Summary
פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.
Abstract
ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי לזהות איזופורמים ספציפיים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC) במקטעים של סיבי שריר בודדים באמצעות הכתמת נקודות, להלן זיהוי שרשרת כבדה של האוסין שליעל ידי Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייבוש בהקפאה של שרירי השלד האנושיים ובידוד מקטעים של סיבי שריר בודדים. באמצעות MyDoBID, סיבים מסוג I ו- II מסווגים עם נוגדנים ספציפיים MHCI ו- IIa, בהתאמה. סיבים מסווגים משולבים לאחר מכן לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים עבור כל ביופסיה.
סך החלבון בכל דגימה נקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) וטכנולוגיית ג'ל המופעלת על ידי UV. סוג הדגימות של הסיבים מאומת באמצעות כתמים מערביים. מתוארת גם החשיבות של ביצוע נורמליזציה של העמסת חלבונים כדי לשפר את זיהוי חלבון המטרה על פני כתמים מערביים מרובים. היתרונות של איחוד סיבים מסווגים לדגימות ספציפיות לסוג סיבים בהשוואה לסיבים מערביים יחידים, כוללים רב-תכליתיות דגימה, תפוקת דגימה מוגברת, השקעה קצרה יותר בזמן ואמצעים לחיסכון בעלויות, כל זאת תוך שמירה על מידע יקר ערך ספציפי לסוג הסיב שלעתים קרובות מתעלמים ממנו באמצעות דגימות שריר הומוגניות. מטרת הפרוטוקול היא להשיג זיהוי מדויק ויעיל של סיבים מסוג I ו-II שבודדו מדגימות שרירי שלד אנושיים מיובשים בהקפאה.
סיבים בודדים אלה משולבים לאחר מכן ליצירת דגימות ספציפיות לסוג I וסוג II. יתר על כן, הפרוטוקול מורחב וכולל זיהוי של סיבים מסוג IIx, תוך שימוש באקטין כסמן לסיבים שהיו שליליים עבור MHCI ו- MHCIIa, אשר אושרו כסיבי IIx על ידי כתם מערבי. לאחר מכן משתמשים בכל דגימה ספציפית לסוג הסיב כדי לכמת את הביטוי של חלבוני מטרה שונים באמצעות טכניקות קרישה מערביות.
Introduction
שריר השלד הוא רקמה הטרוגנית, בעלת תכונות מטבוליות והתכווצות תאיות מובהקות התלויות בשאלה אם התא (סיבים) הוא עווית איטית (סוג I) או עווית מהירה (סוג II). ניתן לזהות את סוג הסיב על ידי בחינת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC), הנבדלים זה מזה במספר דרכים, כולל זמן התכווצות, מהירות הקיצור ועמידות בפני עייפות1. איזופורמים עיקריים של MHC כוללים סוג I, סוג IIa, סוג IIb וסוג IIx והפרופילים המטבוליים שלהם הם חמצוניים (סוג I ו- IIa) או גליקוליטיים (IIx, IIb)1. חלקם של סוגי סיבים אלה משתנה בסוג השריר ובין המינים. סוג IIb נמצא באופן נרחב בשרירי מכרסמים. שרירי האדם אינם מכילים סיבים מסוג IIb ומורכבים בעיקר מאיזופורמים מסוג MHC מסוג I ו- IIa, עם חלק קטן מסיבי IIx2. פרופילי ביטוי החלבונים משתנים בין סוגי סיבים שונים, וניתן לשנות אותם עם הזדקנות3, פעילות גופנית 4,5 ומחלה6.
לעתים קרובות מתעלמים או לא מאפשרים למדוד תגובות תאיות בסוגים שונים של סיבי שריר השלד בגלל בדיקת הומוגנטים של שרירים (שילוב של כל סוגי הסיבים). כתם מערבי חד-סיבתי מאפשר חקירה של חלבונים מרובים בסיבי שריר בודדים7. מתודולוגיה זו שימשה בעבר לייצור מאפיינים חדשניים ואינפורמטיביים של סיב בודד שלא ניתן היה להשיג באמצעות תכשירים הומוגניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות של המתודולוגיה המערבית המקורית של כתם סיב יחיד, כולל האופי הגוזל זמן, חוסר היכולת לייצר שכפול דגימות, והשימוש בריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) יקרים ורגישים. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, שיטה זו מוגבלת עוד יותר בשל אילוצי הזמן של הצורך לבודד סיבים בודדים במסגרת זמן מוגבלת (כלומר, 1-2 שעות). למרבה המזל, ריסון זה מתמתן על ידי בידוד מקטעים חד-סיביים מרקמה מיובשת בהקפאה8. עם זאת, איסוף סיבים מדגימות מיובשות בהקפאה מוגבל על ידי גודל ואיכות הרקמה הביופסית.
זיהוי סוג הסיבים בשיטת הכתמת נקודות9 הורחב והורחב באופן משמעותי בפרוטוקול מקיף זה. בעבר, הוכח כי מעט כמו ~ 2-10 מ"ג של רקמת שריר במשקל רטוב מספיק לייבוש בהקפאה וניתוח חלבון איזופורם MHC סיב יחיד9. Christensen et al.9 השתמשו ב-30% מקטע סיבים ~1 מ"מ כדי לזהות את איזופורם MHC הקיים על ידי כתם נקודה, אשר אושר על ידי כתם מערבי. עבודה זו הראתה כי על ידי החלפת כתם מערבי בכתמים נקודתיים, העלויות הכוללות הופחתו פי ~ 40 (עבור 50 מקטעי סיבים). לאחר מכן "אוגמו" סיבים לדגימות מסוג I ו-II, שאפשרו שכפול ניסיוני9. עם זאת, התקבלו רק שתי דגימות ספציפיות לסוג הסיבים: סוג I (MHCI חיובי) וסוג II (סיבים חיוביים MHCII), עם דגימות מסוג II המכילות תערובת של MHCIIa ו- MHCIIx 6,10. יש לציין כי הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד ניתן לזהות סיבי IIx טהורים מסוג IIx ומספק זרימת עבודה מפורטת ביותר (המסוכמת באיור 1), כולל אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות שריר אנושיות נלקחו מהווסטוס לטרליס מ n = 3 (2 גברים, 1 נקבה), בגילאי 70-74 שנים בתנאים סטריליים באמצעות הרדמה מקומית (Xylocaine) ומחט ברגסטרום שונה עבור יניקה ידנית11,12. הדגימות היו תת-קבוצה של מחקר קודם שאושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ויקטוריה (HRETH11/221) ונערך בהתאם להצהרת הלסינקי13. המשתתפים נתנו הסכמה כתובה ומודעת להשתתף במחקר זה. פרטים מלאים על כל החומרים הדרושים לפרוטוקול זה מוצגים בטבלת החומרים. בנוסף, רשימה של אסטרטגיות לפתרון בעיות המטפלות בבעיות פרוטוקול נפוצות מסופקת בטבלה 1.
1. ייבוש בהקפאה
- בזמן שאתם שומרים את דגימות השריר שעברו ביופסיה קפואות על קרח יבש, שוקלים ומטפלים בצינורית קפואה ריקה על המאזניים.
- לשקול במהירות מינימום של 10 מ"ג של רקמה קפואה במשקל רטוב. רשום את המשקל למקום עשרוני אחד.
- הפקידו את הרקמה בצינור המיקרוצנטריפוגה המקורר מראש שיש לו 3-4 חורים שנוקבו לתוך המכסה והכניסו אותו לכוס קטנה עם 2-3 כדורי קרח יבש.
- פעל בהתאם להוראות ההפעלה של יצרן מייבש ההקפאה.
- ודאו שכל השסתומים במייבש ההקפאה סגורים והפעילו את מייבש ההקפאה.
- השתמשו בלוח הבקרה כדי לבדוק שנקודת הגדרת הוואקום תוכנתה לתנאי ייבוש אופטימליים בהקפאה עבור רקמה אנושית, 0.12 מיליבר (mBar) (איור 2).
- לחץ ידנית על מייבש ההקפאה והמתן עד שהתא יתקרר ל -40 מעלותצלזיוס.
- לאחר שהתא הגיע לטמפרטורה זו, הסירו את המכסה, ולאחר מכן את תא הזכוכית, והניחו את הכד (עם דגימת שריר) על במת המתכת.
- החלף את תא הזכוכית והמכסה. סגרו את שסתום שחרור הוואקום על המכסה והמתינו עד שנורית סולם הוואקום תהפוך לירוקה כדי לוודא שהמייבש אטום בוואקום.
- יבשו בהקפאה את דגימות השריר למשך 48 שעות. לאחר השלמת הייבוש בהקפאה, כבו את משאבת הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הוואקום ופתחו את שסתום שחרור הוואקום במכסה.
- הסירו את מכסה התא ואספו את הדגימה המיובשת בהקפאה. שקלו את הרקמה ורשמו את המשקל למקום עשרוני אחד.
- חישוב אחוז אובדן המשקל; ~ ירידה של 75% במשקל מצביעה על כך שהרקמה יובשה בהצלחה בהקפאה (בעבודה זו, ממוצע ± SD, 76 ± 9%, n = 11 דגימות שריר).
- לחץ על AUTO כדי לכבות את משאבת הוואקום והמקפיא. אפשרו ליחידה להגיע לטמפרטורת הסביבה.
- נקו את סלילי הקירור בהתאם להוראות היצרן ונקזו נוזלים שהצטברו מהקולט.
הערה: איסוף הסיבים יכול להתחיל באופן מיידי. כאשר הרקמה אינה משמשת לבידוד סיבים, יש לשמור את הדגימה המיובשת בהקפאה בטמפרטורה של -80°C במיכל אטום עם חרוזי מייבש. אזהרה: קרח יבש הוא מסוכן (דרגה 9); עיין ב- MSDS לקבלת טיפול בטוח מומלץ.
2. איסוף סיבים
- הכנת אוסף סיבים
- יש לסמן לפחות 50 צינורות מיקרופוגה (סיבים 1 עד 50) ופיפטה 10 μL של חיץ דנטורינג לכל צינור.
- הכינו את אזור האיסוף עם שני זוגות של מלקחיים לניתוח רקמות עדינות, רקמה נטולת מוך, מנורת ספסל, סטריאומיקרוסקופ (עם הבמה השחורה למעלה), מערבולת וצנטריפוגת ספסל.
- הניחו את דגימת השריר המיובשת בהקפאה על מכסה צלחת פטרי. הניחו את המכסה על במת המיקרוסקופ המנתח.
- צפה בסרטון של דיסקציה של סיב יחיד. תרגלו את הפרוטוקול המלא מאיסוף סיבים ועד לזיהוי סוג סיב יחיד לפחות פעמיים לפני תחילת המחקר.
- לפני איסוף הסיבים, יש לחשב את הנפח הכולל הדרוש לדגימת סוג סיבים מכל ביופסיה באופן הבא. לדוגמה, אם הנפח ההתחלתי של 1 סיב = 10 μL והנפח שנותר לאחר MyDoBID הוא (1 סיב × 10 μL) - 1 μL המשמש להכתמת נקודות = 9 μL (נפח דגימה), חשב את נפח הדגימה הכולל הנדרש על ידי הכפלת נפח הדגימה (μL) במספר הכולל של כתמים מערביים שיופעלו והכפל סכום זה כדי לקחת בחשבון יתירות: (9 μL × 4 כתמים מערביים) × 2 = 72 μL. חשב את מספר הסיבים הדרושים לכל דגימה מוקלדת על ידי חלוקת נפח הדגימה הסופי הנדרש (μL) בנפח הדגימה לכל דגימה ספציפית לסוג סיבים (לדוגמה, 72 μL ÷ 9 μL = 8 סיבים לכל דגימה ספציפית לסוג הסיב). כדי להשיג זאת, לאסוף סך של 50 סיבים.
הערה: נפח הדגימה הנדרש הוא ריכוז החלבון המינימלי הנדרש להפעלת MyDoBID ו- Western Blotting אם כמות החלבון המוטענת שווה לסיב ~3 מ"מ (~ 12 מיקרוגרם משקל רטוב) עבור כל דגימה (ראה קובץ משלים 1 לפרטים). עם זאת, נפח זה אינו לוקח בחשבון אם ג'לים חוזרים נדרשים עבור חלבון נתון. זהירות: המלקחיים חדים; טפל בהם בזהירות כדי למנוע את הסיכון של ניקוב העור.
- בידוד סיב יחיד
- על פיסת נייר קטנה בגודל 5 ס"מ x 1 ס"מ, השתמש בסרגל כדי לצייר קו של 1 ס"מ. סמן כל 1 מ"מ בקו זה.
- הכניסו אותו מתחת למכסה צלחת הפטרי כמדריך להערכת אורך הסיבים שנאספו.
- הניחו את דגימת השריר המיובשת בהקפאה מתחת לסטריאומיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (x 7.5). השתמשו בזוג אחד של מלקחיים לניתוח רקמות עדינות כדי להחזיק את השריר המיובש בהקפאה במקומו ועם השני התחילו להפריד צרורות קטנים של סיבים (כפי שניתן לראות בסרטון).
- בודדו צרור סיבים אחד והמשיכו להפריד זה מזה עד שמקטעי סיבים בודדים מבודדים מהצרור.
- אספו לפחות 50 סיבים באורך ~1 מ"מ לפחות.
- העבירו את הסיב לחלל ריק על צלחת הפטרי. בדוק מקטעים בעלי סיב יחיד בהגדלה גבוהה יותר (x 50). ודאו שמדובר בסיב בודד על ידי הפרדה נוספת של הסיב בקצהו. אם הסיב נשבר במקום להיפרד, זהו סיב יחיד.
- דנטורציה של סיבים
- בעזרת מלקחיים, אספו בעדינות את הסיב והניחו אותו ישירות לתוך חיץ הדנטורינג המקורק (אל תתנו למלקחיים להיתקל בחיץ).
- בדוק את המלקחיים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהסיב הוסר בהצלחה. סגור את הצינור והקש בחוזקה על תחתית הצינור על הספסל שלוש פעמים כדי להבטיח שהסיב יזוז לתוך החיץ.
- נקו את המלקחיים באמצעות רקמה נטולת סיבים לפני שתעברו לסיב הבא. חזור על תהליך זה עד שכל הסיבים נאספים.
- מערבלים את דגימות הסיבים וצנטריפוגה קצרה במשך 5 שניות ב 2,500 × גרם כדי למשוך את הדגימה לתחתית הצינור.
הערה: משך הצנטריפוגה (5 שניות) מתוזמן מההתחלה (0 × גרם) עד שהמהירות מגיעה ל~2,500 × גרם. - השאירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי. יש להקפיא ולאחר מכן להפשיר את הדגימות לפני השימוש.
3. כתם נקודה
- הכנת הממברנה והפעלתה
- מדדו, תייגו וחתכו לגודל קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) אחד (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) כדי להתאים ל-50 דגימות (~10.5 ס"מ x 5.5 ס"מ).
- סמן את הגבול השמאלי מבחינה מספרית מלמעלה למטה (1 עד 10) ואת הגבול העליון בסדר אלפביתי משמאל לימין (A עד E) במרווחים של 1 ס"מ זה מזה.
- הכן ארבעה גיליונות נייר סינון במידות של 12.5 ס"מ x 7.5 ס"מ.
- ערמו שני גיליונות יחד ליצירת ערימה. השרו מראש את ערימת נייר הסינון במאגר העברה אחד.
- מניחים את הממברנה במיכל. יוצקים 95% אתנול על הממברנה, עם נפח מספיק כדי לטבול לחלוטין את הממברנה (10-15 מ"ל). התסיסו על הנדנדה במשך דקה.
- אספו את האתנול, טבלו את הממברנה במאגר העברה 1x (~ 15 מ"ל), ונדנדו במשך 2 דקות נוספות.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר הן באתנול והן בחיץ העברה לניסויים עתידיים של הכתמת נקודות עד להיווצרות שיקוע (שינוי לאחר שישה שימושים). - הנח את ערימת נייר המסנן הספוג במאגר העברה על משטח שטוח הניתן להזזה, כגון מכסה גדול, ושטח באמצעות הרולר. מקם את קרום PVDF על הערימה באמצעות משחרר ג'ל או פינצטה.
- הניחו גיליון בודד של נייר סינון יבש על גבי הממברנה והעבירו את הגלגלת מעל נייר הסינון כדי לספוג את עודפי החיץ על פני הממברנה. הסר את נייר הסינון העליון מבלי לשפשף את הממברנה.
אזהרה: מתנול (דרגה 3, תת-סיכון 6.1) ואתנול (דרגה 3) מסוכנים. עיין בגליון הנתונים של בטיחות החומרים (MSDS) לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
- ספיגת דגימה לממברנה
- הפשירו את דגימות הסיבים, בצעו צנטריפוגה קצרה (5 שניות) בטמפרטורת החדר כמו בשלב 2.3.4 וערבבו היטב את הדגימה.
- מבלי לגעת בקרום עם קצה הפיפטה, יש להפקיד באיטיות טיפה ~1 μL של כל דגימה על הממברנה באזור המיועד. מידות השטח המיועד לדגימת סיבים הן ~ 1 ס"מ x 1 ס"מ. המטרה היא לאתר את הדגימה במרכז אזור זה.
- הניחו לטיפות הדגימה להיספג דרך הממברנה למשך 15 דקות לפחות. ודא שלא נשאר חיץ דגימה והוא נספג לחלוטין.
- בעזרת פינצטה מפלסטיק, הרימו בזהירות את הממברנה מערימת נייר הפילטר הלח, הניחו אותה על גיליון יבש אחד של נייר פילטר, וייבשו את הממברנה למשך 5 דקות לפחות.
- ברגע שכתמי הדגימה הופכים לבנים לחלוטין, הפעל מחדש את הממברנה.
- הפעלה מחדש של הממברנה וחסימה
- הפעל מחדש את הממברנה על-ידי חזרה על שלבים 3.1.5 ו- 3.1.6.
- הניחו את הממברנה במאגר השטיפה ושטפו במשך 5 דקות עם נדנדה. יש להשליך את מאגר הכביסה.
- דוגרים על הממברנה בחיץ חוסם למשך 30 דקות תוך כדי נדנוד.
- שטפו את הממברנה 3 פעמים עם חיץ שטיפה עד שהמאגר כבר לא מעונן.
- השאירו את הממברנה בשטיפה הסופית על הנדנדה.
4. תיוג חיסוני
- איתור MHCIIa
- יש לדלל את הנוגדן הראשוני MHCIIa ב-1 ל-200 ב-10 מ"ל של מאגר אלבומין בסרום בקר (BSA).
- יש להשליך את חיץ השטיפה מהממברנה ולאחר מכן לשפוך את נוגדן MHCIIa המדולל על הממברנה.
- הניחו את המיכל (עם הממברנה ב-MHCIIa) על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב-4°C למשך הלילה.
- יש לאסוף את נוגדן MHCIIa ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C. שטפו את הממברנה עם חיץ חוסם למשך 2 דקות על הנדנדה.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכל הנוגדנים הראשוניים עד פי חמישה כל עוד המאגר נשאר ברור. - לשטוף פעמיים נוספות; 5 דקות בכל פעם; שלוש שטיפות בסך הכל.
- לדלל עכבר אימונוגלובולין G חזרת פרוקסידז (IgG-HRP) נוגדן משני ב 1 ל 20,000 ב 10 מ"ל של חיץ חוסם ולהוסיף לממברנה.
- השליכו את חיץ השטיפה ודגרו על הממברנה בעכבר IgG-HRP משני עם נדנוד למשך שעה אחת.
- יש להשליך את המשני ולשטוף את הממברנה במאגר השטיפה (2, 5, 5 דקות).
- השאירו את הממברנה ספוגה בשטיפה הסופית עד שהיא מוכנה להדמיה.
- הפעל את מכונת ההדמיה בג'ל, המתן 15 דקות עד שמכונת ההדמיה תגיע לטמפרטורת ההפעלה הנדרשת ולאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים).
- בחלון התוכנה, לחץ על New Single Channel Protocol (איור 3A). לתמונת אור לבן של הממברנה, תחת יישומים | כתמים | לחץ על Colorimetric (איור 3B).
- לחץ על אזור הג'ל; כל אפשרות מתוכנתת למידות ספציפיות כך שיתאימו לגודל של סוגי ג'ל שונים. בחרו באפשרות המתאימה ביותר למידות הממברנה (איור 3C).
- הכינו את ה-ECL על ידי שילוב ריאגנטים של לומינול ופרוקסידז ביחס של 1:1. הכינו נפח מספיק של תערובת ECL כדי לכסות את כל הממברנה, בדרך כלל נדרש נפח כולל של 800-1,000 מיקרוליטר.
- מניחים את הממברנה על מגש פלסטיק גדול ושקוף ומפזרים את תערובת ECL על הממברנה.
- הניחו את הממברנה על לוח ההדמיה.
- לחץ על מיקום ג'ל (כפתור צהוב) לתצוגה חיה של המצלמה. לחצו לחיצה ממושכת וגררו את לחצן הזום כדי להגדיל את אזור ההדמיה של הממברנה. בשלב זה, יישרו את מיקום הממברנה במידת הצורך.
- לחץ על הפעל פרוטוקול (כפתור ירוק) והמתן להפקת תמונה צבעונית של הממברנה. שמרו תמונה זו כדי לסייע בהתאמת הנקודות לדוגמת הסיב המתאימה.
- מבלי להזיז את הממברנה, שנו את היישום בתוכנה על-ידי לחיצה על האפשרות לכריכה של 2 x 2 (Chemi High Resolution) (איור 3D).
- תחת חשיפה לתמונה ותוכנה, מטב את זמן החשיפה, לחץ על פסים חלשים (איור 3E) | מצב צבירת אותות.
- תחת הגדרה, הקלד 1 שניות עבור התמונה הראשונה, 30 שניות עבור התמונה האחרונה ו- 30 תמונות בסך הכל (איור 3F).
- לחץ על הפעל פרוטוקול.
- שמור תמונה בשלבים הבאים: לפני רוויית אות (כל הנקודות הגלויות שחורות), רוויית אות ראשונית (נקודות מסוימות מתחילות להרוות) וכתמים רוויים יתר על המידה (כל הכתמים עם אות חזק שזוהה הם רוויים).
- שמור את כל התמונות הדרושות לפני סיום הצטברות האות. הוציאו את הממברנה מהתמונה.
- בעזרת משחרר הג'ל, החזירו את הממברנה למיכל בעזרת חיץ השטיפה.
- איתור MHCI
- שפכו את חיץ השטיפה החוצה ופנקו את הממברנה עם חיץ הפשטה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C (ודאו שהקרום שקוע לחלוטין).
- אספו מחדש את חיץ ההפשטה ושטפו את הממברנה בחיץ השטיפה במשך 5 דקות עם נדנדה.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפשטה 10x לפני השלכתו. - שפכו החוצה את חיץ השטיפה והפעם מרחו נוגדן MHCI ראשוני מדולל בריכוז התחלתי של 1 ל-200 (טווח: 1 ל-200 ל-1 ל-500). רוק את הממברנה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
- לאחר הדגירה בנוגדן MHCI ראשוני, יש לאסוף את הנוגדן ולשטוף את הממברנה כמו בשלבים 4.1.4 ו-4.1.5.
- לדלל עכבר IgM HRP נוגדן משני בחסימת חיץ ב 1 ל 20,000. יוצקים את המאגר החוסם מהממברנה ודגרים בעכבר IgM משני כמו בשלב 4.1.7.
- שטיפה ולכידת תמונה זיהו MHCI כמו בשלבים 4.1.8 עד 4.1.24.
אזהרה: מאגר הפשטה מכיל אורגנו פוספין 3-5% (דרגה 8). עיין ב- MSDS לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
- איתור MHCIIx פוטנציאלי באמצעות Actin
- הפשיט את הממברנה פעם נוספת (שלבים 4.2.1 ו- 4.2.2).
- חזור על סעיף 4.1, הפעם תוך שימוש בנוגדן ראשוני אקטין מדולל ב-1 ל-500 במאגר BSA ולאחר מכן נוגדן משני HRP מדולל ב-1 ל-20,000 במאגר חוסם.
5. זיהוי סוג סיבים
- ניתוח אותות MHCI, MHCIIa ואקטין
- הכירו את לוח עוצמת האות (איור 4A). רשום לעצמך את שלבים 5.1.2 עד 5.1.4.
- עוצמת אות רווי מצביעה איכותית על כך שזיהוי החלבון חזק.
- מתון מציין כי חלבון המטרה נמצא ברמה בינונית.
- אות חלש מצביע על נוכחות מועטה של חלבון מטרה.
- השתמשו בלוח עוצמת האות כדי לסווג סיבים עם עוצמת אות 'רוויה', 'בינונית' או 'חלשה' (איור 4A).
- בצעו זיהוי סוג סיבים על-ידי השוואת תוצאות MHCIIa ו-MHCI תחילה (איור 4B, כתמים שמאליים ואמצעיים).
- הקלט סיבים עם עוצמת אות רוויה או בינונית של איזופורם MHC אחד בלבד.
- אם אות האיזופורם MHC 'חלש', השאירו את הסיב לא מסומן (ראו איור 4B).
- לבסוף, כאשר אקטין נצפה (עוצמת אות בינונית או רוויה) בסיבים ללא זיהוי MHCI או IIa, רשמו אותו כסיב פוטנציאלי מסוג IIx (איור 4B, כתם ימני).
- הקלט סיבים עם אות איזופורם MHC חלש אך אקטין זוהה (עוצמה בינונית או רוויה) כבלתי מזוהה.
- השליכו דגימות עם זיהוי חלש או ללא זיהוי (ללא סיבים נאספים) עבור כל שלושת חלבוני המטרה (איור 4C).
- הקלט כל סיב שבו אותות MHCI ו- MHCII מזוהים עם אות 'רווי' או מתון. דגימות אלה אינן מיועדות לשימוש בתכשיר ספציפי לסוג הסיבים.
- הכנת דגימות ספציפיות לסוג סיבים
- הכינו דגימה נפרדת מסוג I ו-II לכל ביופסיה. עבור דגימה מסוג II, שלב את מספר הסיבים המינימלי הנדרש (מחושב בשלב 2.1.5) שבהם MHCIIa מזוהה ברמות רוויות או בינוניות.
- בצינור נפרד שמסומן כסוג I, חזרו על התהליך הזה עבור סיבים שבהם MHCI מזוהה (איור 4D).
- השתמש בסיבים עם עוצמת אות בינונית אם אין מספיק סיבים עם אותות רוויים.
- שלב כל סיבי IIx פוטנציאליים.
- השתמש מיד בדגימות ספציפיות לסוג סיבים עבור כתמים מערביים או לאחסן אותם ב -80 ° C לשימוש עתידי.
6. אישור סוג סיבי כתם מערביים
- נצלו 10 μL מכל דגימה ספציפית לסוג הסיב (נפח הדגימה המינימלי הנדרש, ראה שלב 2.1.5).
- יש להפריד דגימות באמצעות הג'ל הטרומי שצוין באמצעות SDS-PAGE בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- השתמש במכונת הדמיה של ג'ל כדי לזהות את החלבון בג'ל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- מניחים את הג'ל במאגר העברה קר 1x למשך 10 דקות.
- העברה רטובה של החלבונים לקרום ניטרוצלולוז בגודל 0.45 מיקרומטר (9.5 ס"מ x 13.5 ס"מ) על פי פרוטוקול היצרן.
- לאחר ההעברה, לשטוף בקצרה את הממברנה עם ultrapure H2O במיכל. יוצקים החוצה את המים האולטרה-טהורים.
- הוסף 10 מ"ל של תמיסת משפר אות נוגדנים לממברנה ולסלע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- אסוף מחדש את תמיסת משפר אות הנוגדנים ושטוף 5x (5 שניות לכל כביסה) עם H2O טהור במיוחד.
הערה: ניתן להשתמש בתמיסת משפר אות נוגדנים פי 5 לפני השלכתה. - יוצקים החוצה את השטיפה האחרונה, מוסיפים תמיסת חסימה ומתנדנדים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
- השתמש בלהב אזמל נקי או מספריים כדי לחתוך אופקית על פני הממברנה במשקל מולקולרי המבטיח כי חלבונים בגודל 180 kDa ומעלה נמצאים בחלק העליון של הממברנה.
- השתמשו בחלק העליון הזה לאישור נוסף של סוג הסיב.
- השתמש בחלק מתחת 180 kDa כדי לזהות חלבוני מטרה שונים.
- בחלק העליון של הממברנה, בצע את סעיף 4.1 עם נוגדן משניים MHCIIx ראשוני ועכבר אימונוגלובולין M (IgM) HRP.
- הסירו את הממברנה (כמתואר בסעיפים 4.2.1 ו-4.2.2) לפני חזרה על התהליך עם MHCIIa IgG ראשוני ונוגדן משני מסוג IgG HRP בעכבר.
- הפשיטו פעם נוספת ולבסוף מרחו נוגדן משני מסוג MHCI IgM ראשוני ועכבר מסוג IgM HRP.
הערה: שלב זה הוא איכותי ולכן כל אובדן חלבון עקב הפשטת הממברנה אינו מהווה דאגה. - השוו את האות שזוהה בין איזופורמים שונים של MHC (כפי שניתן לראות באיור 5B). כאשר עוצמת האות מזוהה ברמות בינוניות עד רוויות במדגם הצפוי (MHCI - סוג I, MHCIIa - סוג II ו- MHCIIx - סוג IIx), הדגימות הספציפיות לסוג הסיב יירשמו כאמינות לשימוש במחקרים עתידיים.
- רשום את הדגימה כבלתי אמינה כאשר יותר מאיזופורם MHC אחד מזוהה באותה מידה בדגימה.
אזהרה: תמיסת משפר נוגדנים מכילה נתרן הידרוקסידי 50%. עיין ב- MSDS לקבלת המלצות לטיפול בטוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי סיבי שריר בודדים מסוג MHCI, MHCIIa ו-MHCIIx באמצעות כתם נקודות
מאפיין של MyDoBID הוא סיווג של עוצמת האות MHC ו-Actin המשתנה בסיב נתון (איור 4A). סוג הסיבים זוהה על-ידי נוכחות או היעדר איזופורמים MHCI ו-IIa (איור 4B). שישה סיבים לא הראו זיהוי MHC או אקטין (actin), מה שמצביע על כך שלא נאספו סיבים. התוצאות של כתם נקודה ספציפי זה היו זיהוי של 22 סיבים מסוג II, 7 סיבים מסוג I ו-3 סיבים פוטנציאליים מסוג IIx; 2 דגימות לא מזוהות ו-6 דגימות סווגו כ'ללא סיבים' שנאספו (איור 4B, C). סיבים שעדיין לא היה להם אות MHCI או MHCIIa שניתן לזיהוי, היו חיוביים לאקטין זוהו כסיבים פוטנציאליים מסוג IIx בתהליך של אלימינציה. באמצעות לוח עוצמת האות כדי לסווג עוצמת אות MHCI ו- IIa, סיבים 'בינוניים' או 'רוויים' שולבו כדי לייצר דגימות מסוג I או II, בהתאמה. סיבים שלא זוהו או שזוהה בהם אקטין חלש או שלא זוהה כלל אקטין לא נכללו בניתוח שלאחר מכן והושלכו (איור 4D).
אישור הקלדת סיבים באמצעות כתם מערבי
הדגימות הספציפיות לסוג הסיבים אומתו באמצעות כתמים מערביים ונוגדנים ספציפיים ל-MHC (איור 5). דגימות סיבים מסוג I וסוג II מביופסיה בודדת אחת בוצעו יחד עם דגימה מסוג IIx, שהייתה דגימה של סיבים פוטנציאליים מסוג IIx משני אנשים בשל המספר הנמוך של סיבים מסוג IIx הקיימים בכל ביופסיה. נתוני הכתם המערביים אישרו כי זיהוי סוג הסיבים היה מוצלח.
איור 1: סיכום זרימת עבודה המתאר הכנת דגימה, הקלדת סיבים ואישור כתם מערבי על ספציפיות הסיבים . (A) רקמה אנושית מיובשת בהקפאה למשך 48 שעות. (B,C) מקטעי סיבים בודדים מבודדים תחת מיקרוסקופ מנתח. (D) סיבים עוברים דנטורציה ו-(E) לאחר שעה אחת, מאוחסנים בטמפרטורה של -80°C. (F) סדר דגירה ראשוני של נוגדנים. (G) הסיבים זוהו באמצעות MHCIIa (סוג II), MHCI (סוג I) ואקטין (IIx?, סיבים פוטנציאליים מסוג IIx). (H) לאחר מכן אוגמו סיבים. (I) דגימות ספציפיות לסוג סיבים לצד עקומת כיול מנותחות באמצעות SDS PAGE ו-Western Blotting. (י) תיקוף זיהוי סוג הסיבים באמצעות כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מסך התצוגה ולוח הבקרה של מערכת הייבוש בהקפאה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרות הדמיה ללכידת אור לבן של הממברנה ואחריה זיהוי כימילומינסנטי של חלבוני מטרה. כדי לצלם את הממברנה תחת אור לבן, (A) בחר ערוץ יחיד חדש ואחריו (B) כתמים | יישום קולורימטרי . (C) בהתבסס על גודל הג'ל שבו נעשה שימוש, בחר את אזור ההדמיה המתאים ולאחר מכן צלם תמונת אור לבן על-ידי לחיצה על Run Protocol. (D) מבלי להזיז את הממברנה, חזור על שלב B אך הפעם, בחר כתמים | חמי היי רזולוציה. לפני שתלחץ על הפעלה, בחר (E) חשיפה לתמונה כדי למטב פסים חלשים , ו-(F) הגדר את מצב צבירת האותות ובמקרה הראשון, הגדר את זמן החשיפה לכל שנייה למשך 30 שניות בסך הכל כשסימון פיקסלים רוויים מסומן. לחץ על פרוטוקול הפעלה ואפשר להפעלה להסתיים לפני בחירת התמונות הטובות ביותר לשמירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי סוג סיבים. (A) סוגי סיבים זוהו ביחס לכל הסיבים האחרים על הממברנה, מסווגים לפי לוח עוצמת האות עבור כל איזופורם MHC שזוהה (למשל, אות MHCI: רווי, בינוני וקלוש). (B) באמצעות הפאנל ב-(A), נוגדן MHCIIa זיהה סיבים מסוג II (כחול, כתם שמאלי), ולאחר הפשטת הממברנה, נוגדן MHCI זיהה סיבים מסוג I (אדום, כתם אמצעי). נוגדן אקטין שימש לזיהוי סיבי IIx פוטנציאליים אם אות אקטין חיובי זוהה בסיבים שבהם לא זוהה אות MHCI או IIa קודם (ירוק, כתם ימני). סיבים שלא פעלו בהתאם להנחיות אלה מודגשים בסגול (לא מזוהים). לבסוף, דגימות שליליות לאות אקטין הצביעו על כך שלא נאספו סיבים ('ללא סיבים'). (C) טבלה המציגה תיוג סיבים המתאים למיקום הדגימה על כתמי נקודות המוצגים ב-(B). (D) מתווה בחירת סיבים להכנת דגימות ספציפיות לסוג הסיבים. המטרה הייתה לאסוף 10 סיבים רוויים לכל סוג סיבים. כאן, עבור סיבים מסוג II, זוהו ונאגרו שמונה סיבים רוויים. עבור סיבים מסוג I, פחות מ -10 סיבים רוויים היו נוכחים, ולכן נבחרו גם סיבים עם עוצמת אות בינונית. עבור סיבים מסוג IIx זוהו ונאגרו שני סיבים. אם מזוהים פחות מ-10 סיבים (רוויים ומתונים), ייתכן שיהיה צורך באיסוף סיבים נוסף. הערה: אות האקטין המוצג ב-(B) לא הגיע לרוויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אישור כתם מערבי לזיהוי סוג הסיב. זיהוי סוג הסיבים בוצע לפי איור 4 כדי לייצר דגימות מסוג I (~10 סיבים) וסוג II (~10 סיבים). מכיוון שלא זוהו סיבי IIx מאותה ביופסיה, דגימת IIx המוצגת כאן הופקה מיותר מדגימת שריר אחת (n = 2 אנשים). אליציטוט קטן של כל דגימה ספציפית לסיב מנותח על ידי כתם מערבי כדי לאשר זיהוי סוג סיבים. סמני משקל מולקולריים (kDa) מסומנים משמאל, נלכדים תחת אור לבן מבלי להזיז את הממברנה. חלבוני המטרה מזוהים ברצף של MHCIIx, MHCIIa ו-MHCI, כאשר המיוזין מהג'ל המופעל על-ידי UV מציין חזותית את כמות החלבון המועמס בכל דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: חישוב מסת סיבים מיובשים בהקפאה באמצעות עקומת כיול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אוסף סיבים
בהתבסס על מספר שנות ניסיון, רוב החוקרים יכולים לשלוט בטכניקה זו; עם זאת, תרגול מוביל לאיסוף סיבים מהיר ויעיל יותר לניתוחים במורד הזרם. כדי שניתן יהיה לבודד 30 מקטעי סיבים בודדים באיכות לאיגום, מומלץ לאסוף 50 מקטעי סיבים בכל דגימה. מומלץ ללמוד היטב את סרטון איסוף הסיבים ולאחר ביצוע שני מפגשי תרגול (~50 סיבים בכל מפגש) כדי להשיג סטנדרט סביר. כל הסיבים שנאספים עוברים MyDoBID כדי לזהות את סוג הסיבים, מה שיגלה עד כמה הטכניקה מבוצעת בצורה יעילה. זה ייראה כמספר נמוך של אות MHC 'ללא סיבים' או 'חלש' שזוהה בדגימות סיבים (ראה סעיף פרוטוקול 5.1).
ידוע כי שריר יכול להכיל סיבים היברידיים, כאשר גם MHCI וגם MHCIIa נמצאים, או MHCIIa ו- IIx 2,14. מגבלה של MyDoBID היא שלא ניתן לוודא נוכחות של סיב היברידי מכיוון שדגימה חיובית לנוגדנים MHCI ו- MHCIIa יכולה להיות סיב היברידי או שנאספו שני סיבים. יתר על כן, MyDoBID אינו יכול לזהות MHCIIa בנפרד מהיברידיות MHCIIa/IIx מכיוון שהנוגדן הראשי MHCIIa יזהה נוכחות של MHCIIa הן בסיבי IIa והן בסיבי IIa/IIx. מסיבות אלה, לא בוצע זיהוי והכנה של דגימות של סיבים היברידיים, ודגימות עם אותות MHCI ו-MHCIIa שנפלו מחוץ לטווחים המתוארים בלוח עוצמת האות הושלכו (איור 4A). מגבלה נוספת היא שלא ניתן לקבוע את חלקם של סוגי סיבי השריר בדגימה באמצעות MyDoBID, ויש צורך ביישום ניתוחים אימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים כדי לקבוע את התפלגות סוג הסיבים2.
כתם נקודה
לוח עוצמת האות ומזהה סוג הסיב מסתמכים על כך שכל הדגימה מיוצגת בנפח הקטן המוחל על קרום כתם הנקודות. כדי להשיג זאת, הדגימה מעורבבת היטב על ידי תסיסה לפני העמסה על הממברנה. כל הסיבים עם איזופורם MHC אחד בלבד עוברים לשלב הבא של איגום. בשלב זה, חשוב שכל סיב עם יותר מ-MHC אחד לא ימשיך לשלב הבא של שילוב דגימות. אם הדגימה מזוהמת, יש להשליך את כל הדגימה המאוגמת ועל החוקר לחזור לאיסוף סיבים ולחזור על שלבי בידוד הסיבים וניקוי הנקודות.
תיוג חיסוני
בעבר דווח כי 5 דקות הן זמן מספיק לחסום אתרים לא ספציפיים על הממברנה לזיהוי MHCI ו- MHCIIa9. קידום הטכניקה ל- MyDoBID דורש שימוש בנוגדן אקטין (Actin). נמצא כי היה צורך להגדיל את זמן החסימה של 5 דקות ל -30 דקות, כפי שדווח6, כדי לקבל קרום עם רקע מינימלי, שכן חסימה של 5 דקות הביאה לרקע קרום כהה יותר. חסימת זמן היא שיקול בכל טכניקה לזיהוי חיסוני, כגון כתם מערבי או אימונוהיסטוכימיה, ויש לשנותה בהתאם לצורך.
הפשטת הממברנה
הפשטה אינה יכולה לשמש לניתוחים כמותיים15 מכיוון שהיא גם מסירה חלבונים בעלי עניין, אך ניתן להשתמש בה ב- MyDoBID מכיוון שהיא בדיקה איכותית. מטרת ההפשטה היא להסיר את הנוגדנים הכבולים מפני השטח של הממברנה, ולאפשר שימוש בנוגדן חדש עם הפרעה מינימלית מהנוגדן הקודם. ב- MyDoBID קיימת אפשרות ליישם את הדגימה על פני שני קרומים, כאשר איזופורמים שונים של MHC מזוהים על ממברנות נפרדות. אם גישה זו מועדפת, הימנע מטיפול בצינור הדגימה יותר מפעם אחת על ידי טעינת הכתמים בו זמנית. זה יבטיח שזמן הייבוש בין כל נקודת דגימה יהיה דומה (~ 5 שניות הפרש) והשלבים הבאים יבוצעו בו זמנית במיכלים נפרדים. יש לציין כי אפשרות זו תגדיל את הזמן, המדגם, ואת הצריכה המתכלה.
נוגדנים מוחלים תחילה כדי לזהות סיבי MHCIIa, ולאחר מכן MHCI, מכיוון שנוגדן MHCI תמיד נותן אות בהיר מאוד, שיהיה קשה יותר לפשוט מאשר MHCIIa. אקטין מתבטא בצורה הומוגנית בסיבי שרירי השלד ומשמש כדי לאשר שחלק מהסיבים הוחל בהצלחה על הממברנה כמתואר לעיל.
הדמיה, זיהוי סוג סיבים והכנת דגימות ספציפיות לסוג הסיבים
כלי חדש פותח בפרוטוקול הזה כדי לסייע בזיהוי סוג הסיבים ובבחירת הדגימות כדי ליצור דגימות ספציפיות לסוג הסיבים (איור 4A). הדוגמה המוצגת בלוח עוצמת האות משמשת להגדרת עוצמת אות MHCI כ: (i) רווי, (ii) בינוני או (iii) חלש. לאיגום סיבים לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים, סיבים המציגים עוצמת אות רווי נבחרים ראשונים, ובמידת הצורך מוסיפים סיבים בעלי עוצמת אות בינונית. בעת הכנת דגימות מסוג I ו- II, יש בדרך כלל מספיק סיבים "רוויים" ו"בינוניים", כך שניתן יהיה להיפטר מסיבים המסווגים כ"קלושים" או בלתי מזוהים.
חידוש בשימוש באקטין במקום נוגדן MHCIIx לזיהוי סיבים טהורים מסוג IIx
בעבר, כדי לזהות סיבי IIx טהורים, אות MHCIIx הושווה באופן סובייקטיבי לאות MHCI ו- MHCIIa על כתם נקודה, ובתהליך של אלימינציה, הסיבים ללא אות MHCI או IIa, אך עם אות MHCIIx, זוהו כ- IIx טהור. עם זאת, בעיות יכולות להתעורר בעת שימוש בשני נוגדנים ראשוניים מסוג IgM של עכבר (MHCIIx ו- MHCI) על אותו ממברנה. למרות הפשטת הממברנה בין נוגדנים ראשוניים, ניתן לזהות אות נוגדנים שיורי. שימוש בנוגדן ראשוני נגד אקטין מונע את התרחשות הבעיה. כאן השתמשנו באקטין כדי לאשר שנאסף סיב ובהיעדר MHCI ו- MHCIIa, מציין כי סיב IIx היה נוכח. סיבי IIx פוטנציאליים מאושרים לאחר מכן על-ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי ל-MHCIIx (ראו איור 5 במאמר זה ואיור 2 ב-9). נוגדן 6H1 הוכח16 כדי לזהות את הרצועה המופרדת אלקטרופורטית המתאימה MHCIIx בשרירי השלד של חולדה ומסמן סיבים מסוג IIx בחתכים של עכבר, חולדה ושרירים אנושיים2.
אישור סוג סיבי כתם מערבי
מומלץ להריץ את כל הדגימות הספציפיות לסוג הסיבים מאותה ביופסיה על אותו ג'ל. עם נוגדן MHCI הדורש את אותו נוגדן משני כמו MHCIIx, דגימות מסוג I ו- IIx צריכות להיות מופרדות על ידי נתיב אחד לפחות בג'ל נתון, כפי שמוצג באיור 5. מכיוון שתכולת החלבון תשתנה בין דגימות ספציפיות לסוג סיבים עקב גודל סיבים משתנה, יש להשתמש בג'ל הראשון כדי לקבוע את נפח הדגימה שיש לטעון בריצות הג'ל הבאות כדי להשיג כמויות דומות של חלבון בכל הדגימות. לשם כך, החלבון הכולל בדגימה נתונה נקבע באמצעות טכנולוגיית הדמיה של ג'ל המופעל על ידי UV כדי לדמיין את כל רצועות החלבון שהופרדו בג'ל על ידי SDS-PAGE לפני ההעברה. החלבון הכולל בכל דגימה נקבע מתמונת הג'ל ומשמש לתיקון עומס לא שוויוני בריצת הכתם המערבית הבאה, בתנאי שעקומת כיול של מספר מסות ידועות של רקמת שריר השלד מופעלת לצד הדגימות הספציפיות לסוג הסיבים 3,4,6,17. כמו כן, אין צורך להשתמש בחלבון "משק בית" כמו אקטין כדי לקבוע את סך החלבון, מה שידרוש גם עקומת כיולמשלו 15. טכנולוגיה זו היא שיטה מדויקת וחוסכת זמן לקביעת סך החלבון וניתן לבצע אותה עם דגימה קטנה מאוד (כלומר, ~1/5עשירית הסיב9) ללא צורך בריאגנטים נוספים או תקני חלבון תוך מקסום כל חלקי הממברנה לאיתור חלבונים מעניינים.
כשמדובר בתיוג חיסוני במהלך שלב הכתם המערבי, נוגדן MHCIIx מיושם תחילה בשל השפע הנמוך יחסית של MHCIIx בהשוואה לאיזופורמים אחרים של MHC. ברגע שהממברנה מוכנה לגילוי נוגדנים MHCI, היא הייתה עוברת שני שלבים של הפשטה (כלומר, לאחר זיהוי MHCIIx ו-MHCIIa). כתוצאה מכך, זיהוי MHCI צריך להיות מזוהה בעיקר בדגימה מסוג I, עם אות שיורי מינימלי שזוהה מנוגדני MHC קודמים (איור 5). כתם מערבי משמש כדי לאשר את הטוהר של כל דגימה ספציפית לסוג סיב באמצעות כל שלושת נוגדני MHC על אותו חלק ממברנה. עם זאת, הצורך בהפשטה היה מתבטל אם נוגדנים MHCI או MHCIIx היו גדלים במין מארח אחר כגון ארנב או עז.
יישומים
המתודולוגיה המתוארת כאן יכולה לשמש להקלדת סיבים, מקטעים של סיבים בודדים משרירי שלד טריים או מיובשים בהקפאה, כדי לבחון ביטוי חלבון ספציפי מסוג סיבים בשרירי השלד האנושיים. בנוסף, באמצעות דגימות שריר טריות,ניתן להשתמש בסיבים שלמים או מכניים 6. שימוש בסיב עור מאפשר בחינה נוספת של ביטוי חלבונים בתאים תת-תאיים כגון אלה שבתאי הציטוזול והממברנה. יישום זה שימש בעבר למדידת כמות הגליקוגן שנקשר לעומת לא קשור במקטעי סיבים בעלי עור מכני מאנשים בריאים וסוכרתיים6. חשוב לציין, MyDoBID מועיל לניסויים המשתמשים בדגימות דנטורציה בלבד ולא יתאים למחקרים הדורשים חלבונים במצבם הטבעי. בעוד שייתכן שניתן יהיה לבצע ניתוחים אחרים כגון בדיקות אנזימטיות או גישות פרוטאומיות בתמיסה בתנאים טבעיים, יידרש אופטימיזציה נוספת כך שניתן יהיה להסיר חלק מהסיב לצורך זיהוי איזופורמים MHC באמצעות MyDoBID.
לסיכום, ניתן לזהות בהצלחה את סוג I, סוג II וסוג IIx על ידי יישום טכניקה פשוטה עם חומרים מתכלים זמינים המשמשים בדרך כלל לכתמים מערביים. אנו כוללים מידע מעשי נרחב, כאשר עם סיום מוצלח יפיקו דגימות ספציפיות לסוג סיבים שהן באיכות, שלמות ואמינות הטובות ביותר האפשריות למחקרים עתידיים. טכניקה זו היא הגישה המעשית והמועדפת לביצוע אנליזה ביוכימית של שרירי שלד ספציפיים לסיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
הנוגדנים נגד MHC I (A4.840) ו- MHCIIa (A4.74) ששימשו במחקר זה פותחו על ידי ד"ר H. M. Blau והנוגדן נגד MHCIIx (6H1) פותח על ידי ד"ר C. A. Lucas והתקבל מבנק Hybridoma למחקרים התפתחותיים (DSHB), הודות לחסות המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה (איווה סיטי, IA). אנו מודים לוויקטוריה ל. ויקסמה על שסיפקה את דגימות השריר האנושי למחקר זה. רוב התמונות באיור 1 נלקחו מ-BioRender.com.
מימון:
מחקר זה לא זכה למימון חיצוני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J.
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
