Summary
Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.
Abstract
De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om specifieke myosine heavy chain (MHC) isovormen in segmenten van individuele spiervezels te identificeren met behulp van dot blotting, hierna aangeduid als Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Dit protocol beschrijft het proces van het vriesdrogen van menselijke skeletspieren en het isoleren van segmenten van afzonderlijke spiervezels. Met behulp van MyDoBID worden type I- en II-vezels geclassificeerd met respectievelijk MHCI- en IIa-specifieke antilichamen. Geclassificeerde vezels worden vervolgens gecombineerd tot vezeltypespecifieke monsters voor elke biopsie.
Het totale eiwit in elk monster wordt bepaald door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en UV-geactiveerde geltechnologie. Het vezeltype van monsters wordt gevalideerd met behulp van western blotting. Het belang van het uitvoeren van normalisatie van de eiwitbelasting om de detectie van doeleiwitten in meerdere westernvlekken te verbeteren, wordt ook beschreven. De voordelen van het consolideren van geclassificeerde vezels in vezeltypespecifieke monsters in vergelijking met westernblots met één vezel, zijn onder meer de veelzijdigheid van monsters, een grotere doorvoer van monsters, een kortere tijdsinvestering en kostenbesparende maatregelen, en dat alles met behoud van waardevolle vezeltypespecifieke informatie die vaak over het hoofd wordt gezien met behulp van gehomogeniseerde spiermonsters. Het doel van het protocol is om nauwkeurige en efficiënte identificatie te bereiken van type I- en type II-vezels geïsoleerd uit gevriesdroogde menselijke skeletspiermonsters.
Deze individuele vezels worden vervolgens gecombineerd om type I en type II vezeltype-specifieke monsters te creëren. Bovendien wordt het protocol uitgebreid met de identificatie van type IIx-vezels, waarbij actine wordt gebruikt als marker voor vezels die negatief waren voor MHCI en MHCIIa, die worden bevestigd als IIx-vezels door western blotting. Elk vezeltype-specifiek monster wordt vervolgens gebruikt om de expressie van verschillende doeleiwitten te kwantificeren met behulp van western blotting-technieken.
Introduction
Skeletspieren zijn een heterogeen weefsel, met verschillende cellulaire metabole en contractiele eigenschappen die afhankelijk zijn van het feit of de cel (vezel) langzame spiertrekkingen (type I) of snelle spiertrekkingen (type II) is. Het vezeltype kan worden geïdentificeerd door de myosine zware keten (MHC) isovormen te onderzoeken, die op verschillende manieren van elkaar verschillen, waaronder contractietijd, snelheid van verkorting en vermoeidheidsweerstand1. De belangrijkste MHC-isovormen zijn type I, type IIa, type IIb en type IIx en hun metabole profielen zijn oxidatief (type I en IIa) of glycolytisch (IIx, IIb)1. Het aandeel van deze vezeltypes varieert in spiertype en tussen soorten. Type IIb wordt veel aangetroffen in de spier van knaagdieren. Menselijke spieren bevatten geen type IIb-vezels en bestaan voornamelijk uit MHC-isovormen type I- en IIa-vezels, met een klein aandeel IIx-vezels2. Eiwitexpressieprofielen variëren tussen verschillende vezeltypes en kunnen worden gewijzigd bij veroudering3, lichaamsbeweging 4,5 en ziekte6.
Het meten van cellulaire responsen in verschillende skeletspiervezeltypes wordt vaak over het hoofd gezien of is niet mogelijk vanwege het onderzoek van spierhomogenaten (een mix van alle vezeltypes). Single-fiber western blot maakt het mogelijk om meerdere eiwitten in individuele spiervezels te onderzoeken7. Deze methodologie is eerder gebruikt om nieuwe en informatieve eigenschappen van één vezel te produceren die niet mogelijk waren om te verkrijgen met homogenaatpreparaten. Er zijn echter enkele beperkingen van de oorspronkelijke single-fiber western blot-methodologie, waaronder de tijdrovende aard, het onvermogen om monsterreplicaten te genereren en het gebruik van dure, gevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL)-reagentia. Als vers weefsel wordt gebruikt, is deze methode verder beperkt vanwege de tijdsdruk van het moeten isoleren van individuele vezels binnen een beperkt tijdsbestek (d.w.z. 1-2 uur). Gelukkig wordt deze beperking verzacht door segmenten van één vezel te isoleren van gevriesdroogd weefsel8. Het verzamelen van vezels uit gevriesdroogde monsters wordt echter beperkt door de grootte en kwaliteit van het biopsieweefsel.
Identificatie van het vezeltype met behulp van de dot blotting-methode9 is in dit uitgebreide protocol aanzienlijk uitgewerkt en uitgebreid. Eerder is aangetoond dat slechts ~2-10 mg spierweefsel met nat gewicht voldoende is voor vriesdrogen en MHC-isovormeiwitanalyse met één vezel9. Christensen et al.9 gebruikten 30% van een ~1 mm vezelsegment om de MHC-isovorm te detecteren die aanwezig was door dot-blotting, wat werd bevestigd door western blotting. Dit werk toonde aan dat door western blotting te vervangen door dot blotting, de totale kosten met ~40-voudig werden verlaagd (voor 50 vezelsegmenten). Vezels werden vervolgens "gepoold" in type I- en type II-monsters, wat experimentele replicatie mogelijk maakte9. Een beperking was echter dat er slechts twee vezeltypespecifieke monsters werden verkregen: type I (MHCI-positief) en type II (MHCII-positieve vezels), waarbij type II-monsters een mengsel van MHCIIa en MHCIIx 6,10 bevatten. Het huidige protocol laat met name zien hoe zuivere type IIx-vezels kunnen worden geïdentificeerd en biedt een zeer gedetailleerde workflow (samengevat in figuur 1), inclusief strategieën voor het oplossen van problemen met veelvoorkomende protocolproblemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke spiermonsters werden verkregen uit de vastus lateralis van n = 3 (2 mannen, 1 vrouw), in de leeftijd van 70-74 jaar oud onder steriele omstandigheden met behulp van lokale anesthesie (xylocaïne) en een Bergstrom-naald aangepast voor handmatige afzuiging11,12. De monsters waren een subset van een eerdere studie die was goedgekeurd door de Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki13. Deelnemers gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek. Volledige details van alle materialen die nodig zijn voor dit protocol worden weergegeven in de Tabel met materialen. Daarnaast vindt u in tabel 1 een lijst met strategieën voor het oplossen van veelvoorkomende protocolproblemen.
1. Vriesdrogen
- Terwijl u de biopsie-spiermonsters bevroren houdt op droogijs, weegt en tarraleert u een lege bevroren buis op de weegschaal.
- Weeg snel minimaal 10 mg bevroren weefsel met nat gewicht af. Noteer het gewicht tot op één decimaal.
- Deponeer het weefsel in de voorgekoelde microcentrifugebuis waarvan 3-4 gaatjes in het deksel zijn gestoken en plaats het in een klein bekerglas met 2-3 pellets droogijs.
- Volg de gebruiksaanwijzing van de fabrikant van de vriesdroger.
- Zorg ervoor dat alle kleppen op de vriesdroger gesloten zijn en schakel de vriesdroger in.
- Gebruik het bedieningspaneel om te controleren of het vacuüminstelpunt is geprogrammeerd voor optimale vriesdroogomstandigheden voor menselijk weefsel, 0.12 millibar (mBar) (Figuur 2).
- Druk handmatig op de vriesdroger en wacht tot de kamer is afgekoeld tot -40 °C.
- Zodra de kamer die temperatuur heeft bereikt, verwijdert u het deksel, vervolgens de glazen kamer en plaatst u het bekerglas (met spiermonster) op de metalen tafel.
- Plaats de glazen kamer en het deksel terug. Sluit de vacuümontlastklep op het deksel en wacht tot het lampje van de vacuümweegschaal groen wordt om ervoor te zorgen dat de droger vacuüm is verzegeld.
- Vriesdroog de spiermonsters gedurende 48 uur. Zodra het vriesdrogen is voltooid, schakelt u de vacuümpomp uit door op de vacuümknop te drukken en opent u het vacuümontlastventiel op het deksel.
- Verwijder het deksel van de kamer en vang het gevriesdroogde monster op. Weeg het weefsel en noteer het gewicht tot op één decimaal.
- Bereken het procentuele gewichtsverlies; ~75% gewichtsafname geeft aan dat het weefsel met succes is gevriesdroogd (in dit werk, gemiddelde ± SD, 76 ± 9%, n = 11 spiermonsters).
- Druk op AUTO om de vacuümpomp en vriezer uit te schakelen. Laat het apparaat op kamertemperatuur komen.
- Reinig de koelspiralen volgens de instructies van de fabrikant en laat de opgehoopte vloeistof uit de opvangbak lopen.
OPMERKING: De inzameling van vezels kan onmiddellijk beginnen. Wanneer weefsel niet wordt gebruikt voor vezelisolatie, bewaar het gevriesdroogde monster dan bij -80 °C in een afgesloten container met adsiccatorparels. LET OP: Droogijs is gevaarlijk (klasse 9); raadpleeg het MSDS voor aanbevolen veilige hantering.
2. Vezel inzameling
- Voorbereiding van de vezelverzameling
- Etiketteer minimaal 50 microfugebuisjes (vezel 1 tot 50) en pipetteer 10 μL denatureringsbuffer op elk buisje.
- Bereid het verzamelgebied voor met twee paar fijne weefselontledende pincetten, pluisvrij weefsel, een tafellamp, een stereomicroscoop (met de zwarte trap omhoog), een draaikolk en een tafelcentrifuge.
- Plaats het gevriesdroogde spiermonster op het deksel van een petrischaal. Plaats het deksel op de tafel van de ontleedmicroscoop.
- Bekijk de video van dissectie met één vezel. Oefen het volledige protocol, van vezelverzameling tot identificatie van het type enkele vezel, ten minste twee keer voordat u met een onderzoek begint.
- Bereken voorafgaand aan de vezelverzameling het totale volume dat nodig is voor een vezeltypemonster van elke biopsie als volgt. Bijvoorbeeld, als het startvolume van 1 vezel = 10 μL en het resterende volume na MyDoBID (1 vezel × 10 μL) - 1 μL gebruikt voor dot blotting = 9 μL (monstervolume) is, bereken dan het totale benodigde monstervolume door het monstervolume (μL) te vermenigvuldigen met het totale aantal western blots dat zal worden uitgevoerd en verdubbel dit bedrag om rekening te houden met redundantie: (9 μL × 4 western blots) × 2 = 72 μL. Bereken het aantal benodigde vezels per getypt monster door het uiteindelijke benodigde monstervolume (μL) te delen door het monstervolume per vezeltypespecifiek monster (bijv. 72 μL ÷ 9 μL = 8 vezels per vezeltypespecifiek monster). Om dit te bereiken, verzamelt u in totaal 50 vezels.
OPMERKING: Het vereiste monstervolume is de minimale eiwitconcentratie die nodig is om zowel MyDoBID als western blotting uit te voeren als de hoeveelheid geladen eiwit gelijk is aan een vezel van ~3 mm (~12 μg nat gewicht) voor elk monster (zie aanvullend bestand 1 voor details). Dit volume houdt echter geen rekening met de vraag of herhaalde gels nodig zijn voor een bepaald eiwit. LET OP: Pincetten zijn scherp; Ga er voorzichtig mee om om het risico van een lekke band te voorkomen.
- Isolatie met één vezel
- Gebruik een liniaal op een klein stukje papier van 5 cm x 1 cm om een lijn van 1 cm te trekken. Markeer elke 1 mm op die lijn.
- Steek dit onder het deksel van de petrischaal als richtlijn om de lengte van de verzamelde vezels in te schatten.
- Plaats het gevriesdroogde spiermonster onder de stereomicroscoop met een lage vergroting (x 7,5). Gebruik een pincet voor het ontleden van fijn weefsel om de gevriesdroogde spier op zijn plaats te houden en begin met de andere kleine bundels vezels te scheiden (zoals te zien is in de video).
- Isoleer een bundel vezels en blijf uit elkaar plagen totdat enkele vezelsegmenten van de bundel zijn geïsoleerd.
- Verzamel minimaal 50 vezels die minimaal ~1 mm lang zijn.
- Verplaats de vezel naar een lege ruimte op de petrischaal. Inspecteer segmenten met één vezel bij een hogere vergroting (x 50). Zorg ervoor dat het een enkele vezel is door de vezel aan het einde verder te scheiden. Als de vezel breekt in plaats van te scheiden, is het een enkele vezel.
- Denaturatie van vezels
- Verzamel de vezel voorzichtig met een pincet en plaats deze rechtstreeks in de gealiquoteerde denatureringsbuffer (laat de pincet de buffer niet raken).
- Controleer de pincet onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de vezel met succes is verwijderd. Sluit de buis en tik drie keer stevig met de onderkant van de buis op de bank om ervoor te zorgen dat de vezel in de buffer beweegt.
- Veeg de pincet schoon met een pluisvrije tissue voordat u verder gaat met de volgende vezel. Herhaal dit proces totdat alle vezels zijn verzameld.
- Draai de vezelmonsters en centrifugeer kort gedurende 5 s bij 2.500 × g om het monster naar de bodem van de buis te trekken.
NOTITIE: De centrifugatieduur (5 s) wordt getimed vanaf het begin (0 × g) totdat de snelheid ~2,500 × g bereikt. - Laat de monsters 1 uur op kamertemperatuur staan. Bewaren bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Vries de monsters in en ontdooi ze voor gebruik.
3. Stippen blotting
- Membraanvoorbereiding en -activering
- Meet, label en snijd één polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan (0,2 μm poriegrootte) op maat om in 50 monsters (~10,5 cm x 5,5 cm) te passen.
- Markeer de linkerrand numeriek van boven naar beneden (1 tot 10) en de bovenrand alfabetisch van links naar rechts (A tot E) op een afstand van 1 cm van elkaar.
- Leg vier vellen filtreerpapier klaar met de afmetingen van 12,5 cm x 7,5 cm.
- Stapel twee vellen op elkaar om een stapel te vormen. Week de stapel filtreerpapier voor in 1x transferbuffer.
- Plaats het membraan in een bakje. Giet 95% ethanol over het membraan, met voldoende volume om het membraan volledig onder te dompelen (10-15 ml). Schud 1 minuut op de wip.
- Vang de ethanol op, dompel het membraan onder in 1x overdrachtsbuffer (~15 ml) en schud nog eens 2 minuten.
OPMERKING: Zowel ethanol als overdrachtsbuffer kunnen worden hergebruikt voor toekomstige dot-blotting-experimenten totdat sedimentatie ontstaat (verandering na zes keer gebruiken). - Leg de stapel met transferbuffer doordrenkt filtreerpapier op een vlakke, beweegbare ondergrond, zoals een groot deksel, en druk plat met de roller. Plaats het PVDF-membraan op de stapel met behulp van een gelontgrendeler of een pincet.
- Leg een enkel vel droog filterpapier op het membraan en beweeg de roller over het filtreerpapier om overtollige buffer op het membraanoppervlak op te nemen. Verwijder het bovenste filterpapier zonder over het membraan te wrijven.
LET OP: Methanol (klasse 3, subrisico 6.1) en ethanol (klasse 3) zijn gevaarlijk. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor aanbevelingen voor veilig gebruik.
- Monsterabsorptie naar het membraan
- Ontdooi de vezelmonsters, voer een korte centrifuge (5 s) uit bij kamertemperatuur zoals in stap 2.3.4 en meng het monster grondig.
- Zonder het membraan met de pipetpunt aan te raken, deponeert u langzaam een druppel van ~1 μL van elk monster op het membraan in het daarvoor bestemde gebied. De afmetingen van het aangewezen gebied per vezelmonster zijn ~1 cm x 1 cm. Probeer het monster in het midden van dit gebied te vinden.
- Laat de monsterdruppels minimaal 15 minuten door het membraan trekken. Zorg ervoor dat er geen monsterbuffer achterblijft en volledig wordt geabsorbeerd.
- Til het membraan met een plastic pincet voorzichtig van de vochtige stapel filterpapier, plaats het op een enkel droog vel filterpapier en dehydrateer het membraan gedurende ten minste 5 minuten.
- Zodra de monstervlekken helemaal wit worden, activeert u het membraan opnieuw.
- Reactivering en blokkering van het membraan
- Activeer het membraan opnieuw door stap 3.1.5 en 3.1.6 te herhalen.
- Plaats het membraan in de wasbuffer en spoel gedurende 5 minuten af met schommelen. Gooi de wasbuffer weg.
- Incubeer het membraan in de blokkeerbuffer gedurende 30 minuten tijdens het schommelen.
- Spoel het membraan 3x af met wasbuffer totdat de buffer niet meer troebel is.
- Laat het membraan in de laatste wasbeurt op de rocker.
4. Immuno-etikettering
- Detectie van MHCIIa
- Verdun het primaire MHCIIa-antilichaam met 1 op 200 in 10 ml Bovine Serum Albumine (BSA)-buffer.
- Gooi de wasbuffer van het membraan weg en giet vervolgens het verdunde MHCIIa-antilichaam op het membraan.
- Plaats de container (met het membraan in MHCIIa) op de wip bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of bij 4 °C 's nachts.
- Verzamel het MHCIIa-antilichaam en bewaar het bij 4 °C. Was het membraan met blokkeerbuffer gedurende 2 minuten op de wip.
OPMERKING: Alle primaire antilichamen kunnen tot vijf keer worden hergebruikt, zolang de buffer helder blijft. - Spoel nog twee keer; 5 min per keer; Drie wasbeurten in totaal.
- Verdun het secundaire antilichaam van muizenimmunoglobuline G Mierikswortelperoxidase (IgG-HRP) met 1 op 20.000 in 10 ml blokkeerbuffer en voeg toe aan het membraan.
- Gooi de wasbuffer weg en incubeer het membraan in muis IgG-HRP secundair met schommelen gedurende 1 uur.
- Gooi de secundaire weg en was het membraan in de wasbuffer (2, 5, 5 min).
- Laat het membraan weken in de laatste wasbeurt tot het klaar is voor beeldvorming.
- Schakel de gelimager in, wacht 15 minuten totdat de imager de gewenste bedrijfstemperatuur heeft bereikt en open vervolgens de beeldvormingssoftware (zie Materiaaltabel).
- Klik in het softwarevenster op New Single Channel Protocol (Afbeelding 3A). Voor een witlichtbeeld van het membraan, onder Toepassingen | Vlekken | klik op Colorimetrisch (Figuur 3B).
- Klik op het gelgebied; Elke optie is geprogrammeerd voor specifieke afmetingen om te passen bij de grootte van verschillende geltypes. Selecteer de juiste optie die het beste past bij de afmetingen van het membraan (Figuur 3C).
- Bereid de ECL voor door luminol- en peroxidasereagentia te combineren in een verhouding van 1:1. Maak een voldoende volume ECL-mengsel om het hele membraan te bedekken, meestal is een totaal volume van 800-1.000 μL vereist.
- Plaats het membraan op een grote doorzichtige plastic bak en verdeel het ECL-mengsel over het membraan.
- Plaats het membraan op de beeldplaat.
- Klik op Position Gel (gele knop) voor een live cameraweergave. Klik op vasthouden en sleep de zoomknop om het beeldgebied van het membraan te maximaliseren. Maak nu indien nodig de positie van het membraan recht.
- Klik op Protocol uitvoeren (groene knop) en wacht tot een colorimetrisch beeld van het membraan is geproduceerd. Sla deze afbeelding op om te helpen bij het matchen van de punten met het bijbehorende vezelmonster.
- Zonder het membraan te verplaatsen, wijzigt u de toepassing op de software door op de optie voor een 2 x 2 binning (Chemi High Resolution) te klikken (Figuur 3D).
- Klik onder Beeldbelichting en software de belichtingstijd optimaliseren op Faint Bands (Figuur 3E) | Signaalaccumulatiemodus.
- Typ onder Setup 1 s voor de eerste afbeelding, 30 s voor de laatste afbeelding en 30 totale afbeeldingen (Afbeelding 3F).
- Klik op Protocol uitvoeren.
- Sla een afbeelding op in de volgende fasen: vóór signaalverzadiging (alle zichtbare stippen zijn zwart), initiële signaalverzadiging (sommige stippen beginnen te verzadigen) en oververzadigde vlekken (alle plekken met een sterk signaal gedetecteerd zijn verzadigd).
- Sla alle vereiste afbeeldingen op voordat u de signaalaccumulatie beëindigt. Haal het membraan uit de imager.
- Plaats het membraan met behulp van de gelvrijmaker terug in de container met de wasbuffer.
- Detectie van MHCI
- Giet de wasbuffer uit en behandel het membraan met stripbuffer gedurende 30 min op 37 °C (zorg ervoor dat het membraan volledig is ondergedompeld).
- Verzamel de stripbuffer en spoel het membraan in de wasbuffer gedurende 5 minuten met schommelen.
NOTITIE: Stripbuffer kan 10x worden hergebruikt voordat deze wordt weggegooid. - Giet de wasbuffer uit en breng deze keer MHCI primair antilichaam verdund aan met een startconcentratie van 1 op 200 (bereik: 1 op 200 tot 1 op 500). Schud het membraan gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
- Na incubatie in het primaire MHCI-antilichaam, het antilichaam verzamelen en het membraan wassen zoals in de stappen 4.1.4 en 4.1.5.
- Verdun het secundaire IgM HRP-antilichaam van muizen in de blokkeerbuffer bij 1 op 20.000. Giet de blokkeerbuffer uit het membraan en incubeer in de muis IgM secundair zoals in stap 4.1.7.
- Wassen en vastleggen van beelden detecteerde MHCI zoals in de stappen 4.1.8 tot en met 4.1.24.
LET OP: Stripbuffer bevat organofosfine 3-5% (klasse 8). Raadpleeg het MSDS voor aanbevelingen voor veilig gebruik.
- Detectie van potentiële MHCIIx met behulp van Actine
- Strip het membraan nogmaals (stappen 4.2.1 en 4.2.2).
- Herhaal rubriek 4.1, dit keer met het primaire antilichaam van Actine, verdund met 1 op 500 in de BSA-buffer en vervolgens het secundaire HRP-antilichaam van konijnen, verdund met 1 op 20.000 in de blokkeerbuffer.
5. Identificatie van het vezeltype
- MHCI-, MHCIIa- en Actine-signaalanalyse
- Raak vertrouwd met het signaalintensiteitspaneel (Figuur 4A). Noteer de stappen 5.1.2 tot en met 5.1.4.
- Een verzadigde signaalintensiteit geeft kwalitatief aan dat de eiwitdetectie sterk is.
- Een matig geeft aan dat het doeleiwit op een gemiddeld niveau aanwezig is.
- Een zwak signaal geeft aan dat er weinig doeleiwit aanwezig is.
- Gebruik het paneel met signaalintensiteit om vezels te categoriseren met een signaalintensiteit 'verzadigd', 'matig' of 'zwak' (Afbeelding 4A).
- Voer de identificatie van het vezeltype uit door eerst de MHCIIa- en MHCI-resultaten te vergelijken (Figuur 4B, linker en middelste vlekken).
- Neem vezels op met een verzadigde of matige signaalintensiteit van slechts één MHC-isovorm.
- Als het MHC-isovormsignaal 'zwak' is, laat de vezel dan ongemarkeerd (zie figuur 4B).
- Ten slotte, wanneer actine wordt waargenomen (matige of verzadigde signaalintensiteit) in de vezels zonder MHCI of IIa gedetecteerd, registreer het dan als een potentiële type IIx-vezel (Figuur 4B, rechter vlek).
- Registreer vezels met een zwak MHC-isovormsignaal, maar gedetecteerd actine (matige of verzadigde intensiteit) als niet-geïdentificeerd.
- Gooi monsters weg met zwakke of geen detectie (geen vezels verzameld) voor alle drie de doeleiwitten (Figuur 4C).
- Neem elke vezel op waar zowel MHCI- als MHCII-signalen worden gedetecteerd met een 'verzadigd' of matig signaal. Deze monsters zijn niet bedoeld voor gebruik in vezeltypespecifieke bereidingen.
- Bereiding van vezeltypespecifieke monsters
- Maak voor elke biopsie een afzonderlijk type I- en type II-monster. Combineer voor een type II-monster het minimaal vereiste aantal vezels (berekend in stap 2.1.5) waarin MHCIIa wordt gedetecteerd op verzadigde of matige niveaus.
- Herhaal dit proces in een aparte buis met het label type I voor vezels waarin MHCI wordt gedetecteerd (Figuur 4D).
- Gebruik vezels met een matige signaalintensiteit als er niet genoeg vezels zijn met verzadigde signalen.
- Combineer alle mogelijke IIx-vezels.
- Gebruik onmiddellijk vezeltypespecifieke monsters voor western blotting of bewaar ze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
6. Bevestiging van het type Western Blot-vezel
- Gebruik 10 μL van elk vezeltypespecifiek monster (het minimaal vereiste monstervolume, zie stap 2.1.5).
- Scheid monsters met behulp van de gespecificeerde prefab-gel via SDS-PAGE volgens het protocol van de fabrikant.
- Gebruik een gelimager om het eiwit in de gel te detecteren volgens het protocol van de fabrikant.
- Plaats de gel in een koude 1x transferbuffer gedurende 10 min.
- Breng de eiwitten nat over op een nitrocellulosemembraan van 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) volgens het protocol van de fabrikant.
- Spoel het membraan na het overbrengen kort af met ultrapuur H2O in een bakje. Giet het ultrapure water eruit.
- Voeg 10 ml antilichaamsignaalversterkeroplossing toe aan het membraan en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Verzamel de antilichaamsignaalversterkeroplossing en was 5x (5 s per wasbeurt) met ultrapure H2O.
OPMERKING: Antilichaamsignaalversterkeroplossing kan 5x worden gebruikt voordat deze wordt weggegooid. - Giet de laatste was uit, voeg blokkeeroplossing toe en rock gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
- Gebruik een schoon scalpelmesje of een schaar om horizontaal over het membraan te snijden met een molecuulgewicht dat ervoor zorgt dat eiwitten van 180 kDa en hoger zich op het bovenste gedeelte van het membraan bevinden.
- Gebruik dit bovenste gedeelte voor verdere bevestiging van het vezeltype.
- Gebruik de portie onder 180 kDa om verschillende doeleiwitten te detecteren.
- Volg rubriek 4.1 op het bovenste gedeelte van het membraan met MHCIIx primair en muizen immunoglobuline M (IgM) HRP-secundair antilichaam.
- Strip het membraan (zoals beschreven in de rubrieken 4.2.1 en 4.2.2) voordat u het proces herhaalt met MHCIIa IgG primair en muizen IgG HRP secundair antilichaam.
- Strip nogmaals en breng ten slotte MHCI IgM primair en muis IgM HRP secundair antilichaam aan.
OPMERKING: Deze stap is kwalitatief en dus is eiwitverlies als gevolg van membraanstripping geen probleem. - Vergelijk het signaal dat is gedetecteerd tussen de verschillende MHC-isovormen (zoals te zien is in figuur 5B). Wanneer de signaalintensiteit wordt gedetecteerd op matige tot verzadigde niveaus in het verwachte monster (MHCI - type I, MHCIIa - type II en MHCIIx - type IIx), zullen de vezeltype-specifieke monsters als betrouwbaar worden geregistreerd voor gebruik in toekomstige studies.
- Registreer het monster als onbetrouwbaar wanneer er meer dan één MHC-isovorm in gelijke mate in een monster wordt gedetecteerd.
LET OP: Antilichaamversterkende oplossing bevat 50% natriumhydroxide. Raadpleeg MSDS voor aanbevelingen voor veilig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificatie van individuele MHCI-, MHCIIa- en MHCIIx-spiervezels met behulp van dot blotting
Een kenmerk van MyDoBID is de categorisering van de variërende MHC- en Actine-signaalintensiteitssterkte in een bepaalde vezel (Figuur 4A). Het vezeltype werd geïdentificeerd door de aan- of afwezigheid van MHCI- en IIa-isovormen (Figuur 4B). Zes vezels vertoonden geen MHC- of actinedetectie, wat aangeeft dat er geen vezels waren verzameld. De resultaten van deze specifieke dot blot waren de identificatie van 22 type II-vezels, 7 type I-vezels en 3 potentiële type IIx-vezels; 2 niet-geïdentificeerde monsters en 6 monsters werden geclassificeerd als 'geen vezels' verzameld (figuur 4B, C). Vezels die geen detecteerbaar MHCI- of MHCIIa-signaal hadden en toch positief waren voor actine, werden geïdentificeerd als potentiële type IIx-vezels door een eliminatieproces. Met behulp van het signaalintensiteitspaneel om de signaalsterkte van MHCI en IIa te classificeren, werden 'matige' of 'verzadigde' vezels gecombineerd om respectievelijk type I- of II-monsters te produceren. Vezels die niet geïdentificeerd waren of waar zwak of geen actine werd gedetecteerd, werden niet opgenomen in de daaropvolgende analyse en werden weggegooid (Figuur 4D).
Bevestiging van vezeltypering met behulp van western blotting
De vezeltype-specifieke monsters werden gevalideerd met behulp van western blotting en MHC-specifieke antilichamen (Figuur 5). Type I- en type II-vezelmonsters van één individuele biopsie werden uitgevoerd samen met een type IIx-monster, een monster van potentiële type IIx-vezels van twee individuen vanwege het lage aantal type IIx-vezels dat in elke biopsie aanwezig was. Western blot-gegevens bevestigden dat de identificatie van het vezeltype succesvol was.
Afbeelding 1: Samenvatting van de workflow met een overzicht van de monstervoorbereiding, vezeltypering en bevestiging van de vezelspecificiteit met western blet. (A) Menselijk weefsel wordt gedurende 48 uur gevriesdroogd. (B,C) Afzonderlijke vezelsegmenten worden geïsoleerd onder een ontleedmicroscoop. (D) Vezels worden gedenatureerd en (E) na 1 uur opgeslagen bij -80 °C. (F) Primaire incubatievolgorde van antilichamen. (G) Vezels werden puntgevlekt en vezeltype geïdentificeerd met behulp van MHCIIa (type II), MHCI (type I) en actine (IIx?, potentiële type IIx-vezel). (H) Vezels werden vervolgens samengevoegd. (I) Vezeltype-specifieke monsters naast een kalibratiecurve worden geanalyseerd via SDS PAGE en western blotting. (J) Validatie van identificatie van vezeltype met behulp van western blotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Display en bedieningspaneel van het vriesdroogsysteem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Imager-instellingen voor het opvangen van wit licht van het membraan, gevolgd door chemiluminescente detectie van doeleiwitten. Om het membraan onder wit licht in beeld te brengen, selecteert u (A) Nieuw enkel kanaal gevolgd door (B) Vlekken | colorimetrische toepassing. (C) Selecteer op basis van de grootte van de gebruikte gel het juiste beeldvormingsgebied en maak vervolgens een witlichtbeeld door op Run Protocol te drukken. (D) Herhaal stap B zonder het membraan te verplaatsen, maar kies deze keer voor Blots | Chemi Hallo resolutie. Voordat u op uitvoeren drukt, kiest u (E) Beeldbelichting om te optimaliseren voor zwakke banden en (F) stelt u de signaalaccumulatiemodus in en stelt u in eerste instantie de belichtingstijd in voor elke seconde voor een totaal van 30 s met Lichte verzadigde pixels aangevinkt. Druk op Run Protocol en wacht tot de run is voltooid voordat u de beste afbeeldingen selecteert om op te slaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Identificatie van het vezeltype. (A) Vezeltypes werden geïdentificeerd ten opzichte van alle andere vezels op het membraan, gecategoriseerd door het signaalintensiteitspaneel voor elke gedetecteerde MHC-isovorm (bijv. MHCI-signaal: verzadigd, matig en zwak). (B) Met behulp van het paneel in (A) identificeerde het MHCIIa-antilichaam type II-vezels (blauw, linkervlek) en na het strippen van het membraan identificeerde het MHCI-antilichaam type I-vezels (rood, middelste vlek). Actine-antilichaam werd gebruikt om potentiële IIx-vezels te identificeren als een positief Actine-signaal werd gedetecteerd in vezels waar geen eerder MHCI- of IIa-signaal werd gedetecteerd (groene, rechter vlek). Vezels die niet aan deze richtlijnen voldoen, zijn paars gemarkeerd (niet geïdentificeerd). Ten slotte gaven monsters die negatief waren voor het Actine-signaal aan dat er geen vezels waren verzameld ("No Fiber"). (C) Tabel met vezeletikettering die overeenkomt met de monsterpositie op puntvlekken zoals weergegeven in (B). (D) Overzicht van vezelselectie voor het bereiden van vezeltypespecifieke monsters. Het doel was om voor elk vezeltype 10 verzadigde vezels te verzamelen. Hier, voor type II-vezels, werden acht verzadigde vezels geïdentificeerd en gepoold. Voor type I-vezels waren minder dan 10 verzadigde vezels aanwezig, dus werden ook vezels met een matige signaalsterkte geselecteerd. Voor type IIx-vezels werden twee vezels geïdentificeerd en gepoold. Als er minder dan 10 vezels (verzadigd en matig) worden geïdentificeerd, kan verdere vezelverzameling nodig zijn. OPMERKING: Het Actine-signaal weergegeven in (B) heeft de verzadiging niet bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Western blot bevestiging van identificatie van het vezeltype. Identificatie van het vezeltype werd uitgevoerd volgens figuur 4 om monsters van type I (~10 vezels) en type II (~10 vezels) te genereren. Aangezien er geen IIx-vezels werden geïdentificeerd uit dezelfde biopsie, werd het hier getoonde IIx-monster geproduceerd uit meer dan één spiermonster (n = 2 individuen). Een klein aliquot van elk vezelspecifiek monster wordt geanalyseerd door middel van western blotting om de identificatie van het vezeltype te bevestigen. Molecuulgewichtmarkeringen (kDa) zijn aan de linkerkant aangegeven, gevangen onder wit licht zonder het membraan te bewegen. Doeleiwitten worden gedetecteerd in de sequentie van MHCIIx, MHCIIa en MHCI, waarbij het myosine van de UV-geactiveerde gel visueel de hoeveelheid eiwit aangeeft die per monster is geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Strategieën voor het oplossen van veelvoorkomende protocolproblemen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Berekening van de massa van gevriesdroogde vezels met behulp van een kalibratiecurve. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vezel inzameling
Op basis van enkele jaren ervaring kunnen de meeste onderzoekers deze techniek onder de knie krijgen; De praktijk leidt echter tot een snellere en efficiëntere vezelinzameling voor stroomafwaartse analyses. Om 30 enkelvoudige vezelsegmenten van een kwaliteit voor pooling te kunnen isoleren, wordt aanbevolen om 50 vezelsegmenten per monster te verzamelen. Het wordt aanbevolen om de video over het verzamelen van vezels zorgvuldig te bestuderen en na het uitvoeren van twee oefensessies (~50 vezels per sessie) om een redelijke standaard te bereiken. Alle verzamelde vezels ondergaan MyDoBID om het vezeltype te identificeren, waaruit zal blijken hoe effectief de techniek wordt uitgevoerd. Dit zou worden gezien als een laag aantal 'Geen vezel' of 'zwakke' MHC-signalen gedetecteerd in vezelmonsters (zie protocolparagraaf 5.1).
Het is bekend dat spieren hybride vezels kunnen bevatten, waar zowel MHCI als MHCIIa aanwezig zijn, of MHCIIa en IIx 2,14. Een beperking van de MyDoBID is dat de aanwezigheid van een hybride vezel niet kan worden vastgesteld omdat een monster dat positief is voor zowel MHCI- als MHCIIa-antilichamen een hybride vezel kan zijn of dat er twee vezels zijn verzameld. Verder kan MyDoBID MHCIIa niet afzonderlijk van MHCIIa/IIx-hybriden detecteren, aangezien het primaire antilichaam van MHCIIa de aanwezigheid van MHCIIa in zowel IIa- als IIa/IIx-vezels zou detecteren. Om deze redenen werden geen monsters van hybride vezels geïdentificeerd en voorbereid, en monsters met zowel MHCI- als MHCIIa-signalen die buiten de bereiken vielen die werden beschreven in het signaalintensiteitspaneel, werden weggegooid (Figuur 4A). Een andere beperking is dat het aandeel spiervezeltypes in een monster niet kan worden bepaald met behulp van MyDoBID, en het toepassen van conventionele immunohistochemische analyses is noodzakelijk om de vezeltypeverdeling2 te bepalen.
Stippen blotting
Het signaalintensiteitspaneel en de vezeltype-ID zijn afhankelijk van het feit dat het volledige monster wordt weergegeven in het kleine volume dat op het dot-blotting-membraan wordt aangebracht. Om dit te bereiken, wordt het monster grondig gemengd door te roeren voordat het op het membraan wordt geladen. Alle vezels met slechts één MHC-isovorm gaan naar de volgende stap van pooling. In dit stadium is het belangrijk dat een vezel met meer dan één MHC niet doorgaat naar deze volgende stap van het combineren van monsters. Als een monster besmet is, moet het hele gepoolde monster worden weggegooid en moet de onderzoeker teruggaan naar Vezelverzameling en de vezelisolatie- en puntdeppingsstappen herhalen.
Immuno-etikettering
Eerder werd gemeld dat 5 minuten een voldoende tijd is om niet-specifieke plaatsen op het membraan te blokkeren voor de detectie van MHCI en MHCIIa9. Om de techniek naar MyDoBID te brengen, moet een Actine-antilichaam worden gebruikt. Het bleek dat de bloktijd van 5 minuten moest worden verlengd tot 30 minuten, zoals gerapporteerd6, om een membraan met minimale achtergrond te verkrijgen, aangezien blokkering van 5 minuten resulteerde in een donkerdere membraanachtergrond. Blokkeertijd is een overweging bij elke immunodetectietechniek, zoals western blotting of immunohistochemie, en moet indien nodig worden gewijzigd.
Strippen van het membraan
Strippen kan niet worden gebruikt voor kwantitatieve analyses15 omdat het ook interessante eiwitten verwijdert, maar kan worden gebruikt in MyDoBID omdat het een kwalitatieve test is. Het doel van strippen is om de gebonden antilichamen van het oppervlak van het membraan te verwijderen, waardoor een nieuw antilichaam kan worden gebruikt met minimale interferentie van het eerdere antilichaam. In MyDoBID is er de mogelijkheid om het monster over twee membranen aan te brengen, waarbij de verschillende MHC-isovormen op afzonderlijke membranen worden gedetecteerd. Als deze aanpak de voorkeur heeft, vermijd dan om de monsterbuis meer dan eens aan te raken door de spots tegelijkertijd te laden. Dit zorgt ervoor dat de droogtijd tussen elke monsterplek vergelijkbaar is (~5 s verschil) en de volgende stappen die gelijktijdig in afzonderlijke containers worden uitgevoerd. Opgemerkt moet worden dat deze optie de tijd, het monster en het verbruik van verbruiksartikelen zou verhogen.
Antilichamen worden toegepast om eerst MHCIIa-vezels te detecteren, gevolgd door MHCI, omdat het MHCI-antilichaam altijd een zeer helder signaal geeft, dat moeilijker te strippen zou zijn dan de MHCIIa. Actine wordt homogeen tot expressie gebracht in skeletspiervezels en wordt gebruikt om te bevestigen dat een deel van de vezel met succes op het membraan is aangebracht zoals hierboven beschreven.
Beeldvorming, identificatie van het vezeltype en voorbereiding van vezeltypespecifieke monsters
In dit protocol is een nieuwe tool ontwikkeld om te helpen bij de identificatie van het vezeltype en de monsterselectie om vezeltypespecifieke monsters te maken (Figuur 4A). Het voorbeeld in het paneel met signaalintensiteit wordt gebruikt om de intensiteit van het MHCI-signaal te definiëren als: (i) verzadigd, (ii) matig of (iii) zwak. Voor het samenvoegen van vezels in vezeltypespecifieke monsters, worden eerst vezels met een verzadigde signaalintensiteit geselecteerd en indien nodig worden vezels met een matige signaalintensiteit toegevoegd. Bij het bereiden van type I- en II-monsters zijn er doorgaans voldoende 'verzadigde' en 'matige' vezels, zodat vezels die als 'zwak' of niet-geïdentificeerd zijn gecategoriseerd, kunnen worden weggegooid.
Nieuwigheid van het gebruik van actine in plaats van MHCIIx-antilichamen om zuivere type IIx-vezels te identificeren
Eerder, om zuivere IIx-vezels te identificeren, werd het MHCIIx-signaal subjectief vergeleken met het MHCI- en MHCIIa-signaal op een puntvlek, en door een proces van eliminatie werden de vezels zonder MHCI- of IIa-signaal, maar met MHCIIx-signaal, geïdentificeerd als pure IIx. Er kunnen zich echter problemen voordoen bij het gebruik van twee primaire IgM-antilichamen van muizen (MHCIIx en MHCI) op hetzelfde membraan. Ondanks het strippen van het membraan tussen primaire antilichamen, kan een resterend antilichaamsignaal worden gedetecteerd. Het gebruik van het primaire anti-actine-antilichaam van konijnen voorkomt dat dit probleem optreedt. Hier gebruikten we Actin om te bevestigen dat een vezel werd verzameld en bij afwezigheid van zowel MHCI als MHCIIa, geeft dit aan dat er een IIx-vezel aanwezig was. Potentiële IIx-vezels worden vervolgens bevestigd door western blotting met behulp van het MHCIIx-specifieke antilichaam (zie figuur 5 in dit artikel en figuur 2 in9). Van het 6H1-antilichaam is aangetoonddat 16 de elektroforetisch gescheiden band detecteert die overeenkomt met MHCIIx in skeletspieren van ratten en labelt type IIx-vezels in dwarsdoorsneden van muis-, ratten- en menselijke spieren2.
Bevestiging van het type Western blot-vezel
Het is een goede gewoonte om alle vezeltype-specifieke monsters van dezelfde biopsie op dezelfde gel uit te voeren. Omdat MHCI-antilichamen hetzelfde secundaire antilichaam vereisen als MHCIIx, moeten type I- en IIx-monsters worden gescheiden door ten minste één baan op een bepaalde gel, zoals weergegeven in figuur 5. Aangezien het eiwitgehalte zal variëren tussen vezeltypespecifieke monsters als gevolg van variabele vezelgrootte, moet de eerste gel worden gebruikt om het volume van het monster te bepalen dat in volgende gelruns moet worden geladen om vergelijkbare hoeveelheden eiwit in alle monsters te verkrijgen. Om dit te doen, wordt het totale eiwit in een bepaald monster bepaald met behulp van UV-geactiveerde gelbeeldvormingstechnologie om alle eiwitbanden te visualiseren die voorafgaand aan de overdracht door SDS-PAGE in de gel zijn gescheiden. Het totale eiwit in elk monster wordt bepaald aan de hand van het gelbeeld en gebruikt om ongelijke belasting in de volgende western blot-run te corrigeren, op voorwaarde dat een kalibratiecurve van verschillende bekende massa's skeletspierweefsel wordt uitgevoerd naast de vezeltype-specifieke monsters 3,4,6,17. Het is ook niet nodig om een 'huishoudelijk' eiwit zoals Actine te gebruiken om het totale eiwit te bepalen, waarvoor ook een eigen kalibratiecurve nodig zou zijn15. Deze technologie is een tijdbesparende en nauwkeurige methode om het totale eiwit te bepalen en kan worden uitgevoerd met zeer weinig monster (d.w.z. ~1/5e van een vezel9) zonder dat er extra reagentia of eiwitstandaarden nodig zijn, terwijl alledelen van het membraan worden gemaximaliseerd voor het detecteren van interessante eiwitten.
Als het gaat om immunolabeling tijdens de western blot-stap, wordt het MHCIIx-antilichaam als eerste toegepast vanwege de relatief lage abundantie van MHCIIx in vergelijking met de andere MHC-isovormen. Zodra het membraan klaar is voor detectie van MHCI-antilichamen, zou het twee stappen van strippen hebben ondergaan (d.w.z. post-MHCIIx- en MHCIIa-detectie). Bijgevolg moet de detectie van MHCI in de eerste plaats worden gedetecteerd in een type I-monster, met een minimaal restsignaal dat wordt gedetecteerd van eerdere MHC-antilichamen (Figuur 5). Western blotting wordt gebruikt om de zuiverheid van elk vezeltypespecifiek monster te bevestigen met behulp van alle drie de MHC-antilichamen op hetzelfde membraangedeelte. De noodzaak om te strippen zou echter worden geëlimineerd als MHCI- of MHCIIx-antilichamen zouden worden gekweekt in een andere gastheersoort, zoals konijn of geit.
Toepassingen
De hier beschreven methodologie kan worden gebruikt voor het typen van afzonderlijke vezelsegmenten van verse of gevriesdroogde skeletspieren om vezeltype-specifieke eiwitexpressie in menselijke skeletspieren te onderzoeken. Bovendien kunnen met behulp van verse spiermonsters intacte of mechanisch gevilde vezels worden gebruikt6. Het gebruik van een gevilde vezel maakt verder onderzoek van eiwitexpressie in subcellulaire compartimenten mogelijk, zoals die in de cytosol- en membraancompartimenten. Deze applicatie is eerder gebruikt om de hoeveelheid glycogeen te meten die gebonden is versus ongebonden in mechanisch gevilde vezelsegmenten van gezonde en diabetici6. Belangrijk is dat MyDoBID gunstig is voor experimenten die alleen gedenatureerde monsters gebruiken en niet geschikt zijn voor onderzoeken die eiwitten in hun oorspronkelijke staat vereisen. Hoewel het mogelijk is dat andere analyses, zoals enzymatische assays of proteomische benaderingen in oplossing, onder native omstandigheden kunnen worden uitgevoerd, zou verdere optimalisatie nodig zijn, zodat een deel van de vezel kan worden verwijderd voor MHC-isovormidentificatie met behulp van MyDoBID.
Samenvattend kunnen type I, type II en type IIx met succes worden geïdentificeerd door de toepassing van een eenvoudige techniek met gemakkelijk verkrijgbare verbruiksartikelen die vaak worden gebruikt voor western blotting. We voegen uitgebreide praktische informatie toe, waar na succesvolle afronding vezeltypespecifieke monsters zullen worden geproduceerd die van de best mogelijke kwaliteit, integriteit en betrouwbaarheid zijn voor toekomstige studies. Deze techniek is de praktische en geprefereerde benadering voor het uitvoeren van vezelspecifieke biochemische analyse van skeletspieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De antilichamen tegen MHC I (A4.840) en MHCIIa (A4.74) die in deze studie zijn gebruikt, zijn ontwikkeld door Dr. H. M. Blau en het antilichaam tegen MHCIIx (6H1) is ontwikkeld door Dr. C. A. Lucas en verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), dankzij de auspiciën van het National Institute of Child Health and Human Development en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen (Iowa City, IA). We danken Victoria L. Wyckelsma voor het beschikbaar stellen van de menselijke spiermonsters voor dit onderzoek. Het merendeel van de afbeeldingen in figuur 1 is afkomstig van BioRender.com.
Financiering:
Deze studie ontving geen externe financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J.
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
