Fibertypeidentifikation af menneskelig skeletmuskulatur

Summary

Denne protokol demonstrerer enkeltfiberisolering fra frysetørret human skeletmuskulatur og fibertypeklassificering i henhold til Myosin heavy chain (MHC) isoform ved hjælp af dot blotting-teknikken. Identificerede MHC I og II fiberprøver kan derefter analyseres yderligere for fibertypespecifikke forskelle i proteinekspression ved hjælp af western blotting.

Abstract

Teknikken beskrevet her kan bruges til at identificere specifikke myosin heavy chain (MHC) isoformer i segmenter af individuelle muskelfibre ved hjælp af dot blotting, i det følgende benævnt Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Denne protokol beskriver processen med frysetørring af menneskelig skeletmuskulatur og isolering af segmenter af enkeltmuskelfibre. Ved hjælp af MyDoBID klassificeres type I- og II-fibre med henholdsvis MHCI- og IIa-specifikke antistoffer. Klassificerede fibre kombineres derefter til fibertypespecifikke prøver for hver biopsi.

Det totale protein i hver prøve bestemmes ved natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og UV-aktiveret gelteknologi. Fibertypen af prøver valideres ved hjælp af western blotting. Vigtigheden af at udføre proteinbelastningsnormalisering for at forbedre målproteindetektion på tværs af flere vestlige blots er også beskrevet. Fordelene ved at konsolidere klassificerede fibre i fibertypespecifikke prøver sammenlignet med enkeltfiber vestlige blots inkluderer prøvealsidighed, øget prøvegennemstrømning, kortere tidsinvestering og omkostningsbesparende foranstaltninger, samtidig med at værdifulde fibertypespecifikke oplysninger bevares, der ofte overses ved hjælp af homogeniserede muskelprøver. Formålet med protokollen er at opnå nøjagtig og effektiv identifikation af type I- og type II-fibre isoleret fra frysetørrede humane skeletmuskelprøver.

Disse individuelle fibre kombineres efterfølgende for at skabe type I og type II fibertypespecifikke prøver. Desuden udvides protokollen til at omfatte identifikation af type IIx-fibre ved hjælp af Actin som markør for fibre, der var negative for MHCI og MHCIIa, som bekræftes som IIx-fibre ved western blotting. Hver fibertypespecifik prøve bruges derefter til at kvantificere ekspressionen af forskellige målproteiner ved hjælp af western blotting-teknikker.

Introduction

Skeletmuskulatur er et heterogent væv med forskellige cellulære metaboliske og kontraktile egenskaber, der afhænger af, om cellen (fiber) er langsom træk (type I) eller hurtig trækning (type II). Fibertypen kan identificeres ved at undersøge myosin heavy chain (MHC) isoformer, som adskiller sig fra hinanden på flere måder, herunder sammentrækningstid, forkortelseshastighed og træthedsmodstand¹. De vigtigste MHC-isoformer omfatter type I, type IIa, type IIb og type IIx, og deres metaboliske profiler er enten oxidative (type I og IIa) eller glycolytiske (IIx, IIb)¹. Andelen af disse fibertyper varierer i muskeltype og mellem arter. Type IIb findes bredt i gnavermuskel. Menneskelige muskler indeholder ingen type IIb-fibre og består overvejende af MHC-isoformer type I- og IIa-fibre med en lille andel IIx-fibre². Proteinekspressionsprofiler varierer mellem forskellige fibertyper og kan ændres med aldring³, øvelse ^4,5 og sygdom⁶.

Måling af cellulære reaktioner i forskellige skeletmuskelfibertyper overses ofte eller er ikke mulig på grund af undersøgelsen af muskelhomogenater (en blanding af alle fibertyper). Single-fiber western blot giver mulighed for undersøgelse af flere proteiner i individuelle muskelfibre⁷. Denne metode er tidligere blevet anvendt til at producere nye og informative enkeltfiberegenskaber, der ikke var mulige at opnå ved anvendelse af homogenatpræparater. Der er dog nogle begrænsninger ved den oprindelige enkeltfiber western blot-metode, herunder den tidskrævende natur, manglende evne til at generere prøvereplikater og brugen af dyre, følsomme forbedrede kemiluminescensreagenser (ECL). Hvis der anvendes frisk væv, er denne metode yderligere begrænset på grund af tidsbegrænsningerne ved at skulle isolere individuelle fibre inden for en begrænset tidsramme (dvs. 1-2 timer). Heldigvis afbødes denne fastholdelse ved at isolere enkeltfibersegmenter fra frysetørret væv⁸. Imidlertid er fiberopsamling fra frysetørrede prøver begrænset af størrelsen og kvaliteten af det biopsierede væv.

Fibertypeidentifikation ved hjælp af dot blotting-metoden⁹ er blevet væsentligt uddybet og udvidet i denne omfattende protokol. Tidligere er det blevet påvist, at så lidt som ~ 2-10 mg vådvægts muskelvæv er tilstrækkeligt til frysetørring og enkeltfiber MHC isoform proteinanalyse⁹. Christensen et ^al.9 brugte 30% af et ~ 1 mm fibersegment til at detektere MHC-isoformen til stede ved dot blotting, hvilket blev bekræftet ved western blotting. Dette arbejde viste, at ved at erstatte western blotting med dot blotting, blev de samlede omkostninger reduceret med ~ 40 gange (for 50 fibersegmenter). Fibre blev derefter "poolet" i type I og type II prøver, hvilket muliggjorde eksperimentel replikation⁹. Ikke desto mindre var en begrænsning, at der kun blev opnået to fibertypespecifikke prøver: type I (MHCI-positive) og type II (MHCII-positive fibre) med type II-prøver indeholdende en blanding af MHCIIa og MHCIIx ^6,10. Især demonstrerer den aktuelle protokol, hvordan rene type IIx-fibre kan identificeres og giver en meget detaljeret arbejdsgang (opsummeret i figur 1), herunder fejlfindingsstrategier for almindelige protokolproblemer.

Protocol

Humane muskelprøver blev opnået fra vastus lateralis fra n = 3 (2 hanner, 1 hun), i alderen 70-74 år under sterile forhold ved hjælp af lokalbedøvelse (Xylocaine) og en Bergstrom-nål modificeret til manuel sugning^11,12. Prøverne var en delmængde af en tidligere undersøgelse, der var godkendt af Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) og udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen¹³. Deltagerne gav skriftligt, informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Alle detaljer om alle materialer, der kræves til denne protokol, er vist i materialetabellen. Derudover findes der en liste over fejlfindingsstrategier, der adresserer almindelige protokolproblemer, i tabel 1.

1. Frysetørring

1. Mens du holder de biopsierede muskelprøver frosne på tøris, vejes og taraes et tomt frosset rør på vægten.
2. Vej hurtigt mindst 10 mg frossent væv med vådvægt. Registrer vægten med én decimal.
3. Deponer vævet i det forkølede mikrocentrifugerør, der har fået gennemboret 3-4 huller i låget, og læg det i et lille bægerglas med 2-3 pellets tøris.
4. Følg frysetørrerproducentens betjeningsvejledning.
5. Sørg for, at alle ventiler på frysetørreren er lukket, og tænd for frysetørreren.
6. Brug kontrolpanelet til at kontrollere, at vakuumsætpunktet er programmeret til optimale frysetørringsforhold for humant væv, 0,12 millibar (mBar) (figur 2).
7. Tryk manuelt på frysetørreren, og vent, indtil kammeret er afkølet til -40 ^oC.
8. Når kammeret har nået denne temperatur, fjernes låget, derefter glaskammeret, og bægerglasset (med muskelprøve) anbringes på metaltrinnet.
9. Udskift glaskammeret og låget. Luk vakuumudløserventilen på låget, og vent, indtil vakuumvægtlampen lyser grønt for at sikre, at tørretumbleren er vakuumforseglet.
10. Frysetør muskelprøverne i 48 timer. Når frysetørringen er afsluttet, skal du slukke for vakuumpumpen ved at trykke på vakuumknappen og åbne vakuumudløsningsventilen på låget.
11. Fjern kammerets låg og opsaml den frysetørrede prøve. Væv vejes, og vægten registreres med én decimal.
12. Beregn det procentvise vægttab; ~ 75% vægttab indikerer, at vævet er succesfuldt frysetørret (i dette arbejde betyder gennemsnit ± SD, 76 ± 9%, n = 11 muskelprøver).
13. Tryk på AUTO for at slukke for vakuumpumpen og fryseren. Lad enheden nå omgivelsestemperatur.
14. Rengør kølespolerne i henhold til producentens anvisninger, og tøm akkumuleret væske fra opsamleren.
    BEMÆRK: Fiberindsamling kan påbegyndes med det samme. Når væv ikke anvendes til fiberisolering, opbevares den frysetørrede prøve ved -80 °C i en forseglet beholder med ekssikkatorperler.  FORSIGTIG: Tøris er farlig (klasse 9); Se MSDS for anbefalet sikker håndtering.

2. Fiber indsamling

1. Forberedelse af fiberopsamling
   1. Mærk mindst 50 mikrofugerør (fiber 1 til 50) og pipette 10 μL denatureringsbuffer til hvert rør.
   2. Forbered opsamlingsområdet med to par finvævsdissekerende tang, fnugfrit væv, en bordlampe, et stereomikroskop (med det sorte stadium opad), en hvirvel og en bordcentrifuge.
   3. Læg den frysetørrede muskelprøve på et petriskållåg. Placer låget på scenen af dissekeringsmikroskopet.
   4. Se videoen af enkeltfiberdissektion. Øv den komplette protokol fra fiberindsamling til enkeltfibertypeidentifikation mindst to gange, før du påbegynder en undersøgelse.
   5. Før fiberopsamling beregnes det samlede volumen, der kræves til en fibertypeprøve fra hver biopsi som følger. For eksempel, hvis startvolumenet på 1 fiber = 10 μL og det resterende volumen efter MyDoBID er (1 fiber × 10 μL) - 1 μL brugt til dot blotting = 9 μL (prøvevolumen), skal du beregne det samlede prøvevolumen , der kræves ved at gange prøvevolumenet (μL) med det samlede antal vestlige blots, der køres, og fordoble dette beløb for at tage højde for redundans: (9 μL × 4 vestlige blots) × 2 = 72 μL. Beregn antallet af fibre, der kræves pr. typet prøve, ved at dividere det krævede slutprøvevolumen (μL) med prøvevolumenet pr. fibertypespecifik prøve (f.eks. 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibre pr. fibertypespecifik prøve). For at dette skal opnås, skal du samle i alt 50 fibre.
      BEMÆRK: Det krævede prøvevolumen er den mindste proteinkoncentration, der kræves for at køre både MyDoBID og western blotting, hvis mængden af fyldt protein svarer til en ~ 3 mm fiber (~ 12 μg vådvægt) for hver prøve (se supplerende fil 1 for detaljer). Dette volumen tager imidlertid ikke højde for, om gentagne geler er nødvendige for et givet protein.  FORSIGTIG: Tang er skarpe; Håndter dem forsigtigt for at undgå risikoen for hudpunktering.
2. Isolering af enkeltfiber
   1. På et lille stykke papir 5 cm x 1 cm skal du bruge en lineal til at tegne en linje på 1 cm. Marker hver 1 mm på den linje.
   2. Indsæt dette under petriskållåget som en vejledning til at estimere længden af de indsamlede fibre.
   3. Den frysetørrede muskelprøve anbringes under stereomikroskopet ved lav forstørrelse (x 7.5). Brug et par fint vævsdissekerende tang til at holde den frysetørrede muskel på plads, og med den anden begynde at adskille små bundter fibre (som det ses i videoen).
   4. Isoler et bundt fibre og fortsæt med at drille fra hinanden, indtil enkelte fibersegmenter er isoleret fra bundtet.
   5. Saml mindst 50 fibre, der er mindst ~ 1 mm lange.
   6. Flyt fiberen til et tomt rum på petriskålen. Undersøg enkeltfibersegmenter under højere forstørrelse (x 50). Sørg for, at det er en enkelt fiber ved yderligere at adskille fiberen i slutningen. Hvis fiberen går i stykker i stedet for at adskille, er det en enkelt fiber.
3. Denaturering af fibre
   1. Brug tang til forsigtigt at samle fiberen og placere den direkte i den aliquoterede denatureringsbuffer (lad ikke tangen støde på bufferen).
   2. Kontroller tangen under mikroskopet for at sikre, at fiberen er blevet fjernet. Luk røret og bank bunden af røret fast på bænken tre gange for at sikre, at fiberen bevæger sig ind i bufferen.
   3. Tør tangen ren med fnugfrit væv, inden du går videre til den næste fiber. Gentag denne proces, indtil alle fibre er opsamlet.
   4. Fiberprøverne hvirvel og centrifugeres kortvarigt i 5 s ved 2.500 × g for at trække prøven til bunden af røret.
      BEMÆRK: Centrifugeringsvarigheden (5 s) er tidsindstillet fra starten (0 × g), indtil hastigheden når ~2.500 × g.
   5. Lad prøverne stå ved stuetemperatur i 1 time. Opbevares ved -80 °C til fremtidig brug. Frys og tø derefter prøverne op før brug.

3. Dot blotting

1. Membranforberedelse og aktivering
   1. Mål, mærk og skær i størrelse en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (0,2 μm porestørrelse), så den passer til 50 prøver (~ 10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Marker venstre kant numerisk fra top til bund (1 til 10) og den øverste kant alfabetisk fra venstre mod højre (A til E) med en afstand på 1 cm.
   3. Forbered fire ark filterpapir med dimensionerne 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Bunke to ark sammen for at danne en stak. Forblød filterstakken i 1x overførselsbuffer.
   5. Anbring membranen i en beholder. Hæld 95% ethanol over membranen med tilstrækkelig volumen til helt at nedsænke membranen (10-15 ml). Rør på vippen i 1 min.
   6. Husk ethanolen, nedsænk membranen i 1x overførselsbuffer (~ 15 ml), og rock i yderligere 2 minutter.
      BEMÆRK: Både ethanol og overførselsbuffer kan genbruges til fremtidige dot blotting-eksperimenter, indtil sedimentering dannes (ændres efter seks anvendelser).
   7. Læg den buffergennemblødte filterpapirstak på en plan, bevægelig overflade, f.eks. et stort låg, og flad med rullen. Placer PVDF-membranen på stakken ved hjælp af en geludløser eller pincet.
   8. Placer et enkelt ark tørt filterpapir oven på membranen, og flyt rullen over filterpapiret for at opsuge overskydende buffer på membranoverfladen. Fjern det øverste filterpapir uden at gnide membranen.
      FORSIGTIG: Methanol (klasse 3, underrisiko 6.1) og ethanol (klasse 3) er farlige. Se sikkerhedsdatabladet (MSDS) for anbefalinger om sikker håndtering.
2. Prøveabsorption til membranen
   1. Fiberprøverne optøs, der udføres en kort centrifuge (5 s) ved stuetemperatur som i trin 2.3.4, og prøven blandes grundigt.
   2. Uden at berøre membranen med pipettespidsen aflejres langsomt en ~1 μL dråbe af hver prøve på membranen i det angivne område. Dimensionerne på det udpegede område pr. Fiberprøve er ~ 1 cm x 1 cm. Målet er at få øje på prøven i midten af dette område.
   3. Lad prøvedråberne trække gennem membranen i mindst 15 minutter. Sørg for, at der ikke er nogen prøvebuffer tilbage, og at den absorberes fuldstændigt.
   4. Brug plastikpincet til forsigtigt at løfte membranen af den fugtige filterstak, læg den på et enkelt tørt ark filterpapir, og dehydrer membranen i mindst 5 minutter.
   5. Når prøvepletterne bliver helt hvide, skal du genaktivere membranen.
3. Genaktivering og blokering af membran
   1. Membranen genaktiveres ved gentagelse af trin 3.1.5 og 3.1.6.
   2. Anbring membranen i vaskebuffer og skyl i 5 min med gyngning. Kassér vaskebufferen.
   3. Inkuber membranen i blokerende buffer i 30 minutter, mens du rocker.
   4. Skyl membranen 3x med vaskebuffer, indtil bufferen ikke længere er uklar.
   5. Lad membranen stå i den sidste vask på vipperen.

4. Immunmærkning

1. Påvisning af MHCIIa
   1. MHCIIa primære antistof fortyndes ved 1 ud af 200 i 10 ml bovin serumalbumin (BSA) buffer.
   2. Kassér vaskebufferen fra membranen, og hæld derefter det fortyndede MHCIIa-antistof på membranen.
   3. Anbring beholderen (med membranen i MHCIIa) på vipperen ved stuetemperatur i 2 timer eller ved 4 °C natten over.
   4. MHCIIa-antistoffet huskes og opbevares ved 4 °C. Vask membranen med blokerende buffer i 2 min på vippen.
      BEMÆRK: Alle primære antistoffer kan genbruges op til fem gange, så længe bufferen forbliver klar.
   5. Skyl to gange mere; 5 minutter hver gang; Tre vaske i alt.
   6. Fortynd mus immunglobulin G peberrodsperoxidase (IgG-HRP) sekundært antistof ved 1 ud af 20.000 i 10 ml blokerende buffer og tilsæt membranen.
   7. Kassér vaskebufferen og inkuber membranen i mus IgG-HRP sekundært med gyngning i 1 time.
   8. Kassér sekundæret og vask membranen i vaskebuffer (2, 5, 5 min).
   9. Lad membranen ligge i blød i den endelige vask, indtil den er klar til billeddannelse.
   10. Tænd gelkameraet, vent 15 minutter på, at kameraværktøjet når den ønskede driftstemperatur, og åbn derefter billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen).
   11. I softwarevinduet skal du klikke på Ny enkeltkanalprotokol (figur 3A). For et billede af membranen med hvidt lys under Programmer | Klumper | klik på Kolorimetri (figur 3B).
   12. Klik på gelområdet; Hver indstilling er programmeret til specifikke dimensioner, så den passer til størrelsen på forskellige geltyper. Vælg den passende indstilling, så den passer bedst til membranens dimensioner (figur 3C).
   13. ECL fremstilles ved at kombinere luminol- og peroxidasereagenser i forholdet 1:1. Lav et tilstrækkeligt volumen ECL-blanding til at dække hele membranen, typisk kræves et samlet volumen på 800-1.000 μL.
   14. Placer membranen på en stor klar plastbakke og fordel ECL-blandingen på membranen.
   15. Placer membranen på billedpladen.
   16. Klik på Position Gel (gul knap) for at se kameraet direkte. Klik på og træk zoomknappen for at maksimere membranens billedområde. På dette tidspunkt skal du rette membranens position, hvis det kræves.
   17. Klik på Kør protokol (grøn knap), og vent på, at der produceres et kolorimetrisk billede af membranen. Gem dette billede for at hjælpe med at matche prikkerne til den tilsvarende fiberprøve.
   18. Uden at flytte membranen skal du ændre applikationen på softwaren ved at klikke på indstillingen for en 2 x 2 binning (Chemi High Resolution) (figur 3D).
   19. Under Billedeksponering og software skal du optimere eksponeringstiden og klikke på Svage bånd (figur 3E) | Signalakkumuleringstilstand.
   20. Under Opsætning skal du indtaste 1 s for det første billede, 30 s for det sidste billede og 30 billeder i alt (figur 3F).
   21. Klik på Kør protokol.
   22. Gem et billede i følgende faser: før signalmætning (alle synlige prikker er sorte), indledende signalmætning (nogle prikker begynder at mætte) og overmættede pletter (alle pletter med stærkt detekteret signal er mættede).
   23. Gem alle nødvendige billeder, før du afslutter signalakkumulering. Tag membranen ud af billeddanneren.
   24. Brug geludløseren til at placere membranen tilbage i beholderen med vaskebufferen.
2. Påvisning af MHCI
   1. Hæld vaskebufferen ud og behandl membranen med strippebuffer i 30 minutter ved 37 °C (sørg for, at membranen er helt nedsænket).
   2. Husk strippebufferen og skyl membranen i vaskebuffer i 5 minutter med gyngning.
      BEMÆRK: Afstribningsbuffer kan genbruges 10x før kassering.
   3. Hæld vaskebufferen ud, og påfør denne gang MHCI primært antistof fortyndet i en startkoncentration på 1 til 200 (interval: 1 til 200 til 1 til 500). Rock membranen ved stuetemperatur i 1 time.
   4. Efter inkubation i MHCI primært antistof huskes antistoffet, og membranen vaskes som i trin 4.1.4 og 4.1.5.
   5. Fortynd mus IgM HRP sekundært antistof i blokerende buffer ved 1 ud af 20.000. Den blokerende buffer hældes ud af membranen og inkuberes i musens sekundære IgM som i trin 4.1.7.
   6. Vask og billedoptagelse registrerede MHCI som i trin 4.1.8 til 4.1.24.
      FORSIGTIG: Stripping buffer indeholder Organo Phosphine 3-5% (klasse 8). Se MSDS for anbefalinger om sikker håndtering.
3. Påvisning af potentiel MHCIIx ved hjælp af Actin
   1. Membranen strippes endnu en gang (trin 4.2.1 og 4.2.2).
   2. Pkt. 4.1 gentages, denne gang ved anvendelse af primært Actin-antistof fortyndet ved 1:500 i BSA-buffer og derefter sekundært HRP-antistof fortyndet ved 1 ud af 20.000 i blokerende buffer.

5. Identifikation af fibertype

1. MHCI-, MHCIIa- og Actin-signalanalyse
   1. Bliv fortrolig med signalintensitetspanelet (figur 4A). Vær opmærksom på trin 5.1.2 til 5.1.4.
   2. En mættet signalintensitet indikerer kvalitativt, at proteindetekteringen er stærk.
   3. En moderat indikerer, at målproteinet er til stede på et medium niveau.
   4. Et svagt signal indikerer, at der kun er lidt målprotein til stede.
   5. Brug signalintensitetspanelet til at kategorisere fibre med 'mættet', 'moderat' eller 'svag' signalintensitet (figur 4A).
   6. Udfør fibertypeidentifikation ved først at sammenligne MHCIIa- og MHCI-resultater (figur 4B, venstre og midterste blot).
   7. Optag fibre med mættet eller moderat signalintensitet på kun en MHC-isoform.
   8. Hvis MHC-isoformsignalet er 'svagt', skal fiberen være umærket (se figur 4B).
   9. Endelig, hvor Actin observeres (moderat eller mættet signalintensitet) i fibrene uden detektering af MHCI eller IIa, skal du registrere det som en potentiel type IIx-fiber (figur 4B, højre blot).
   10. Optag fibre med svagt MHC-isoformsignal, men Actin detekteret (moderat eller mættet intensitet) som uidentificeret.
   11. Kassér prøver med svag eller ingen detektion (ingen fiber opsamlet) for alle tre målproteiner (figur 4C).
   12. Optag enhver fiber, hvor både MHCI- og MHCII-signaler registreres med et 'mættet' eller moderat signal. Disse prøver er ikke beregnet til brug i fibertypespecifik forberedelse.
2. Fremstilling af fibertypespecifikke prøver
   1. Der udarbejdes en separat type I- og type II-prøve for hver biopsi. For en type II-prøve kombineres det krævede minimum antal fibre (beregnet i trin 2.1.5), hvor MHCIIa detekteres ved mættede eller moderate niveauer.
   2. I et separat rør mærket som type I gentages denne proces for fibre, hvor MHCI detekteres (figur 4D).
   3. Brug fibre med moderat signalintensitet, hvis der ikke er nok fibre med mættede signaler.
   4. Kombiner eventuelle potentielle IIx-fibre.
   5. Brug straks fibertypespecifikke prøver til western blotting eller opbevar dem ved -80 °C til fremtidig brug.

6. Bekræftelse af Western blot-fibertype

1. Brug 10 μL af hver fibertypespecifik prøve (det krævede mindste prøvevolumen, se trin 2.1.5).
2. Adskil prøver ved hjælp af den specificerede præfabrikerede gel via SDS-PAGE i henhold til producentens protokol.
3. Brug en gelbilleddanner til at detektere proteinet i gelen i henhold til producentens protokol.
4. Sæt gelen i kold 1x overførselsbuffer i 10 min.
5. Våd overføres proteinerne til en 0,45 μm nitrocellulosemembran (9,5 cm x 13,5 cm) i henhold til producentens protokol.
6. Efter overførsel skylles membranen kort med ultraren_H2Oi en beholder. Hæld det ultrarene vand ud.
7. Tilsæt 10 ml antistofsignalforstærkeropløsning til membranen og sten ved stuetemperatur i 10 minutter.
8. Husk antistofsignalforstærkeropløsningen og vask 5x (5 s pr. vask) med ultraren H₂O.
   BEMÆRK: Antistofsignalforstærkeropløsning kan bruges 5x før kassering.
9. Hæld den sidste vask ud, tilsæt blokeringsopløsning og rock ved stuetemperatur i 1 time.
10. Brug et rent skalpelblad eller en saks til at skære vandret over membranen med en molekylvægt, der sikrer, at proteiner, der er 180 kDa og derover, er på den øverste del af membranen.
11. Brug denne øverste sektion til yderligere bekræftelse af fibertype.
12. Brug delen under 180 kDa til at detektere forskellige målproteiner.
13. På den øverste del af membranen følges pkt. 4.1 med sekundært MHCIIx primært og sekundært antistof mod MHCIIx Immunoglobulin M (IgM) HRP.
14. Membranen strippes (som beskrevet i pkt. 4.2.1 og 4.2.2), før processen gentages med sekundært MHCIIa IgG-hoved- og muse-IgG HRP-antistof.
15. Strip endnu en gang og anvend til sidst MHCI IgM primært og mus IgM HRP sekundært antistof.
    BEMÆRK: Dette trin er kvalitativt, og derfor er ethvert proteintab på grund af membranstripning ikke et problem.
16. Sammenlign det detekterede signal på tværs af de forskellige MHC-isoformer (som vist i figur 5B). Når signalintensiteten detekteres ved moderate til mættede niveauer i den forventede prøve (MHCI - type I, MHCIIa - type II og MHCIIx - type IIx), registreres de fibertypespecifikke prøver som pålidelige til brug i fremtidige undersøgelser.
17. Prøven registreres som upålidelig, når der påvises mere end én MHC-isoform på samme måde i en prøve.
    FORSIGTIG: Antistofforstærkeropløsning indeholder natriumhydroxid 50%. Se MSDS for anbefalinger om sikker håndtering.

Representative Results

Identifikation af individuelle MHCI-, MHCIIa- og MHCIIx-muskelfibre ved hjælp af dot blotting
Et træk ved MyDoBID er kategoriseringen af den varierende MHC- og Actin-signalintensitetsstyrke i en given fiber (figur 4A). Fibertype blev identificeret ved tilstedeværelse eller fravær af MHCI- og IIa-isoformer (figur 4B). Seks fibre viste ingen MHC- eller actindetektion, hvilket indikerer, at der ikke blev indsamlet fiber. Resultaterne af denne specifikke dot blot var identifikationen af 22 type II-fibre, 7 type I-fibre og 3 potentielle type IIx-fibre; 2 uidentificerede prøver og 6 prøver blev klassificeret som 'Ingen fiber' indsamlet (figur 4B, C). Fibre, der endnu ikke havde noget påviseligt MHCI- eller MHCIIa-signal, var positive for Actin, blev identificeret som potentielle type IIx-fibre ved en elimineringsproces. Ved hjælp af signalintensitetspanelet til klassificering af MHCI- og IIa-signalstyrke blev 'moderate' eller 'mættede' fibre kombineret til henholdsvis type I- eller II-prøver. Fibre, der var uidentificerede eller havde svag eller ingen Actin påvist, blev ikke inkluderet i efterfølgende analyse og blev kasseret (figur 4D).

Bekræftelse af fibertypebestemmelse ved hjælp af western blotting
De fibertypespecifikke prøver blev valideret ved hjælp af western blotting og MHC-specifikke antistoffer (figur 5). Type I og type II fiberprøver fra en individuel biopsi blev kørt sammen med en type IIx prøve, som var en prøve af potentielle type IIx fibre fra to individer på grund af det lave antal type IIx fibre til stede i hver biopsi. Western blot-data bekræftede, at fibertypeidentifikationen var vellykket.

Figur 1: Oversigt over arbejdsgang, der skitserer prøveforberedelse, fibertypning og western blot-bekræftelse af fiberspecificitet . (A) Humant væv frysetørres i 48 timer. (B,C) Enkeltfibersegmenter isoleres under et dissekerende mikroskop. (D) Fibre denatureres og (E) opbevares efter 1 time ved -80 °C. (F) Primær antistofinkubationsrækkefølge. (G) Fibre blev dot blotted og fibertype identificeret ved hjælp af MHCIIa (type II), MHCI (type I) og actin (IIx?, potentiel type IIx fiber). (H) Fibre blev derefter samlet. (I) Fibertypespecifikke prøver sammen med en kalibreringskurve analyseres via SDS PAGE og western blotting. (J) Validering af fibertypeidentifikation ved hjælp af western blotting. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Skærm og kontrolpanel i frysetørringssystemet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Imagerindstillinger for optagelse af hvidt lys i membranen efterfulgt af kemiluminescerende detektion af målproteiner. For at afbilde membranen under hvidt lys skal du (A) vælge Ny enkeltkanal efterfulgt af (B) Klumper | kolorimetrisk anvendelse. (C) Baseret på størrelsen af den anvendte gel skal du vælge det relevante billedområde og derefter tage et billede med hvidt lys ved at trykke på Kør protokol. (D) Uden at flytte membranen gentages trin B , men denne gang vælges Pletter | Chemi Hej Opløsning. Før du trykker på Kør, skal du vælge (E) Billedeksponering for at optimere til svage bånd og (F) indstille signalakkumuleringstilstand og i første omgang indstille eksponeringstiden for hvert sekund i i alt 30 sekunder med Fremhæv mættede pixels markeret. Tryk på Kør protokol , og lad kørslen fuldføre, før du vælger de bedste billeder til lagring. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Identifikation af fibertype. (A) Fibertyper blev identificeret i forhold til alle andre fibre på membranen, kategoriseret af signalintensitetspanelet for hver detekteret MHC-isoform (f.eks. MHCI-signal: mættet, moderat og svag). (B) Ved hjælp af panelet i (A) identificerede MHCIIa-antistoffet type II-fibre (blå, venstre blot), og efter stripping af membranen identificerede MHCI-antistoffet type I-fibre (rød, midterste blot). Actin-antistof blev brugt til at identificere potentielle IIx-fibre, hvis et positivt Actin-signal blev detekteret i fibre, hvor der ikke tidligere blev detekteret MHCI- eller IIa-signal (grøn, højre blot). Fibre, der ikke fulgte disse retningslinjer, fremhæves i lilla (uidentificeret). Endelig viste prøver, der var negative for Actin-signalet, at der ikke var indsamlet fibre ('No Fiber'). (C) Tabel, der viser fibermærkning svarende til prøvepositionen på dot blots vist i (B). (D) Oversigt over fiberudvælgelse til fremstilling af fibertypespecifikke prøver. Målet var at indsamle 10 mættede fibre for hver fibertype. Her blev otte mættede fibre identificeret og samlet for type II-fibre. For type I-fibre var mindre end 10 mættede fibre til stede, så fibre med moderat signalstyrke blev også valgt. For type IIx-fibre blev to fibre identificeret og samlet. Hvis mindre end 10 fibre (mættede og moderate) identificeres, kan yderligere fiberopsamling være nødvendig.  BEMÆRK: Actinsignalet vist i (B) har ikke nået mætning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Western blot-bekræftelse af identifikation af fibertype. Fibertypeidentifikation blev udført i henhold til figur 4 for at generere type I (~ 10 fibre) og type II (~ 10 fibre) prøver. Da der ikke var nogen IIx-fibre identificeret fra den samme biopsi, blev IIx-prøven vist her produceret fra mere end en muskelprøve (n = 2 individer). En lille delprøve af hver fiberspecifik prøve analyseres ved western blotting for at bekræfte fibertypeidentifikation. Molekylvægtsmarkører (kDa) er angivet til venstre, fanget under hvidt lys uden at bevæge membranen. Målproteiner detekteres i sekvensen MHCIIx, MHCIIa og MHCI, hvor myosinet fra den UV-aktiverede gel visuelt angiver mængden af proteinbelastning pr. Prøve. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Fejlfindingsstrategier for almindelige protokolproblemer. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Beregning af frysetørret fibermasse ved hjælp af en kalibreringskurve. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Fiber indsamling
Baseret på flere års erfaring kan de fleste forskere mestre denne teknik; Praksis fører dog til hurtigere og mere effektiv fiberindsamling til downstream-analyser. For at kunne isolere 30 enkeltfibersegmenter af en kvalitet til pooling anbefales det, at der indsamles 50 fibersegmenter pr. prøve. Det anbefales at studere fiberindsamlingsvideoen omhyggeligt og efter at have udført to øvelsessessioner (~ 50 fibre pr. Session) for at opnå en rimelig standard. Alle indsamlede fibre gennemgår MyDoBID for at identificere fibertypen, hvilket vil afsløre, hvor effektivt teknikken udføres. Dette vil blive set som et lavt antal 'Ingen fiber' eller 'svag' MHC-signal detekteret i fiberprøver (se protokol afsnit 5.1).

Det er kendt, at muskler kan indeholde hybridfibre, hvor både MHCI og MHCIIa er til stede, eller MHCIIa og IIx ^2,14. En begrænsning af MyDoBID er, at tilstedeværelsen af en hybridfiber ikke kan fastslås, fordi en prøve, der er positiv for både MHCI- og MHCIIa-antistoffer, enten kan være en hybridfiber, eller at to fibre blev indsamlet. Desuden kan MyDoBID ikke detektere MHCIIa separat fra MHCIIa/IIx-hybrider, da MHCIIa's primære antistof ville detektere tilstedeværelsen af MHCIIa i både IIa- og IIa/IIx-fibre. Af disse grunde blev der ikke udført identifikation og forberedelse af prøver af hybridfibre, og prøver, der har både MHCI- og MHCIIa-signaler, der faldt uden for de områder, der er beskrevet i signalintensitetspanelet, blev kasseret (figur 4A). En yderligere begrænsning er, at andelen af muskelfibertyper i en prøve ikke kan bestemmes ved hjælp af MyDoBID, og anvendelse af konventionelle immunhistokemiske analyser er nødvendig for at bestemme fibertypefordeling².

Dot blotting
Signalintensitetspanelet og fibertype-ID er afhængige af, at hele prøven er repræsenteret i det lille volumen, der påføres dot blotting-membranen. For at opnå dette blandes prøven grundigt ved omrøring, inden den lægges på membranen. Alle fibre med kun en MHC-isoform bevæger sig til næste trin i pooling. På dette stadium er det vigtigt, at enhver fiber med mere end en MHC ikke må gå videre til dette næste trin med at kombinere prøver. Hvis en prøve er forurenet, skal hele den samlede prøve kasseres, og forskeren skal gå tilbage til fiberindsamling og gentage fiberisolerings- og dot blotting-trinnene.

Immunmærkning
Tidligere blev det rapporteret, at 5 min er en tilstrækkelig tid til at blokere ikke-specifikke steder på membranen til påvisning af MHCI og MHCIIa⁹. At fremme teknikken til MyDoBID kræver, at der anvendes et Actin-antistof. Det blev konstateret, at 5 minutters bloktiden skulle øges til 30 minutter, som rapporteret⁶, for at opnå en membran med minimal baggrund, da 5 minutters blokering resulterede i en mørkere membranbaggrund. Blokeringstid er en overvejelse i enhver immundetektionsteknik, såsom western blotting eller immunhistokemi, og bør ændres efter behov.

Stripping membranen
Stripping kan ikke bruges til kvantitative analyser¹⁵ , fordi det også fjerner proteiner af interesse, men kan bruges i MyDoBID, da det er et kvalitativt assay. Formålet med stripning er at fjerne de bundne antistoffer fra membranens overflade, så et nyt antistof kan anvendes med minimal interferens fra det tidligere antistof. I MyDoBID er der mulighed for at påføre prøven på tværs af to membraner, hvor de forskellige MHC-isoformer detekteres på separate membraner. Hvis denne fremgangsmåde foretrækkes, skal prøveglasset undgås at håndtere prøveglasset mere end én gang ved at fylde pletterne på samme tid. Dette sikrer, at tørretiden mellem hvert prøvested er ens (~5 s forskel) og efterfølgende trin udføres samtidigt i separate beholdere. Det skal bemærkes, at denne mulighed vil øge tiden, prøven og forbrugsforbruget.

Antistoffer påføres for først at detektere MHCIIa-fibre efterfulgt af MHCI, fordi MHCI-antistoffet altid giver et meget lyst signal, som ville være sværere at strippe end MHCIIa. Actin udtrykkes homogent i skeletmuskelfibre og bruges til at bekræfte, at en del af fiberen med succes blev påført membranen som beskrevet ovenfor.

Imaging, fibertypeidentifikation og forberedelse af fibertypespecifikke prøver
Der er udviklet et nyt værktøj i denne protokol til at hjælpe med fibertypeidentifikation og prøveudvælgelse for at skabe fibertypespecifikke prøver (figur 4A). Eksemplet i signalintensitetspanelet bruges til at definere MHCI-signalintensitet som: (i) mættet, (ii) moderat eller (iii) svag. Til pooling af fibre i fibertypespecifikke prøver vælges fibre, der viser mættet signalintensitet, først, og om nødvendigt tilsættes fibre med moderat signalintensitet. Ved fremstilling af type I- og II-prøver er der typisk nok 'mættede' og 'moderate' fibre, så fibre kategoriseret som 'svage' eller uidentificerede kan kasseres.

Nyhed ved at bruge Actin i stedet for MHCIIx-antistof til at identificere rene type IIx-fibre
Tidligere, for at identificere rene IIx-fibre, blev MHCIIx-signalet subjektivt sammenlignet med MHCI- og MHCIIa-signalet på en prikblot, og ved en elimineringsproces blev fibrene uden MHCI- eller IIa-signal, men med MHCIIx-signal, identificeret som ren IIx. Der kan dog opstå problemer, når du bruger to primære IgM-antistoffer til mus (MHCIIx og MHCI) på den samme membran. På trods af stripping membranen mellem primære antistoffer kan resterende antistofsignal detekteres. Brug af kaninanti-Actin primært antistof forhindrer dette problem i at opstå. Her brugte vi Actin til at bekræfte, at en fiber blev opsamlet, og i mangel af både MHCI og MHCIIa, indikerer det, at en IIx-fiber var til stede. Potentielle IIx-fibre bekræftes derefter ved western blotting ved anvendelse af det MHCIIx-specifikke antistof (se figur 5 i dette papir og figur 2 i⁹). 6H1-antistoffet har vist^{sig 16} at detektere det elektroforetisk adskilte bånd svarende til MHCIIx i rotteskeletmuskulatur og mærker type IIx-fibre i tværsnit af mus, rotte og menneskelige muskler².

Western blot fiber type bekræftelse
Det er bedste praksis at køre alle fibertypespecifikke prøver fra den samme biopsi på den samme gel. Med MHCI-antistof, der kræver det samme sekundære antistof som MHCIIx, skal type I- og IIx-prøver adskilles med mindst én bane på en given gel, som vist i figur 5. Da proteinindholdet vil variere på tværs af fibertypespecifikke prøver på grund af variabel fiberstørrelse, skal den første gel bruges til at bestemme mængden af prøve, der skal fyldes i efterfølgende gelkørsler for at opnå lignende mængder protein på tværs af alle prøver. For at gøre dette bestemmes det samlede protein i en given prøve ved hjælp af UV-aktiveret gelbilleddannelsesteknologi til at visualisere alle proteinbånd, der er blevet adskilt i gelen ved SDS-PAGE inden overførsel. Det samlede protein i hver prøve bestemmes ud fra gelbilledet og bruges til at korrigere ulige belastning i den næste western blot-kørsel, forudsat at en kalibreringskurve for flere kendte masser af skeletmuskelvæv køres sammen med de fibertypespecifikke prøver 3,4,6,17. Der er heller ikke behov for at bruge et 'husholdningsprotein' som Actin til at bestemme det samlede protein, hvilket også ville kræve sin egen kalibreringskurve¹⁵. Denne teknologi er en tidsbesparende og nøjagtig metode til at bestemme det samlede protein og kan udføres med meget lidt prøve (dvs. ~ 1/5^th af en fiber⁹) uden behov for yderligere reagenser eller proteinstandarder, samtidig med at alle sektioner af membranen maksimeres til påvisning af proteiner af interesse.

Når det kommer til immunmærkning under det vestlige blot-trin, påføres MHCIIx-antistoffet først på grund af den relativt lave overflod af MHCIIx sammenlignet med de andre MHC-isoformer. Når membranen er klar til MHCI-antistofdetektion, ville den have gennemgået to trin med stripping (dvs. efter MHCIIx og MHCIIa-detektion). Påvisning af MHCI bør derfor primært påvises i en type I-prøve med minimalt restsignal detekteret fra tidligere MHC-antistoffer (figur 5). Western blotting bruges til at bekræfte renheden af hver fibertypespecifik prøve ved hjælp af alle tre MHC-antistoffer på den samme membrandel. Behovet for stripning ville dog blive elimineret, hvis enten MHCI- eller MHCIIx-antistoffer blev opdrættet i en anden værtsart såsom kanin eller ged.

Programmer
Metoden beskrevet her kan bruges til fibertypning af enkeltfibersegmenter fra frisk eller frysetørret skeletmuskulatur til at undersøge fibertypespecifik proteinekspression i menneskelig skeletmuskulatur. Derudover kan der ved hjælp af friske muskelprøver anvendes enten intakte eller mekanisk skinnede fibre⁶. Brug af en flået fiber tillader yderligere undersøgelse af proteinekspression i subcellulære rum, såsom dem i cytosol- og membranrummene. Denne applikation er tidligere blevet brugt til at måle mængden af glykogen, der er bundet vs. ubundet i mekanisk flåede fibersegmenter fra raske og diabetiske individer⁶. Det er vigtigt, at MyDoBID er gavnligt for eksperimenter, der kun bruger denaturerede prøver og ikke ville være passende til undersøgelser, der kræver proteiner i deres oprindelige tilstand. Selvom det er muligt, at andre analyser, såsom enzymatiske assays eller proteomiske tilgange i opløsning, kunne udføres under native forhold, ville yderligere optimering være påkrævet, så en del af fiberen kunne fjernes til MHC-isoformidentifikation ved hjælp af MyDoBID.

Sammenfattende kan type I, type II og type IIx identificeres med succes ved anvendelse af en enkel teknik med let tilgængelige forbrugsvarer, der almindeligvis anvendes til western blotting. Vi inkluderer omfattende praktisk information, hvor der efter vellykket gennemførelse vil producere fibertypespecifikke prøver, der er af den bedst mulige kvalitet, integritet og pålidelighed til fremtidige undersøgelser. Denne teknik er den praktiske og foretrukne tilgang til udførelse af fiberspecifik skeletmuskulatur biokemisk analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.