Summary
Questo protocollo dimostra l'isolamento di una singola fibra dal muscolo scheletrico umano liofilizzato e la classificazione del tipo di fibra in base all'isoforma della catena pesante della miosina (MHC) utilizzando la tecnica del dot blotting. I campioni di fibre MHC I e II identificati possono quindi essere ulteriormente analizzati per le differenze specifiche del tipo di fibra nell'espressione proteica utilizzando il western blotting.
Abstract
La tecnica qui descritta può essere utilizzata per identificare specifiche isoforme della catena pesante della miosina (MHC) in segmenti di singole fibre muscolari utilizzando il dot blotting, di seguito denominato rilevamento della catena pesante della miaosina mediante lotto Dot Bper l'entificazione IDdel tipo di fibra muscolare (MyDoBID). Questo protocollo descrive il processo di liofilizzazione del muscolo scheletrico umano e l'isolamento di segmenti di singole fibre muscolari. Utilizzando MyDoBID, le fibre di tipo I e II sono classificate rispettivamente con anticorpi specifici per MHCI e IIa. Le fibre classificate vengono quindi combinate in campioni specifici per ogni biopsia.
La proteina totale in ciascun campione è determinata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil-solfato (SDS-PAGE) e tecnologia gel attivata dai raggi UV. Il tipo di fibra dei campioni viene convalidato utilizzando il western blotting. Viene inoltre descritta l'importanza di eseguire la normalizzazione del carico proteico per migliorare il rilevamento della proteina bersaglio in più western blot. I vantaggi del consolidamento delle fibre classificate in campioni specifici per il tipo di fibra rispetto ai western blot a fibra singola includono la versatilità del campione, l'aumento della produttività del campione, l'investimento di tempo più breve e le misure di risparmio sui costi, il tutto mantenendo preziose informazioni specifiche sul tipo di fibra che vengono spesso trascurate utilizzando campioni muscolari omogeneizzati. Lo scopo del protocollo è quello di ottenere un'identificazione accurata ed efficiente delle fibre di tipo I e di tipo II isolate da campioni di muscolo scheletrico umano liofilizzato.
Queste singole fibre vengono successivamente combinate per creare campioni specifici per il tipo di fibra di tipo I e di tipo II. Inoltre, il protocollo è stato esteso per includere l'identificazione delle fibre di tipo IIx, utilizzando l'actina come marcatore per le fibre che erano negative per MHCI e MHCIIa, che sono confermate come fibre IIx mediante western blotting. Ogni campione specifico per tipo di fibra viene quindi utilizzato per quantificare l'espressione di varie proteine bersaglio utilizzando tecniche di western blotting.
Introduction
Il muscolo scheletrico è un tessuto eterogeneo, con distinte proprietà cellulari, metaboliche e contrattili che dipendono dal fatto che la cellula (fibra) sia a contrazione lenta (tipo I) o a contrazione rapida (tipo II). Il tipo di fibra può essere identificato esaminando le isoforme della catena pesante della miosina (MHC), che differiscono l'una dall'altra in diversi modi, tra cui il tempo di contrazione, la velocità di accorciamento e la resistenza alla fatica1. Le principali isoforme MHC includono il tipo I, il tipo IIa, il tipo IIb e il tipo IIx e i loro profili metabolici sono ossidativi (tipo I e IIa) o glicolitici (IIx, IIb)1. La proporzione di questi tipi di fibre varia nel tipo di muscolo e tra le specie. Il tipo IIb è ampiamente presente nel muscolo dei roditori. I muscoli umani non contengono fibre di tipo IIb e sono costituiti prevalentemente da fibre isoforme MHC di tipo I e IIa, con una piccola percentuale di fibre IIx2. I profili di espressione proteica variano tra i diversi tipi di fibre e possono essere alterati con l'invecchiamento3, l'esercizio fisico 4,5 e la malattia6.
La misurazione delle risposte cellulari in diversi tipi di fibre muscolari scheletriche è spesso trascurata o non è possibile a causa dell'esame degli omogenati muscolari (un mix di tutti i tipi di fibre). Il western blot a fibra singola consente l'indagine di più proteine nelle singole fibre muscolari7. Questa metodologia è stata precedentemente utilizzata per produrre caratteristiche nuove e informative della singola fibra che non era possibile ottenere utilizzando preparati omogeneizzati. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni della metodologia originale del western blot a fibra singola, tra cui la natura dispendiosa in termini di tempo, l'incapacità di generare repliche del campione e l'uso di reagenti a chemiluminescenza potenziata (ECL) costosi e sensibili. Se si utilizza tessuto fresco, questo metodo è ulteriormente limitato a causa dei vincoli di tempo dovuti alla necessità di isolare le singole fibre entro un periodo di tempo limitato (ad esempio, 1-2 ore). Fortunatamente, questa restrizione è mitigata isolando segmenti di fibra singola dal tessuto liofilizzato8. Tuttavia, la raccolta di fibre da campioni liofilizzati è limitata dalle dimensioni e dalla qualità del tessuto sottoposto a biopsia.
L'identificazione del tipo di fibra utilizzando il metodo del dot blotting9 è stata significativamente elaborata e ampliata in questo protocollo completo. In precedenza, è stato dimostrato che un minimo di ~2-10 mg di tessuto muscolare umido è adeguato per la liofilizzazione e l'analisi della proteina isoforma MHC a fibra singola9. Christensen et al.9 hanno utilizzato il 30% di un segmento di fibra di ~1 mm per rilevare l'isoforma MHC presente mediante dot blotting, che è stata confermata dal western blotting. Questo lavoro ha dimostrato che sostituendo il western blotting con il dot blotting, i costi complessivi sono stati ridotti di ~ 40 volte (per 50 segmenti di fibra). Le fibre sono state poi "raggruppate" in campioni di tipo I e di tipo II, che hanno permesso la replicazione sperimentale9. Tuttavia, una limitazione è stata che sono stati ottenuti solo due campioni specifici per tipo di fibra: di tipo I (MHCI positivo) e di tipo II (fibre MHCII positive), con campioni di tipo II contenenti una miscela di MHCIIa e MHCIIx 6,10. In particolare, il protocollo corrente dimostra come è possibile identificare le fibre pure di tipo IIx e fornisce un flusso di lavoro altamente dettagliato (riepilogato nella Figura 1), comprese le strategie di risoluzione dei problemi comuni del protocollo.
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Protocol
Campioni di muscolo umano sono stati ottenuti dal vasto laterale di n = 3 (2 maschi, 1 femmina), di età compresa tra 70 e 74 anni in condizioni sterili utilizzando l'anestesia locale (xilocaina) e un ago di Bergstrom modificato per l'aspirazione manuale11,12. I campioni erano un sottoinsieme di uno studio precedente approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Università di Victoria (HRETH11/221) e condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki13. I partecipanti hanno fornito il consenso scritto e informato per partecipare a questo studio. I dettagli completi di tutti i materiali richiesti per questo protocollo sono riportati nella Tabella dei materiali. Inoltre, nella Tabella 1 viene fornito un elenco di strategie di risoluzione dei problemi che risolvono i problemi comuni del protocollo.
1. Liofilizzazione
- Mantenendo i campioni muscolari sottoposti a biopsia congelati su ghiaccio secco, pesare e tarare una provetta congelata vuota sulla bilancia.
- Pesare rapidamente un minimo di 10 mg di tessuto congelato a peso umido. Registrare il peso con una cifra decimale.
- Depositare il tessuto nella provetta per microcentrifuga preraffreddata con 3-4 fori nel coperchio e metterlo in un piccolo becher con 2-3 pellet di ghiaccio secco.
- Seguire le istruzioni per l'uso del produttore del liofilizzatore.
- Assicurarsi che tutte le valvole del liofilizzatore siano chiuse e accendere il liofilizzatore.
- Utilizzare il pannello di controllo per verificare che il set point di vuoto sia programmato per condizioni di liofilizzazione ottimali per i tessuti umani, 0,12 millibar (mBar) (Figura 2).
- Premere manualmente sul liofilizzatore e attendere che la camera si sia raffreddata a −40 oC.
- Una volta che la camera ha raggiunto quella temperatura, rimuovere il coperchio, quindi la camera di vetro e posizionare il becher (con il campione di muscoli) sul tavolino metallico.
- Riposizionare la camera di vetro e il coperchio. Chiudere la valvola di rilascio del vuoto sul coperchio e attendere che la spia della bilancia del vuoto diventi verde per assicurarsi che l'asciugatrice sia sigillata sottovuoto.
- Liofilizzare i campioni muscolari per 48 ore. Una volta completata la liofilizzazione, spegnere la pompa del vuoto premendo il pulsante del vuoto e aprire la valvola di rilascio del vuoto sul coperchio.
- Rimuovere il coperchio della camera e raccogliere il campione liofilizzato. Pesare il tessuto e registrare il peso con una cifra decimale.
- Calcolare la percentuale di perdita di peso; ~75% di diminuzione del peso indica che il tessuto è liofilizzato con successo (in questo lavoro, media ± DS, 76 ± 9%, n = 11 campioni muscolari).
- Premere AUTO per spegnere la pompa del vuoto e il congelatore. Lasciare che l'unità raggiunga la temperatura ambiente.
- Pulire le serpentine di raffreddamento secondo le istruzioni del produttore e scaricare il liquido accumulato dal collettore.
NOTA: La raccolta delle fibre può iniziare immediatamente. Quando il tessuto non viene utilizzato per l'isolamento delle fibre, conservare il campione liofilizzato a -80 °C in un contenitore sigillato con perle essiccanti. ATTENZIONE: Il ghiaccio secco è pericoloso (Classe 9); fare riferimento alla scheda di sicurezza per una manipolazione sicura consigliata.
2. Raccolta delle fibre
- Preparazione della raccolta delle fibre
- Etichettare un minimo di 50 provette per microfuge (fibre da 1 a 50) e pipettare 10 μL di tampone denaturante a ciascuna provetta.
- Preparare l'area di raccolta con due paia di pinze per dissezione di tessuti fini, un tessuto privo di lanugine, una lampada da banco, uno stereomicroscopio (con il tavolino nero sollevato), un vortice e una centrifuga da banco.
- Posizionare il campione di muscolo liofilizzato sul coperchio di una piastra di Petri. Posizionare il coperchio sul tavolino del microscopio da dissezione.
- Guarda il video della dissezione a fibra singola. Mettere in pratica il protocollo completo, dalla raccolta della fibra all'identificazione del tipo di fibra singola, almeno due volte prima di iniziare uno studio.
- Prima della raccolta delle fibre, calcolare il volume totale richiesto per un campione di tipo di fibra da ciascuna biopsia come segue. Ad esempio, se il volume iniziale di 1 fibra = 10 μL e il volume rimanente dopo MyDoBID è (1 fibra × 10 μL) - 1 μL utilizzato per il dot blotting = 9 μL (volume del campione), calcolare il volume totale del campione richiesto moltiplicando il volume del campione (μL) per il numero totale di western blot che verranno eseguiti e raddoppiare questa quantità per tenere conto della ridondanza: (9 μL × 4 western blot) × 2 = 72 μL. Calcolare il numero di fibre necessarie per campione tipizzato dividendo il volume finale del campione richiesto (μL) per il volume del campione per campione specifico del tipo di fibra (ad esempio, 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibre per campione specifico del tipo di fibra). Per raggiungere questo obiettivo, raccogli un totale di 50 fibre.
NOTA: Il volume del campione richiesto è la concentrazione proteica minima richiesta per eseguire sia MyDoBID che il western blotting se la quantità di proteine caricate è equivalente a una fibra di ~3 mm (~12 μg di peso umido) per ciascun campione (vedere il file supplementare 1 per i dettagli). Tuttavia, questo volume non tiene conto del fatto che siano necessari gel ripetuti per una determinata proteina. ATTENZIONE: Le pinze sono affilate; maneggiarli con cura per evitare il rischio di puntura della pelle.
- Isolamento a fibra singola
- Su un piccolo foglio di carta di 5 cm x 1 cm, usa un righello per tracciare una linea di 1 cm. Segna ogni 1 mm su quella linea.
- Inseriscilo sotto il coperchio della capsula di Petri come guida per stimare la lunghezza delle fibre raccolte.
- Posizionare il campione di muscolo liofilizzato sotto lo stereomicroscopio a basso ingrandimento (x 7,5). Usa un paio di pinze per la dissezione dei tessuti fini per tenere in posizione il muscolo liofilizzato e con l'altro inizia a separare piccoli fasci di fibre (come si vede nel video).
- Isolare un fascio di fibre e continuare a separare fino a quando i singoli segmenti di fibra non sono isolati dal fascio.
- Raccogli un minimo di 50 fibre di almeno ~ 1 mm di lunghezza.
- Sposta la fibra in uno spazio vuoto sulla capsula di Petri. Ispezionare i segmenti a fibra singola con un ingrandimento maggiore (x 50). Assicurati che sia una singola fibra separando ulteriormente la fibra all'estremità. Se la fibra si rompe invece di separarsi, si tratta di una singola fibra.
- Denaturazione delle fibre
- Usando una pinza, raccogliere delicatamente la fibra e posizionarla direttamente nel tampone denaturante aliquotato (non lasciare che il forcipe incontri il tampone).
- Controllare le pinze sotto il microscopio per assicurarsi che la fibra sia stata rimossa con successo. Chiudere il tubo e picchiettare saldamente il fondo del tubo sul banco tre volte per assicurarsi che la fibra si sposti nel tampone.
- Pulisci la pinza con un panno privo di lanugine prima di passare alla fibra successiva. Ripeti questo processo fino a quando tutte le fibre non sono state raccolte.
- Vorticare i campioni di fibre e centrifugare brevemente per 5 secondi a 2.500 × g per aspirare il campione sul fondo della provetta.
NOTA: La durata della centrifugazione (5 s) è temporizzata dall'inizio (0 × g) fino a quando la velocità raggiunge ~2.500 × g. - Lasciare i campioni a temperatura ambiente per 1 ora. Conservare a -80 °C per un uso futuro. Congelare e scongelare i campioni prima dell'uso.
3. Tamponamento a punti
- Preparazione e attivazione della membrana
- Misurare, etichettare e tagliare a misura una membrana in difluoruro di polivinilidene (PVDF) (dimensione dei pori di 0,2 μm) per adattarsi a 50 campioni (~10,5 cm x 5,5 cm).
- Segna il bordo sinistro numericamente dall'alto verso il basso (da 1 a 10) e il bordo superiore in ordine alfabetico da sinistra a destra (da A a E) distanziati di 1 cm l'uno dall'altro.
- Preparare quattro fogli di carta da filtro delle dimensioni di 12,5 cm x 7,5 cm.
- Impila due fogli insieme per formare una pila. Preimmergere la risma di carta da filtro in 1x tampone di trasferimento.
- Mettere la membrana in un contenitore. Versare etanolo al 95% sulla membrana, con un volume sufficiente per immergere completamente la membrana (10-15 ml). Agitare sul bilanciere per 1 min.
- Raccogliere l'etanolo, immergere la membrana in 1x tampone di trasferimento (~15 mL) e scuotere per altri 2 minuti.
NOTA: Sia l'etanolo che il tampone di trasferimento possono essere riutilizzati per futuri esperimenti di dot blotting fino a quando non si forma la sedimentazione (cambiare dopo sei utilizzi). - Appoggiare la pila di carta da filtro imbevuta di tampone di trasferimento su una superficie mobile piana come un coperchio grande e appiattirla con il rullo. Posizionare la membrana in PVDF sulla pila utilizzando un distaccante di gel o una pinzetta.
- Posizionare un singolo foglio di carta da filtro asciutta sopra la membrana e spostare il rullo sulla carta da filtro per assorbire il tampone in eccesso sulla superficie della membrana. Rimuovere la carta da filtro superiore senza strofinare la membrana.
ATTENZIONE: Il metanolo (Classe 3, sottorischio 6.1) e l'etanolo (Classe 3) sono pericolosi. Fare riferimento alla scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) per raccomandazioni sulla manipolazione sicura.
- Assorbimento del campione nella membrana
- Scongelare i campioni di fibre, eseguire una breve centrifuga (5 s) a temperatura ambiente come al punto 2.3.4 e mescolare accuratamente il campione.
- Senza toccare la membrana con il puntale della pipetta, depositare lentamente una goccia di ~1 μL di ciascun campione sulla membrana nell'area designata. Le dimensioni dell'area designata per campione di fibra sono ~1 cm x 1 cm. Cerca di individuare il campione al centro di quest'area.
- Lasciare che le goccioline del campione penetrino attraverso la membrana per almeno 15 minuti. Assicurarsi che non rimanga alcun tampone campione e che sia completamente assorbito.
- Usando una pinzetta di plastica, sollevare con cautela la membrana dall'annuncioamp pila di carta da filtro, posizionarla su un singolo foglio asciutto di carta da filtro e disidratare la membrana per almeno 5 minuti.
- Una volta che le macchie del campione diventano completamente bianche, riattivare la membrana.
- Riattivazione e blocco della membrana
- Riattivare la membrana ripetendo i passaggi 3.1.5 e 3.1.6.
- Mettere la membrana nel tampone di lavaggio e risciacquare per 5 minuti a dondolo. Gettare il tampone di lavaggio.
- Incubare la membrana nel tampone bloccante per 30 minuti mentre si dondola.
- Risciacquare la membrana 3 volte con tampone di lavaggio fino a quando il tampone non è più torbido.
- Lasciare la membrana nel lavaggio finale sul bilanciere.
4. Immunoetichettatura
- Rilevamento di MHCIIa
- Diluire l'anticorpo primario MHCIIa a 1 su 200 in 10 mL di tampone di albumina sierica bovina (BSA).
- Eliminare il tampone di lavaggio dalla membrana e quindi versare l'anticorpo MHCIIa diluito sulla membrana.
- Posizionare il contenitore (con la membrana in MHCIIa) sul bilanciere a temperatura ambiente per 2 h o a 4 °C per tutta la notte.
- Raccogliere l'anticorpo MHCIIa e conservarlo a 4 °C. Lavare la membrana con tampone bloccante per 2 minuti sul bilanciere.
NOTA: Tutti gli anticorpi primari possono essere riutilizzati fino a cinque volte finché il tampone rimane limpido. - Risciacquare altre due volte; 5 minuti ogni volta; Tre lavaggi in totale.
- Diluire l'anticorpo secondario dell'immunoglobulina G di rafano perossidasi (IgG-HRP) di topo a 1 su 20.000 in 10 mL di tampone bloccante e aggiungerlo alla membrana.
- Scartare il tampone di lavaggio e incubare la membrana in IgG-HRP secondarie di topo con oscillazione per 1 h.
- Scartare il secondario e lavare la membrana in tampone di lavaggio (2, 5, 5 min).
- Lasciare la membrana in ammollo nel lavaggio finale fino al momento dell'imaging.
- Accendere la gel imager, attendere 15 minuti affinché raggiunga la temperatura di esercizio richiesta, quindi aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali).
- Nella finestra del software, fare clic su Nuovo protocollo a canale singolo (Figura 3A). Per un'immagine a luce bianca della membrana, in Applicazioni | Macchie | fare clic su Colorimetrico (Figura 3B).
- Fare clic sull'area del gel; Ogni opzione è programmata per dimensioni specifiche per adattarsi alle dimensioni di vari tipi di gel. Selezionare l'opzione appropriata per adattarsi al meglio alle dimensioni della membrana (Figura 3C).
- Preparare l'ECL combinando i reagenti luminol e perossidasi in un rapporto 1:1. Produrre un volume sufficiente di miscela ECL per coprire l'intera membrana, in genere è richiesto un volume totale di 800-1.000 μL.
- Posizionare la membrana su un ampio vassoio di plastica trasparente e disperdere la miscela ECL sulla membrana.
- Posizionare la membrana sulla piastra ai fosfori.
- Fare clic su Posiziona gel (pulsante giallo) per una vista della telecamera dal vivo. Fare clic su Tieni premuto e trascinare il pulsante di zoom per ingrandire l'area di imaging della membrana. A questo punto, raddrizzare la posizione della membrana se necessario.
- Fare clic su Run Protocol (pulsante verde) e attendere che venga prodotta un'immagine colorimetrica della membrana. Salvare questa immagine per facilitare l'abbinamento dei punti al campione di fibre corrispondente.
- Senza spostare la membrana, modificare l'applicazione sul software facendo clic sull'opzione per un binning 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Figura 3D).
- In Esposizione immagine e software, ottimizzare il tempo di esposizione, fare clic su Bande deboli (Figura 3E) | Modalità di accumulo del segnale.
- In Imposta, digitare 1 s per la prima immagine, 30 s per l'ultima immagine e 30 immagini totali (Figura 3F).
- Fare clic su Esegui protocollo.
- Salvare un'immagine nelle seguenti fasi: prima della saturazione del segnale (tutti i punti visibili sono neri), della saturazione iniziale del segnale (alcuni punti iniziano a saturarsi) e dei punti sovrasaturi (tutti i punti con segnale forte rilevato sono saturi).
- Salvare tutte le immagini richieste prima di terminare l'accumulo del segnale. Estrarre la membrana dall'imager.
- Utilizzando il distaccante di gel, riposizionare la membrana nel contenitore con il tampone di lavaggio.
- Rilevamento di MHCI
- Versare il tampone di lavaggio e trattare la membrana con tampone di strippaggio per 30 minuti a 37 °C (assicurarsi che la membrana sia completamente immersa).
- Raccogliere il tampone di strippaggio e sciacquare la membrana nel tampone di lavaggio per 5 minuti con oscillazione.
NOTA: Il tampone di strippaggio può essere riutilizzato 10 volte prima di essere eliminato. - Versare il tampone di lavaggio e questa volta applicare l'anticorpo primario MHCI diluito a una concentrazione iniziale di 1 su 200 (intervallo: da 1 su 200 a 1 su 500). Scuotere la membrana a temperatura ambiente per 1 h.
- Dopo l'incubazione nell'anticorpo primario MHCI, raccogliere nuovamente l'anticorpo e lavare la membrana come nei passaggi 4.1.4 e 4.1.5.
- Diluire l'anticorpo secondario IgM HRP di topo nel tampone bloccante a 1 su 20.000. Versare il tampone bloccante dalla membrana e incubare nelle IgM secondarie di topo come al punto 4.1.7.
- Il lavaggio e l'acquisizione dell'immagine hanno rilevato MHCI come nei passaggi da 4.1.8 a 4.1.24.
ATTENZIONE: Il tampone di stripping contiene fosfina organica al 3-5% (classe 8). Fare riferimento alla scheda di sicurezza per le raccomandazioni sulla manipolazione sicura.
- Rilevamento di potenziali MHCIIx mediante actina
- Spelare nuovamente la membrana (punti 4.2.1 e 4.2.2).
- Ripetere il paragrafo 4.1, questa volta applicando l'anticorpo primario di actina diluito a 1 su 500 nel tampone BSA e poi l'anticorpo secondario HRP di coniglio diluito a 1 su 20.000 nel tampone bloccante.
5. Identificazione del tipo di fibra
- Analisi del segnale MHCI, MHCIIa e actina
- Acquisire familiarità con il pannello dell'intensità del segnale (Figura 4A). Prendere nota dei passaggi da 5.1.2 a 5.1.4.
- Un'intensità del segnale saturo indica qualitativamente che il rilevamento della proteina è forte.
- Un moderato indica che la proteina bersaglio è presente a un livello medio.
- Un debole segnale indica che è presente poca proteina bersaglio.
- Utilizzare il pannello dell'intensità del segnale per classificare le fibre con intensità del segnale "satura", "moderata" o "debole" (Figura 4A).
- Eseguire l'identificazione del tipo di fibra confrontando prima i risultati di MHCIIa e MHCI (Figura 4B, macchie a sinistra e al centro).
- Registra fibre con intensità del segnale satura o moderata di una sola isoforma MHC.
- Se il segnale dell'isoforma MHC è "debole", lasciare la fibra non contrassegnata (vedere la Figura 4B).
- Infine, se si osserva actina (intensità del segnale moderata o satura) nelle fibre senza MHCI o IIa rilevati, registrarla come potenziale fibra di tipo IIx (Figura 4B, macchia a destra).
- Registrare le fibre con un debole segnale isoforme MHC ma l'actina rilevata (intensità moderata o satura) non è stata identificata.
- Scartare i campioni con rilevamento debole o assente (nessuna fibra raccolta) per tutte e tre le proteine bersaglio (Figura 4C).
- Registra qualsiasi fibra in cui vengono rilevati sia i segnali MHCI che MHCII con un segnale "saturo" o moderato. Questi campioni non sono destinati all'uso nella preparazione specifica del tipo di fibra.
- Preparazione di campioni specifici per tipo di fibra
- Preparare un campione separato di tipo I e di tipo II per ogni biopsia. Per un campione di tipo II, combinare il numero minimo richiesto di fibre (calcolato al punto 2.1.5) in cui viene rilevata MHCIIa a livelli saturi o moderati.
- In una provetta separata etichettata come tipo I, ripetere questo processo per le fibre in cui viene rilevato MHCI (Figura 4D).
- Utilizzare fibre con intensità di segnale moderata se non ci sono abbastanza fibre con segnali saturi.
- Combina tutte le potenziali fibre IIx.
- Utilizzare immediatamente campioni specifici per il tipo di fibra per il western blotting o conservarli a -80 °C per un uso futuro.
6. Conferma del tipo di fibra Western blot
- Utilizzare 10 μL di ciascun campione specifico per il tipo di fibra (il volume minimo di campione richiesto, vedere il passaggio 2.1.5).
- Separare i campioni utilizzando il gel prefabbricato specificato tramite SDS-PAGE secondo il protocollo del produttore.
- Utilizzare un gel imager per rilevare la proteina nel gel secondo il protocollo del produttore.
- Mettere il gel nel tampone di trasferimento 1x freddo per 10 minuti.
- Trasferire a umido le proteine su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) secondo il protocollo del produttore.
- Dopo il trasferimento, sciacquare brevemente la membrana con H2O ultrapuro in un contenitore. Versare l'acqua ultrapura.
- Aggiungere 10 mL di soluzione di potenziamento del segnale anticorpale alla membrana e scuotere a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Raccogliere la soluzione di potenziamento del segnale anticorpale e lavare 5 volte (5 s per lavaggio) con H2O ultrapuro.
NOTA: La soluzione di potenziamento del segnale anticorpale può essere utilizzata 5 volte prima di essere eliminata. - Versare l'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione bloccante e far oscillare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Utilizzare una lama di bisturi pulita o delle forbici per tagliare orizzontalmente la membrana a un peso molecolare che assicuri che le proteine di 180 kDa e oltre si trovino sulla sezione superiore della membrana.
- Utilizzare questa sezione superiore per un'ulteriore conferma del tipo di fibra.
- Utilizzare la porzione inferiore a 180 kDa per rilevare diverse proteine bersaglio.
- Sulla parte superiore della membrana, seguire il paragrafo 4.1 con l'anticorpo MHCIIx primario e l'anticorpo secondario HRP Immunoglobulina M (IgM) di topo.
- Rimuovere la membrana (come descritto nei paragrafi 4.2.1 e 4.2.2) prima di ripetere il processo con l'anticorpo MHCIIa IgG primario e l'anticorpo secondario IgG HRP di topo.
- Rimuovere ancora una volta e infine applicare l'anticorpo MHCI IgM primario e l'anticorpo secondario IgM HRP di topo.
NOTA: Questo passaggio è qualitativo e quindi qualsiasi perdita di proteine dovuta allo stripping della membrana non è un problema. - Confrontare il segnale rilevato tra le diverse isoforme MHC (come mostrato nella Figura 5B). Quando l'intensità del segnale viene rilevata a livelli da moderati a saturi nel campione previsto (MHCI - tipo I, MHCIIa - tipo II e MHCIIx - tipo IIx) i campioni specifici del tipo di fibra saranno registrati come affidabili per l'uso in studi futuri.
- Registrare il campione come inaffidabile quando più di un'isoforma MHC viene rilevata allo stesso modo in un campione.
ATTENZIONE: La soluzione di potenziamento degli anticorpi contiene idrossido di sodio al 50%. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per le raccomandazioni sulla manipolazione sicura.
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Representative Results
Identificazione delle singole fibre muscolari MHCI, MHCIIa e MHCIIx mediante dot blotting
Una caratteristica di MyDoBID è la categorizzazione della diversa intensità del segnale MHC e Actin in una data fibra (Figura 4A). Il tipo di fibra è stato identificato dalla presenza o dall'assenza delle isoforme MHCI e IIa (Figura 4B). Sei fibre non hanno mostrato alcun rilevamento di MHC o actina, indicando che non c'era alcuna fibra raccolta. I risultati di questo specifico dot blot sono stati l'identificazione di 22 fibre di tipo II, 7 fibre di tipo I e 3 potenziali fibre di tipo IIx; 2 campioni non identificati e 6 campioni sono stati classificati come "No Fiber" raccolti (Figura 4B, C). Le fibre che non avevano alcun segnale MHCI o MHCIIa rilevabile, ma che erano positive per l'actina, sono state identificate come potenziali fibre di tipo IIx mediante un processo di eliminazione. Utilizzando il pannello di intensità del segnale per classificare l'intensità del segnale MHCI e IIa, le fibre "moderate" o "sature" sono state combinate per produrre campioni di tipo I o II, rispettivamente. Le fibre che non erano state identificate o che avevano una debole o nessuna actina rilevata non sono state incluse nell'analisi successiva e sono state scartate (Figura 4D).
Conferma della tipizzazione delle fibre mediante western blotting
I campioni specifici per tipo di fibra sono stati convalidati utilizzando il western blotting e gli anticorpi specifici per MHC (Figura 5). I campioni di fibre di tipo I e di tipo II di una singola biopsia sono stati eseguiti insieme a un campione di tipo IIx, che era un campione di potenziali fibre di tipo IIx di due individui a causa del basso numero di fibre di tipo IIx presenti in ciascuna biopsia. I dati di Western blot hanno confermato che l'identificazione del tipo di fibra ha avuto successo.
Figura 1: Riepilogo del flusso di lavoro che delinea la preparazione del campione, la tipizzazione delle fibre e la conferma della specificità delle fibre da parte del western blot . (A) Il tessuto umano viene liofilizzato per 48 ore. (B,C) I singoli segmenti di fibra vengono isolati al microscopio da dissezione. (D) Le fibre vengono denaturate e (E) dopo 1 ora, conservate a -80 °C. (F) Ordine di incubazione degli anticorpi primari. (G) Le fibre sono state tamponate a punti e il tipo di fibra identificato utilizzando MHCIIa (tipo II), MHCI (tipo I) e actina (IIx?, potenziale fibra di tipo IIx). (H) Le fibre sono state poi raggruppate. (I) I campioni specifici del tipo di fibra insieme a una curva di calibrazione vengono analizzati tramite SDS PAGE e western blotting. (J) Convalida dell'identificazione del tipo di fibra mediante western blotting. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schermo di visualizzazione e pannello di controllo del sistema di liofilizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Impostazioni dell'imager per la cattura della luce bianca della membrana seguita dal rilevamento chemiluminescente delle proteine bersaglio. Per visualizzare l'immagine della membrana sotto la luce bianca, (A) selezionare Nuovo canale singolo seguito da (B) Macchie | applicazione colorimetrica . (C) In base alle dimensioni del gel utilizzato, selezionare l'area di imaging appropriata, quindi acquisire un'immagine a luce bianca premendo Run Protocol. (D) Senza muovere la membrana, ripetere il passaggio B ma questa volta, scegliendo Macchie | Chemi Hi Risoluzione. Prima di premere Esegui, scegliere (E) Esposizione immagine per ottimizzare le bande deboli e (F) impostare la modalità di accumulo del segnale e, in prima istanza, impostare il tempo di esposizione per ogni secondo per un totale di 30 secondi con i pixel saturi di luce selezionati. Premere Run Protocol e attendere il completamento dell'esecuzione prima di selezionare le immagini migliori da salvare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione del tipo di fibra. (A) I tipi di fibre sono stati identificati rispetto a tutte le altre fibre sulla membrana, classificate dal pannello di intensità del segnale per ogni isoforma MHC rilevata (ad esempio, segnale MHCI: Saturato, Moderato e Debole). (B) Utilizzando il pannello in (A), l'anticorpo MHCIIa ha identificato le fibre di tipo II (blu, macchia sinistra) e, dopo aver rimosso la membrana, l'anticorpo MHCI ha identificato le fibre di tipo I (rosso, macchia centrale). L'anticorpo dell'actina è stato utilizzato per identificare potenziali fibre IIx se è stato rilevato un segnale positivo di actina in fibre in cui non è stato rilevato alcun precedente segnale MHCI o IIa (verde, macchia a destra). Le fibre che non hanno seguito queste linee guida sono evidenziate in viola (non identificate). Infine, i campioni negativi per il segnale di actina indicavano che non era stata raccolta alcuna fibra («No Fiber»). (C) Tabella che mostra l'etichettatura delle fibre corrispondente alla posizione del campione sui dot blot mostrati in (B). (D) Schema di selezione delle fibre per la preparazione di campioni specifici per tipo di fibra. L'obiettivo era quello di raccogliere 10 fibre sature per ogni tipo di fibra. Qui, per le fibre di tipo II, sono state identificate e raggruppate otto fibre sature. Per le fibre di tipo I, erano presenti meno di 10 fibre sature, quindi sono state selezionate anche fibre con moderata potenza del segnale. Per le fibre di tipo IIx, sono state identificate e raggruppate due fibre. Se vengono identificate meno di 10 fibre (sature e moderate), potrebbe essere necessaria un'ulteriore raccolta di fibre. NOTA: Il segnale di actina mostrato in (B) non ha raggiunto la saturazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conferma Western blot dell'identificazione del tipo di fibra. L'identificazione del tipo di fibra è stata effettuata come da Figura 4 per generare campioni di tipo I (~10 fibre) e di tipo II (~10 fibre). Poiché non sono state identificate fibre IIx dalla stessa biopsia, il campione IIx mostrato qui è stato prodotto da più di un campione muscolare (n = 2 individui). Una piccola aliquota di ciascun campione specifico della fibra viene analizzata mediante western blotting per confermare l'identificazione del tipo di fibra. I marcatori di peso molecolare (kDa) sono indicati a sinistra, catturati sotto luce bianca senza muovere la membrana. Le proteine bersaglio vengono rilevate nella sequenza di MHCIIx, MHCIIa e MHCI, con la miosina del gel attivato dai raggi UV che indica visivamente la quantità di proteine caricate per campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Strategie di risoluzione dei problemi di protocollo comuni. Clicca qui per scaricare questa tabella.
File supplementare 1: Calcolo della massa di fibra liofilizzata utilizzando una curva di calibrazione. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Raccolta fibre
Sulla base di diversi anni di esperienza, la maggior parte dei ricercatori è in grado di padroneggiare questa tecnica; Tuttavia, la pratica porta a una raccolta più rapida ed efficiente delle fibre per le analisi a valle. Per essere in grado di isolare 30 segmenti di fibra singola di una qualità per il pooling, si consiglia di raccogliere 50 segmenti di fibra per campione. Si consiglia di studiare attentamente il video di raccolta delle fibre e dopo aver eseguito due sessioni di pratica (~ 50 fibre per sessione) per raggiungere uno standard ragionevole. Tutte le fibre raccolte vengono sottoposte a MyDoBID per identificare il tipo di fibra, che rivelerà l'efficacia con cui viene eseguita la tecnica. Questo sarebbe visto come un basso numero di segnali MHC "senza fibra" o "debole" rilevati in campioni di fibra (vedere la sezione 5.1 del protocollo).
È noto che il muscolo può contenere fibre ibride, in cui sono presenti sia MHCI che MHCIIa, o MHCIIa e IIx 2,14. Un limite di MyDoBID è che la presenza di una fibra ibrida non può essere accertata perché un campione positivo per entrambi gli anticorpi MHCI e MHCIIa potrebbe essere una fibra ibrida o che siano state raccolte due fibre. Inoltre, MyDoBID non è in grado di rilevare MHCIIa separatamente dagli ibridi MHCIIa/IIx poiché l'anticorpo primario MHCIIa rileverebbe la presenza di MHCIIa sia nelle fibre IIa che IIa/IIx. Per questi motivi, l'identificazione e la preparazione di campioni di fibre ibride non sono stati eseguiti e i campioni che hanno entrambi i segnali MHCI e MHCIIa che non rientravano negli intervalli descritti nel pannello di intensità del segnale sono stati scartati (Figura 4A). Un'ulteriore limitazione è che la proporzione di tipi di fibre muscolari in un campione non può essere determinata utilizzando MyDoBID e l'applicazione di analisi immunoistochimiche convenzionali è necessaria per determinare la distribuzione del tipo di fibra2.
Tamponamento a punti
Il pannello di intensità del segnale e l'ID del tipo di fibra si basano sul fatto che l'intero campione sia rappresentato nel piccolo volume applicato alla membrana di dot blotting. A tal fine, il campione viene accuratamente miscelato mediante agitazione prima di caricarlo sulla membrana. Tutte le fibre con una sola isoforma MHC passano alla fase successiva di pooling. In questa fase, è importante che qualsiasi fibra con più di un MHC non debba procedere a questa fase successiva di combinazione dei campioni. Se un campione è contaminato, l'intero campione aggregato deve essere scartato e il ricercatore deve tornare alla raccolta delle fibre e ripetere le fasi di isolamento delle fibre e dot blotting.
Immunoetichettatura
In precedenza è stato riportato che 5 minuti è un tempo adeguato per bloccare i siti non specifici sulla membrana per la rilevazione di MHCI e MHCIIa9. L'avanzamento della tecnica a MyDoBID richiede l'utilizzo di un anticorpo di actina. È stato riscontrato che il tempo di blocco di 5 minuti doveva essere aumentato a 30 minuti, come riportato6, per ottenere una membrana con uno sfondo minimo, poiché il blocco di 5 minuti ha portato a uno sfondo di membrana più scuro. Il tempo di blocco è una considerazione in qualsiasi tecnica di immunorilevazione, come il western blotting o l'immunoistochimica, e deve essere modificato in modo appropriato.
Rimozione della membrana
Lo stripping non può essere utilizzato per le analisi quantitative15 perché rimuove anche le proteine di interesse, ma può essere utilizzato in MyDoBID poiché si tratta di un test qualitativo. Lo scopo dello stripping è quello di rimuovere gli anticorpi legati dalla superficie della membrana, consentendo l'utilizzo di un nuovo anticorpo con un'interferenza minima da parte dell'anticorpo precedente. In MyDoBID, c'è la possibilità di applicare il campione su due membrane, dove le diverse isoforme MHC vengono rilevate su membrane separate. Se si preferisce questo approccio, evitare di maneggiare la provetta più di una volta caricando contemporaneamente i punti. Ciò garantirà che il tempo di essiccazione tra ogni punto di campionamento sia simile (~5 s di differenza) e che le fasi successive vengano eseguite contemporaneamente in contenitori separati. Va notato che questa opzione aumenterebbe il tempo, il campione e il consumo di materiali di consumo.
Gli anticorpi vengono applicati per rilevare prima le fibre MHCIIa, seguite dall'MHCI, perché l'anticorpo MHCI fornisce sempre un segnale molto luminoso, che sarebbe più difficile da rimuovere rispetto all'MHCIIa. L'actina è espressa in modo omogeneo nelle fibre muscolari scheletriche e viene utilizzata per confermare che una parte della fibra è stata applicata con successo alla membrana come descritto sopra.
Imaging, identificazione del tipo di fibra e preparazione di campioni specifici per tipo di fibra
In questo protocollo è stato sviluppato un nuovo strumento per facilitare l'identificazione del tipo di fibra e la selezione del campione per creare campioni specifici per il tipo di fibra (Figura 4A). L'esempio mostrato nel pannello dell'intensità del segnale viene utilizzato per definire l'intensità del segnale MHCI come: (i) satura, (ii) moderata o (iii) debole. Per raggruppare le fibre in campioni specifici del tipo di fibra, vengono selezionate per prime le fibre che mostrano un'intensità del segnale satura e, se necessario, vengono aggiunte fibre con intensità del segnale moderata. Quando si preparano campioni di tipo I e II, ci sono in genere abbastanza fibre "sature" e "moderate" in modo che le fibre classificate come "deboli" o non identificate possano essere scartate.
Novità nell'utilizzo dell'actina al posto dell'anticorpo MHCIIx per identificare le fibre pure di tipo IIx
In precedenza, per identificare le fibre IIx pure, il segnale MHCIIx veniva soggettivamente confrontato con il segnale MHCI e MHCIIa su un dot blot e, mediante un processo di eliminazione, le fibre senza segnale MHCI o IIa, ma con segnale MHCIIx, sono state identificate come IIx pure. Tuttavia, possono sorgere problemi quando si utilizzano due anticorpi primari IgM di topo (MHCIIx e MHCI) sulla stessa membrana. Nonostante lo stripping della membrana tra gli anticorpi primari, può essere rilevato il segnale anticorpale residuo. L'utilizzo dell'anticorpo primario anti-actina di coniglio previene il verificarsi di questo problema. Qui abbiamo usato l'actina per confermare che una fibra è stata raccolta e, in assenza sia di MHCI che di MHCIIa, indica che era presente una fibra IIx. Le potenziali fibre IIx vengono quindi confermate mediante western blotting utilizzando l'anticorpo specifico MHCIIx (vedere la Figura 5 in questo documento e la Figura 2 in9). L'anticorpo 6H1 ha dimostrato16 di rilevare la banda separata elettroforeticamente corrispondente a MHCIIx nel muscolo scheletrico di ratto ed etichetta le fibre di tipo IIx nelle sezioni trasversali dei muscoli di topo, ratto e uomo2.
Conferma del tipo di fibra Western blot
È buona norma eseguire tutti i campioni specifici del tipo di fibra dalla stessa biopsia sullo stesso gel. Con l'anticorpo MHCI che richiede lo stesso anticorpo secondario di MHCIIx, i campioni di tipo I e IIx devono essere separati da almeno una corsia su un dato gel, come mostrato nella Figura 5. Poiché il contenuto proteico varia tra i campioni specifici del tipo di fibra a causa della dimensione variabile della fibra, il primo gel deve essere utilizzato per determinare il volume del campione che deve essere caricato nei successivi cicli di gel per ottenere quantità simili di proteine in tutti i campioni. A tal fine, la proteina totale in un determinato campione viene determinata utilizzando la tecnologia di imaging su gel attivata dai raggi UV per visualizzare tutte le bande proteiche che sono state separate nel gel da SDS-PAGE prima del trasferimento. La proteina totale in ciascun campione viene determinata dall'immagine del gel e utilizzata per correggere il carico ineguale nel successivo ciclo di western blot, a condizione che una curva di calibrazione di diverse masse note di tessuto muscolare scheletrico venga eseguita insieme ai campioni specifici del tipo di fibra 3,4,6,17. Inoltre, non è necessario utilizzare una proteina "housekeeping" come l'actina per determinare la proteina totale, che richiederebbe anche una propria curva di calibrazione15. Questa tecnologia è un metodo accurato e che consente di risparmiare tempo per determinare la proteina totale e può essere eseguita con un campione molto piccolo (cioè ~ 1/5 di una fibra9) senza la necessità di reagenti aggiuntivi o standard proteici, massimizzando tutte le sezioni della membrana per rilevare leproteine di interesse.
Quando si tratta di immunomarcatura durante la fase di western blot, l'anticorpo MHCIIx viene applicato per primo a causa dell'abbondanza relativamente bassa di MHCIIx rispetto alle altre isoforme MHC. Una volta che la membrana è pronta per il rilevamento dell'anticorpo MHCI, deve essere stata sottoposta a due fasi di stripping (cioè dopo il rilevamento MHCIIx e MHCIIa). Di conseguenza, il rilevamento di MHCI dovrebbe essere rilevato principalmente in un campione di tipo I, con un segnale residuo minimo rilevato dai precedenti anticorpi MHC (Figura 5). Il Western blotting viene utilizzato per confermare la purezza di ciascun campione specifico per tipo di fibra utilizzando tutti e tre gli anticorpi MHC sulla stessa porzione di membrana. Tuttavia, la necessità di stripping verrebbe eliminata se gli anticorpi MHCI o MHCIIx fossero allevati in una specie ospite diversa come coniglio o capra.
Applicazioni
La metodologia qui descritta può essere utilizzata per la tipizzazione di singoli segmenti di fibre da muscolo scheletrico fresco o liofilizzato per esaminare l'espressione proteica specifica del tipo di fibra nel muscolo scheletrico umano. Inoltre, utilizzando campioni di muscolo freschi, è possibile utilizzare fibre intatte o spellate meccanicamente6. L'uso di una fibra con pelle consente un ulteriore esame dell'espressione proteica nei compartimenti subcellulari come quelli nei compartimenti del citosol e della membrana. Questa applicazione è stata precedentemente utilizzata per misurare la quantità di glicogeno che è legata rispetto a quella non legata in segmenti di fibre a pelle meccanica di individui sani e diabetici6. È importante sottolineare che MyDoBID è utile per gli esperimenti che utilizzano solo campioni denaturati e non sarebbe appropriato per gli studi che richiedono proteine nel loro stato nativo. Sebbene sia possibile che altre analisi, come saggi enzimatici o approcci proteomici in soluzione, possano essere eseguite in condizioni native, sarebbe necessaria un'ulteriore ottimizzazione in modo che una parte della fibra possa essere rimossa per l'identificazione dell'isoforma MHC utilizzando MyDoBID.
In sintesi, il tipo I, il tipo II e il tipo IIx possono essere identificati con successo mediante l'applicazione di una tecnica semplice con materiali di consumo prontamente disponibili comunemente usati per il western blotting. Includiamo ampie informazioni pratiche, dove una volta completato con successo produrremo campioni specifici per il tipo di fibra che sono della migliore qualità, integrità e affidabilità possibili per studi futuri. Questa tecnica è l'approccio pratico e preferito per eseguire l'analisi biochimica del muscolo scheletrico specifico per le fibre.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli anticorpi contro MHC I (A4.840) e MHCIIa (A4.74) utilizzati in questo studio sono stati sviluppati dal Dr. H. M. Blau e l'anticorpo contro MHCIIx (6H1) è stato sviluppato dal Dr. C. A. Lucas e ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), grazie agli auspici del National Institute of Child Health and Human Development e mantenuto dall'Università dell'Iowa. Dipartimento di Scienze Biologiche (Iowa City, IA). Ringraziamo Victoria L. Wyckelsma per aver fornito i campioni di muscolo umano per questo studio. La maggior parte delle immagini nella Figura 1 proviene da BioRender.com.
Finanziamento:
Questo studio non ha ricevuto finanziamenti esterni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
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