Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65750
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

Abstract

Burada tarif edilen teknik, nokta lekeleme kullanılarak bireysel kas liflerinin segmentlerinde spesifik miyozin ağır zincir (MHC) izoformlarını tanımlamak için kullanılabilir, bundan sonra kas lifi tipinin (MyDoBID) IDgirişi için Dot Blotting tarafından osinağır zincir tespitim olarak anılacaktır. Bu protokol, insan iskelet kasının dondurularak kurutulması ve tek kas liflerinin segmentlerinin izole edilmesi sürecini açıklar. MyDoBID kullanılarak, tip I ve II fiberler sırasıyla MHCI ve IIa'ya özgü antikorlarla sınıflandırılır. Sınıflandırılmış lifler daha sonra her biyopsi için lif tipine özgü örneklerde birleştirilir.

Her numunedeki toplam protein, Sodyum Dodesil-Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve UV ile aktive olan jel teknolojisi ile belirlenir. Numunelerin lif tipi, western blotlama kullanılarak doğrulanır. Birden fazla batı lekesinde hedef protein tespitini geliştirmek için protein yükleme normalizasyonu gerçekleştirmenin önemi de açıklanmaktadır. Sınıflandırılmış elyafları, tek lifli western blotlara kıyasla elyaf tipine özgü numuneler halinde birleştirmenin faydaları arasında numune çok yönlülüğü, artan numune verimi, daha kısa süreli yatırım ve maliyet tasarrufu önlemleri yer alırken, homojenize kas numuneleri kullanılarak sıklıkla gözden kaçan elyaf tipine özgü değerli bilgiler korunur. Protokolün amacı, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kası örneklerinden izole edilen tip I ve tip II liflerin doğru ve verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlamaktır.

Bu münferit lifler daha sonra tip I ve tip II lif tipine özgü numuneler oluşturmak için birleştirilir. Ayrıca, protokol, batı blotlama ile IIx lifleri olarak doğrulanan MHCI ve MHCIIa için negatif olan lifler için bir belirteç olarak Aktin kullanılarak tip IIx liflerin tanımlanmasını içerecek şekilde genişletilmiştir. Her lif tipine özgü numune daha sonra batı blotlama teknikleri kullanılarak çeşitli hedef proteinlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılır.

Introduction

İskelet kası, hücrenin (lif) yavaş seğirme (tip I) veya hızlı seğirme (tip II) olmasına bağlı olarak farklı hücresel, metabolik ve kasılma özelliklerine sahip heterojen bir dokudur. Lif tipi, kasılma süresi, kısalma hızı ve yorulma direnci1 dahil olmak üzere çeşitli şekillerde birbirinden farklı olan miyozin ağır zincir (MHC) izoformları incelenerek tanımlanabilir. Başlıca MHC izoformları arasında tip I, tip IIa, tip IIb ve tip IIx bulunur ve metabolik profilleri oksidatif (tip I ve IIa) veya glikolitiktir (IIx, IIb)1. Bu lif tiplerinin oranı kas tipine göre ve türler arasında farklılık gösterir. Tip IIb, kemirgen kasında yaygın olarak bulunur. İnsan kasları herhangi bir tip IIb lifi içermez ve ağırlıklı olarak MHC izoformları tip I ve IIa liflerinden oluşur ve az miktarda IIx lifleri2 bulunur. Protein ekspresyon profilleri farklı lif türleri arasında değişir ve yaşlanma 3, egzersiz 4,5 ve hastalık6 ile değiştirilebilir.

Farklı iskelet kası lifi tiplerinde hücresel yanıtların ölçülmesi, kas homojenatlarının (tüm lif tiplerinin bir karışımı) incelenmesi nedeniyle genellikle göz ardı edilir veya mümkün değildir. Tek lifli western blot, tek tek kas liflerinde birden fazla proteinin araştırılmasına izin verir7. Bu metodoloji daha önce homojenat preparatları kullanılarak elde edilmesi mümkün olmayan yeni ve bilgilendirici tek lifli özellikler üretmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, orijinal tek lifli western blot metodolojisinin, zaman alıcı doğası, numune kopyalarının üretilememesi ve pahalı, hassas gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktiflerinin kullanımı dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Taze doku kullanılıyorsa, bu yöntem, sınırlı bir zaman dilimi içinde (yani 1-2 saat) tek tek lifleri izole etme ihtiyacının zaman kısıtlamaları nedeniyle daha da sınırlıdır. Neyse ki, bu kısıtlama, dondurularak kurutulmuş dokudan tek lifli segmentlerin izole edilmesiyle hafifletilir8. Bununla birlikte, dondurularak kurutulmuş örneklerden lif toplanması, biyopsi yapılan dokunun boyutu ve kalitesi ile sınırlıdır.

Nokta lekeleme yöntemi9 kullanılarak fiber tipi tanımlama, bu kapsamlı protokolde önemli ölçüde detaylandırılmış ve genişletilmiştir. Daha önce, dondurarak kurutma ve tek lifli MHC izoform protein analizi için ~ 2-10 mg kadar az ıslak ağırlık kas dokusunun yeterli olduğu gösterilmiştir9. Christensen ve ark.9, batı lekeleme ile doğrulanan nokta lekeleme ile mevcut MHC izoformunu tespit etmek için ~1 mm'lik bir lif segmentinin %30'unu kullandı. Bu çalışma, batı lekelemenin nokta lekeleme ile değiştirilmesiyle, toplam maliyetlerin ~ 40 kat azaldığını gösterdi (50 elyaf segmenti için). Lifler daha sonra tip I ve tip II numuneler halinde "toplandı", bu da deneysel replikasyonaizin verdi 9. Bununla birlikte, bir sınırlama, yalnızca iki lif tipine özgü numunenin elde edilmesiydi: tip I (MHCI pozitif) ve tip II (MHCII pozitif lifler), tip II numuneler ile MHCIIa ve MHCIIx 6,10 karışımı içerir. Özellikle, mevcut protokol, saf tip IIx fiberlerin nasıl tanımlanabileceğini gösterir ve yaygın protokol sorunları için sorun giderme stratejileri de dahil olmak üzere oldukça ayrıntılı bir iş akışı (Şekil 1'de özetlenmiştir) sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

70-74 yaşları arasındaki n=3 (2 erkek, 1 kadın) yaşları arasında vastus lateralis'ten lokal anestezi (Ksilokain) ve manuel aspirasyon için modifiye edilmiş Bergstrom iğnesi kullanılarak insan kas örnekleri alındı11,12. Örnekler, Victoria Üniversitesi İnsan Araştırmaları Etik Komitesi (HRETH11/221) tarafından onaylanan ve HelsinkiBildirgesi 13'e uygun olarak yürütülen önceki bir çalışmanın alt kümesiydi. Katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı, bilgilendirilmiş onam verdiler. Bu protokol için gerekli olan tüm malzemelerin tüm detayları Malzeme Tablosunda gösterilmektedir. Ayrıca, yaygın protokol sorunlarını ele alan sorun giderme stratejilerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.

1. Dondurarak kurutma

  1. Biyopsi yapılan kas örneklerini kuru buz üzerinde donmuş halde tutarken, boş bir donmuş tüpü tartın ve tartıda darasını alın.
  2. En az 10 mg ıslak ağırlıkta donmuş dokuyu hızlı bir şekilde tartın. Ağırlığı bir ondalık basamağa kaydedin.
  3. Dokuyu, kapağa 3-4 delik açılmış önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne koyun ve 2-3 kuru buz topağı içeren küçük bir behere yerleştirin.
  4. Dondurarak kurutucu üreticisinin kullanım talimatlarına uyun.
  5. Dondurarak kurutucudaki tüm vanaların kapalı olduğundan emin olun ve dondurarak kurutucuyu açın.
  6. Vakum ayar noktasının insan dokusu için optimum dondurarak kurutma koşulları, 0,12 milibar (mBar) için programlandığını kontrol etmek için kontrol panelini kullanın (Şekil 2).
  7. Dondurarak kurutma makinesinin kılavuzuna basın ve hazne −40 oC'ye soğuyana kadar bekleyin.
  8. Hazne bu sıcaklığa ulaştığında, kapağı, ardından cam hazneyi çıkarın ve kabı (kas örneği ile) metal tablaya yerleştirin.
  9. Cam hazneyi ve kapağı değiştirin. Kapaktaki vakum tahliye vanasını kapatın ve kurutucunun vakumla kapatıldığından emin olmak için vakumlu terazi ışığı yeşile dönene kadar bekleyin.
  10. Kas örneklerini 48 saat dondurarak kurutun. Dondurarak kurutma tamamlandıktan sonra, vakum düğmesine basarak vakum pompasını kapatın ve kapaktaki vakum tahliye vanasını açın.
  11. Haznenin kapağını çıkarın ve dondurularak kurutulmuş numuneyi toplayın. Dokuyu tartın ve ağırlığı bir ondalık basamağa kaydedin.
  12. Kilo kaybının yüzdesini hesaplayın; Ağırlıktaki ~%75 azalma, dokunun başarılı bir şekilde dondurularak kurutulduğunu gösterir (bu çalışmada, ortalama ± SD, %76 ± %9, n = 11 kas örneği).
  13. Vakum pompasını ve dondurucuyu kapatmak için OTOMATİK'e basın. Ünitenin ortam sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
  14. Soğutma serpantinlerini üreticinin talimatlarına göre temizleyin ve biriken sıvıyı kollektörden boşaltın.
    NOT: Lif toplama işlemi hemen başlayabilir. Elyaf izolasyonu için doku kullanılmadığında, dondurularak kurutulmuş numuneyi -80 °C'de kurutucu boncuklarla kapalı bir kapta saklayın.  DİKKAT: Kuru buz tehlikelidir (Sınıf 9); önerilen güvenli kullanım için MSDS'ye bakın.

2. Lif toplama

  1. Lif toplama hazırlığı
    1. En az 50 mikrofüj tüpünü (Fiber 1 ila 50) etiketleyin ve her tüpe 10 μL denatüre edici tampon pipetleyin.
    2. Toplama alanını iki çift ince doku diseksiyon forsepsi, tüy bırakmayan doku, bir tezgah üstü lamba, bir stereomikroskop (siyah sahne yukarıda), bir girdap ve bir tezgah üstü santrifüj ile hazırlayın.
    3. Dondurularak kurutulmuş kas örneğini bir Petri kabı kapağına yerleştirin. Kapağı diseksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin.
    4. Tek lifli diseksiyon videosunu izleyin. Bir çalışmaya başlamadan önce lif toplamadan tek lif tipi tanımlamaya kadar tüm protokolü en az iki kez uygulayın.
    5. Lif toplamadan önce, her biyopsiden lif tipi bir örnek için gereken toplam hacmi aşağıdaki gibi hesaplayın. Örneğin, 1 fiberin başlangıç hacmi = 10 μL ve MyDoBID'den sonra kalan hacim (1 fiber × 10 μL) - nokta lekeleme için kullanılan 1 μL = 9 μL (numune hacmi) ise, numune hacmini (μL) çalıştırılacak toplam western blot'ların sayısıyla çarparak gereken toplam numune hacmini hesaplayın ve fazlalığı hesaba katmak için bu miktarı ikiye katlayın: (9 μL × 4 batı lekesi) × 2 = 72 μL. Gerekli nihai numune hacmini (μL) elyaf tipine özgü numune başına numune hacmine bölerek tiplendirilen numune başına gereken elyaf sayısını hesaplayın (örneğin, elyaf tipine özgü numune başına 72 μL ÷ 9 μL = 8 elyaf). Bunun başarılması için toplam 50 lif toplayın.
      NOT: Yüklenen protein miktarı her numune için ~3 mm fibere (~12 μg ıslak ağırlık) eşdeğerse, gereken numune hacmi hem MyDoBID hem de western blotlamayı çalıştırmak için gereken minimum protein konsantrasyonudur (ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın). Bununla birlikte, bu hacim, belirli bir protein için tekrar jellerin gerekli olup olmadığını etkilemez.  DİKKAT: Forseps keskindir; Cilt delinmesi riskini önlemek için bunları dikkatli kullanın.
  2. Tek lif izolasyonu
    1. 5 cm x 1 cm'lik küçük bir kağıda, 1 cm'lik bir çizgi çizmek için bir cetvel kullanın. Bu çizgide her 1 mm'yi işaretleyin.
    2. Toplanan liflerin uzunluğunu tahmin etmek için bunu bir kılavuz olarak Petri kabı kapağının altına yerleştirin.
    3. Dondurularak kurutulmuş kas örneğini stereomikroskobun altına düşük büyütmede (x 7.5) yerleştirin. Dondurularak kurutulmuş kası yerinde tutmak için bir çift ince doku diseksiyon forseps kullanın ve diğeriyle küçük lif demetlerini ayırmaya başlayın (videoda görüldüğü gibi).
    4. Bir lif demetini izole edin ve tek lif segmentleri demetten izole edilene kadar ayırmaya devam edin.
    5. En az ~1 mm uzunluğunda en az 50 lif toplayın.
    6. Lifi Petri kabında boş bir alana taşıyın. Tek lifli segmentleri daha yüksek büyütme (x 50) altında inceleyin. Sonunda elyafı daha da ayırarak tek bir elyaf olduğundan emin olun. Lif ayrılmak yerine koparsa tek bir liftir.
  3. Liflerin denatürasyonu
    1. Forseps kullanarak, lifi nazikçe toplayın ve doğrudan aliquoted denatüre edici tampona yerleştirin (forsepslerin tamponla karşılaşmasına izin vermeyin).
    2. Lifin başarıyla çıkarıldığından emin olmak için forsepsleri mikroskop altında kontrol edin. Tüpü kapatın ve fiberin tampona hareket etmesini sağlamak için tüpün altını tezgaha üç kez sıkıca vurun.
    3. Bir sonraki elyafa geçmeden önce forsepsleri tüy bırakmayan bir doku kullanarak silerek temizleyin. Tüm lifler toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
    4. Lif numunelerini vorteksleyin ve numuneyi tüpün dibine çekmek için 2.500 × g'da 5 saniye boyunca kısaca santrifüjleyin.
      NOT: Santrifüj süresi (5 s), başlangıçtan (0 × g) hız ~2,500 × g'ye ulaşana kadar zamanlanır.
    5. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat bekletin. İleride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Kullanmadan önce numuneleri dondurun ve ardından çözdürün.

3. Nokta lekeleme

  1. Membran hazırlama ve aktivasyon
    1. 50 numuneye (~10,5 cm x 5,5 cm) sığacak şekilde bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranı (0,2 μm gözenek boyutu) ölçün, etiketleyin ve boyutlandırın.
    2. Sol kenarlığı yukarıdan aşağıya sayısal olarak (1'den 10'a kadar) ve üst kenarlığı soldan sağa (A'dan E'ye) 1 cm aralıklarla alfabetik olarak işaretleyin.
    3. 12,5 cm x 7,5 cm boyutlarında dört yaprak filtre kağıdı hazırlayın.
    4. Bir yığın oluşturmak için iki sayfayı bir araya getirin. Filtre kağıdı yığınını 1x transfer tamponunda önceden ıslatın.
    5. Membranı bir kaba yerleştirin. Membranı tamamen daldırmak için yeterli hacimde (10-15 mL) membranın üzerine% 95 etanol dökün. Rocker'da 1 dakika çalkalayın.
    6. Etanolü geri toplayın, membranı 1x transfer tamponuna (~ 15 mL) daldırın ve 2 dakika daha sallayın.
      NOT: Hem etanol hem de transfer tamponu, sedimantasyon oluşana kadar (altı kullanımdan sonra değişir) gelecekteki nokta lekeleme deneyleri için yeniden kullanılabilir.
    7. Transfer tamponu ile ıslatılmış filtre kağıdı yığınını büyük bir kapak gibi düz, hareketli bir yüzeye yerleştirin ve silindirle düzleştirin. PVDF membranını bir jel ayırıcı veya cımbız kullanarak yığının üzerine yerleştirin.
    8. Membranın üzerine tek bir yaprak kuru filtre kağıdı yerleştirin ve membran yüzeyindeki fazla tamponu emmek için silindiri filtre kağıdının üzerinde hareket ettirin. Membranı ovalamadan üst filtre kağıdını çıkarın.
      DİKKAT: Metanol (Sınıf 3, alt risk 6.1) ve etanol (Sınıf 3) tehlikelidir. Güvenli kullanım önerileri için malzeme güvenlik veri sayfasına (MSDS) bakın.
  2. Membrana numune absorpsiyonu
    1. Lif numunelerini çözdürün, adım 2.3.4'teki gibi oda sıcaklığında kısa bir santrifüj (5 sn) yapın ve numuneyi iyice karıştırın.
    2. Pipet ucuyla membrana dokunmadan, her bir numuneden ~1 μL'lik bir damlayı belirlenen alandaki membranın üzerine yavaşça bırakın. Lif numunesi başına belirlenen alanın boyutları ~1 cm x 1 cm'dir. Numuneyi bu alanın merkezinde tespit etmeyi hedefleyin.
    3. Numune damlacıklarının membrandan en az 15 dakika geçmesine izin verin. Numune tamponunun kalmadığından ve tamamen emildiğinden emin olun.
    4. Plastik cımbız kullanarak, membranı nemli filtre kağıdı yığınından dikkatlice kaldırın, tek bir kuru filtre kağıdına yerleştirin ve membranı en az 5 dakika kurutun.
    5. Numune lekeleri tamamen beyaza döndüğünde, zarı yeniden etkinleştirin.
  3. Membran reaktivasyonu ve bloğu
    1. 3.1.5 ve 3.1.6 adımlarını tekrarlayarak membranı yeniden etkinleştirin.
    2. Membranı yıkama tamponuna yerleştirin ve sallayarak 5 dakika durulayın. Yıkama tamponunu atın.
    3. Sallanırken membranı 30 dakika boyunca bloke edici tamponda inkübe edin.
    4. Tampon artık bulanık olmayana kadar membranı 3x yıkama tamponu ile durulayın.
    5. Membranı külbütördeki son yıkamada bırakın.

4. İmmün etiketleme

  1. MHCIIa'nın Tespiti
    1. MHCIIa primer antikorunu 10 mL Sığır Serum Albümini (BSA) tamponunda 200'de 1 oranında seyreltin.
    2. Yıkama tamponunu membrandan atın ve ardından seyreltilmiş MHCIIa antikorunu membranın üzerine dökün.
    3. Kabı (membran MHCIIa'da olacak şekilde) 2 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de külbütöre yerleştirin.
    4. MHCIIa antikorunu hatırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Membranı külbütör üzerinde 2 dakika boyunca bloke edici tamponla yıkayın.
      NOT: Tüm primer antikorlar, tampon temiz kaldığı sürece beş kata kadar tekrar kullanılabilir.
    5. İki kez daha durulayın; Her seferinde 5 dakika; toplamda üç yıkama.
    6. Fare İmmünoglobulin G Yaban turpu Peroksidaz (IgG-HRP) sekonder antikorunu 10 mL bloke edici tamponda 20.000'de 1'de seyreltin ve membrana ekleyin.
    7. Yıkama tamponunu atın ve membranı fare IgG-HRP sekonder içinde 1 saat sallanarak inkübe edin.
    8. İkincil olanı atın ve membranı yıkama tamponunda yıkayın (2, 5, 5 dakika).
    9. Görüntüleme için hazır olana kadar membranı son yıkamada bekletin.
    10. Jel görüntüleyiciyi açın, görüntüleyicinin gerekli çalışma sıcaklığına ulaşması için 15 dakika bekleyin ve ardından görüntüleme yazılımını açın (bkz.
    11. Yazılım penceresinde Yeni Tek Kanal Protokolü'ne tıklayın (Şekil 3A). Membranın beyaz ışıklı görüntüsü için, Uygulamalar | Lekeler | Kolorimetrik'e tıklayın (Şekil 3B).
    12. Jel alanına tıklayın; Her seçenek, çeşitli jel türlerinin boyutuna uyacak şekilde belirli boyutlar için programlanmıştır. Membranın boyutlarına en uygun seçeneği seçin (Şekil 3C).
    13. Luminol ve peroksidaz reaktiflerini 1:1 oranında birleştirerek ECL'yi hazırlayın. Tüm membranı kaplamak için yeterli hacimde ECL karışımı yapın, tipik olarak toplam 800-1.000 μL hacim gereklidir.
    14. Membranı büyük, şeffaf plastik bir tepsiye yerleştirin ve ECL karışımını membranın üzerine dağıtın.
    15. Membranı görüntüleme plakasına yerleştirin.
    16. Canlı kamera görüntüsü için Position Gel'e (sarı düğme) tıklayın. Membranın görüntüleme alanını en üst düzeye çıkarmak için yakınlaştırma düğmesine tıklayın, basılı tutun ve sürükleyin. Bu noktada, gerekirse zarın konumunu düzeltin.
    17. Protokolü Çalıştır'a (yeşil düğme) tıklayın ve membranın kolorimetrik görüntüsünün üretilmesini bekleyin. Noktaları ilgili lif örneğiyle eşleştirmeye yardımcı olması için bu görüntüyü kaydedin.
    18. Membranı hareket ettirmeden, 2 x 2 gruplama (Chemi Yüksek Çözünürlük) seçeneğine tıklayarak yazılımdaki uygulamayı değiştirin (Şekil 3D).
    19. Görüntü pozlaması ve yazılım altında, pozlama süresini optimize edin, Soluk Bantlar (Şekil 3E) | Sinyal Biriktirme Modu.
    20. Kurulum altında, ilk görüntü için 1 sn, son görüntü için 30 sn ve toplam 30 görüntü yazın (Şekil 3F).
    21. Protokolü Çalıştır'a tıklayın.
    22. Bir görüntüyü şu aşamalarda kaydedin: sinyal doygunluğundan önce (tüm görünür noktalar siyahtır), ilk sinyal doygunluğu (bazı noktalar doymaya başlar) ve aşırı doygun noktalar (güçlü sinyal algılanan tüm noktalar doygundur).
    23. Sinyal birikimini sonlandırmadan önce gerekli tüm görüntüleri kaydedin. Membranı görüntüleyiciden çıkarın.
    24. Jel ayırıcıyı kullanarak, membranı yıkama tamponu ile kaba geri yerleştirin.
  2. MHCI'nin Tespiti
    1. Yıkama tamponunu dökün ve membrana 37 °C'de 30 dakika sıyırma tamponu uygulayın (membranın tamamen daldırıldığından emin olun).
    2. Sıyırma tamponunu geri toplayın ve membranı 5 dakika boyunca sallayarak yıkama tamponunda durulayın.
      NOT: Sıyırma tamponu, atılmadan önce 10 kez tekrar kullanılabilir.
    3. Yıkama tamponunu dökün ve bu sefer 200'de 1'lik bir başlangıç konsantrasyonunda seyreltilmiş MHCI primer antikoru uygulayın (aralık: 200'de 1 ila 500'de 1). Membranı oda sıcaklığında 1 saat sallayın.
    4. MHCI primer antikorunda inkübe edildikten sonra, antikoru geri toplayın ve membranı adım 4.1.4 ve 4.1.5'teki gibi yıkayın.
    5. Fare IgM HRP sekonder antikorunu bloke edici tamponda 20.000'de 1 oranında seyreltin. Bloke edici tamponu membrandan boşaltın ve adım 4.1.7'deki gibi ikincil fare IgM'sinde inkübe edin.
    6. Yıkama ve görüntü yakalama, 4.1.8 ila 4.1.24 adımlarında olduğu gibi MHCI algıladı.
      DİKKAT: Sıyırma tamponu %3-5 Organo Fosfin içerir (Sınıf 8). Güvenli kullanım önerileri için MSDS'ye bakın.
  3. Aktin kullanılarak potansiyel MHCIIx'in tespiti
    1. Membranı bir kez daha soyun (adım 4.2.1 ve 4.2.2).
    2. Bölüm 4.1'i tekrarlayın, bu sefer BSA tamponunda 500'de 1'de seyreltilmiş Aktin primer antikoru ve daha sonra bloke edici tamponda 20.000'de 1'de seyreltilmiş tavşan HRP sekonder antikoru uygulayın.

5. Elyaf tipi tanımlama

  1. MHCI, MHCIIa ve Aktin sinyal analizi
    1. Sinyal yoğunluğu panelini tanıyın (Şekil 4A). 5.1.2 ile 5.1.4 arasındaki adımları not edin.
    2. Doymuş bir sinyal yoğunluğu, kalitatif olarak protein tespitinin güçlü olduğunu gösterir.
    3. Orta, hedef proteinin orta seviyede mevcut olduğunu gösterir.
    4. Zayıf bir sinyal, çok az hedef proteinin mevcut olduğunu gösterir.
    5. Fiberleri 'doymuş', 'orta' veya 'zayıf' sinyal yoğunluğuna sahip kategorilere ayırmak için sinyal yoğunluğu panelini kullanın (Şekil 4A).
    6. Önce MHCIIa ve MHCI sonuçlarını karşılaştırarak lif tipi tanımlaması yapın (Şekil 4B, sol ve orta lekeler).
    7. Yalnızca bir MHC izoformunun doymuş veya orta sinyal yoğunluğuna sahip lifleri kaydedin.
    8. MHC izoform sinyali 'zayıf' ise, fiberi işaretsiz bırakın (bkz. Şekil 4B).
    9. Son olarak, MHCI veya IIa tespit edilmeyen liflerde Aktin gözlendiğinde (orta veya doymuş sinyal yoğunluğu), bunu potansiyel bir tip IIx lifi olarak kaydedin (Şekil 4B, sağ leke).
    10. Zayıf MHC izoform sinyaline sahip lifleri kaydedin, ancak Aktin tanımlanamayan olarak algılandı (orta veya doymuş yoğunlukta).
    11. Her üç hedef protein için de zayıf veya hiç tespit edilmemiş (lif toplanmamış) numuneleri atın (Şekil 4C).
    12. Hem MHCI hem de MHCII sinyallerinin 'doymuş' veya orta düzeyde bir sinyalle algılandığı herhangi bir fiberi kaydedin. Bu numuneler, elyaf tipine özgü preparasyonda kullanım için değildir.
  2. Elyaf tipine özel numunelerin hazırlanması
    1. Her biyopsi için ayrı bir tip I ve tip II numune hazırlayın. Tip II numune için, MHCIIa'nın doymuş veya orta seviyelerde tespit edildiği gerekli minimum lif sayısını (adım 2.1.5'te hesaplanmıştır) birleştirin.
    2. Tip I olarak etiketlenmiş ayrı bir tüpte, MHCI'nin tespit edildiği lifler için bu işlemi tekrarlayın (Şekil 4D).
    3. Doymuş sinyallere sahip yeterli fiber yoksa, orta sinyal yoğunluğuna sahip fiberler kullanın.
    4. Herhangi bir potansiyel IIx fiberini birleştirin.
    5. Western blotlama için hemen elyaf tipine özel numuneler kullanın veya ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

6. Western blot fiber tipi onayı

  1. Her bir elyaf tipine özgü numuneden 10 μL kullanın (gereken minimum numune hacmi, bkz. adım 2.1.5).
  2. Belirtilen prekast jeli kullanarak numuneleri, üreticinin protokolüne göre SDS-PAGE aracılığıyla ayırın.
  3. Jeldeki proteini üreticinin protokolüne göre tespit etmek için bir jel görüntüleyici kullanın.
  4. Jeli 10 dakika boyunca soğuk 1x transfer tamponuna yerleştirin.
  5. Proteinleri, üreticinin protokolüne göre 0,45 μm nitroselüloz membrana (9,5 cm x 13,5 cm) ıslak olarak aktarın.
  6. Transferden sonra, membranı bir kapta ultra saf H2O ile kısaca durulayın. Ultra saf suyu dökün.
  7. Membrana 10 mL antikor sinyal arttırıcı solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çalkalayın.
  8. Antikor sinyal arttırıcı solüsyonu geri toplayın ve ultra safH2Oile 5x (yıkama başına 5 s) yıkayın.
    NOT: Antikor sinyal arttırıcı solüsyon, atılmadan önce 5 kez kullanılabilir.
  9. Son yıkamayı dökün, bloke edici solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat çalkalayın.
  10. 180 kDa ve üzeri proteinlerin zarın üst kısmında olmasını sağlayan moleküler ağırlıkta zarı yatay olarak kesmek için temiz bir neşter bıçağı veya makas kullanın.
  11. Daha fazla fiber tipi onayı için bu üst bölümü kullanın.
  12. Farklı hedef proteinleri tespit etmek için 180 kDa'nın altındaki kısmı kullanın.
  13. Membranın üst kısmında, MHCIIx primer ve fare İmmünoglobulin M (IgM) HRP sekonder antikoru ile bölüm 4.1'i takip edin.
  14. İşlemi MHCIIa IgG primer ve fare IgG HRP sekonder antikoru ile tekrarlamadan önce membranı (bölüm 4.2.1 ve 4.2.2'de açıklandığı gibi) soyun.
  15. Bir kez daha soyun ve son olarak MHCI IgM primer ve fare IgM HRP sekonder antikoru uygulayın.
    NOT: Bu adım kalitatiftir ve bu nedenle membran sıyırma nedeniyle herhangi bir protein kaybı endişe verici değildir.
  16. Farklı MHC izoformlarında tespit edilen sinyali karşılaştırın ( Şekil 5B'de görüldüğü gibi). Beklenen numunede (MHCI - tip I, MHCIIa - tip II ve MHCIIx - tip IIx) sinyal yoğunluğu orta ila doymuş seviyelerde tespit edildiğinde, fiber tipine özgü numuneler gelecekteki çalışmalarda kullanılmak üzere güvenilir olarak kaydedilecektir.
  17. Bir numunede birden fazla MHC izoformu eşit olarak tespit edildiğinde numuneyi güvenilmez olarak kaydedin.
    DİKKAT: Antikor arttırıcı solüsyon %50 sodyum hidroksit içerir. Güvenli kullanım önerileri için MSDS'ye bakın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nokta lekeleme kullanılarak bireysel MHCI, MHCIIa ve MHCIIx kas liflerinin tanımlanması
MyDoBID'in bir özelliği, belirli bir fiberde değişen MHC ve Aktin sinyal yoğunluğu gücünün kategorize edilmesidir (Şekil 4A). Lif tipi, MHCI ve IIa izoformlarının varlığı veya yokluğu ile tanımlandı (Şekil 4B). Altı lif, MHC veya aktin tespiti göstermedi, bu da lif toplanmadığını gösterdi. Bu spesifik nokta lekesinin sonuçları, 22 tip II fiber, 7 tip I fiber ve 3 potansiyel tip IIx fiberin tanımlanmasıydı; Tanımlanamayan 2 örnek ve toplanan 6 örnek 'Lifsiz' olarak sınıflandırılmıştır (Şekil 4B, C). Saptanabilir herhangi bir MHCI veya MHCIIa sinyaline sahip olmayan ancak Aktin için pozitif olan lifler, bir eliminasyon işlemi ile potansiyel tip IIx lifleri olarak tanımlandı. MHCI ve IIa sinyal gücünü sınıflandırmak için sinyal yoğunluğu paneli kullanılarak, sırasıyla tip I veya II numuneler üretmek için 'orta' veya 'doymuş' fiberler birleştirildi. Tanımlanamayan veya soluk veya hiç Aktin tespit edilmeyen lifler sonraki analizlere dahil edilmedi ve atıldı (Şekil 4D).

Western blotting kullanarak fiber tipleme onayı
Lif tipine özgü örnekler, western blotlama ve MHC'ye özgü antikorlar kullanılarak doğrulandı (Şekil 5). Bir biyopsiden alınan tip I ve tip II lif örnekleri, her biyopside bulunan düşük sayıda tip IIx lif nedeniyle iki bireyden alınan potansiyel tip IIx liflerinin bir örneği olan bir tip IIx örneği ile birlikte çalıştırıldı. Western blot verileri, fiber tipi tanımlamanın başarılı olduğunu doğruladı.

Figure 1
Şekil 1: Numune hazırlama, elyaf tiplemesi ve elyaf özgüllüğünün western blot doğrulamasını özetleyen iş akışı özeti . (A) İnsan dokusu 48 saat dondurularak kurutulur. (B,C) Tek lif segmentleri diseksiyon mikroskobu altında izole edilir. (D) Lifler denatüre edilir ve (E) 1 saat sonra -80 °C'de saklanır. (F) Birincil antikor inkübasyon sırası. (G) Lifler nokta lekeli ve lif tipi MHCIIa (tip II), MHCI (tip I) ve aktin (IIx?, potansiyel tip IIx lif) kullanılarak tanımlandı. (H) Lifler daha sonra bir araya getirildi. (I) Bir kalibrasyon eğrisinin yanı sıra elyaf tipine özgü numuneler, SDS PAGE ve western blotlama yoluyla analiz edilir. (J) Western blotlama kullanılarak elyaf tipi tanımlamanın doğrulanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Dondurarak kurutma sisteminin ekranı ve kontrol paneli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Membranın beyaz ışık yakalaması ve ardından hedef proteinlerin kemilüminesan tespiti için görüntüleyici ayarları. Membranı beyaz ışık altında görüntülemek için (A) Yeni Tek Kanal'ı ve ardından (B) Lekeler | kolorimetrik uygulama'yı seçin. (C) Kullanılan jelin boyutuna bağlı olarak, uygun görüntüleme alanını seçin ve ardından Protokolü Çalıştır'a basarak beyaz ışıklı bir görüntü alın. (D) Membranı hareket ettirmeden B adımını tekrarlayın, ancak bu sefer Lekeler | Chemi Merhaba Çözünürlük. Çalıştır düğmesine basmadan önce, Soluk Bantları optimize etmek için (E) Görüntü Pozlama'yı seçin ve (F) Sinyal Biriktirme Modu'nu ayarlayın ve ilk olarak, Doygun pikselleri vurgula işaretliyken her saniye için pozlama süresini toplam 30 saniye olarak ayarlayın. Protokolü Çalıştır'a basın ve kaydetmek için en iyi görüntüleri seçmeden önce çalıştırmanın tamamlanmasını bekleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Fiber tipi tanımlaması. (A) Fiber tipleri, tespit edilen her MHC izoformu için sinyal yoğunluğu paneli tarafından kategorize edilen, membran üzerindeki diğer tüm fiberlere göre tanımlanmıştır (örneğin, MHCI sinyali: Doymuş, Orta ve Zayıf). (B) (A)'daki paneli kullanarak, MHCIIa antikoru tip II lifleri (mavi, sol leke) tanımladı ve zarı sıyırdıktan sonra, MHCI antikoru tip I lifleri (kırmızı, orta leke) tanımladı. Aktin antikoru, daha önce MHCI veya IIa sinyalinin tespit edilmediği liflerde (yeşil, sağ leke) pozitif bir Aktin sinyali tespit edilirse, potansiyel IIx liflerini tanımlamak için kullanıldı. Bu yönergelere uymayan lifler mor renkle (tanımlanamayan) vurgulanmıştır. Son olarak, Aktin sinyali için negatif olan numuneler, hiçbir lifin toplanmadığını gösterdi ('Lif Yok'). (C) (B)'de gösterilen nokta lekeleri üzerindeki numune konumuna karşılık gelen fiber etiketlemeyi gösteren tablo. (D) Elyaf tipine özel numunelerin hazırlanması için elyaf seçiminin ana hatları. Amaç, her lif türü için 10 doymuş lif toplamaktı. Burada, tip II lifler için sekiz doymuş lif tanımlandı ve toplandı. Tip I fiberler için 10'dan az doymuş fiber mevcuttu, bu nedenle orta derecede sinyal gücüne sahip fiberler de seçildi. Tip IIx lifleri için iki lif tanımlandı ve toplandı. 10'dan az lif (doymuş ve orta) tanımlanırsa, daha fazla lif toplanması gerekebilir.  NOT: (B)'de gösterilen Aktin sinyali doygunluğa ulaşmamıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Fiber tipi tanımlamanın Western blot onayı. Tip I (~10 lif) ve tip II (~10 lif) numuneler oluşturmak için Şekil 4'e göre lif tipi tanımlaması yapılmıştır. Aynı biyopsiden tanımlanan IIx lifleri olmadığından, burada gösterilen IIx örneği birden fazla kas örneğinden (n = 2 kişi) üretildi. Her bir elyafa özgü numunenin küçük bir alikotu, elyaf tipi tanımlamasını doğrulamak için batı lekeleme ile analiz edilir. Moleküler ağırlık belirteçleri (kDa) solda belirtilmiştir, zarı hareket ettirmeden beyaz ışık altında yakalanır. Hedef proteinler, MHCIIx, MHCIIa ve MHCI dizisinde tespit edilir ve UV ile aktive olan jelden gelen miyozin, numune başına yüklenen protein miktarını görsel olarak gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yaygın protokol sorunları için sorun giderme stratejileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak dondurularak kurutulmuş lif kütlesinin hesaplanması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lif toplama
Birkaç yıllık deneyime dayanarak, çoğu araştırmacı bu teknikte ustalaşabilir; Bununla birlikte, uygulama, sonraki analizler için daha hızlı ve daha verimli lif toplamaya yol açar. Havuzlama kalitesinde 30 tek elyaf segmentini izole edebilmek için, numune başına 50 elyaf segmentinin toplanması önerilir. Makul bir standarda ulaşmak için lif toplama videosunu dikkatlice incelemek ve iki uygulama seansı (seans başına ~ 50 lif) gerçekleştirdikten sonra önerilir. Toplanan tüm lifler, tekniğin ne kadar etkili bir şekilde uygulandığını ortaya çıkaracak olan lif türünü belirlemek için MyDoBID'e tabi tutulur. Bu, fiber numunelerde tespit edilen düşük sayıda 'Fiber yok' veya 'zayıf' MHC sinyali olarak görülecektir (bkz. protokol bölüm 5.1).

Kasın hem MHCI hem de MHCIIa'nın bulunduğu hibrit lifler veya MHCIIa ve IIx 2,14 içerebileceği bilinmektedir. MyDoBID'in bir sınırlaması, hem MHCI hem de MHCIIa antikorları için pozitif bir numunenin bir hibrit fiber olabileceği veya iki lifin toplanmış olabileceği için bir hibrit fiberin varlığının tespit edilememesidir. Ayrıca, MHCIIa primer antikoru hem IIa hem de IIa/IIx liflerinde MHCIIa'nın varlığını tespit edeceğinden, MyDoBID MHCIIa'yı MHCIIa/IIx hibritlerinden ayrı olarak tespit edemez. Bu nedenlerden dolayı, hibrit fiber numunelerinin tanımlanması ve hazırlanması gerçekleştirilmemiş ve sinyal yoğunluğu panelinde açıklanan aralıkların dışında kalan hem MHCI hem de MHCIIa sinyallerine sahip numuneler atılmıştır (Şekil 4A). Diğer bir sınırlama, bir numunedeki kas lifi tiplerinin oranının MyDoBID kullanılarak belirlenememesi ve lif tipi dağılımını belirlemek için geleneksel immünohistokimyasal analizlerin uygulanmasının gerekli olmasıdır2.

Nokta lekeleme
Sinyal yoğunluğu paneli ve fiber tipi kimliği, nokta lekeleme membranına uygulanan küçük hacimde temsil edilen tüm numuneye dayanır. Bunu başarmak için numune, membran üzerine yüklenmeden önce çalkalama ile iyice karıştırılır. Sadece bir MHC izoformuna sahip tüm lifler, bir sonraki havuzlama adımına geçer. Bu aşamada, birden fazla MHC'ye sahip herhangi bir elyafın, numuneleri birleştirmenin bir sonraki adımına geçmemesi önemlidir. Bir numune kontamine olmuşsa, havuzlanan numunenin tamamının atılması gerekir ve araştırmacı Fiber toplamaya geri dönmeli ve fiber izolasyonu ve nokta lekeleme adımlarını tekrarlamalıdır.

İmmün etiketleme
Daha önce, MHCI veMHCIIa 9'un tespiti için membran üzerindeki spesifik olmayan bölgeleri bloke etmek için 5 dakikanın yeterli bir süre olduğu bildirilmişti. Tekniğin MyDoBID'e ilerletilmesi, bir Aktin antikorunun kullanılmasını gerektirir. 5 dakikalık bloklamanın daha koyu bir membran arka planı ile sonuçlanması nedeniyle, minimum arka plana sahip bir membran elde etmek için 5 dakikalık blok süresininrapor edildiği gibi 30 dakikaya çıkarılması gerektiği bulundu. Bloke etme süresi, western blotlama veya immünohistokimya gibi herhangi bir immüno-tespit tekniğinde dikkate alınması gereken bir husustur ve uygun şekilde değiştirilmelidir.

Membranın sıyrılması
Sıyırma, kantitatif analizler için kullanılamaz15 çünkü ilgilenilen proteinleri de ortadan kaldırır, ancak kalitatif bir test olduğu için MyDoBID'de kullanılabilir. Sıyırmanın amacı, bağlı antikorları zarın yüzeyinden uzaklaştırmak ve önceki antikordan minimum girişimle yeni bir antikorun kullanılmasına izin vermektir. MyDoBID'de, numuneyi farklı MHC izoformlarının ayrı membranlarda tespit edildiği iki membrana uygulama seçeneği vardır. Bu yaklaşım tercih edilirse, noktaları aynı anda yükleyerek numune tüpünü birden fazla kez tutmaktan kaçının. Bu, her bir numune noktası arasındaki kurutma süresinin benzer olmasını (~5 s fark) ve sonraki adımların ayrı kaplarda aynı anda gerçekleştirilmesini sağlayacaktır. Bu seçeneğin zaman, numune ve sarf malzemesi tüketimini artıracağına dikkat edilmelidir.

Antikorlar ilk önce MHCIIa liflerini, ardından MHCI'yi tespit etmek için uygulanır, çünkü MHCI antikoru her zaman çok parlak bir sinyal verir, bu da MHCIIa'dan daha zor soyulur. Aktin, iskelet kası liflerinde homojen bir şekilde eksprese edilir ve lifin bir kısmının yukarıda tarif edildiği gibi zara başarıyla uygulandığını doğrulamak için kullanılır.

Görüntüleme, lif tipi tanımlama ve lif tipine özel numunelerin hazırlanması
Bu protokolde, lif tipine özgü numuneler oluşturmak için lif tipi tanımlamasına ve numune seçimine yardımcı olmak için yeni bir araç geliştirilmiştir (Şekil 4A). Sinyal yoğunluğu panelinde gösterilen örnek, MHCI sinyal yoğunluğunu şu şekilde tanımlamak için kullanılır: (i) doymuş, (ii) orta veya (iii) zayıf. Fiberlerin fiber tipine özel numuneler halinde toplanması için öncelikle doymuş sinyal yoğunluğu gösteren fiberler seçilir ve gerekirse orta sinyal yoğunluğuna sahip fiberler eklenir. Tip I ve II numuneler hazırlanırken, tipik olarak yeterli miktarda 'doymuş' ve 'orta' lif vardır, böylece 'soluk' veya tanımlanamayan olarak kategorize edilen lifler atılabilir.

Saf tip IIx liflerini tanımlamak için MHCIIx antikoru yerine Aktin kullanmanın yeniliği
Önceden, saf IIx liflerini tanımlamak için, MHCIIx sinyali, bir nokta lekesi üzerindeki MHCI ve MHCIIa sinyaliyle öznel olarak karşılaştırıldı ve bir eleme işlemiyle, MHCI veya IIa sinyali olmayan, ancak MHCIIx sinyali olan lifler saf IIx olarak tanımlandı. Bununla birlikte, aynı zar üzerinde iki fare IgM primer antikoru (MHCIIx ve MHCI) kullanıldığında sorunlar ortaya çıkabilir. Primer antikorlar arasındaki membranın sıyrılmasına rağmen, rezidüel antikor sinyali tespit edilebilir. Tavşan anti-Aktin primer antikorunun kullanılması bu sorunun oluşmasını önler. Burada bir lifin toplandığını doğrulamak için Aktin kullandık ve hem MHCI hem de MHCIIa'nın yokluğunda, bir IIx lifinin mevcut olduğunu gösterir. Potansiyel IIx lifleri daha sonra MHCIIx'e özgü antikor kullanılarak western blotlama ile doğrulanır (bu yazıda Şekil 5'e ve9'da Şekil 2'ye bakınız). 6H1 antikorunun, sıçan iskelet kasında MHCIIx'e karşılık gelen elektroforetik olarak ayrılmış bandı tespit ettiği ve fare, sıçan ve insan kaslarınınenine kesitlerinde tip IIx liflerini etiketlediğigösterilmiştir 2.

Western blot fiber tipi onayı
Aynı biyopsiden alınan tüm lif tipine özgü numuneleri aynı jel üzerinde çalıştırmak en iyi uygulamadır. MHCIIx ile aynı ikincil antikoru gerektiren MHCI antikoru ile, tip I ve IIx numuneleri, Şekil 5'te gösterildiği gibi, belirli bir jel üzerinde en az bir şeritle ayrılmalıdır. Protein içeriği, değişken lif boyutu nedeniyle lif tipine özgü numuneler arasında değişeceğinden, tüm numunelerde benzer miktarlarda protein elde etmek için sonraki jel çalışmalarında yüklenmesi gereken numune hacmini belirlemek için ilk jel kullanılmalıdır. Bunu yapmak için, belirli bir numunedeki toplam protein, transferden önce jel içinde SDS-PAGE ile ayrılmış tüm protein bantlarını görselleştirmek için UV ile aktive olan jel görüntüleme teknolojisi kullanılarak belirlenir. Her numunedeki toplam protein, jel görüntüsünden belirlenir ve lif tipine özgü numuneler 3,4,6,17 ile birlikte bilinen birkaç iskelet kası dokusu kütlesinin bir kalibrasyon eğrisinin çalıştırılması şartıyla, bir sonraki western blot çalışmasında eşit olmayan yüklemeyi düzeltmek için kullanılır. Ayrıca, kendi kalibrasyon eğrisini15 gerektiren toplam proteini belirlemek için Aktin gibi bir 'temizlik' proteini kullanmaya gerek yoktur. Bu teknoloji, toplam proteini belirlemek için zaman kazandıran ve doğru bir yöntemdir ve ek reaktiflere veya protein standartlarına ihtiyaç duymadan çok az örnekle (yani, bir lifin ~1/5'i 9) gerçekleştirilebilirken, zarın tüm bölümlerini en üst düzeye çıkarırken, ilgilenilen proteinleri tespit etmek için.

Western blot adımı sırasında immüno-etiketleme söz konusu olduğunda, MHCIIx antikoru, diğer MHC izoformlarına kıyasla nispeten düşük MHCIIx bolluğu nedeniyle ilk olarak uygulanır. Membran MHCI antikor tespiti için hazır olduğunda, iki aşamalı sıyırma işlemine tabi tutulacaktır (yani, MHCIIx ve MHCIIa tespiti sonrası). Sonuç olarak, MHCI'nin saptanması, önceki MHC antikorlarından tespit edilen minimal rezidüel sinyal ile öncelikle bir tip I numunede tespit edilmelidir (Şekil 5). Western blotlama, aynı membran kısmı üzerinde üç MHC antikorunun tümü kullanılarak her bir lif tipine özgü numunenin saflığını doğrulamak için kullanılır. Bununla birlikte, tavşan veya keçi gibi farklı bir konakçı türde MHCI veya MHCIIx antikorları yetiştirilirse, sıyırma ihtiyacı ortadan kalkacaktır.

Uygulama
Burada açıklanan metodoloji, insan iskelet kasında lif tipine özgü protein ekspresyonunu incelemek için taze veya dondurularak kurutulmuş iskelet kasından tek lif segmentlerinin lif tiplemesi için kullanılabilir. Ek olarak, taze kas örnekleri kullanılarak, sağlam veya mekanik olarak derisi soyulmuş lifler kullanılabilir6. Kabuklu bir lifin kullanılması, sitozol ve zar bölmelerindekiler gibi hücre altı bölmelerde protein ekspresyonunun daha fazla incelenmesine izin verir. Bu uygulama daha önce sağlıklı ve diyabetik bireylerden mekanik olarak derili lif segmentlerinde bağlı ve bağlanmamış glikojen miktarını ölçmek için kullanılmıştır6. Daha da önemlisi, MyDoBID yalnızca denatüre numuneleri kullanan deneyler için faydalıdır ve doğal hallerinde protein gerektiren çalışmalar için uygun olmayacaktır. Enzimatik tahliller veya çözelti içi proteomik yaklaşımlar gibi diğer analizlerin doğal koşullar altında gerçekleştirilebilmesi mümkün olsa da, MyDoBID kullanılarak MHC izoform tanımlaması için lifin bir kısmının çıkarılabilmesi için daha fazla optimizasyon gerekli olacaktır.

Özetle, tip I, tip II ve tip IIx, western blotlama için yaygın olarak kullanılan hazır sarf malzemeleriyle basit bir tekniğin uygulanmasıyla başarılı bir şekilde tanımlanabilir. Başarılı bir şekilde tamamlandıktan sonra, gelecekteki çalışmalar için mümkün olan en iyi kalite, bütünlük ve güvenilirliğe sahip lif türüne özgü numuneler üretecek kapsamlı pratik bilgiler ekliyoruz. Bu teknik, lif spesifik iskelet kası biyokimyasal analizinin gerçekleştirilmesinde pratik ve tercih edilen yaklaşımdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışmada kullanılan MHC I (A4.840) ve MHCIIa'ya (A4.74) karşı antikorlar Dr. HM Blau tarafından geliştirilmiştir ve MHCIIx'e (6H1) karşı antikor Dr. CA Lucas tarafından geliştirilmiştir ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü'nün himayesinde ve Iowa Üniversitesi tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan (DSHB) elde edilmiştir. Biyolojik Bilimler Bölümü (Iowa City, IA). Bu çalışma için insan kas örneklerini sağladığı için Victoria L. Wyckelsma'ya teşekkür ederiz. Şekil 1'deki görüntülerin çoğu BioRender.com'dan alınmıştır.

Finansman:
Bu çalışma hiçbir dış fon almadı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies  1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol N/A 100% ethanol can be sourced from any company Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich   A2066 Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales Mettler Toledo Model number: MSZ042101
Antibody enhancer Thermo Fischer Scientific 32110 Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL) N/A N/A
Benchtop centrifuge Eppendorf 5452 Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. Diploma Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich  BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002 Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever  Bio-Rad Laboratories 4560000 Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager  Bio-Rad Laboratories Model number: Universal hood III Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter Bio-Rad Laboratories 1704070 Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad) Bio-Rad Laboratories 1656001
ECL (enhanced chemiluminescence) Bio-Rad Laboratories 1705062 Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) Bio-Rad Laboratories 1610772 Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick Whatmann 3030917 Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps Dumont F6521-1EA Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid   N/A N/A Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System Labconco 7750030 Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC  N/A N/A Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers 1653320 Bio-Rad Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil N/A N/A
 Image lab software  Bio-Rad Laboratories N/A Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator Bio-Rad Laboratories 1660521 Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp N/A N/A
Magnetic stirrer with flea N/A N/A
Membrane roller  Bio-Rad Laboratories 1651279 Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. 
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL) N/A N/A
Mouse IgG HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31430 Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary Abcam ab97230 Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody DSHB A4.840  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody DSHB A4.74  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody DSHB 6H1 Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm  Bio-Rad Laboratories 1620115 For Western blotting.
Petri dish lid N/A N/A
Plastic tweezers N/A N/A
Power Pack  Bio-Rad Laboratories 164-5050 Product name: Basic power supply.
Protein ladder Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm Bio-Rad Laboratories 1620177
Rabbit HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31460 Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker N/A N/A
Ruler N/A N/A
Scissors N/A N/A
Stereomicroscope Motic SMZ-168
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059 Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free) Kimberly-Clark professional 34120 Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018 dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray Bio-Rad Laboratories 1704089
 UV-activation precast gel Bio-Rad Laboratories 5678085 Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex N/A N/A
Wash buffer (1x TBST) 10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma  BIOA0027-4L 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers Sistema Store bought Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

Tags

Lif Tipi Tanımlama İskelet Kası Miyozin Ağır Zinciri Nokta Lekeleme MyDoBID Kas Lifi Tipi Sınıflandırması MHCI-antikorlar IIa-spesifik Antikorlar Biyopsi Örnekleri Sodyum Dodesil-sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) UV ile aktive Jel Teknolojisi Western Blotting Protein Yükleme Normalizasyonu Tek lifli Western Blots Numune Çok Yönlülüğü Numune Verimi Zaman Yatırımı Maliyet Tasarrufu Önlemleri
İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Latchman, H. K., Wette, S. G.,… More

Latchman, H. K., Wette, S. G., Ellul, D. J., Murphy, R. M., Frankenberg, N. T. Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (199), e65750, doi:10.3791/65750 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter