Summary
このプロトコルは、ドットブロッティング技術を使用して、ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームに従って、凍結乾燥したヒト骨格筋および繊維タイプの分類からの単一繊維の分離を示しています。同定されたMHC IおよびIIファイバーサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して、タンパク質発現におけるファイバータイプ特異的な違いについてさらに分析することができます。
Abstract
ここで説明する技術は、ドットブロッティング(以下、筋線維タイプのIDエンティフィケーション(MyDoBID)のためのDot BロッティングによるMyosin重鎖検出と呼ぶドットブロッティングを用いて、個々の筋線維のセグメント中の特定のミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを同定するために用いることができる。このプロトコルは人間の骨格筋を凍結乾燥し、単一の筋繊維の区分を隔離するプロセスを記述する。MyDoBIDを用いて、I型線維とII型線維をそれぞれMHCI特異的抗体とIIa特異的抗体で分類します。次に、分類されたファイバーは、各生検のファイバータイプ固有のサンプルに結合されます。
各サンプル中の総タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびUV活性化ゲル技術によって決定されます。ファイバータイプのサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して検証されます。また、複数のウェスタンブロットで標的タンパク質の検出を強化するために、タンパク質ローディングの正規化を行うことの重要性についても説明します。単繊維ウェスタンブロットと比較して、分類された繊維を繊維タイプ固有のサンプルに統合する利点には、サンプルの多様性、サンプルスループットの向上、投資時間の短縮、コスト削減対策などがあり、均質化された筋肉サンプルでは見落とされがちな繊維タイプ固有の貴重な情報を保持します。プロトコルの目的は、凍結乾燥したヒト骨格筋サンプルから単離されたタイプIおよびタイプII繊維の正確かつ効率的な同定を達成することです。
その後、これらの個々の繊維を組み合わせて、タイプIおよびタイプIIの繊維タイプ固有のサンプルを作成します。さらに、MHCIおよびMHCIIaが陰性であった線維のマーカーとしてアクチンを使用し、ウェスタンブロッティングによってIIx線維として確認されたIIx型線維の同定を含むようにプロトコルを拡張しています。次に、各繊維タイプ固有のサンプルを使用して、ウェスタンブロッティング技術を使用してさまざまな標的タンパク質の発現を定量化します。
Introduction
骨格筋は不均一な組織であり、細胞(繊維)が遅筋(タイプI)か速筋(タイプII)かに依存する明確な細胞代謝および収縮特性を持っています。繊維の種類は、収縮時間、短縮速度、耐疲労性など、いくつかの点で互いに異なるミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを調べることで識別できます1。主なMHCアイソフォームには、I型、IIa型、IIb型、IIx型があり、それらの代謝プロファイルは酸化性(I型およびIIa型)または解糖系(IIx、IIb)のいずれかです1。これらの繊維の種類の割合は、筋肉の種類や種によって異なります。IIb型はげっ歯類の筋肉に広く見られます。ヒトの筋肉にはIIb型線維は含まれておらず、主にMHCアイソフォームI型およびIIa線維で構成されており、IIx線維の割合はわずかです2。タンパク質の発現プロファイルは繊維の種類によって異なり、加齢3、運動4,5、疾患6によって変化する可能性があります。
異なる骨格筋線維タイプの細胞応答を測定することは、筋ホモジネート(すべての線維タイプの混合物)の検査のために見落とされたり、不可能になったりすることがよくあります。単繊維ウェスタンブロットは、個々の筋線維中の複数のタンパク質の調査を可能にします7。この方法論は、ホモジネート調製物では得られなかった新規で有益な単繊維特性を生み出すために以前に利用されてきました。しかし、当初のシングルファイバーウェスタンブロット法には、時間がかかること、サンプルの複製ができないこと、高価で高感度な化学発光(ECL)試薬の使用など、いくつかの限界がありました。新鮮な組織を使用する場合、この方法は、限られた時間枠(すなわち、1〜2時間)内に個々の繊維を単離する必要があるという時間的制約のためにさらに制限されます。幸いなことに、この拘束は、凍結乾燥組織から単線維セグメントを単離することによって緩和される8。ただし、凍結乾燥サンプルからの繊維収集は、生検組織のサイズと品質によって制限されます。
ドットブロッティング法9を用いた繊維タイプの同定は、この包括的なプロトコルにおいて大幅に精緻化され、拡張された。以前、わずか2~10mgの湿潤重量の筋肉組織が凍結乾燥および単繊維MHCアイソフォームタンパク質分析に十分であることが実証されています9。Christensen et al.9 は、ドットブロッティングによって存在する MHC アイソフォームを検出するために、~1 mm のファイバーセグメントの 30% を使用し、これはウェスタンブロッティングによって確認されました。この研究では、ウェスタンブロッティングをドットブロッティングに置き換えることで、全体的なコストが~40倍削減されることが示されました(ファイバーセグメント50個分)。その後、繊維をタイプIおよびタイプIIのサンプルに「プール」し、実験的な複製を可能にした9。それにもかかわらず、限界は、タイプI(MHCI陽性)とタイプII(MHCII陽性繊維)の2つの繊維タイプ固有のサンプルしか得られず、タイプIIサンプルにはMHCIIaとMHCIIxの混合物が含まれていることでした6,10。特に、現在のプロトコルは、純粋なIIx型ファイバーの同定方法を示しており、一般的なプロトコルの問題に対するトラブルシューティング戦略を含む、非常に詳細なワークフロー(図1に要約)を提供しています。
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Protocol
ヒトの筋肉サンプルは、局所麻酔(キシロカイン)と手動吸引用に改造されたバーグストローム針を使用した無菌条件下で70〜74歳のn = 3(男性2人、女性1人)の外側広筋から採取されました11,12。サンプルは、ビクトリア大学ヒト研究倫理委員会(HRETH11/221)によって承認され、ヘルシンキ宣言13に従って実施された以前の研究のサブセットでした。参加者は、この研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供しました。このプロトコルに必要なすべての材料の詳細は、材料表に示されています。さらに、一般的なプロトコルの問題に対処するトラブルシューティング戦略のリストを表 1 に示します。
1.フリーズドライ
- 生検された筋肉サンプルをドライアイスで凍結したまま、空の凍結チューブを体重計で計量し、風袋引きします。
- 最低10mgの湿重量凍結組織を速やかに計量する。重量を小数点以下1桁まで記録します。
- 蓋に3〜4個の穴が開けられた予冷された微量遠心チューブに組織を堆積させ、ドライアイスのペレットを2〜3個入れた小さなビーカーに入れます。
- 凍結乾燥機の製造元の取扱説明書に従ってください。
- 凍結乾燥機のすべてのバルブが閉じていることを確認し、凍結乾燥機のスイッチを入れます。
- コントロールパネルを使用して、真空設定値が人体組織に最適な凍結乾燥条件( 0.12ミリバール(mBar)) にプログラムされていることを確認します(図2)。
- 凍結乾燥機の 手動 を押し、チャンバーが-40 °Cに冷えるまで待ちます。
- チャンバーがその温度に達したら、蓋を外し、次にガラスチャンバーを取り外し、ビーカー(筋肉サンプルを含む)を金属ステージに置きます。
- ガラスチャンバーと蓋を交換してください。蓋の真空リリースバルブを閉じ、真空スケールライトが緑色に変わるまで待って、乾燥機が真空シールされていることを確認します。
- 筋肉サンプルを48時間凍結乾燥します。凍結乾燥が完了したら、真空ボタンを押して真空ポンプをオフにし、蓋の真空リリースバルブを開きます。
- チャンバーの蓋を外し、凍結乾燥したサンプルを回収します。組織の重量を量り、小数点以下1桁まで重量を記録します。
- 体重の減少率を計算します。~75%の重量減少は、組織が凍結乾燥に成功したことを示します(この研究では、平均±SD、76±9%、n = 11の筋肉サンプル)。
- AUTOを押して、真空ポンプと冷凍庫のスイッチを切ります。ユニットが周囲温度に達するまで待ちます。
- 製造元の指示に従って冷却コイルを清掃し、蓄積した液体をコレクターから排出します。
注意: ファイバーの収集はすぐに開始できます。組織を繊維の分離に使用しない場合は、凍結乾燥したサンプルをデシケータービーズ付きの密閉容器に-80°Cで保管してください。 注意:ドライアイスは危険です(クラス9)。推奨される安全な取り扱いについては、MSDSを参照してください。
2.繊維の収集
- 繊維回収の準備
- 最低50本のマイクロチューブ(ファイバー1〜50)に標識し、各チューブに10 μLの変性バッファーをピペットで固定します。
- 2組の微細組織解剖鉗子、糸くずの出ない組織、卓上ランプ、実体顕微鏡(黒いステージを上にした状態)、ボルテックス、および卓上遠心分離機で採取エリアを準備します。
- 凍結乾燥した筋肉サンプルをペトリ皿の蓋に置きます。解剖顕微鏡のステージに蓋を置きます。
- 単繊維解剖のビデオをご覧ください。研究を開始する前に、繊維の収集から単一繊維タイプの識別までの完全なプロトコルを少なくとも2回練習してください。
- 繊維採取の前に、 各生検から繊維タイプサンプルに必要な総量 を次のように計算します。例えば、開始容量が 1 ファイバー = 10 μL で、MyDoBID 後の残量が (1 ファイバー × 10 μL) - ドットブロッティングに使用した 1 μL = 9 μL (サンプル量) の場合、サンプル容量 (μL) に実行するウェスタンブロットの総数を掛けて 必要な総サンプル 量を計算し、冗長性を考慮してこの量を 2 倍にします。 (9 μL × 4ウェスタンブロット) × 2 = 72 μL。 最終必要サンプル量(μL)をファイバータイプ固有のサンプルあたりのサンプル量で割ることにより、タイプされたサンプルあたりに必要なファイバー数を計算します(たとえば、 ファイバータイプ固有のサンプルあたり 72 μL÷9 μL = 8ファイバー)。これを達成するには、合計50本の繊維を収集します。
注:必要なサンプル量は、ロードされたタンパク質の量が各サンプルのファイバー ~3 mm(湿重量~12 μg)に相当する場合、MyDoBID とウェスタンブロッティングの両方を実行するために必要な最小タンパク質濃度です(詳細については、補足ファイル 1 を参照)。ただし、この容量は、特定のタンパク質にリピートゲルが必要かどうかを考慮していません。 注意: 鉗子は鋭利です。皮膚に穴を開ける危険を避けるために、注意して取り扱ってください。
- 単芯ファイバー絶縁
- 5cm×1cmの小紙に定規を使って1cmの線を引きます。その線に1mmごとにマークを付けます。
- これをシャーレの蓋の下にガイドとして挿入し、収集された繊維の長さを推定します。
- 凍結乾燥した筋肉サンプルを低倍率(7.5倍)で実体顕微鏡の下に置きます。1組の微細組織解剖鉗子を使用して凍結乾燥した筋肉を所定の位置に保持し、もう1組で繊維の小さな束を分離し始めます(ビデオを参照)。
- 繊維の 1 つの束を単離し、単一の繊維セグメントが束から分離されるまで引き離し続けます。
- 長さが少なくとも~1mmの繊維を最低50本集めます。
- ファイバーをペトリ皿の空きスペースに移動します。単繊維セグメントを高倍率(50倍)で検査します。最後にファイバーをさらに分離して、単一のファイバーであることを確認します。繊維が分離せずに壊れる場合、それは単一の繊維です。
- 繊維の変性
- 鉗子を使用して、繊維を静かに回収し、分注した変性バッファーに直接入れます(鉗子がバッファーに接触しないようにしてください)。
- 顕微鏡で鉗子をチェックして、繊維が正常に除去されたことを確認します。チューブを閉じ、ベンチでチューブの底をしっかりと3回叩いて、ファイバーがバッファーに移動するようにします。
- 次の繊維に移る前に、糸くずの出ないティッシュで鉗子をきれいに拭きます。すべての繊維が収集されるまで、このプロセスを繰り返します。
- ファイバーサンプルをボルテックスし、2,500 × g で5秒間短時間遠心分離して、サンプルをチューブの底に引き込みます。
注:遠心分離時間(5秒)は、開始(0 × g)から速度が~2,500 × gに達するまでの時間です。 - サンプルを室温で1時間放置します。将来の使用のために-80°Cで保管してください。使用前にサンプルを凍結してから解凍してください。
3. ドットブロッティング
- メンブレンの調製と活性化
- 50 サンプル(~10.5 cm x 5.5 cm)に適合するように、1 つのポリフッ化二フッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(孔径 0.2 μm)のサイズに測定、標識、および切断します。
- 左の境界線を上から下 (1 から 10) の数字でマークし、上の境界線を左から右 (A から E) のアルファベット順に 1 cm 間隔でマークします。
- 12.5cm×7.5cmのろ紙を4枚用意します。
- 2枚のシートを重ねて積み重ねます。ろ紙スタックを1x転写バッファーに事前に浸します。
- メンブレンを容器に入れます。95%エタノールをメンブレンに注ぎ、メンブレンを完全に浸すのに十分な量(10〜15 mL)を注ぎます。ロッカーで1分間攪拌します。
- エタノールを回収し、メンブレンを 1 倍転写バッファー(~15 mL)に浸し、さらに 2 分間揺石します。
注:エタノールと転写バッファーはどちらも、沈降が形成されるまで(6回使用すると交換)、将来のドットブロッティング実験に再利用できます。 - 転写バッファーを浸した濾紙を大きな蓋などの平らな可動面に置き、ローラーで平らにします。PVDFメンブレンをゲルリリーサーまたはピンセットを使用してスタック上に配置します。
- メンブレンの上に乾いた濾紙を1枚置き、ローラーを濾紙の上で動かして、メンブレン表面の余分なバッファーを吸収します。メンブレンをこすらずに上部のろ紙を取り除きます。
注意:メタノール(クラス3、サブリスク6.1)とエタノール(クラス3)は危険です。安全な取り扱いに関する推奨事項については、製品安全データシート(MSDS)を参照してください。
- メンブレンへのサンプル吸収
- 繊維サンプルを解凍し、ステップ2.3.4と同様に室温で短時間の遠心分離(5秒)を行い、サンプルを完全に混合します。
- ピペットチップでメンブレンに触れずに、各サンプルの~1 μL滴をメンブレンの所定の領域にゆっくりと堆積させます。繊維サンプルあたりの指定面積の寸法は、~1 cm x 1 cm です。この領域の中心にあるサンプルを見つけることを目指しています。
- サンプル液滴をメンブレンに少なくとも15分間浸します。サンプルバッファーが残っておらず、完全に吸収されていることを確認してください。
- プラスチックピンセットを使用して、湿らせた濾紙のスタックからメンブレンを慎重に持ち上げ、1枚の乾いた濾紙の上に置き、メンブレンを少なくとも5分間脱水します。
- サンプルの斑点が完全に白くなったら、メンブレンを再活性化します。
- 膜の再活性化とブロック
- 手順3.1.5と3.1.6を繰り返して、メンブレンを再活性化します。
- メンブレンを洗浄バッファーに入れ、ロッキングしながら5分間すすぎます。洗浄バッファーを廃棄します。
- メンブレンをブロッキングバッファー中で30分間、ロッキングしながらインキュベートします。
- 緩衝液が曇らなくなるまで、洗浄バッファーでメンブレンを3回すすぎます。
- メンブレンはロッカーでの最終洗浄時に残しておきます。
4. 免疫標識
- MHCIIaの検出
- MHCIIa一次抗体を10 mLのウシ血清アルブミン(BSA)緩衝液中で200分の1に希釈します。
- 洗浄バッファーをメンブレンから廃棄し、希釈したMHCIIa抗体をメンブレンに注ぎます。
- 容器(MHCIIaのメンブレン付き)をロッカーに置き、室温で2時間または4°Cで一晩。
- MHCIIa抗体を回収し、4°Cで保存してください。 メンブレンをブロッキングバッファーでロッカー上で2分間洗浄します。
注:すべての一次抗体は、バッファーが透明である限り、最大5倍まで再利用できます。 - さらに2回すすいでください。毎回5分。合計3回の洗浄。
- マウス免疫グロブリンG西洋ワサビペルオキシダーゼ(IgG-HRP)二次抗体を10 mLのブロッキングバッファーで20,000分の1で希釈し、メンブレンに添加します。
- 洗浄バッファーを廃棄し、マウスIgG-HRPセカンダリーでメンブレンを1時間ロッキングしながらインキュベートします。
- 二次膜を廃棄し、洗浄バッファー(2、5、5分)でメンブレンを洗浄します。
- イメージングの準備が整うまで、メンブレンを最終洗浄に浸しておきます。
- ゲルイメージャーの電源を入れ、イメージャーが必要な動作温度に達するまで15分間待ってから、イメージングソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。
- ソフトウェアウィンドウで、[ New Single Channel Protocol](新しいシングルチャネルプロトコル )をクリックします(図3A)。メンブレンの白色光画像の場合は、[ アプリケーション] |しみ | [ 比色] をクリックします(図3B)。
- ゲル領域をクリックします。各オプションは、さまざまなゲルタイプのサイズに合わせて特定の寸法にプログラムされています。メンブレンの寸法に最も適した適切なオプションを選択します(図3C)。
- ルミノール試薬とペルオキシダーゼ試薬を1:1の比率で組み合わせてECLを調製します。メンブレン全体を覆うのに十分な量のECL混合物を作成し、通常、総容量は800〜1,000μLが必要です。
- メンブレンを大きな透明なプラスチックトレイに置き、ECL混合物をメンブレンに分散させます。
- メンブレンをイメージングプレートの上に置きます。
- Position Gel(黄色のボタン)をクリックすると、ライブカメラビューが表示されます。ズームボタンをクリックしたままドラッグすると、メンブレンのイメージング領域が最大化されます。この時点で、必要に応じてメンブレンの位置をまっすぐにします。
- Run Protocol(緑色のボタン)をクリックし、メンブレンの比色画像が生成されるのを待ちます。この画像を保存して、ドットを対応するファイバーサンプルに一致させます。
- メンブレンを動かさずに、 2 x 2ビニング (Chemi High Resolution)のオプションをクリックして、ソフトウェア上のアプリケーションを変更します(図3D)。
- [Image exposure and software](画像の露出とソフトウェア)で、露光時間を最適化し、[Faint Bands](フェイントバンド)(図3E)|信号蓄積モード。
- [Setup](設定)で、最初の画像に1秒、最後の画像に30秒、合計30枚の画像を入力します(図3F)。
- [ Run Protocol] をクリックします。
- 信号が飽和する前(目に見えるすべてのドットが黒くなる)、最初の信号が飽和する前(一部のドットが飽和し始める)、および過飽和スポット(強い信号が検出されたすべてのスポットが飽和する)の段階で画像を保存します。
- 信号の蓄積を終了する前に、必要なすべてのイメージを保存します。イメージャーからメンブレンを取り出します。
- ゲルリリーサーを使用して、メンブレンを洗浄バッファーの入った容器に戻します。
- MHCIの検出
- 洗浄バッファーを注ぎ、ストリッピングバッファーで37°Cで30分間メンブレンを処理します(メンブレンが完全に浸漬していることを確認してください)。
- ストリッピングバッファーを回収し、メンブレンを洗浄バッファーでロッキングしながら 5 分間すすぎます。
注:ストリッピングバッファは、廃棄する前に10倍再利用できます。 - 洗浄バッファーを注ぎ、今度は開始濃度200分の1(範囲:200分の1から500分の1)に希釈したMHCI一次抗体を塗布します。メンブレンを室温で1時間揺り動かします。
- MHCI一次抗体でインキュベートした後、抗体を回収し、ステップ4.1.4および4.1.5に従ってメンブレンを洗浄します。
- マウスIgM HRP二次抗体をブロッキングバッファー中で20,000分の1に希釈します。メンブレンからブロッキングバッファーを流し出し、ステップ4.1.7と同様にマウスIgMセカンダリーでインキュベートします。
- 洗浄と画像キャプチャは、手順4.1.8から4.1.24のようにMHCIを検出しました。
注意:剥離バッファーには、有機ホスフィン3〜5%(クラス8)が含まれています。安全な取り扱いに関する推奨事項については、MSDSを参照してください。
- アクチンを用いたMHCIIx候補の検出
- もう一度メンブレンを剥がします(手順4.2.1および4.2.2)。
- セクション4.1を繰り返し、今度はアクチン一次抗体をBSA緩衝液で500分の1に希釈し、次に20,000分の1で希釈したウサギHRP二次抗体をブロッキング緩衝液で適用します。
5. ファイバータイプの識別
- MHCI、MHCIIa、アクチンシグナル解析
- 信号強度パネル(図4A)をよく理解します。手順 5.1.2 から 5.1.4 をメモします。
- 飽和シグナル強度は、タンパク質の検出が強いことを定性的に示しています。
- 中程度は、標的タンパク質が中程度に存在することを示します。
- 微弱なシグナルは、標的タンパク質がほとんど存在しないことを示しています。
- 信号強度パネルを使用して、信号強度が「飽和」、「中程度」、または「微弱」のファイバーを分類します(図4A)。
- 最初にMHCIIaとMHCIの結果を比較して、ファイバータイプの同定を行います(図4B、左および中央のブロット)。
- 1つのMHCアイソフォームのみの飽和または中程度のシグナル強度を持つファイバーを記録します。
- MHCアイソフォームシグナルが「微弱」な場合は、ファイバーにマークを付けないままにします( 図4Bを参照)。
- 最後に、MHCIまたはIIaが検出されないファイバーでアクチンが観察された場合(中程度または飽和シグナル強度)は、それを潜在的なIIx型ファイバーとして記録します(図4B、右ブロット)。
- MHCアイソフォームシグナルが微弱であるが、アクチンが検出された(中程度または飽和強度)ファイバーを未同定として記録します。
- 3 つの標的タンパク質すべてについて、検出が微弱または検出されない(繊維が回収されない)サンプルは廃棄します(図 4C)。
- MHCI信号とMHCII信号の両方が「飽和」または中程度の信号で検出されたファイバーを記録します。これらのサンプルは、繊維タイプ固有の調製には使用できません。
- 繊維種別サンプルの調製
- 生検ごとに個別のタイプIとタイプIIのサンプルを準備します。タイプIIサンプルの場合、MHCIIaが飽和レベルまたは中程度のレベルで検出されるファイバーの最小必要数(ステップ2.1.5で計算)を組み合わせます。
- タイプIとラベル付けされた別のチューブで、MHCIが検出されたファイバーに対してこのプロセスを繰り返します(図4D)。
- 飽和した信号を持つファイバーが十分にない場合は、中程度の信号強度のファイバーを使用します。
- 潜在的なIIxファイバーを組み合わせます。
- ウェスタンブロッティングには、ファイバータイプ固有のサンプルを直ちに使用するか、将来の使用のために-80°Cで保存してください。
6. ウェスタンブロット繊維の種類の確認
- 各ファイバータイプ固有のサンプルを10 μL利用します(必要な最小サンプル量、ステップ2.1.5を参照)。
- メーカーのプロトコルに従って、SDS-PAGEを介して指定されたプレキャストゲルを使用してサンプルを分離します。
- ゲルイメージャーを使用して、メーカーのプロトコルに従ってゲル中のタンパク質を検出します。
- ゲルを冷たい1x転写バッファーに10分間入れます。
- メーカーのプロトコルに従って、タンパク質を0.45 μmのニトロセルロースメンブレン(9.5 cm x 13.5 cm)に湿式転写します。
- 転写後、容器内で超高純度H2Oでメンブレンを短時間すすぎます。超純水を注ぎます。
- 10 mLの抗体シグナルエンハンサー溶液をメンブレンに加え、室温で10分間揺るがします。
- 抗体シグナルエンハンサー溶液を回収し、超高純度H2Oで5回(1回の洗浄あたり5秒)洗浄します。
注:抗体シグナルエンハンサー溶液は、廃棄する前に5回使用できます。 - 最後の洗浄液を注ぎ、ブロッキング溶液を加え、室温で1時間揺石します。
- 清潔なメスの刃またはハサミを使用して、180 kDa以上のタンパク質が膜の上部にあることを確認する分子量で膜を横切って水平に切断します。
- この上部セクションを使用して、ファイバータイプをさらに確認します。
- 180 kDa未満の部分を使用して、さまざまなターゲットタンパク質を検出します。
- メンブレンの上部に、セクション4.1に従ってMHCIIx一次抗体およびマウス免疫グロブリンM(IgM)HRP二次抗体を添加します。
- メンブレンを剥がしてから(セクション4.2.1および4.2.2に記載)、MHCIIa IgG一次抗体およびマウスIgG HRP二次抗体でこのプロセスを繰り返します。
- もう一度剥がし、最後にMHCI IgM一次抗体とマウスIgM HRP二次抗体を塗布します。
注:このステップは定性的なものであるため、メンブレンストリッピングによるタンパク質の損失は問題になりません。 - 異なるMHCアイソフォームで検出されたシグナルを比較します( 図5Bを参照)。予想されるサンプル(MHCI - タイプI、MHCIIa - タイプII、MHCIIx - タイプIIx)で信号強度が中程度から飽和レベルで検出された場合、ファイバータイプ固有のサンプルは、将来の研究で使用するために信頼できるものとして記録されます。
- 1つのサンプルで複数のMHCアイソフォームが等しく検出された場合、サンプルを信頼できないものとして記録します。
注意:抗体エンハンサー溶液には水酸化ナトリウムが50%含まれています。安全な取り扱いに関する推奨事項については、MSDSを参照してください。
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Representative Results
ドットブロッティングを用いたMHCI、MHCIIa、MHCIIx筋線維の個体同定
MyDoBIDの特徴は、特定のファイバー内のさまざまなMHCおよびアクチンシグナル強度を分類することです(図4A)。繊維の種類は、MHCIおよびIIaアイソフォームの有無によって識別されました(図4B)。6本のファイバーはMHCまたはアクチンの検出を示さず、ファイバーが回収されていないことを示しました。この特定のドットブロットの結果は、22 の Type II ファイバー、7 つの Type I ファイバー、および 3 つの潜在的な IIx タイプのファイバーの同定でした。2 つの未確認サンプルと 6 つのサンプルは、収集された「繊維なし」に分類されました(図 4B、C)。MHCIまたはMHCIIaシグナルが検出されないがアクチン陽性であるファイバーは、除去プロセスによってIIx型ファイバーの候補として同定されました。MHCIおよびIIaのシグナル強度を分類するためにシグナル強度パネルを使用し、「中程度」または「飽和」ファイバーを組み合わせて、それぞれI型またはII型サンプルを作製しました。未確認の繊維、またはアクチンが検出されなかった繊維は、その後の分析に含まれず、廃棄しました(図4D)。
ウェスタンブロッティングによる繊維のタイピング確認
繊維タイプ特異的サンプルは、ウェスタンブロッティングとMHC特異的抗体を用いてバリデーションしました(図5)。1つの個人生検からのI型およびII型線維サンプルは、各生検に存在するIIx型線維の数が少ないため、2人の個人からの潜在的なIIx型線維のサンプルであるIIx型サンプルとともに実行されました。ウェスタンブロットデータにより、ファイバータイプの同定が成功したことが確認されました。
図1:サンプル調製、ファイバータイピング、およびファイバー特異性のウェスタンブロットの確認を概説したワークフローの概要 。 (A)ヒト組織を48時間凍結乾燥する。 (B、C)単繊維セグメントを解剖顕微鏡で単離します。(D)繊維を変性させ、(E)1時間後に-80°Cで保存する。 (F)一次抗体のインキュベーション順序。(G)ファイバーをドットブロットし、MHCIIa(II型)、MHCI(I型)、アクチン(IIx?、IIx型電位線維)を用いて繊維の種類を同定した。(H)次に、繊維をプールした。(I)検量線とともにファイバータイプ固有のサンプルを、SDS PAGEおよびウェスタンブロッティングで分析します。(J)ウェスタンブロッティングを用いた繊維種同定のバリデーション。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:凍結乾燥システムの表示画面とコントロールパネル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:膜の白色光捕捉とそれに続く標的タンパク質の化学発光検出のためのイメージャー設定。 白色光下でメンブレンを画像化するには、(A) New Single Channel を選択し、(B) Lots | colorimetric applicationを選択します。(C)使用するゲルのサイズに基づいて、適切なイメージング領域を選択し、 Run Protocolを押して白色光画像を撮影します。(D)メンブレンを動かさずに、ステップ B を繰り返しますが、今回は ブロット|ケミ:こんにちは解像度。 実行を押す前に、(E) 画像 露出を選択して フェイントバンド に最適化し、(F) 信号蓄積モード を設定し、最初に、飽和 ピクセルのハイライト にチェックを入れた状態で、合計30秒間、毎秒の露出時間を設定します。 [プロトコルの実行 ]を押し、実行が完了するのを待ってから、保存に最適な画像を選択します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ファイバータイプの識別。 (A)線維の種類は、メンブレン上の他のすべての線維を基準にして同定し、検出された各MHCアイソフォームのシグナル強度パネルによって分類した(例:MHCIシグナル:飽和、中程度、および微弱)。(B)(A)のパネルを用いて、MHCIIa抗体はII型線維(青色、左ブロット)を同定し、膜を剥離した後、MHCII抗体はI型線維(赤色、中ブロット)を同定した。アクチン抗体を使用して、以前のMHCIまたはIIaシグナルが検出されなかったファイバーで陽性のアクチンシグナルが検出された場合に、潜在的なIIxファイバーを同定しました(緑、右のブロット)。これらのガイドラインに従わなかったファイバーは、紫色(未識別)で強調表示されます。最後に、アクチンシグナルが陰性のサンプルは、繊維が採取されていないことを示しました(「繊維なし」)。(c)(B)に示すドットブロット上の試料位置に対応する繊維標識を示す表。(D)繊維種別試料を調製するための繊維選定の概要。目的は、繊維の種類ごとに10本の飽和繊維を収集することでした。ここで、タイプII繊維について、8つの飽和繊維を同定し、プールした。タイプIファイバーの場合、飽和ファイバーは10本未満しか存在しなかったため、中程度の信号強度を持つファイバーも選択されました。タイプIIxファイバーの場合、2本のファイバーが同定され、プールされました。10本未満の繊維(飽和および中程度)が特定された場合は、さらに繊維の収集が必要になることがあります。 注:(B)に示すアクチンシグナルは飽和に達していません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ウェスタンブロットによる繊維型同定の確認。 図4に従って繊維タイプの同定を行い、タイプI(~10本の繊維)およびタイプII(~10本の繊維)のサンプルを生成しました。同じ生検から同定されたIIx線維がなかったため、ここに示したIIxサンプルは複数の筋肉サンプル(n = 2個体)から作製された。各繊維特異的サンプルの少量のアリコートをウェスタンブロッティングで分析し、繊維タイプの同定を確認します。分子量マーカー(kDa)は左側に示されており、メンブレンを動かさずに白色光で捕捉されます。MHCIIx、MHCIIa、MHCIの配列で標的タンパク質を検出し、UV活性化ゲル由来のミオシンをサンプルあたりのタンパク質負荷量を視覚的に示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表 1: 一般的なプロトコルの問題のトラブルシューティング戦略。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:検量線を用いた凍結乾燥繊維質量の算出このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
繊維の収集
数年の経験に基づいて、ほとんどの研究者はこの手法を習得できます。しかし、実践することで、下流分析のためのファイバー収集をより迅速かつ効率的に行うことができます。プーリング用に品質の 30 本の単一ファイバーセグメントを分離できるようにするには、サンプルごとに 50 本のファイバーセグメントを収集することをお勧めします。妥当な基準を達成するために、繊維収集ビデオを注意深く研究し、2回の練習セッション(セッションあたり~50本の繊維)を実行した後に推奨されます。収集されたすべてのファイバーは、ファイバータイプを識別するためにMyDoBIDを受け、技術がどの程度効果的に実行されているかが明らかになります。これは、ファイバーサンプルで検出された「ファイバーなし」または「かすかな」MHC信号の数が少ないと見なされます(プロトコルセクション5.1を参照)。
筋肉には、MHCIとMHCIIaの両方、またはMHCIIaとIIx 2,14の両方が存在するハイブリッド線維が含まれることが知られています。MyDoBIDの限界は、MHCI抗体とMHCIIa抗体の両方が陽性のサンプルがハイブリッドファイバーであるか、2本のファイバーが収集された可能性があるため、ハイブリッドファイバーの存在を確認できないことです。さらに、MHCIIa一次抗体はIIa線維とIIa/IIx線維の両方にMHCIIaが存在することを検出するため、MyDoBIDはMHCIIaをMHCIIa/IIxハイブリッドとは別に検出することはできません。これらの理由から、ハイブリッドファイバーのサンプルの同定と調製は行わず、MHCIとMHCIIaの両方のシグナルがシグナル強度パネルに記載されている範囲から外れたサンプルは廃棄しました(図4A)。さらなる制限は、サンプル中の筋線維の種類の割合をMyDoBIDを使用して決定することができず、線維の種類の分布を決定するには従来の免疫組織化学的分析を適用する必要があることです2。
ドットブロッティング
シグナル強度パネルとファイバータイプIDは、ドットブロッティングメンブレンに塗布された少量のサンプル全体に依存しています。これを達成するために、サンプルはメンブレンにロードする前に攪拌によって完全に混合されます。MHCアイソフォームが1つしかないすべての繊維は、プーリングの次のステップに進みます。この段階では、複数のMHCを持つファイバーは、サンプルを組み合わせるこの次のステップに進んではならないことが重要です。サンプルが汚染されている場合、プールされたサンプル全体を廃棄する必要があり、研究者はファイバー収集に戻り、 ファイバー 分離とドットブロッティングのステップを繰り返す必要があります。
免疫標識
以前に、MHCIおよびMHCIIa9の検出のために膜上の非特異的部位をブロックするには5分が適切な時間であると報告されていました。この手法をMyDoBIDに進めるには、アクチン抗体を使用する必要があります。5分間のブロッキングではメンブレンのバックグラウンドが暗くなるため、バックグラウンドが最小限に抑えられたメンブレンを得るには、5分間のブロック時間を30分に増やす必要があることが分かりました。ブロッキング時間は、ウェスタンブロッティングや免疫組織化学などの免疫検出技術において考慮すべきことであり、必要に応じて変更する必要があります。
メンブレンの剥離
ストリッピングは、目的のタンパク質も除去するため、定量分析には使用できませんが15 、定性アッセイであるため、MyDoBIDで使用できます。ストリッピングの目的は、結合した抗体をメンブレンの表面から除去し、以前の抗体からの干渉を最小限に抑えて新しい抗体を使用できるようにすることです。MyDoBIDでは、サンプルを2つのメンブレンに塗布するオプションがあり、異なるMHCアイソフォームが別々のメンブレンで検出されます。この方法が望ましい場合は、スポットを同時にロードして、サンプルチューブを複数回取り扱うことは避けてください。これにより、各サンプルスポット間の乾燥時間がほぼ同じ(~5秒の差)になり、その後のステップが別々の容器で同時に実行されます。このオプションでは、時間、サンプル、消耗品の消費量が増加することに注意してください。
MHCI抗体は常に非常に明るいシグナルを発し、MHCIIaよりも剥がしにくいため、抗体は最初にMHCIIa線維を検出するために適用され、次にMHCI線維を検出します。アクチンは骨格筋線維に均一に発現しており、上記のように線維の一部が膜にうまく塗布されたことを確認するために用いられる。
イメージング、繊維タイプの同定、およびファイバータイプ固有のサンプルの調製
このプロトコルでは、ファイバータイプ固有のサンプルを作成するためのファイバータイプの同定とサンプル選択を支援する新しいツールが開発されました(図4A)。信号強度パネルに示されている例は、MHCI信号強度を(i)飽和、(ii)中程度、または(iii)かすかなものとして定義するために使用されます。ファイバーをファイバータイプ固有のサンプルにプールするには、最初に飽和シグナル強度を示すファイバーが選択され、必要に応じて、中程度のシグナル強度のファイバーが追加されます。タイプIおよびIIのサンプルを調製する場合、通常、「微弱」または未確認に分類される繊維を廃棄できるように、「飽和」および「中程度」の繊維が十分にあります。
MHCIIx抗体の代わりにアクチンを用いて純粋なIIx型線維を同定することの新規性
従来、純粋なIIx線維を同定するために、MHCIIxシグナルをドットブロット上のMHCIおよびMHCIIaシグナルと主観的に比較し、消去法により、MHCIまたはIIaシグナルを有さず、MHCIIxシグナルを有するファイバーを純粋なIIxとして同定しました。しかし、2つのマウスIgM一次抗体(MHCIIxおよびMHCI)を同じメンブレンで使用すると、問題が発生する可能性があります。一次抗体間のメンブレンを剥がしても、残存抗体シグナルが検出されることがあります。ウサギの抗アクチン一次抗体を利用することで、この問題の発生を防ぐことができます。ここでは、アクチンを用いて繊維が採取されたことを確認し、MHCIとMHCIIaの両方が存在しない場合は、IIx繊維が存在することを示しました。次に、MHCIIx特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、IIxファイバーの候補が確認されます(本論文の図5および図9の図2を参照)。6H1抗体は、ラットの骨格筋におけるMHCIIxに対応する電気泳動分離バンドを検出し、マウス、ラット、およびヒトの筋肉の断面においてIIx型線維を標識することが示されている16。
ウェスタンブロット繊維の種類の確認
ベストプラクティスは、同じ生検から採取したすべての繊維タイプ固有のサンプルを同じゲルで分析することです。MHCIIxと同じ二次抗体を必要とするMHCI抗体では、図5に示すように、I型とIIx型のサンプルをゲル上で少なくとも1レーンずつ分離する必要があります。タンパク質含有量はファイバーサイズが異なるため、ファイバータイプ固有のサンプル間で異なるため、最初のゲルを使用して、すべてのサンプルで同様の量のタンパク質を得るために、後続のゲル分析でロードする必要があるサンプルの量を決定する必要があります。これを行うために、特定のサンプル中の総タンパク質は、転写前にSDS-PAGEによってゲル内で分離されたすべてのタンパク質バンドを視覚化するUV活性化ゲルイメージング技術を使用して決定されます。各サンプルの総タンパク質はゲル画像から決定され、骨格筋組織のいくつかの既知の質量の検量線がファイバータイプ固有のサンプル3,4,6,17と一緒に実行された場合、次のウェスタンブロットランで不均等な負荷を補正するために使用されます。また、総タンパク質を決定するためにアクチンなどの「ハウスキーピング」タンパク質を使用する必要はなく、これも独自の検量線を必要とします15。この技術は、総タンパク質を測定するための時間を節約し、正確な方法であり、追加の試薬やタンパク質標準を必要とせずに、非常に少ないサンプル(すなわち、ファイバー9の~1/5)で実施でき、目的のタンパク質を検出するための膜のすべてのセクションを最大化します。
ウェスタンブロットステップでの免疫標識に関しては、他のMHCアイソフォームと比較してMHCIIxの存在量が比較的少ないため、MHCIIx抗体が最初に適用されます。メンブレンがMHCI抗体検出の準備が整うと、2段階のストリッピング(MHCIIxおよびMHCIIa検出後)が行われます。したがって、MHCIの検出は、主にI型サンプルで検出し、以前のMHC抗体から検出された残留シグナルは最小限に抑える必要があります(図5)。ウェスタンブロッティングは、同じ膜部分に3つのMHC抗体すべてを使用して、各ファイバータイプ固有のサンプルの純度を確認するために使用されます。ただし、MHCI抗体またはMHCIIx抗体のいずれかがウサギやヤギなどの異なる宿主種で産生された場合、ストリッピングの必要はなくなります。
アプリケーション
ここで説明する方法論は、新鮮または凍結乾燥した骨格筋からの単一繊維セグメントの繊維タイピングに利用して、ヒト骨格筋における繊維タイプ特異的タンパク質発現を調べることができます。さらに、新鮮な筋肉サンプルを使用して、無傷または機械的に皮を剥がれた繊維のいずれかを使用できます6。皮剥がれた繊維を使用すると、細胞質や膜コンパートメントなどの細胞内コンパートメントでのタンパク質発現をさらに調べることができます。このアプリケーションは、健康な人や糖尿病の人の機械的に皮を剥がした繊維セグメントに結合しているグリコーゲンと結合していないグリコーゲンの量を測定するために以前に使用されていました6。重要なことは、MyDoBIDは変性サンプルのみを使用する実験に有益であり、天然状態のタンパク質を必要とする研究には適さないということです。酵素アッセイや溶液内プロテオミクスアプローチなどの他の分析をネイティブ条件下で実施することは可能ですが、MyDoBIDを使用してMHCアイソフォームを同定するためにファイバーの一部を除去できるように、さらなる最適化が必要になります。
要約すると、タイプI、タイプII、およびタイプIIxは、ウェスタンブロッティングに一般的に使用されるすぐに入手できる消耗品を使用して、簡単な手法を適用することで正常に同定できます。これには広範な実用的な情報が含まれており、無事に完了すると、将来の研究のために可能な限り最高の品質、完全性、および信頼性を備えたファイバータイプ固有のサンプルが生成されます。この手法は、線維特異的な骨格筋の生化学的分析を行うための実用的で好ましいアプローチです。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究で使用したMHC I(A4.840)およびMHCIIa(A4.74)に対する抗体は、H.M.Blau博士によって開発され、MHCIIx(6H1)に対する抗体は、C.A.ルーカス博士によって開発され、国立成育医療研究所の後援により、アイオワ大学によって維持されているDevelopmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)から入手しました。 生物科学部(アイオワ州アイオワシティ)。この研究のためにヒトの筋肉サンプルを提供してくれたVictoria L. Wyckelsmaに感謝します。図 1 の画像の大部分は、BioRender.com から入手したものです。
融資：
この研究は外部資金を受けていない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J.
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
