतृप्ति से पहले (सभी दृश्यमान बिंदु काले होते हैं), प्रारंभिक सिग्नल संतृप्ति (कुछ बिंदु संतृप्त होने लगते हैं), और ओवरसैचुरेटेड स्पॉट (मजबूत सिग्नल वाले सभी धब्बे संतृप्त होते हैं)।
    23. सिग्नल संचय समाप्त करने से पहले सभी आवश्यक छवियों को सहेजें। इमेजर से झिल्ली को बाहर निकालें।
    24. जेल रिलीजर का उपयोग करके, झिल्ली को वॉश बफर के साथ कंटेनर में वापस रखें।
  2. एमएचसीआई का पता लगाना
    1. वॉश बफर को बाहर डालें और झिल्ली को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए स्ट्रिपिंग बफर के साथ इलाज करें (सुनिश्चित करें कि झिल्ली पूरी तरह से डूब गई है)।
    2. स्ट्रिपिंग बफर को याद करें और झिल्ली को रॉकिंग के साथ 5 मिनट के लिए वॉश बफर में कुल्ला करें।
      नोट: स्ट्रिपिंग बफर को छोड़ने से पहले 10x पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    3. वॉश बफर डालें और इस बार 200 में 1 की शुरुआती एकाग्रता पर एमएचसीआई प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें (सीमा: 200 में 1 से 500 में 1)। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर झिल्ली को हिलाएं।
    4. एमएचसीआई प्राथमिक एंटीबॉडी में इंजेक्शन लगाने के बाद, एंटीबॉडी को याद करें और चरण 4.1.4 और 4.1.5 के रूप में झिल्ली को धो लें।
    5. 20,000 में से 1 पर बफर को अवरुद्ध करने में माउस आईजीएम एचआरपी द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें। झिल्ली से ब्लॉकिंग बफर डालें और चरण 4.1.7 के रूप में माउस आईजीएम सेकेंडरी में इनक्यूबेट करें।
    6. वॉश और इमेज कैप्चर ने चरण 4.1.8 से 4.1.24 के अनुसार एमएचसीआई का पता लगाया।
      सावधानी: स्ट्रिपिंग बफर में ऑर्गनो फॉस्फीन 3-5% (कक्षा 8) होता है। सुरक्षित हैंडलिंग सिफारिशों के लिए MSDS देखें।
  3. एक्टिन का उपयोग करके संभावित एमएचसीआईएक्स का पता लगाना
    1. झिल्ली को एक बार फिर से पट्टी करें (चरण 4.2.1 और 4.2.2)।
    2. धारा 4.1 को दोहराएं, इस बार बीएसए बफर में 500 में से 1 पर एक्टिन प्राथमिक एंटीबॉडी को लागू करें और फिर बफर को अवरुद्ध करने में 20,000 में से 1 पर खरगोश एचआरपी द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें।

5. फाइबर प्रकार की पहचान

  1. एमएचसीआई, एमएचसीआईआईए, और एक्टिन सिग्नल विश्लेषण।
    1. सिग्नल तीव्रता पैनल (चित्रा 4 ए) से परिचित हो जाओ। चरण 5.1.2 से 5.1.4 का एक नोट बनाएं।
    2. एक संतृप्त संकेत तीव्रता गुणात्मक रूप से इंगित करती है कि प्रोटीन का पता लगाना मजबूत है।
    3. एक मध्यम इंगित करता है कि लक्ष्य प्रोटीन मध्यम स्तर पर मौजूद है।
    4. एक बेहोश संकेत इंगित करता है कि थोड़ा लक्ष्य प्रोटीन मौजूद है।
    5. फाइबर को 'संतृप्त', 'मध्यम', या 'बेहोश' सिग्नल तीव्रता (चित्रा 4 ए) के साथ वर्गीकृत करने के लिए सिग्नल तीव्रता पैनल का उपयोग करें।
    6. पहले एमएचसीआईए और एमएचसीआई परिणामों की तुलना करके फाइबर प्रकार की पहचान करें (चित्रा 4 बी, बाएं और मध्य धब्बे)।
    7. केवल एक एमएचसी आइसोफॉर्म की संतृप्त या मध्यम सिग्नल तीव्रता के साथ फाइबर रिकॉर्ड करें।
    8. यदि एमएचसी आइसोफॉर्म सिग्नल 'बेहोश' है, तो फाइबर को अचिह्नित छोड़ दें ( चित्रा 4 बी देखें)।
    9. अंत में, जहां एक्टिन को उन तंतुओं में देखा जाता है (मध्यम या संतृप्त सिग्नल तीव्रता) जिसमें कोई एमएचसीआई या आईआईए का पता नहीं चला है, इसे संभावित प्रकार आईआईएक्स फाइबर (चित्रा 4 बी, दाएं धब्बा) के रूप में रिकॉर्ड करें।
    10. बेहोश एमएचसी आइसोफॉर्म सिग्नल के साथ फाइबर रिकॉर्ड करें लेकिन एक्टिन ने अज्ञात के रूप में (मध्यम या संतृप्त तीव्रता) का पता लगाया।
    11. सभी तीन लक्ष्य प्रोटीन (चित्रा 4 सी) के लिए बेहोश या बिना पहचान (कोई फाइबर एकत्र नहीं) वाले नमूने छोड़ दें।
    12. किसी भी फाइबर को रिकॉर्ड करें जहां एमएचसीआई और एमएचसीआईआई दोनों संकेतों को 'संतृप्त' या मध्यम संकेत के साथ पाया जाता है। ये नमूने फाइबर प्रकार-विशिष्ट तैयारी में उपयोग के लिए नहीं हैं।
  2. फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने की तैयारी
    1. प्रत्येक बायोप्सी के लिए एक अलग प्रकार I और प्रकार II नमूना तैयार करें। टाइप II नमूने के लिए, फाइबर की न्यूनतम आवश्यक संख्या (चरण 2.1.5 में गणना) को मिलाएं जिसमें एमएचसीआईआईए संतृप्त या मध्यम स्तर पर पाया जाता है।
    2. टाइप 1 के रूप में लेबल किए गए एक अलग ट्यूब में, फाइबर के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं जिसमें एमएचसीआई का पता लगाया जाता है (चित्रा 4 डी)।
    3. यदि संतृप्त संकेतों के साथ पर्याप्त फाइबर नहीं हैं तो मध्यम सिग्नल तीव्रता वाले फाइबर का उपयोग करें।
    4. किसी भी संभावित आईआईएक्स फाइबर को मिलाएं।
    5. पश्चिमी सोख्ता के लिए तुरंत फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने का उपयोग करें या उन्हें भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. पश्चिमी धब्बा फाइबर प्रकार की पुष्टि

  1. प्रत्येक फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने के 10 μL का उपयोग करें, (आवश्यक न्यूनतम नमूना मात्रा, चरण 2.1.5 देखें)।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एसडीएस-पेज के माध्यम से निर्दिष्ट प्रीकास्ट जेल का उपयोग करके नमूने अलग करें।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल में प्रोटीन का पता लगाने के लिए जेल इमेजर का उपयोग करें।
  4. जेल को 10 मिनट के लिए ठंडे 1x ट्रांसफर बफर में रखें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन को 0.45 μm नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (9.5 सेमी x 13.5 सेमी) पर स्थानांतरित करें।
  6. स्थानांतरण के बाद, एक कंटेनर में अल्ट्राप्योर एच2ओ के साथ झिल्ली को संक्षेप में कुल्ला करें। अत्यधिक शुद्ध पानी डालें।
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर झिल्ली और चट्टान में एंटीबॉडी सिग्नल बढ़ाने वाले घोल के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. एंटीबॉडी सिग्नल एन्हांसर समाधान को याद करें और अल्ट्राप्योर एच2ओ के साथ 5x (5 एस प्रति वॉश) धोएं।
    नोट: एंटीबॉडी सिग्नल एन्हांसर समाधान को छोड़ने से पहले 5x का उपयोग किया जा सकता है।
  9. अंतिम धोने के लिए डालें, ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रॉक करें।
  10. आणविक भार पर झिल्ली में क्षैतिज रूप से काटने के लिए एक साफ स्केलपेल ब्लेड या कैंची का उपयोग करें जो यह सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन जो 180 केडीए और उससे अधिक हैं, झिल्ली के शीर्ष खंड पर हैं।
  11. आगे फाइबर प्रकार की पुष्टि के लिए इस शीर्ष अनुभाग का उपयोग करें।
  12. विभिन्न लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए 180 केडीए से नीचे के हिस्से का उपयोग करें।
  13. झिल्ली के शीर्ष खंड पर, एमएचसीआईआईएक्स प्राथमिक और माउस इम्युनोग्लोबुलिन एम (आईजीएम) एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अनुभाग 4.1 का पालन करें।
  14. एमएचसीआईआईए आईजीजी प्राइमरी और माउस आईजीजी एचआरपी सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ प्रक्रिया को दोहराने से पहले झिल्ली (जैसा कि अनुभाग 4.2.1 और 4.2.2 में वर्णित है) को स्ट्रिप करें।
  15. एक बार फिर स्ट्रिप करें और अंत में एमएचसीआई आईजीएम प्राइमरी और माउस आईजीएम एचआरपी सेकेंडरी एंटीबॉडी लागू करें।
    नोट: यह कदम गुणात्मक है और इसलिए झिल्ली स्ट्रिपिंग के कारण किसी भी प्रोटीन की हानि चिंता का विषय नहीं है।
  16. विभिन्न एमएचसी आइसोफॉर्म में पाए गए सिग्नल की तुलना करें (जैसा कि चित्रा 5 बी में देखा गया है)। जब अपेक्षित नमूने (एमएचसीआई - टाइप 1, एमएचसीआईआईए - टाइप II और एमएचसीआईआईएक्स - टाइप आईआईएक्स) में मध्यम से संतृप्त स्तर पर सिग्नल तीव्रता का पता लगाया जाता है, तो फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने भविष्य के अध्ययनों में उपयोग के लिए विश्वसनीय के रूप में दर्ज किए जाएंगे।
  17. नमूने को अविश्वसनीय के रूप में रिकॉर्ड करें जब एक नमूने में एक से अधिक एमएचसी आइसोफॉर्म समान रूप से पाए जाते हैं।
    सावधानी: एंटीबॉडी बढ़ाने वाले समाधान में सोडियम हाइड्रॉक्साइड 50% होता है। सुरक्षित हैंडलिंग सिफारिशों के लिए MSDS देखें।

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Representative Results

डॉट ब्लॉटिंग का उपयोग करके व्यक्तिगत एमएचसीआई, एमएचसीआईआईए और एमएचसीआईआईएक्स मांसपेशी फाइबर की पहचान
MyDoBID की एक विशेषता किसी दिए गए फाइबर में अलग-अलग एमएचसी और एक्टिन सिग्नल तीव्रता शक्ति का वर्गीकरण है (चित्रा 4 ए)। फाइबर प्रकार की पहचान एमएचसीआई और आईआईए आइसोफॉर्म (चित्रा 4 बी) की उपस्थिति या अनुपस्थिति से की गई थी। छह तंतुओं ने कोई एमएचसी या एक्टिन का पता नहीं लगाया, यह दर्शाता है कि कोई फाइबर एकत्र नहीं किया गया था। इस विशिष्ट डॉट ब्लॉट के परिणाम 22 प्रकार II फाइबर, 7 प्रकार I फाइबर और 3 संभावित प्रकार IIx फाइबर की पहचान थे; 2 अज्ञात नमूने और 6 नमूने एकत्र किए गए 'नो फाइबर' के रूप में वर्गीकृत किए गए थे (चित्रा 4 बी, सी)। जिन तंतुओं में कोई पता लगाने योग्य एमएचसीआई या एमएचसीआईए सिग्नल नहीं था, फिर भी एक्टिन के लिए सकारात्मक थे, उन्हें उन्मूलन की प्रक्रिया द्वारा संभावित प्रकार आईआईएक्स फाइबर के रूप में पहचाना गया था। एमएचसीआई और आईआईए सिग्नल ताकत को वर्गीकृत करने के लिए सिग्नल तीव्रता पैनल का उपयोग करते हुए, 'मध्यम' या 'संतृप्त' फाइबर को क्रमशः टाइप 1 या 2 नमूने बनाने के लिए जोड़ा गया था। फाइबर जो अज्ञात थे या बेहोश थे या कोई एक्टिन नहीं पाया गया था, उन्हें बाद के विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था और उन्हें छोड़ दिया गया था (चित्रा 4 डी)।

पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर फाइबर टाइपिंग की पुष्टि।
फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने पश्चिमी सोख्ता और एमएचसी-विशिष्ट एंटीबॉडी (चित्रा 5) का उपयोग करके मान्य किए गए थे। एक व्यक्तिगत बायोप्सी से टाइप I और टाइप II फाइबर नमूने एक प्रकार IIx नमूने के साथ चलाए गए थे, जो प्रत्येक बायोप्सी में मौजूद प्रकार IIx फाइबर की कम संख्या के कारण दो व्यक्तियों से संभावित प्रकार IIx फाइबर का एक नमूना था। पश्चिमी धब्बा डेटा ने पुष्टि की कि फाइबर प्रकार की पहचान सफल रही।

Figure 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो सारांश नमूना तैयारी, फाइबर टाइपिंग और फाइबर विशिष्टता की पश्चिमी धब्बा पुष्टि को रेखांकित करता है। (ए) मानव ऊतक को 48 घंटे के लिए फ्रीज-सुखाया जाता है (बी, सी) एकल फाइबर खंडों को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत अलग किया जाता है। (डी) फाइबर को विकृत किया जाता है और (ई) 1 घंटे के बाद, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है इनक्यूबेशन। (जी) फाइबर को एमएचसीआईए (टाइप II), एमएचसीआई (टाइप I), और एक्टिन (आईआईएक्स?, संभावित प्रकार IIx फाइबर) का उपयोग करके पहचाना गया था। (एच) फाइबर को तब पूल किया गया था। (i) अंशांकन वक्र के साथ फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूनों का विश्लेषण एसडीएस पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग के माध्यम से किया जाता है। (जे) पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके फाइबर प्रकार की पहचान का सत्यापन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फ्रीज-सुखाने प्रणाली की डिस्प्ले स्क्रीन और नियंत्रण कक्ष। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: झिल्ली के सफेद प्रकाश कैप्चर के लिए इमेजर सेटिंग्स और उसके बाद लक्ष्य प्रोटीन का केमिलुमिनेसेंट पता लगाना। सफेद प्रकाश के तहत झिल्ली की छवि बनाने के लिए, (ए) नए एकल चैनल का चयन करें और उसके बाद (बी) ब्लोट्स | वर्णमिति अनुप्रयोग। (सी) उपयोग किए गए जेल के आकार के आधार पर, उपयुक्त इमेजिंग क्षेत्र का चयन करें, और फिर रन प्रोटोकॉल दबाकर एक सफेद प्रकाश छवि लें। (डी) झिल्ली को हिलाए बिना, चरण बी को दोहराएं लेकिन इस बार, ब्लोट्स चुनें केमी हाय संकल्प. रन दबाने से पहले, बेहोश बैंड के लिए अनुकूलित करने के लिए (ई) इमेज एक्सपोज़र चुनें और (एफ) सिग्नल संचय मोड सेट करें और पहले उदाहरण में, हाइलाइट संतृप्त पिक्सेल टिक के साथ कुल 30 सेकंड के लिए हर सेकंड के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें। रन प्रोटोकॉल दबाएँ और सहेजने के लिए सर्वोत्तम छवियों का चयन करने से पहले रन को पूरा करने की अनुमति दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फाइबर प्रकार की पहचान। (ए) झिल्ली पर अन्य सभी तंतुओं के सापेक्ष फाइबर प्रकारों की पहचान की गई थी, जिन्हें प्रत्येक एमएचसी आइसोफॉर्म के लिए सिग्नल तीव्रता पैनल द्वारा वर्गीकृत किया गया था (जैसे, एमएचसीआई सिग्नल: संतृप्त, मध्यम और बेहोश)। (बी) (ए) में पैनल का उपयोग करते हुए, एमएचसीआईआईए एंटीबॉडी ने टाइप II फाइबर (नीला, बाएं धब्बा) की पहचान की, और झिल्ली को अलग करने के बाद, एमएचसीआई एंटीबॉडी ने टाइप 1 फाइबर (लाल, मध्य धब्बा) की पहचान की। एक्टिन एंटीबॉडी का उपयोग संभावित आईआईएक्स फाइबर की पहचान करने के लिए किया गया था यदि फाइबर में एक सकारात्मक एक्टिन सिग्नल का पता चला था जहां पिछले एमएचसीआई या आईआईए सिग्नल का पता नहीं चला था (हरा, दाहिना धब्बा)। इन दिशानिर्देशों का पालन नहीं करने वाले फाइबर को बैंगनी (अज्ञात) में हाइलाइट किया गया है। अंत में, एक्टिन सिग्नल के लिए नकारात्मक नमूने ने संकेत दिया कि कोई फाइबर एकत्र नहीं किया गया था ('नो फाइबर')। (सी) (बी) में दिखाए गए डॉट ब्लॉट्स पर नमूना स्थिति के अनुरूप फाइबर लेबलिंग दिखाने वाली तालिका। (डी) फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने तैयार करने के लिए फाइबर चयन की रूपरेखा। उद्देश्य प्रत्येक फाइबर प्रकार के लिए 10 संतृप्त फाइबर एकत्र करना था। यहां, टाइप II फाइबर के लिए, आठ संतृप्त फाइबर की पहचान की गई और पूल किया गया। टाइप 1 फाइबर के लिए, 10 से कम संतृप्त फाइबर मौजूद थे, इसलिए मध्यम सिग्नल ताकत वाले फाइबर का भी चयन किया गया था। टाइप आईआईएक्स फाइबर के लिए, दो फाइबर की पहचान की गई और पूल किया गया। यदि 10 से कम फाइबर (संतृप्त और मध्यम) की पहचान की जाती है, तो आगे फाइबर संग्रह आवश्यक हो सकता है।  नोट: (बी) में दिखाया गया एक्टिन सिग्नल संतृप्ति तक नहीं पहुंचा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फाइबर प्रकार की पहचान की पश्चिमी धब्बा पुष्टि। टाइप I (~ 10 फाइबर) और टाइप II (~ 10 फाइबर) नमूने उत्पन्न करने के लिए चित्रा 4 के अनुसार फाइबर प्रकार की पहचान की गई थी। चूंकि एक ही बायोप्सी से पहचाने गए कोई आईआईएक्स फाइबर नहीं थे, इसलिए यहां दिखाए गए आईआईएक्स नमूने को एक से अधिक मांसपेशियों के नमूने (एन = 2 व्यक्तियों) से उत्पादित किया गया था। फाइबर प्रकार की पहचान की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रत्येक फाइबर-विशिष्ट नमूने के एक छोटे एलिकोट का विश्लेषण किया जाता है। आणविक भार मार्कर (केडीए) बाईं ओर इंगित किए जाते हैं, झिल्ली को हिलाए बिना सफेद प्रकाश के तहत कैप्चर किए जाते हैं। लक्ष्य प्रोटीन का पता एमएचसीआईआईएक्स, एमएचसीआईआईए और एमएचसीआई के अनुक्रम में लगाया जाता है, जिसमें यूवी-सक्रिय जेल से मायोसिन प्रति नमूना लोड किए गए प्रोटीन की मात्रा को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सामान्य प्रोटोकॉल समस्याओं के लिए समस्या निवारण रणनीतियाँ। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: अंशांकन वक्र का उपयोग करके फ्रीज-सूखे फाइबर द्रव्यमान की गणना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फाइबर संग्रह
कई वर्षों के अनुभव के आधार पर, अधिकांश शोधकर्ता इस तकनीक में महारत हासिल कर सकते हैं; हालांकि, अभ्यास डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए तेजी से और अधिक कुशल फाइबर संग्रह की ओर जाता है। पूलिंग के लिए गुणवत्ता के 30 एकल फाइबर खंडों को अलग करने में सक्षम होने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रति नमूना 50 फाइबर सेगमेंट एकत्र किए जाएं। फाइबर संग्रह वीडियो का सावधानीपूर्वक अध्ययन करना और दो अभ्यास सत्र (~ 50 फाइबर प्रति सत्र) करने के बाद एक उचित मानक प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। एकत्र किए गए सभी फाइबर फाइबर प्रकार की पहचान करने के लिए MyDoBID से गुजरते हैं, जिससे पता चलेगा कि तकनीक कितनी प्रभावी ढंग से प्रदर्शन की जा रही है। इसे फाइबर नमूनों में पाए गए 'नो फाइबर' या 'बेहोश' एमएचसी सिग्नल की कम संख्या के रूप में देखा जाएगा (प्रोटोकॉल अनुभाग 5.1 देखें)।

यह ज्ञात है कि मांसपेशियों में हाइब्रिड फाइबर हो सकते हैं, जहां एमएचसीआई और एमएचसीआईआईए दोनों मौजूद हैं, या एमएचसीआईआईए और आईआईएक्स 2,14। MyDoBID की एक सीमा यह है कि एक हाइब्रिड फाइबर की उपस्थिति का पता नहीं लगाया जा सकता है क्योंकि एमएचसीआई और एमएचसीआईआईए एंटीबॉडी दोनों के लिए एक नमूना सकारात्मक या तो एक हाइब्रिड फाइबर हो सकता है या दो फाइबर एकत्र किए गए थे। इसके अलावा, MyDoBID MHCIIA / IIx संकरों से अलग से MHCIIA का पता नहीं लगा सकता है क्योंकि MHCIIA प्राथमिक एंटीबॉडी IIA और IIA / IIx फाइबर दोनों में MHCIIA की उपस्थिति का पता लगाएगा। इन कारणों से, हाइब्रिड फाइबर के नमूनों की पहचान और तैयारी नहीं की गई थी, और जिन नमूनों में एमएचसीआई और एमएचसीआईए सिग्नल दोनों हैं जो सिग्नल तीव्रता पैनल में वर्णित सीमाओं के बाहर गिर गए थे, उन्हें छोड़ दिया गया था (चित्रा 4 ए)। एक और सीमा यह है कि एक नमूने में मांसपेशी फाइबर प्रकारों का अनुपात MyDoBID का उपयोग करके निर्धारित नहीं किया जा सकता है, और फाइबर प्रकार वितरण2 निर्धारित करने के लिए पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण लागू करना आवश्यक है।

डॉट ब्लॉटिंग
सिग्नल तीव्रता पैनल और फाइबर प्रकार आईडी पूरे नमूने पर निर्भर करते हैं जो डॉट ब्लोटिंग झिल्ली पर लागू छोटी मात्रा में दर्शाया जाता है। इसे पूरा करने के लिए, नमूना झिल्ली पर लोड करने से पहले आंदोलन द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित किया जाता है। केवल एक एमएचसी आइसोफॉर्म वाले सभी फाइबर पूलिंग के अगले चरण में चले जाते हैं। इस स्तर पर, यह महत्वपूर्ण है कि एक से अधिक एमएचसी वाले किसी भी फाइबर को नमूनों के संयोजन के इस अगले चरण में आगे नहीं बढ़ना चाहिए। यदि कोई नमूना दूषित है, तो पूरे पूल किए गए नमूने को त्यागने की आवश्यकता है और शोधकर्ता को फाइबर संग्रह पर वापस जाना चाहिए और फाइबर अलगाव और डॉट ब्लॉटिंग चरणों को दोहराना चाहिए।

इम्यूनोलेबलिंग
पहले यह बताया गया था कि एमएचसीआई और एमएचसीआईए9 का पता लगाने के लिए झिल्ली पर गैर-विशिष्ट साइटों को अवरुद्ध करने के लिए 5 मिनट पर्याप्त समय है। माईडोबिड में तकनीक को आगे बढ़ाने के लिए एक एक्टिन एंटीबॉडी का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। यह पाया गया कि न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ एक झिल्ली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट ब्लॉक समय को 30 मिनट तक बढ़ाने की आवश्यकता थी, जैसा कि6 बताया गया है, क्योंकि 5 मिनट के अवरोध के परिणामस्वरूप एक गहरी झिल्ली पृष्ठभूमि होती है। किसी भी इम्यूनोडिटेक्शन तकनीक में ब्लॉकिंग टाइम पर विचार किया जाता है, जैसे कि वेस्टर्न ब्लॉटिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, और इसे उपयुक्त रूप से संशोधित किया जाना चाहिए।

झिल्ली को अलग करना
स्ट्रिपिंग का उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण15 के लिए नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह रुचि के प्रोटीन को भी हटा देता है लेकिन इसका उपयोग MyDoBID में किया जा सकता है क्योंकि यह एक गुणात्मक परख है। स्ट्रिपिंग का उद्देश्य झिल्ली की सतह से बंधे एंटीबॉडी को हटाना है, जिससे पूर्व एंटीबॉडी से न्यूनतम हस्तक्षेप के साथ एक नए एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। MyDoBID में, दो झिल्ली में नमूना लागू करने का विकल्प है, जहां अलग-अलग झिल्ली पर विभिन्न एमएचसी आइसोफॉर्म का पता लगाया जाता है। यदि इस दृष्टिकोण को प्राथमिकता दी जाती है, तो एक ही समय में धब्बे लोड करके नमूना ट्यूब को एक से अधिक बार संभालने से बचें। यह सुनिश्चित करेगा कि प्रत्येक नमूना स्थान के बीच सुखाने का समय समान है (~ 5 एस अंतर) और बाद के चरणों को अलग-अलग कंटेनरों में एक साथ किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह विकल्प समय, नमूना और उपभोग्य खपत में वृद्धि करेगा।

एंटीबॉडी को पहले एमएचसीआईए फाइबर का पता लगाने के लिए लागू किया जाता है, इसके बाद एमएचसीआई, क्योंकि एमएचसीआई एंटीबॉडी हमेशा एक बहुत उज्ज्वल संकेत देता है, जो एमएचसीआईए की तुलना में स्ट्रिप करना कठिन होगा। एक्टिन कंकाल की मांसपेशी फाइबर में सजातीय रूप से व्यक्त किया जाता है और इसका उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि फाइबर का एक हिस्सा सफलतापूर्वक झिल्ली पर लागू किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है।

इमेजिंग, फाइबर प्रकार की पहचान, और फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने की तैयारी
फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने बनाने के लिए फाइबर प्रकार की पहचान और नमूना चयन में सहायता के लिए इस प्रोटोकॉल में एक नया उपकरण विकसित किया गया है (चित्रा 4 ए)। सिग्नल इंटेंसिटी पैनल में दिखाए गए उदाहरण का उपयोग एमएचसीआई सिग्नल तीव्रता को परिभाषित करने के लिए किया जाता है: (i) संतृप्त, (ii) मध्यम, या (iii) बेहोश। फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूनों में फाइबर पूलिंग के लिए, संतृप्त सिग्नल तीव्रता दिखाने वाले फाइबर को पहले चुना जाता है और यदि आवश्यक हो, तो मध्यम सिग्नल तीव्रता वाले फाइबर जोड़े जाते हैं। टाइप I और II नमूने तैयार करते समय, आमतौर पर पर्याप्त 'संतृप्त' और 'मध्यम' फाइबर होते हैं ताकि 'बेहोश' या अज्ञात के रूप में वर्गीकृत फाइबर को त्याग दिया जा सके।

शुद्ध प्रकार आईआईएक्स फाइबर की पहचान करने के लिए एमएचसीआईआईएक्स एंटीबॉडी के बजाय एक्टिन का उपयोग करने की नवीनता।
इससे पहले, शुद्ध आईआईएक्स फाइबर की पहचान करने के लिए, एमएचसीआईएक्स सिग्नल की तुलना एक डॉट ब्लॉट पर एमएचसीआई और एमएचसीआईआईए सिग्नल से व्यक्तिपरक रूप से की गई थी, और उन्मूलन की प्रक्रिया द्वारा, बिना एमएचसीआई या आईआईए सिग्नल वाले फाइबर, लेकिन एमएचसीआईएक्स सिग्नल के साथ, शुद्ध आईआईएक्स के रूप में पहचाने गए थे। हालांकि, एक ही झिल्ली पर दो माउस आईजीएम प्राथमिक एंटीबॉडी (एमएचसीआईआईएक्स और एमएचसीआई) का उपयोग करते समय समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी के बीच झिल्ली को अलग करने के बावजूद, अवशिष्ट एंटीबॉडी संकेत का पता लगाया जा सकता है। खरगोश एंटी-एक्टिन प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना इस समस्या को होने से रोकता है। यहां हमने एक्टिन का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया कि एक फाइबर एकत्र किया गया था और एमएचसीआई और एमएचसीआईआईए दोनों की अनुपस्थिति में, इंगित करता है कि एक आईआईएक्स फाइबर मौजूद था। संभावित आईआईएक्स फाइबर की पुष्टि तब एमएचसीआईआईएक्स-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता द्वारा की जाती है (इस पेपर में चित्रा 5 और9 में चित्रा 2 देखें)। 6एच1 एंटीबॉडी कोचूहे के कंकाल की मांसपेशियों में एमएचसीआईआईएक्स के अनुरूप इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से अलग बैंड का पता लगाने के लिए दिखाया गया है और माउस, चूहे और मानव मांसपेशियों के क्रॉस-सेक्शन में टाइप आईआईएक्स फाइबर को लेबल किया गयाहै।

पश्चिमी धब्बा फाइबर प्रकार की पुष्टि
एक ही जेल पर एक ही बायोप्सी से सभी फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने चलाना सबसे अच्छा अभ्यास है। एमएचसीआई एंटीबॉडी को एमएचसीआईआईएक्स के समान द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, टाइप 1 और आईआईएक्स नमूनों को किसी दिए गए जेल पर कम से कम एक लेन से अलग किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है। चूंकि चर फाइबर आकार के कारण प्रोटीन सामग्री फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूनों में भिन्न होगी, इसलिए पहले जेल का उपयोग नमूने की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए जिसे सभी नमूनों में प्रोटीन की समान मात्रा प्राप्त करने के लिए बाद के जेल रन में लोड करने की आवश्यकता होती है। ऐसा करने के लिए, किसी दिए गए नमूने में कुल प्रोटीन यूवी-सक्रिय जेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है ताकि उन सभी प्रोटीन बैंड ों की कल्पना की जा सके जिन्हें हस्तांतरण से पहले एसडीएस-पेज द्वारा जेल में अलग किया गया है। प्रत्येक नमूने में कुल प्रोटीन जेल छवि से निर्धारित किया जाता है और अगले पश्चिमी धब्बा रन में असमान लोडिंग को सही करने के लिए उपयोग किया जाता है, बशर्ते कंकाल की मांसपेशी ऊतक के कई ज्ञात द्रव्यमानों का अंशांकन वक्र फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने 3,4,6,17 के साथ चलाया जाता है। कुल प्रोटीन को निर्धारित करने के लिए एक्टिन जैसे 'हाउसकीपिंग' प्रोटीन का उपयोग करने की भी आवश्यकता नहीं है, जिसके लिए अपने स्वयं के अंशांकन वक्र15 की भी आवश्यकता होगी। यह तकनीक कुल प्रोटीन को निर्धारित करने के लिए एक समय बचाने वाली और सटीक विधि है और इसे अतिरिक्त अभिकर्मकों या प्रोटीन मानकों की आवश्यकता के बिना बहुत कम नमूने (यानी, फाइबर9 का ~ 1/5वां) के साथ किया जा सकता है, जबकि रुचि के प्रोटीन का पता लगाने के लिए झिल्ली के सभी वर्गों को अधिकतम किया जा सकता है।

जब पश्चिमी ब्लॉट चरण के दौरान इम्यूनोलेबलिंग की बात आती है, तो एमएचसीआईआईएक्स एंटीबॉडी को अन्य एमएचसी आइसोफॉर्म की तुलना में एमएचसीआईआईएक्स की अपेक्षाकृत कम प्रचुरता के कारण पहले लागू किया जाता है। एक बार जब झिल्ली एमएचसीआई एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए तैयार हो जाती है, तो यह स्ट्रिपिंग के दो चरणों से गुजरेगी (यानी, एमएचसीआईआईएक्स और एमएचसीआईआईए डिटेक्शन के बाद)। नतीजतन, एमएचसीआई का पता लगाना मुख्य रूप से टाइप 1 नमूने में पाया जाना चाहिए, जिसमें पिछले एमएचसी एंटीबॉडी (चित्रा 5) से न्यूनतम अवशिष्ट संकेत का पता लगाया गया है। पश्चिमी सोख्ता का उपयोग एक ही झिल्ली भाग पर सभी तीन एमएचसी एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रत्येक फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। हालांकि, स्ट्रिपिंग की आवश्यकता समाप्त हो जाएगी यदि एमएचसीआई या एमएचसीआईएक्स एंटीबॉडी को खरगोश या बकरी जैसे एक अलग मेजबान प्रजातियों में उठाया गया था।

अनुप्रयोगों
यहां वर्णित पद्धति का उपयोग मानव कंकाल की मांसपेशियों में फाइबर-प्रकार विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए ताजा या फ्रीज-सूखे कंकाल की मांसपेशी से एकल फाइबर खंडों को फाइबर टाइपिंग के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ताजा मांसपेशियों के नमूनों का उपयोग करके, या तो बरकरार या यांत्रिक रूप से चमड़ी वालेफाइबर का उपयोग किया जा सकता है। एक चमड़ी वाले फाइबर का उपयोग करने से उपकोशिकीय डिब्बों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की आगे की जांच की अनुमति मिलती है जैसे कि साइटोसोल और झिल्ली डिब्बों में। इस एप्लिकेशन का उपयोग पहले ग्लाइकोजन की मात्रा को मापने के लिए किया गया है जो स्वस्थ और मधुमेह वाले व्यक्तियों से यांत्रिक रूप से चमड़ीवाले फाइबर खंडों में बाध्य बनाम अनबाउंड है। महत्वपूर्ण रूप से, MyDoBID उन प्रयोगों के लिए फायदेमंद है जो केवल विकृत नमूनों का उपयोग करते हैं और उन अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं होंगे जिनके लिए उनके मूल राज्य में प्रोटीन की आवश्यकता होती है। हालांकि यह संभव है कि अन्य विश्लेषण जैसे कि एंजाइमेटिक परख या इन-सॉल्यूशन प्रोटिओमिक दृष्टिकोण देशी परिस्थितियों में किए जा सकते हैं, आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी ताकि माइडोबिड का उपयोग करके एमएचसी आइसोफॉर्म पहचान के लिए फाइबर के एक हिस्से को हटाया जा सके।

संक्षेप में, टाइप I, टाइप II, और टाइप IIx को पश्चिमी सोख्ता के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले आसानी से उपलब्ध उपभोग्य सामग्रियों के साथ एक सीधी तकनीक के आवेदन से सफलतापूर्वक पहचाना जा सकता है। हम व्यापक व्यावहारिक जानकारी शामिल करते हैं, जहां सफल समापन पर फाइबर प्रकार-विशिष्ट नमूने का उत्पादन होगा जो भविष्य के अध्ययनों के लिए सर्वोत्तम संभव गुणवत्ता, अखंडता और विश्वसनीयता के हैं। यह तकनीक फाइबर-विशिष्ट कंकाल की मांसपेशी जैव रासायनिक विश्लेषण करने के लिए व्यावहारिक और पसंदीदा दृष्टिकोण है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन में उपयोग किए गए एमएचसी आई (ए 4.840) और एमएचसीआईआईए (ए 4.74) के खिलाफ एंटीबॉडी डॉ एचएम ब्लाउ द्वारा विकसित किए गए थे और एमएचसीआईएक्स (6 एच 1) के खिलाफ एंटीबॉडी डॉ सीए लुकास द्वारा विकसित किया गया था और विकास ता्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक (डीएसएचबी) से प्राप्त किया गया था, जिसका श्रेय राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान के तत्वावधान में जाता है और आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा बनाए रखा जाता है। जैविक विज्ञान विभाग (आयोवा सिटी, आईए)। हम इस अध्ययन के लिए मानव मांसपेशियों के नमूने प्रदान करने के लिए विक्टोरिया एल वाइकेल्स्मा को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 1 में अधिकांश चित्र BioRender.com से प्राप्त किए गए थे।

निधिकरण:
इस अध्ययन को कोई बाहरी धन नहीं मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies  1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol N/A 100% ethanol can be sourced from any company Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich   A2066 Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales Mettler Toledo Model number: MSZ042101
Antibody enhancer Thermo Fischer Scientific 32110 Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL) N/A N/A
Benchtop centrifuge Eppendorf 5452 Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. Diploma Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich  BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002 Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever  Bio-Rad Laboratories 4560000 Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager  Bio-Rad Laboratories Model number: Universal hood III Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter Bio-Rad Laboratories 1704070 Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad) Bio-Rad Laboratories 1656001
ECL (enhanced chemiluminescence) Bio-Rad Laboratories 1705062 Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) Bio-Rad Laboratories 1610772 Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick Whatmann 3030917 Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps Dumont F6521-1EA Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid   N/A N/A Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System Labconco 7750030 Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC  N/A N/A Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers 1653320 Bio-Rad Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil N/A N/A
 Image lab software  Bio-Rad Laboratories N/A Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator Bio-Rad Laboratories 1660521 Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp N/A N/A
Magnetic stirrer with flea N/A N/A
Membrane roller  Bio-Rad Laboratories 1651279 Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. 
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL) N/A N/A
Mouse IgG HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31430 Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary Abcam ab97230 Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody DSHB A4.840  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody DSHB A4.74  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody DSHB 6H1 Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm  Bio-Rad Laboratories 1620115 For Western blotting.
Petri dish lid N/A N/A
Plastic tweezers N/A N/A
Power Pack  Bio-Rad Laboratories 164-5050 Product name: Basic power supply.
Protein ladder Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm Bio-Rad Laboratories 1620177
Rabbit HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31460 Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker N/A N/A
Ruler N/A N/A
Scissors N/A N/A
Stereomicroscope Motic SMZ-168
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059 Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free) Kimberly-Clark professional 34120 Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018 dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray Bio-Rad Laboratories 1704089
 UV-activation precast gel Bio-Rad Laboratories 5678085 Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex N/A N/A
Wash buffer (1x TBST) 10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma  BIOA0027-4L 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers Sistema Store bought Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.

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References

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फाइबर प्रकार की पहचान कंकाल की मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला डॉट ब्लोटिंग माइडोबिड मांसपेशी फाइबर प्रकार वर्गीकरण एमएचसीआई-एंटीबॉडी आईआईए-विशिष्ट एंटीबॉडी बायोप्सी नमूने सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) यूवी-सक्रिय जेल प्रौद्योगिकी पश्चिमी सोख्ता प्रोटीन लोडिंग सामान्यीकरण एकल-फाइबर पश्चिमी धब्बे नमूना बहुमुखी प्रतिभा नमूना थ्रूपुट समय निवेश लागत-बचत के उपाय
मानव कंकाल की मांसपेशी की फाइबर प्रकार की पहचान
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Latchman, H. K., Wette, S. G.,… More

Latchman, H. K., Wette, S. G., Ellul, D. J., Murphy, R. M., Frankenberg, N. T. Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (199), e65750, doi:10.3791/65750 (2023).

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