Summary
该方案演示了使用斑点印迹技术从冻干的人骨骼肌中分离单纤维和根据肌球蛋白重链（MHC）亚型的纤维类型分类。然后，可以使用蛋白质印迹法进一步分析已鉴定的 MHC I 和 II 纤维样品，以了解蛋白质表达的纤维类型特异性差异。
Abstract
此处描述的技术可用于使用斑点印迹法鉴定单个肌肉纤维片段中的特定肌球蛋白重链 （MHC） 亚型，以下称为 Myosin 重链检测，通过 Dot Blotting 进行肌纤维类型 鉴定（MyDoBID）。该协议描述了冷冻干燥人体骨骼肌和分离单肌纤维片段的过程。使用 MyDoBID，I 型和 II 型纤维分别用 MHCI 和 IIa 特异性抗体进行分类。然后将分类的纤维组合成纤维类型特异性样本，用于每次活检。
每个样品中的总蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 和紫外线活化凝胶技术测定。使用蛋白质印迹法验证样品的纤维类型。此外，还描述了进行蛋白上样归一化以增强跨多个蛋白质印迹的靶蛋白检测的重要性。与单纤维蛋白质印迹相比，将分类纤维合并到纤维类型特异性样品中的好处包括样品多功能性、更高的样品通量、更短的时间投资和节省成本的措施，同时保留了使用均质肌肉样品时经常被忽视的有价值的纤维类型特定信息。该协议的目的是准确有效地鉴定从冻干的人类骨骼肌样品中分离出的I型和II型纤维。
这些单独的纤维随后被组合在一起，以创建I型和II型纤维类型特异性样品。此外，该协议扩展到包括鉴定IIx型纤维，使用肌动蛋白作为MHCI和MHCIIa阴性纤维的标记物，这些纤维通过蛋白质印迹被确认为IIx纤维。然后使用蛋白质印迹技术对每种纤维类型特异性样品进行定量分析。
Introduction
骨骼肌是一种异质性组织，具有不同的细胞代谢和收缩特性，这取决于细胞（纤维）是慢速抽搐（I 型）还是快速抽搐（II 型）。纤维类型可以通过检查肌球蛋白重链 （MHC） 亚型来识别，这些亚型在几个方面彼此不同，包括收缩时间、缩短速度和抗疲劳性1。主要的 MHC 亚型包括 I 型、IIa 型、IIb 型和 IIx 型，其代谢特征为氧化性（I 型和 IIa 型）或糖酵解型（IIx、IIb）1。这些纤维类型的比例因肌肉类型和物种而异。IIb型广泛存在于啮齿动物肌肉中。人体肌肉不含任何 IIb 型纤维，主要由 MHC 亚型 I 型和 IIa 型纤维组成，少量 IIx 纤维2。蛋白质表达谱因不同的纤维类型而异，并且可以随着年龄的增长而改变 3、运动 4,5 和疾病6。
由于检查肌肉匀浆（所有纤维类型的混合物），测量不同骨骼肌纤维类型的细胞反应经常被忽视或不可能。单纤维蛋白质印迹法可研究单个肌肉纤维中的多种蛋白质7.该方法以前已被用于产生新颖且信息丰富的单纤维特性，而使用匀浆制剂无法获得这些特性。然而，原始的单纤维蛋白质印迹方法存在一些局限性，包括耗时、无法生成样品重复以及使用昂贵、灵敏的增强化学发光 （ECL） 试剂。如果使用新鲜组织，由于需要在有限的时间范围内（即 1-2 小时）分离单个纤维的时间限制，这种方法会进一步受到限制。幸运的是，通过从冻干组织中分离出单纤维片段来缓解这种限制8。然而，从冻干样本中收集纤维受到活检组织的大小和质量的限制。
使用斑点印迹方法9的纤维类型鉴定已在本综合方案中得到了显着阐述和扩展。先前，已经证明，低至 ~2-10 mg 的湿重肌肉组织就足以进行冷冻干燥和单纤维 MHC 亚型蛋白分析9。Christensen等人9使用30%的~1 mm纤维片段通过斑点印迹检测MHC亚型，并通过蛋白质印迹证实了这一点。这项工作表明，通过用斑点印迹代替蛋白质印迹，总成本降低了 ~40 倍（对于 50 个纤维片段）。然后将纤维“汇集”到 I 型和 II 型样品中，从而允许实验复制9。然而，局限性是仅获得两种纤维类型特异性样品：I型（MHCI阳性）和II型（MHCII阳性纤维），II型样品含有MHCIIa和MHCIIx 6,10的混合物。值得注意的是，当前的协议演示了如何识别纯IIx型光纤，并提供了非常详细的工作流程（如图1所示），包括常见协议问题的故障排除策略。
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Protocol
从股外侧肌获得 n = 3（2 名男性，1 名女性），年龄在 70-74 岁，使用局部麻醉（Xylocaine）和 Bergstrom 针头进行手动抽吸11,12。样本是维多利亚大学人类研究伦理委员会 （HRETH11/221） 批准的先前研究的一个子集，并根据赫尔辛基宣言13 进行。参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。该协议所需的所有材料的完整详细信息显示在材料表中。此外，表 1 中还提供了解决常见协议问题的故障排除策略列表。
1.冷冻干燥
- 在将活检肌肉样本冷冻在干冰上的同时，称重并在秤上将空的冷冻管去皮。
- 快速称量至少 10 mg 湿重冷冻组织。将权重记录到小数点后一位。
- 将组织放入预冷的微量离心管中，该管在盖子上刺了3-4个孔，然后将其放入装有2-3粒干冰的小烧杯中。
- 请遵循冷冻干燥机制造商的操作说明。
- 确保冷冻干燥机上的所有阀门都已关闭并打开冷冻干燥机。
- 使用控制面板检查真空设定点是否已编程为人体组织的最佳冷冻干燥条件，0.12 毫巴 （mBar）（图 2）。
- 按冷冻干燥机上的 手动 键，等待腔室冷却至-40 °C。
- 一旦腔室达到该温度，取下盖子，然后取下玻璃腔，并将烧杯（带有肌肉样本）放在金属载物台上。
- 更换玻璃室和盖子。关闭盖子上的真空释放阀，等待真空刻度灯变为绿色，以确保干燥机是真空密封的。
- 将肌肉样品冷冻干燥48小时。冷冻干燥完成后，按下真空按钮关闭真空泵，然后打开盖子上的真空释放阀。
- 取下腔室的盖子并收集冷冻干燥的样品。称量组织并将重量记录到小数点后一位。
- 计算体重损失的百分比;~75% 的重量减少表明组织已成功冷冻干燥（在这项工作中，平均 ± SD，76 ± 9%，n = 11 个肌肉样本）。
- 按 AUTO 关闭真空泵和冷冻机。让设备达到环境温度。
- 根据制造商的说明清洁冷却盘管，并从收集器中排出积聚的液体。
注意： 纤维收集可以立即开始。当组织不用于纤维分离时，将冷冻干燥的样品保持在-80°C的密封容器中，并用干燥器珠。 注意： 干冰是危险的（第 9 类）;请参阅 MSDS 了解推荐的安全处理方法。
2. 纤维收集
- 纤维采集准备
- 标记至少 50 个微量离心管（纤维 1 至 50），并向每个管移取 10 μL 变性缓冲液。
- 用两对细组织解剖钳、无绒组织、台式灯、立体显微镜（黑色载物台朝上）、涡旋和台式离心机准备收集区域。
- 将冻干的肌肉样品放在培养皿盖上。将盖子放在解剖显微镜的载物台上。
- 观看单纤维解剖视频。在开始研究之前，至少练习两次从纤维收集到单纤维类型鉴定的完整方案。
- 在纤维采集之前，计算 每次活检的纤维类型样本所需的总体积 ，如下所示。例如，如果 1 根纤维的起始体积 = 10 μL，而 MyDoBID 后的剩余体积为 （1 根纤维× 10 μL） - 1 μL 用于斑点印迹 = 9 μL（样品体积），则通过将样品体积 （μL） 乘以将要运行的蛋白质印迹总数来计算 所需的总样品体积 ，并将此量加倍以考虑冗余： （9 μL × 4 个蛋白质印迹） × 2 = 72 μL。 通过将所需的最终样品体积 （μL） 除以每个纤维类型特定样品的样品体积（例如，每个纤维类型特定样品 72 μL ÷ 9 μL = 8 根纤维）来计算 每个类型样品所需的纤维数量 。为此，总共收集 50 根纤维。
注：如果每个样品的蛋白质加载量相当于~3 mm纤维（~12μg湿重），则所需的样品体积是运行MyDoBID和蛋白质印迹所需的最小蛋白质浓度（有关详细信息，请参阅补充文件1）。然而，该体积并不考虑给定蛋白质是否需要重复凝胶。 注意：镊子很锋利;小心处理它们以避免皮肤刺穿的风险。
- 单纤隔离
- 在一张 5 厘米 x 1 厘米的小纸上，用尺子画一条 1 厘米的线。在该线上每隔 1 毫米标记一次。
- 将其插入培养皿盖下作为估计收集的纤维长度的指南。
- 将冷冻干燥的肌肉样品置于低放大倍率（x 7.5）的立体显微镜下。使用一把细组织解剖镊子将冻干的肌肉固定到位，另一把钳子开始分离小束纤维（如视频所示）。
- 分离一束纤维并继续梳理，直到从束中分离出单段纤维。
- 收集至少 50 根长度至少为 ~1 毫米的纤维。
- 将纤维移动到培养皿上的空白处。在更高的放大倍率 （x 50） 下检查单光纤段。通过在末端进一步分离光纤来确保它是单根光纤。如果纤维断裂而不是分离，则它是单根纤维。
- 纤维变性
- 使用镊子，轻轻收集纤维并将其直接放入等分变性缓冲液中（不要让镊子接触缓冲液）。
- 在显微镜下检查镊子，确保纤维已成功取出。关闭管子，将管子底部在工作台上用力敲击三次，以确保光纤进入缓冲液。
- 在继续下一根纤维之前，使用无绒纸巾将镊子擦拭干净。重复此过程，直到收集完所有纤维。
- 涡旋纤维样品并以2,500× g 短暂离心5秒，将样品吸入管底部。
注意：离心持续时间（5 秒）从开始 （0 × g） 开始计时，直到速度达到 ~2,500 × g。 - 将样品在室温下放置1小时。储存在-80°C以备将来使用。使用前冷冻然后解冻样品。
3. 斑点印迹
- 膜制备和活化
- 测量、标记和切割一个聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜（孔径为 0.2 μm）以适合 50 个样品 （~10.5 cm x 5.5 cm）。
- 从上到下（1 到 10）按数字标记左边框，从左到右（A 到 E）按字母顺序标记上边框，间隔 1 厘米。
- 准备四张尺寸为 12.5 厘米 x 7.5 厘米的滤纸。
- 将两张纸堆在一起形成一堆。将滤纸堆栈预浸泡在1x转移缓冲液中。
- 将膜放入容器中。将 95% 乙醇倒在膜上，其体积足以完全浸入膜 （10-15 mL）。在摇杆上搅拌1分钟。
- 收集乙醇，将膜浸入 1x 转移缓冲液 （~15 mL） 中，然后再摇动 2 分钟。
注：乙醇和转印缓冲液均可重复用于未来的斑点印迹实验，直至形成沉降（六次使用后发生变化）。 - 将浸泡过转印缓冲液的滤纸堆放在平坦的可移动表面上，例如大盖子，然后用滚筒压平。使用凝胶释放剂或镊子将 PVDF 膜放置在堆栈上。
- 将单张干燥滤纸放在膜的顶部，然后将滚筒移到滤纸上，以吸收膜表面多余的缓冲液。取下顶部滤纸，不要摩擦膜。
注意：甲醇（第 3 类，亚风险 6.1）和乙醇（第 3 类）是危险的。有关安全处理建议，请参阅材料安全数据表 （MSDS）。
- 样品对膜的吸收
- 解冻纤维样品，如步骤2.3.4所示在室温下进行短暂的离心（5秒），并将样品彻底混合。
- 在不用移液器吸头接触膜的情况下，将每个样品的~1μL液滴缓慢沉积到指定区域的膜上。每个光纤样品的指定区域尺寸为 ~1 cm x 1 cm。目标是在该区域的中心发现样品。
- 让样品液滴通过膜浸泡至少15分钟。确保没有样品缓冲液残留并被完全吸收。
- 使用塑料镊子，小心地将膜从潮湿的滤纸堆中提起，将其放在单张干燥的滤纸上，并使膜脱水至少5分钟。
- 一旦样品斑点完全变白，重新激活膜。
- 膜再活化和阻断
- 通过重复步骤3.1.5和3.1.6重新激活膜。
- 将膜放入洗涤缓冲液中，摇动冲洗5分钟。丢弃洗涤缓冲液。
- 摇动时将膜在封闭缓冲液中孵育30分钟。
- 用洗涤缓冲液冲洗膜 3 次，直到缓冲液不再浑浊。
- 将膜留在摇杆上的最后洗涤中。
4. 免疫标记
- MHCIIa的检测
- 在 10 mL 牛血清白蛋白 （BSA） 缓冲液中以 1/200 稀释 MHCIIa 一抗。
- 弃去膜上的洗涤缓冲液，然后将稀释的MHCIIa抗体倒入膜上。
- 将容器（膜在MHCIIa中）在室温下在摇床上放置2小时或在4°C下过夜。
- 收集MHCIIa抗体并将其储存在4°C。 在摇床上用封闭缓冲液洗涤膜2分钟。
注意：只要缓冲液保持透明，所有一抗最多可重复使用五倍。 - 再冲洗两次;每次5分钟;总共洗涤三次。
- 在 10 mL 封闭缓冲液中以 1/20,000 稀释小鼠免疫球蛋白 G 辣根过氧化物酶 （IgG-HRP） 二抗，并添加到膜中。
- 弃去洗涤缓冲液，将膜在小鼠IgG-HRP二期中摇动孵育1小时。
- 弃去二级并在洗涤缓冲液中洗涤膜（2,5,5分钟）。
- 将膜浸泡在最后的洗涤中，直到准备好成像。
- 打开凝胶成像仪，等待15分钟，使成像仪达到所需的工作温度，然后打开成像软件（参见 材料表）。
- 在软件窗口中，单击 New Single Channel Protocol （图3A）。有关膜的白光图像，请在 “应用”|”印迹 | 单击 比色法 （图3B）。
- 点击凝胶区域;每个选项都针对特定尺寸进行了编程，以适应各种凝胶类型的尺寸。选择适当的选项以最适合膜的尺寸（图3C）。
- 通过以 1：1 的比例组合鲁米诺和过氧化物酶试剂来制备 ECL。制备足够体积的ECL混合物以覆盖整个膜，通常需要800-1,000μL的总体积。
- 将膜放在一个大的透明塑料托盘上，并将ECL混合物分散到膜上。
- 将膜放在成像板上。
- 单击 “定位凝胶 ”（黄色按钮）可查看实时摄像机。单击按住并拖动缩放按钮以最大化膜的成像区域。此时，如果需要，拉直膜的位置。
- 单击 “运行方案 ”（绿色按钮）并等待膜的比色图像生成。保存此图像以帮助将点与相应的光纤样品相匹配。
- 在不移动膜的情况下，通过单击 2 x 2像素合并 （Chemi High Resolution）选项来更改软件上的应用程序（图3D）。
- 在“ 图像曝光和软件”下，优化 曝光时间，单击 “微弱带 ”（图3E） |信号累积模式。
- 在“设置”下，键入第一个图像的 1 秒，最后一个图像的 30 秒，总共 30 个图像（图 3F）。
- 单击 Run Protocol。
- 在以下阶段保存图像：信号饱和前（所有可见点均为黑色）、初始信号饱和（某些点开始饱和）和过饱和点（检测到所有具有强信号的点均已饱和）。
- 在结束信号累积之前保存所有需要的图像。将膜从成像仪中取出。
- 使用凝胶释放剂，将膜放回装有洗涤缓冲液的容器中。
- MHCI的检测
- 倒出洗涤缓冲液，并在37°C下用剥离缓冲液处理膜30分钟（确保膜完全浸没）。
- 收集剥离缓冲液，并在洗涤缓冲液中摇动冲洗膜5分钟。
注意：剥离缓冲液在丢弃前可以重复使用 10 次。 - 倒出洗涤缓冲液，此时应用以 1/200 的起始浓度稀释的 MHCI 一抗（范围：1/200 至 1/500）。在室温下摇动膜1小时。
- 在MHCI一抗中孵育后，收集抗体并按照步骤4.1.4和4.1.5洗涤膜。
- 在封闭缓冲液中以 1/20,000 稀释小鼠 IgM HRP 二抗。从膜中倒出封闭缓冲液，并在小鼠IgM二级中孵育，如步骤4.1.7所示。
- 洗涤和图像捕获检测到MHCI，如步骤4.1.8至4.1.24所示。
注意：剥离缓冲液含有 3-5% 的有机磷化氢（8 类）。有关安全处理建议，请参阅 MSDS。
- 使用肌动蛋白检测潜在的MHCIIx
- 再次剥离膜（步骤4.2.1和4.2.2）。
- 重复第 4.1 节，这次在 BSA 缓冲液中以 1/500 稀释的肌动蛋白一抗，然后在封闭缓冲液中以 1/20,000 稀释的兔 HRP 二抗。
5.光纤类型识别
- MHCI、MHCIIa 和肌动蛋白信号分析
- 熟悉信号强度面板（图4A）。记下步骤 5.1.2 至 5.1.4。
- 饱和信号强度定性地表明蛋白质检测很强。
- 中度表示靶蛋白以中等水平存在。
- 微弱的信号表明存在很少的靶蛋白。
- 使用信号强度面板将光纤分为“饱和”、“中等”或“微弱”信号强度（图 4A）。
- 首先通过比较MHCIIa和MHCI结果进行纤维类型鉴定（图4B，左侧和中间印迹）。
- 记录仅具有一种MHC亚型的饱和或中等信号强度的光纤。
- 如果MHC亚型信号“微弱”，则不标记光纤（见 图4B）。
- 最后，在未检测到MHCI或IIa的纤维中观察到肌动蛋白（中等或饱和信号强度），将其记录为潜在的IIx型纤维（图4B，右印迹）。
- 记录具有微弱 MHC 亚型信号但肌动蛋白检测到（中等或饱和强度）的纤维未识别。
- 丢弃所有三种靶蛋白的微弱或未检测到（未收集纤维）的样品（图4C）。
- 记录任何同时检测到MHCI和MHCII信号的光纤，这些信号都是“饱和”或中等信号。这些样品不用于特定纤维类型的制备。
- 纤维类型特异性样品的制备
- 为每次活检准备单独的 I 型和 II 型样本。对于II型样品，结合所需的最小纤维数（在步骤2.1.5中计算），其中MHCIIa在饱和或中等水平下检测到。
- 在标记为I型的单独管中，对检测到MHCI的纤维重复此过程（图4D）。
- 如果没有足够的饱和信号光纤，请使用信号强度适中的光纤。
- 组合任何潜在的 IIx 光纤。
- 立即使用纤维类型特异性样品进行蛋白质印迹，或将其储存在-80°C以备将来使用。
6. 蛋白质印迹纤维类型确认
- 利用 10 μL 每种纤维类型特定的样品（所需的最小样品体积，参见步骤 2.1.5）。
- 根据制造商的方案，使用指定的预制凝胶通过SDS-PAGE分离样品。
- 根据制造商的方案，使用凝胶成像仪检测凝胶中的蛋白质。
- 将凝胶放入冷的1x转移缓冲液中10分钟。
- 根据制造商的方案，将蛋白质湿转印到0.45μm硝酸纤维素膜（9.5cm×13.5cm）上。
- 转移后，在容器中用超纯H2O短暂冲洗膜。倒出超纯水。
- 向膜中加入 10 mL 抗体信号增强剂溶液，并在室温下摇匀 10 分钟。
- 收集抗体信号增强剂溶液，并用超纯H2O洗涤5次（每次洗涤5秒）。
注：抗体信号增强剂溶液可在丢弃前使用 5 次。 - 倒出最后一次洗涤，加入封闭溶液，并在室温下摇摆1小时。
- 使用干净的手术刀刀片或剪刀以分子量水平切割膜，确保 180 kDa 及以上的蛋白质位于膜的顶部。
- 使用此顶部部分可进一步确认光纤类型。
- 使用低于 180 kDa 的部分检测不同的靶蛋白。
- 在膜的顶部，按照第 4.1 节使用 MHCIIx 一抗和小鼠免疫球蛋白 M （IgM） HRP 二抗。
- 剥离膜（如第 4.2.1 节和第 4.2.2 节所述），然后用 MHCIIa IgG 一抗和小鼠 IgG HRP 二抗重复该过程。
- 再次剥离，最后应用MHCI IgM一抗和小鼠IgM HRP二抗。
注意：此步骤是定性的，因此无需担心由于膜剥离而导致的任何蛋白质损失。 - 比较在不同MHC亚型中检测到的信号（ 如图5B所示）。当在预期样品（MHCI - I 型、MHCIIa - II 型和 MHCIIx - IIx 型）中检测到中等至饱和水平的信号强度时，特定光纤类型的样品将被记录为可靠，以供未来的研究使用。
- 当一个样品中同时检测到一种以上的MHC亚型时，将样品记录为不可靠。
注意：抗体增强剂溶液含有 50% 的氢氧化钠。有关安全处理建议，请参阅 MSDS。
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Representative Results
使用斑点印迹法鉴定单个 MHCI、MHCIIa 和 MHCIIx 肌纤维
MyDoBID的一个特点是对给定光纤中不同的MHC和肌动蛋白信号强度强度进行分类（图4A）。纤维类型通过是否存在MHCI和IIa亚型来识别（图4B）。6根纤维未检测到MHC或肌动蛋白，表明未收集纤维。该特异性斑点印迹的结果是鉴定了22根II型纤维、7根I型纤维和3根潜在的IIx型纤维;收集了2个不明样本和6个样本，归类为“无纤维”（图4B，C）。没有任何可检测到的MHCI或MHCIIa信号但肌动蛋白呈阳性的纤维通过消除过程被鉴定为潜在的IIx型纤维。使用信号强度面板对MHCI和IIa信号强度进行分类，将“中等”或“饱和”光纤组合在一起，分别产生I型或II型样品。未鉴定或未检测到微弱或未检测到肌动蛋白的纤维不包括在随后的分析中并被丢弃（图4D）。
使用蛋白质印迹法进行纤维分型确认
使用蛋白质印迹法和MHC特异性抗体对纤维类型特异性样品进行验证（图5）。来自一个个体活检的 I 型和 II 型纤维样本与 IIx 型样本一起运行，IIx 型样本是来自两个个体的潜在 IIx 型纤维样本，因为每次活检中存在的 IIx 型纤维数量很少。Western blot数据证实了纤维类型鉴定成功。
图 1：概述样品制备、纤维分型和纤维特异性蛋白质印迹确认的工作流程摘要 。 （A）将人体组织冷冻干燥48小时。 （B，C）在解剖显微镜下分离单纤维片段。（D）纤维变性，（E）1小时后，储存在-80°C。 （F）一抗孵育顺序。（G） 使用MHCIIa（II型）、MHCI（I型）和肌动蛋白（IIx？，电位IIx型纤维）对纤维进行斑点印迹和纤维类型鉴定。（H） 然后将纤维汇集在一起。（I） 通过SDS PAGE和蛋白质印迹分析纤维类型特异性样品以及校准曲线。（J） 使用蛋白质印迹法验证纤维类型鉴定。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：冷冻干燥系统的显示屏和控制面板。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：成像仪设置，用于捕获膜的白光，然后对靶蛋白进行化学发光检测。 要在白光下对膜进行成像，（A） 选择新建单通道，然后选择 （B） 印迹 | 比色应用。（C） 根据所用凝胶的大小，选择合适的成像区域，然后按“运行协议”拍摄白光图像。（D） 在不移动膜的情况下，重复步骤 B，但这次选择印迹 |Chemi Hi 分辨率。在按下运行之前，选择 （E） 图像曝光以优化微弱波段和 （F） 设置信号累积模式，并在第一个实例中设置每秒的曝光时间，总共 30 秒，并勾选高亮饱和像素。按“运行协议”并让运行完成，然后再选择要保存的最佳图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：光纤类型识别。 （A） 相对于膜上的所有其他纤维识别纤维类型，按检测到的每种 MHC 亚型的信号强度面板分类（例如，MHCI 信号：饱和、中等和微弱）。（B）使用（A）中的panel，MHCIIa抗体鉴定出II型纤维（蓝色，左侧印迹），剥离膜后，MHCI抗体鉴定出I型纤维（红色，中间印迹）。肌动蛋白抗体用于鉴定潜在的 IIx 纤维，如果在先前未检测到 MHCI 或 IIa 信号的纤维中检测到阳性肌动蛋白信号（绿色，右侧印迹）。未遵循这些准则的纤维以紫色突出显示（未识别）。最后，肌动蛋白信号阴性的样本表明没有收集到纤维（“无纤维”）。（C） 表格显示了与 （B） 所示点印迹上的样品位置相对应的纤维标记。（D） 用于制备特定类型纤维样品的纤维选择概述。目的是为每种纤维类型收集 10 根饱和纤维。在这里，对于II型纤维，鉴定并汇集了八根饱和纤维。对于I型光纤，饱和光纤少于10根，因此也选择了信号强度适中的光纤。对于IIx型光纤，鉴定并汇集了两根光纤。如果鉴定出少于 10 根纤维（饱和纤维和中等纤维），则可能需要进一步收集纤维。 注意： （B） 中所示的肌动蛋白信号尚未达到饱和。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：蛋白质印迹法确认纤维类型鉴定。 如图 4 所示进行纤维类型鉴定，以生成 I 型（~10 根光纤）和 II 型（~10 根光纤）样品。由于同一活检没有鉴定出IIx纤维，因此此处显示的IIx样本是由多个肌肉样本（n = 2个体）产生的。通过蛋白质印迹分析每个纤维特异性样品的少量等分试样，以确认纤维类型鉴定。分子量标记物（kDa）如左图所示，在不移动膜的情况下在白光下捕获。在MHCIIx、MHCIIa和MHCI的序列中检测靶蛋白，来自UV活化凝胶的肌球蛋白直观地指示每个样品的蛋白质上样量。 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：常见协议问题的故障排除策略。请按此下载此表格。
补充文件 1：使用校准曲线计算冻干纤维质量。请点击这里下载此文件。
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Discussion
纤维采集
根据几年的经验，大多数研究人员可以掌握这种技术;然而，实践可以更快、更有效地收集纤维，用于下游分析。为了能够分离出 30 个质量的单纤维段进行池化，建议每个样品收集 50 个纤维段。建议仔细研究纤维采集视频，并在进行两次练习（每节~50根纤维）后达到合理的标准。所有收集的纤维都经过MyDoBID以识别纤维类型，这将揭示该技术的执行效率。这将被视为在光纤样本中检测到的“无光纤”或“微弱”MHC 信号数量较少（参见协议第 5.1 节）。
众所周知，肌肉可以包含混合纤维，其中同时存在 MHCI 和 MHCIIa，或 MHCIIa 和 IIx 2,14。MyDoBID的一个局限性是无法确定杂交纤维的存在，因为MHCI和MHCIIa抗体均呈阳性的样本可能是杂交纤维，也可能是收集了两根纤维。此外，MyDoBID 无法将 MHCIIa 与 MHCIIa/IIx 杂交体分开检测，因为 MHCIIa 一抗会检测 IIa 和 IIa/IIx 纤维中 MHCIIa 的存在。由于这些原因，没有进行杂化光纤的鉴定和制备，并且丢弃了具有MHCI和MHCIIa信号的样品，这些信号超出了信号强度面板中描述的范围（图4A）。另一个局限性是，使用 MyDoBID 无法确定样本中肌纤维类型的比例，并且需要应用常规免疫组织化学分析来确定纤维类型分布2。
斑点印迹
信号强度panel和光纤类型ID依赖于施加到斑点印迹膜的小体积中表示的整个样品。为此，在加载到膜上之前，通过搅拌将样品充分混合。所有只有一种MHC亚型的纤维进入下一步的汇集。在此阶段，重要的是，任何具有多个 MHC 的光纤都不得进行下一步组合样品。如果样品被污染，则需要丢弃整个混合样品，研究人员必须返回纤维收集并重复 纤维 分离和斑点印迹步骤。
免疫标记
先前有报道称，5 分钟是阻断膜上用于检测 MHCI 和 MHCIIa9 的非特异性位点的足够时间。将该技术推进到MyDoBID需要使用肌动蛋白抗体。结果发现，5 min的封闭时间需要增加到30 min，如6所示，以获得具有最小背景的膜，因为5 min封闭导致膜背景更暗。封闭时间是任何免疫检测技术（如蛋白质印迹或免疫组织化学）的考虑因素，应酌情进行调整。
剥离膜
剥离不能用于定量分析15 ，因为它也会去除感兴趣的蛋白质，但可用于MyDoBID，因为它是一种定性测定。剥离的目的是从膜表面去除结合的抗体，从而允许使用新抗体，同时将先前抗体的干扰降至最低。在MyDoBID中，可以选择将样品涂在两个膜上，在单独的膜上检测不同的MHC亚型。如果首选这种方法，请避免通过同时加载斑点来多次处理样品管。这将确保每个样品点之间的干燥时间相似（~5 秒的差异），并在单独的容器中同时执行后续步骤。必须注意的是，此选项会增加时间、样品和耗材消耗。
抗体首先检测 MHCIIa 纤维，然后检测 MHCI，因为 MHCI 抗体总是发出非常明亮的信号，这比 MHCIIa 更难剥离。肌动蛋白在骨骼肌纤维中均匀表达，用于确认如上所述，部分纤维已成功应用于膜上。
成像、纤维类型鉴定和纤维类型特异性样品的制备
该协议中开发了一种新工具，用于协助纤维类型识别和样品选择，以创建特定于纤维类型的样品（图4A）。信号强度面板中显示的示例用于将 MHCI 信号强度定义为：（i） 饱和、（ii） 中等或 （iii） 微弱。为了将光纤汇集到特定类型的光纤样品中，首先选择显示饱和信号强度的光纤，如果需要，添加具有中等信号强度的光纤。在制备I型和II型样品时，通常有足够的“饱和”和“中等”纤维，因此可以丢弃被归类为“微弱”或未识别的纤维。
使用肌动蛋白代替MHCIIx抗体鉴定纯IIx型纤维的新颖性
以前，为了识别纯IIx光纤，在斑点印迹上主观地将MHCIIx信号与MHCI和MHCIIa信号进行比较，并通过消除过程，将没有MHCI或IIa信号但具有MHCIIx信号的光纤鉴定为纯IIx。然而，在同一膜上使用两种小鼠 IgM 一抗（MHCIIx 和 MHCI）时，可能会出现问题。尽管剥离了一抗之间的膜，但仍可检测到残留的抗体信号。使用兔抗肌动蛋白一抗可防止此问题发生。在这里，我们使用肌动蛋白来确认收集了纤维，并且在没有 MHCI 和 MHCIIa 的情况下，表明存在 IIx 纤维。然后使用 MHCIIx 特异性抗体通过蛋白质印迹确认潜在的 IIx 纤维（参见本文中的图 5 和9 中的图 2）。6H1 抗体已被证明16 可检测大鼠骨骼肌中与 MHCIIx 相对应的电泳分离条带，并在小鼠、大鼠和人肌肉横截面中标记 IIx 型纤维2。
蛋白质印迹纤维类型确认
最佳做法是在同一块凝胶上运行来自同一活检的所有纤维类型特异性样品。对于MHCI抗体需要与MHCIIx相同的二抗，I型和IIx型样品应在给定凝胶上至少间隔一个泳道，如图5所示。由于纤维大小不同，不同纤维类型的样品的蛋白质含量会有所不同，因此应使用第一种凝胶来确定在后续凝胶电泳中需要上样的样品体积，以便在所有样品中获得相似量的蛋白质。为此，使用紫外活化凝胶成像技术测定给定样品中的总蛋白质，以在转移之前通过SDS-PAGE可视化凝胶中分离的所有蛋白质条带。每个样品中的总蛋白由凝胶图像测定，并用于校正下一次蛋白质印迹运行中的不相等上样，前提是将几种已知质量的骨骼肌组织校准曲线与纤维类型特异性样品一起运行3,4,6,17。也不需要使用肌动蛋白等“管家”蛋白质来测定总蛋白质，这也需要自己的校准曲线15。该技术是一种节省时间且准确的测定总蛋白的方法，可以使用非常少的样品（即 ~1/5纤维 9）进行，而无需额外的试剂或蛋白质标准品，同时最大限度地利用膜的所有部分来检测目标蛋白质。
在蛋白质印迹步骤中进行免疫标记时，由于与其他 MHC 亚型相比，MHCIIx 的丰度相对较低，因此首先应用 MHCIIx 抗体。一旦膜准备好进行 MHCI 抗体检测，它将经历两个剥离步骤（即 MHCIIx 和 MHCIIa 检测后）。因此，MHCI的检测应主要在I型样本中检测，从先前的MHC抗体中检测到的残留信号最少（图5）。蛋白质印迹法用于在同一膜部分使用所有三种 MHC 抗体来确认每种纤维类型特异性样品的纯度。然而，如果在不同的宿主物种（如兔子或山羊）中产生MHCI或MHCIIx抗体，则无需剥离。
应用
本文描述的方法可用于从新鲜或冻干骨骼肌中对单纤维片段进行纤维分型，以检查人体骨骼肌中纤维类型特异性蛋白的表达。此外，使用新鲜的肌肉样本，可以使用完整或机械皮肤的纤维6.使用带皮纤维可以进一步检查亚细胞区室中的蛋白质表达，例如胞质溶胶和膜区室中的蛋白质表达。该应用以前曾用于测量健康和糖尿病患者6 的机械皮肤纤维片段中结合与未结合的糖原量。重要的是，MyDoBID对于仅使用变性样品的实验是有益的，不适用于需要蛋白质处于天然状态的研究。虽然其他分析（如酶法测定或溶液内蛋白质组学方法）可以在天然条件下进行，但需要进一步优化，以便可以使用MyDoBID去除一部分纤维以进行MHC亚型鉴定。
总之，I型、II型和IIx型可以通过应用一种简单的技术来成功识别，该技术通常用于蛋白质印迹的现成耗材。我们提供广泛的实用信息，在成功完成后，将生产出具有最佳质量、完整性和可靠性的纤维类型特定样品，供未来的研究使用。该技术是进行纤维特异性骨骼肌生化分析的实用和首选方法。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
本研究中使用的抗 MHC I （A4.840） 和 MHCIIa （A4.74） 的抗体由 HM Blau 博士开发，抗 MHCIIx （6H1） 的抗体由 CA Lucas 博士开发，并从发育研究杂交瘤库 （DSHB） 获得，感谢国家儿童健康与人类发展研究所的主持，并由爱荷华大学维护， 生物科学系（爱荷华州爱荷华市）。我们感谢 Victoria L. Wyckelsma 为这项研究提供人体肌肉样本。图 1 中的大多数图像来自 BioRender.com。
资金：
这项研究没有得到任何外部资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
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