Summary
Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.
Abstract
Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, um spezifische Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) in Segmenten einzelner Muskelfasern unter Verwendung von Dot-Blotting zu identifizieren, im Folgenden als My-Osin-Schwerketten-Detektion durch Do-t-B-Lotting zur Identifizierungdes Muskelfasertyps (MyDoBID) bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Gefriertrocknung der menschlichen Skelettmuskulatur und der Isolierung von Segmenten einzelner Muskelfasern. Mit MyDoBID werden Typ-I- und Typ-II-Fasern mit MHCI- bzw. IIa-spezifischen Antikörpern klassifiziert. Klassifizierte Fasern werden dann für jede Biopsie zu fasertypspezifischen Proben kombiniert.
Das Gesamtprotein in jeder Probe wird durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und UV-aktivierte Geltechnologie bestimmt. Der Fasertyp der Proben wird mittels Western Blot validiert. Es wird auch beschrieben, wie wichtig es ist, eine Normalisierung der Proteinbeladung durchzuführen, um die Detektion von Zielproteinen über mehrere Western Blots hinweg zu verbessern. Zu den Vorteilen der Konsolidierung klassifizierter Fasern in fasertypspezifischen Proben im Vergleich zu Western Blots mit einer Faser gehören die Vielseitigkeit der Proben, der erhöhte Probendurchsatz, die kürzere Zeitinvestition und die Kosteneinsparungsmaßnahmen, während wertvolle fasertypspezifische Informationen erhalten bleiben, die bei homogenisierten Muskelproben häufig übersehen werden. Der Zweck des Protokolls besteht darin, eine genaue und effiziente Identifizierung von Typ-I- und Typ-II-Fasern zu erreichen, die aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben isoliert wurden.
Diese einzelnen Fasern werden anschließend zu typ- und typ-II-fasertypspezifischen Proben kombiniert. Darüber hinaus wird das Protokoll um die Identifizierung von Typ-IIx-Fasern erweitert, wobei Aktin als Marker für Fasern verwendet wird, die negativ für MHCI und MHCIIa waren, die durch Western Blot als IIx-Fasern bestätigt werden. Jede fasertypspezifische Probe wird dann verwendet, um die Expression verschiedener Zielproteine mit Hilfe von Western-Blotting-Techniken zu quantifizieren.
Introduction
Der Skelettmuskel ist ein heterogenes Gewebe mit ausgeprägten zellulären metabolischen und kontraktilen Eigenschaften, die davon abhängen, ob die Zelle (Faser) langsam zuckt (Typ I) oder schnell zuckt (Typ II). Der Fasertyp kann durch die Untersuchung der Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) identifiziert werden, die sich in mehrfacher Hinsicht voneinander unterscheiden, einschließlich Kontraktionszeit, Verkürzungsgeschwindigkeit und Ermüdungsbeständigkeit1. Zu den wichtigsten MHC-Isoformen gehören Typ I, Typ IIa, Typ IIb und Typ IIx, und ihre metabolischen Profile sind entweder oxidativ (Typ I und IIa) oder glykolytisch (IIx, IIb)1. Der Anteil dieser Fasertypen variiert je nach Muskeltyp und zwischen den Arten. Typ IIb kommt häufig im Nagetiermuskel vor. Menschliche Muskeln enthalten keine Typ-IIb-Fasern und bestehen überwiegend aus MHC-Isoformen der Typ-I- und IIa-Fasern, mit einem geringen Anteil an IIx-Fasern2. Die Proteinexpressionsprofile variieren zwischen verschiedenen Fasertypen und können sich mit dem Alter3, der körperlichen Betätigung 4,5 und der Krankheit6 verändern.
Die Messung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Skelettmuskelfasertypen wird aufgrund der Untersuchung von Muskelhomogenaten (eine Mischung aus allen Fasertypen) oft übersehen oder ist nicht möglich. Der Western Blot mit einer Faser ermöglicht die Untersuchung mehrerer Proteine in einzelnen Muskelfasern7. Diese Methodik wurde zuvor verwendet, um neuartige und informative Einzelfasereigenschaften herzustellen, die mit Homogenatpräparaten nicht erreicht werden konnten. Es gibt jedoch einige Einschränkungen der ursprünglichen Einzelfaser-Western-Blot-Methode, einschließlich der zeitaufwändigen Natur, der Unfähigkeit, Probenreplikate zu erstellen, und der Verwendung teurer, empfindlicher Reagenzien für die verbesserte Chemilumineszenz (ECL). Wenn frisches Gewebe verwendet wird, ist diese Methode aufgrund der zeitlichen Beschränkungen, einzelne Fasern innerhalb eines begrenzten Zeitrahmens (d. h. 1-2 Stunden) zu isolieren, weiter eingeschränkt. Glücklicherweise wird diese Einschränkung durch die Isolierung von Einzelfasersegmenten aus gefriergetrocknetem Gewebe gemildert8. Die Fasergewinnung aus gefriergetrockneten Proben ist jedoch durch die Größe und Qualität des biopsierten Gewebes begrenzt.
Die Identifizierung von Fasertypen mit der Dot-Blotting-Methode9 wurde in diesem umfassenden Protokoll erheblich ausgearbeitet und erweitert. Zuvor wurde gezeigt, dass bereits ~2-10 mg nasses Muskelgewebe für die Gefriertrocknung und die Analyse von MHC-Isoformproteinen aus einer Faser ausreichen9. Christensen et al.9 verwendeten 30% eines ~1 mm großen Fasersegments, um die MHC-Isoform durch Dot Blot zu detektieren, was durch Western Blot bestätigt wurde. Diese Arbeit zeigte, dass durch die Substitution von Western Blotting durch Dot Blot die Gesamtkosten um ~40-fach gesenkt wurden (für 50 Fasersegmente). Die Fasern wurden dann in Typ-I- und Typ-II-Proben "gepoolt", was eine experimentelle Replikation ermöglichte9. Eine Einschränkung bestand jedoch darin, dass nur zwei fasertypspezifische Proben gewonnen wurden: Typ I (MHCI-positiv) und Typ II (MHCII-positive Fasern), wobei Typ-II-Proben eine Mischung aus MHCIIa und MHCIIx 6,10 enthielten. Insbesondere zeigt das aktuelle Protokoll, wie reine Typ-IIx-Fasern identifiziert werden können, und bietet einen sehr detaillierten Arbeitsablauf (zusammengefasst in Abbildung 1), einschließlich Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menschliche Muskelproben wurden aus dem Vastus lateralis von n = 3 (2 Männer, 1 Frau) im Alter von 70-74 Jahren unter sterilen Bedingungen unter örtlicher Betäubung (Xylocain) und einer für die manuelle Absaugung modifizierten Bergstrom-Nadel gewonnen11,12. Bei den Proben handelte es sich um eine Teilmenge einer früheren Studie, die vom Ethikkomitee für Humanforschung der Universität Victoria genehmigt wurde (HRETH11/221) und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki13 durchgeführt wurde. Die Teilnehmer gaben eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Teilnahme an dieser Studie. Ausführliche Informationen zu allen Materialien, die für dieses Protokoll benötigt werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Darüber hinaus finden Sie in Tabelle 1 eine Liste von Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen.
1. Gefriertrocknung
- Während Sie die biopsierten Muskelproben auf Trockeneis eingefroren halten, wiegen und tarieren Sie ein leeres, gefrorenes Röhrchen auf der Waage.
- Wiegen Sie schnell mindestens 10 mg nasses gefrorenes Gewebe. Notieren Sie das Gewicht auf eine Dezimalstelle genau.
- Geben Sie das Gewebe in das vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen, in das 3-4 Löcher in den Deckel gestochen wurden, und legen Sie es in ein kleines Becherglas mit 2-3 Pellets Trockeneis.
- Beachten Sie die Bedienungsanleitung des Gefriertrocknerherstellers.
- Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gefriertrockner geschlossen sind, und schalten Sie den Gefriertrockner ein.
- Verwenden Sie das Bedienfeld, um zu überprüfen, ob der Vakuum-Sollwert für optimale Gefriertrocknungsbedingungen für menschliches Gewebe programmiert ist, 0,12 Millibar (mBar) (Abbildung 2).
- Drücken Sie am Gefriertrockner manuell und warten Sie, bis die Kammer auf −40 °C abgekühlt ist.
- Sobald die Kammer diese Temperatur erreicht hat, entfernen Sie den Deckel, dann die Glaskammer und stellen Sie das Becherglas (mit der Muskelprobe) auf die Metallbühne.
- Setzen Sie die Glaskammer und den Deckel wieder auf. Schließen Sie das Vakuumventil am Deckel und warten Sie, bis die Vakuumwaage grün leuchtet, um sicherzustellen, dass der Trockner vakuumversiegelt ist.
- Gefriertrocknen Sie die Muskelproben für 48 Stunden. Sobald die Gefriertrocknung abgeschlossen ist, schalten Sie die Vakuumpumpe aus, indem Sie den Vakuumknopf drücken, und öffnen Sie das Vakuumablassventil am Deckel.
- Nehmen Sie den Deckel der Kammer ab und sammeln Sie die gefriergetrocknete Probe. Wiegen Sie das Gewebe und notieren Sie das Gewicht auf eine Dezimalstelle genau.
- Berechnen Sie den prozentualen Gewichtsverlust; ~75% Gewichtsabnahme deutet darauf hin, dass das Gewebe erfolgreich gefriergetrocknet wurde (in dieser Arbeit Mittelwert ± SD, 76 ± 9%, n = 11 Muskelproben).
- Drücken Sie AUTO, um die Vakuumpumpe und den Gefrierschrank auszuschalten. Lassen Sie das Gerät Umgebungstemperatur erreichen.
- Reinigen Sie die Kühlschlangen gemäß den Anweisungen des Herstellers und lassen Sie die angesammelte Flüssigkeit aus dem Kollektor ab.
HINWEIS: Die Fasersammlung kann sofort beginnen. Wenn kein Gewebe zur Faserisolierung verwendet wird, bewahren Sie die gefriergetrocknete Probe bei -80 °C in einem verschlossenen Behälter mit Exsikkatorperlen auf. VORSICHT: Trockeneis ist gefährlich (Klasse 9); Beziehen Sie sich auf das Sicherheitsdatenblatt für die empfohlene sichere Handhabung.
2. Sammlung von Fasern
- Vorbereitung der Fasersammlung
- Beschriften Sie mindestens 50 Mikrofugenröhrchen (Faser 1 bis 50) und pipettieren Sie 10 μl Denaturierungspuffer in jedes Röhrchen.
- Bereiten Sie den Entnahmebereich mit zwei Paar Feingewebepräparierzangen, fusselfreiem Gewebe, einer Tischlampe, einem Stereomikroskop (mit dem schwarzen Tisch nach oben), einem Wirbel und einer Tischzentrifuge vor.
- Legen Sie die gefriergetrocknete Muskelprobe auf einen Petrischalendeckel. Legen Sie den Deckel auf den Tisch des Präpariermikroskops.
- Sehen Sie sich das Video der Einzelfaserdissektion an. Üben Sie das vollständige Protokoll von der Faserentnahme bis zur Identifizierung des Einzelfasertyps mindestens zweimal, bevor Sie mit einer Studie beginnen.
- Berechnen Sie vor der Faserentnahme das Gesamtvolumen, das für eine Faserprobe aus jeder Biopsie erforderlich ist , wie folgt. Wenn z. B. das Ausgangsvolumen von 1 Faser = 10 μl und das nach MyDoBID verbleibende Volumen (1 Faser × 10 μl) - 1 μl für das Dot Blotting = 9 μl (Probenvolumen) beträgt, berechnen Sie das erforderliche Gesamtprobenvolumen , indem Sie das Probenvolumen (μl) mit der Gesamtzahl der Western Blots multiplizieren, die ausgeführt werden, und verdoppeln Sie diese Menge, um Redundanz zu berücksichtigen: (9 μl × 4 Western Blots) × 2 = 72 μl. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Fasern pro typisierter Probe, indem Sie das endgültige erforderliche Probenvolumen (μl) durch das Probenvolumen pro fasertypspezifischer Probe dividieren (z. B. 72 μl ÷ 9 μl = 8 Fasern pro fasertypspezifischer Probe). Um dies zu erreichen, sammeln Sie insgesamt 50 Fasern.
HINWEIS: Das erforderliche Probenvolumen ist die minimale Proteinkonzentration, die erforderlich ist, um sowohl MyDoBID als auch Western Blot durchzuführen, wenn die Menge des geladenen Proteins einer ~3 mm Faser (~12 μg Nassgewicht) für jede Probe entspricht (siehe Zusatzdatei 1 für Details). Dieses Volumen berücksichtigt jedoch nicht, ob für ein bestimmtes Protein Wiederholungsgele erforderlich sind. VORSICHT: Pinzetten sind scharf; Behandeln Sie sie mit Vorsicht, um das Risiko einer Hautdurchstichung zu vermeiden.
- Einzelfaser-Isolierung
- Zeichnen Sie auf einem kleinen Blatt Papier 5 cm x 1 cm mit einem Lineal eine 1 cm lange Linie. Markieren Sie alle 1 mm auf dieser Linie.
- Führen Sie diese unter den Petrischalendeckel ein, um die Länge der gesammelten Fasern abzuschätzen.
- Die gefriergetrocknete Muskelprobe wird bei geringer Vergrößerung (x 7,5) unter das Stereomikroskop gelegt. Verwenden Sie eine Feingewebezange, um den gefriergetrockneten Muskel an Ort und Stelle zu halten, und beginnen Sie mit der anderen, kleine Faserbündel zu trennen (wie im Video zu sehen).
- Isolieren Sie ein Bündel von Fasern und ziehen Sie es weiter auseinander, bis einzelne Fasersegmente aus dem Bündel isoliert sind.
- Sammle mindestens 50 Fasern, die mindestens ~1 mm lang sind.
- Bewegen Sie die Faser an eine leere Stelle in der Petrischale. Prüfen Sie Einzelfasersegmente unter höherer Vergrößerung (x 50). Stellen Sie sicher, dass es sich um eine einzelne Faser handelt, indem Sie die Faser am Ende weiter trennen. Wenn die Faser bricht, anstatt sich zu trennen, handelt es sich um eine einzelne Faser.
- Denaturierung von Fasern
- Sammeln Sie die Faser vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie sie direkt in den aliquotierten Denaturierungspuffer (lassen Sie die Pinzette nicht auf den Puffer treffen).
- Überprüfe die Pinzette unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Faser erfolgreich entfernt wurde. Schließen Sie den Schlauch und klopfen Sie dreimal fest auf den Boden des Schlauchs, um sicherzustellen, dass sich die Faser in den Puffer bewegt.
- Wischen Sie die Pinzette mit fusselfreiem Tuch sauber, bevor Sie zur nächsten Faser übergehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Fasern gesammelt sind.
- Die Faserproben vortexen und 5 s bei 2.500 × g kurz zentrifugieren, um die Probe auf den Boden des Röhrchens zu ziehen.
HINWEIS: Die Zentrifugationsdauer (5 s) ist vom Start (0 × g) bis zum Erreichen der Drehzahl von ~2.500 × g getaktet. - Lassen Sie die Proben 1 h bei Raumtemperatur. Für die spätere Verwendung bei -80 °C lagern. Frieren Sie die Proben ein und tauen Sie sie dann vor der Verwendung wieder auf.
3. Punkt-Blotting
- Membranpräparation und -aktivierung
- Messen, beschriften und schneiden Sie eine Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) (0,2 μm Porengröße) auf 50 Proben (~10,5 cm x 5,5 cm) zu.
- Markieren Sie den linken Rand numerisch von oben nach unten (1 bis 10) und den oberen Rand alphabetisch von links nach rechts (A bis E) im Abstand von 1 cm.
- Bereiten Sie vier Blatt Filterpapier mit den Maßen 12,5 cm x 7,5 cm vor.
- Stapeln Sie zwei Blätter zu einem Stapel zusammen. Weichen Sie den Filterpapierstapel in 1x Transferpuffer ein.
- Legen Sie die Membran in einen Behälter. Gießen Sie 95%iges Ethanol über die Membran, mit genügend Volumen, um die Membran vollständig einzutauchen (10-15 ml). 1 Min. auf der Wippe rühren.
- Sammeln Sie das Ethanol, tauchen Sie die Membran in 1x Transferpuffer (~15 ml) und rocken Sie es weitere 2 Minuten lang.
HINWEIS: Sowohl Ethanol als auch Transferpuffer können für zukünftige Dot-Blotting-Experimente wiederverwendet werden, bis sich Sedimentation bildet (Wechsel nach sechs Anwendungen). - Legen Sie den mit Transferpuffer getränkten Filterpapierstapel auf eine flache, bewegliche Fläche, z. B. einen großen Deckel, und drücken Sie ihn mit der Walze flach. Positionieren Sie die PVDF-Membran mit einem Gelablöser oder einer Pinzette auf dem Stapel.
- Legen Sie ein einzelnes Blatt trockenes Filterpapier auf die Membran und bewegen Sie die Walze über das Filterpapier, um überschüssigen Puffer auf der Membranoberfläche aufzusaugen. Entfernen Sie das obere Filterpapier, ohne die Membran zu reiben.
VORSICHT: Methanol (Klasse 3, Unterrisiko 6.1) und Ethanol (Klasse 3) sind gefährlich. Im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) finden Sie Empfehlungen zur sicheren Handhabung.
- Probenaufnahme an die Membran
- Die Faserproben werden aufgetaut, eine kurze Zentrifuge (5 s) bei Raumtemperatur wie in Schritt 2.3.4 durchgeführt und die Probe gründlich gemischt.
- Ohne die Membran mit der Pipettenspitze zu berühren, geben Sie langsam einen ~1 μl Tropfen jeder Probe auf die Membran im dafür vorgesehenen Bereich. Die Abmessungen des ausgewiesenen Bereichs pro Faserprobe betragen ~1 cm x 1 cm. Versuchen Sie, die Probe in der Mitte dieses Bereichs zu erkennen.
- Lassen Sie die Probentröpfchen mindestens 15 Minuten lang durch die Membran einweichen. Stellen Sie sicher, dass kein Probenpuffer zurückbleibt und vollständig absorbiert wird.
- Heben Sie die Membran mit einer Plastikpinzette vorsichtig vom feuchten Filterpapierstapel ab, legen Sie sie auf ein einzelnes trockenes Blatt Filterpapier und dehydrieren Sie die Membran mindestens 5 Minuten lang.
- Sobald die Probenflecken vollständig weiß geworden sind, reaktivieren Sie die Membran.
- Reaktivierung und Blockierung der Membran
- Die Membran wird durch Wiederholung der Schritte 3.1.5 und 3.1.6 reaktiviert.
- Legen Sie die Membran in Waschpuffer und spülen Sie sie 5 Minuten lang mit Schaukeln. Entsorgen Sie den Waschpuffer.
- Inkubieren Sie die Membran 30 Minuten lang im Blockierungspuffer, während Sie schaukeln.
- Spülen Sie die Membran 3x mit Waschpuffer aus, bis der Puffer nicht mehr trüb ist.
- Lassen Sie die Membran in der letzten Wäsche auf der Wippe.
4. Immunmarkierung
- Nachweis von MHCIIa
- Verdünnen Sie den MHCIIa-Primärantikörper mit 1:200 in 10 ml BSA-Puffer (Rinderserumalbumin).
- Verwerfen Sie den Waschpuffer von der Membran und gießen Sie dann den verdünnten MHCIIa-Antikörper auf die Membran.
- Stellen Sie den Behälter (mit der Membran in MHCIIa) bei Raumtemperatur für 2 h oder über Nacht bei 4 °C auf die Wippe.
- Sammeln Sie den MHCIIa-Antikörper und lagern Sie ihn bei 4 °C. Waschen Sie die Membran mit Blockierpuffer 2 Minuten lang auf der Wippe.
HINWEIS: Alle Primärantikörper können bis zu fünfmal wiederverwendet werden, solange der Puffer frei bleibt. - Noch zweimal ausspülen; 5 min jedes Mal; Insgesamt drei Wäschen.
- Sekundärer Maus-Immunglobulin-G-Meerrettichperoxidase (IgG-HRP)-Sekundärantikörper bei 1 zu 20.000 in 10 ml Blockierungspuffer verdünnen und der Membran hinzufügen.
- Verwerfen Sie den Waschpuffer und inkubieren Sie die Membran in Maus-IgG-HRP-sekundär mit Schaukeln für 1 h.
- Entsorgen Sie das Sekundär und waschen Sie die Membran im Waschpuffer (2, 5, 5 min).
- Lassen Sie die Membran in der letzten Wäsche einweichen, bis sie für die Bildgebung bereit ist.
- Schalten Sie den Gel-Imager ein, warten Sie 15 Minuten, bis der Imager die erforderliche Betriebstemperatur erreicht hat, und öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle).
- Klicken Sie im Softwarefenster auf Neues Single-Channel-Protokoll (Abbildung 3A). Für ein Weißlichtbild der Membran finden Sie unter Anwendungen | Kleckse | Klicken Sie auf Kolorimetrisch (Abbildung 3B).
- Klicken Sie auf den Gelbereich; Jede Option ist für bestimmte Abmessungen programmiert, um der Größe verschiedener Geltypen gerecht zu werden. Wählen Sie die entsprechende Option aus, die am besten zu den Abmessungen der Membran passt (Abbildung 3C).
- Bereiten Sie die ECL vor, indem Sie Luminol- und Peroxidase-Reagenzien im Verhältnis 1:1 kombinieren. Stellen Sie ein ausreichendes Volumen der ECL-Mischung her, um die gesamte Membran zu bedecken, in der Regel ist ein Gesamtvolumen von 800-1.000 μl erforderlich.
- Legen Sie die Membran auf eine große, durchsichtige Kunststoffschale und verteilen Sie die ECL-Mischung auf der Membran.
- Legen Sie die Membran auf die Speicherfolie.
- Klicken Sie auf Position Gel (gelbe Schaltfläche), um eine Live-Kameraansicht zu erhalten. Halten Sie die Zoom-Taste gedrückt und ziehen Sie sie, um den Abbildungsbereich der Membran zu maximieren. Begradigen Sie an dieser Stelle bei Bedarf die Position der Membran.
- Klicken Sie auf Protokoll ausführen (grüne Schaltfläche) und warten Sie, bis ein farbmetrisches Bild der Membran erstellt wurde. Speichern Sie dieses Bild, um die Zuordnung der Punkte zur entsprechenden Faserprobe zu erleichtern.
- Ohne die Membran zu bewegen, ändern Sie die Anwendung in der Software, indem Sie auf die Option für ein 2 x 2-Binning (Chemi High Resolution) klicken (Abbildung 3D).
- Optimieren Sie unter Bildbelichtung und Software die Belichtungszeit, klicken Sie auf Schwache Bänder (Abbildung 3E) | Signal-Akkumulations-Modus.
- Geben Sie unter Setup 1 s für das erste Bild, 30 s für das letzte Bild und insgesamt 30 Bilder ein (Abbildung 3F).
- Klicken Sie auf Protokoll ausführen.
- Speichern Sie ein Bild in den folgenden Phasen: vor der Signalsättigung (alle sichtbaren Punkte sind schwarz), der anfänglichen Signalsättigung (einige Punkte beginnen zu sättigen) und übersättigten Stellen (alle Stellen mit starkem Signal sind gesättigt).
- Speichern Sie alle erforderlichen Bilder, bevor Sie die Signalakkumulation beenden. Nehmen Sie die Membran aus dem Imager.
- Legen Sie die Membran mit dem Gelablöser zurück in den Behälter mit dem Waschpuffer.
- Nachweis von MHCI
- Gießen Sie den Waschpuffer aus und behandeln Sie die Membran 30 Minuten lang bei 37 °C mit Stripping-Puffer (stellen Sie sicher, dass die Membran vollständig eingetaucht ist).
- Ziehen Sie den Stripping-Puffer zurück und spülen Sie die Membran 5 Minuten lang mit Schaukeln im Waschpuffer.
HINWEIS: Der Stripping-Puffer kann 10x wiederverwendet werden, bevor er entsorgt wird. - Gießen Sie den Waschpuffer aus und tragen Sie diesmal MHCI-Primärantikörper in einer Anfangskonzentration von 1 zu 200 (Bereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500) auf. Die Membran 1 h bei Raumtemperatur rocken.
- Nach der Inkubation im MHCI-Primärantikörper wird der Antikörper entnommen und die Membran wie in den Schritten 4.1.4 und 4.1.5 gewaschen.
- Verdünnen Sie den Maus-IgM-HRP-Sekundärantikörper im Blockierungspuffer bei 1 zu 20.000. Gießen Sie den Blockierungspuffer aus der Membran und inkubieren Sie das Maus-IgM-Sekundär wie in Schritt 4.1.7.
- Wash und Bilderfassung erkannten MHCI wie in den Schritten 4.1.8 bis 4.1.24.
VORSICHT: Der Stripping-Puffer enthält Organophosphin 3-5% (Klasse 8). In den Sicherheitsdatenblättern finden Sie Empfehlungen für die sichere Handhabung.
- Nachweis von potentiellem MHCIIx mittels Actin
- Die Membran wird erneut abgezogen (Schritte 4.2.1 und 4.2.2).
- Wiederholen Sie Abschnitt 4.1 und wenden Sie diesmal den Primärantikörper Actin an, der mit 1 zu 500 im BSA-Puffer verdünnt ist, und dann den Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper, der mit 1 zu 20.000 im Blockierungspuffer verdünnt ist.
5. Identifizierung des Fasertyps
- MHCI-, MHCIIa- und Aktin-Signalanalyse
- Machen Sie sich mit dem Signalintensitätsfeld vertraut (Abbildung 4A). Notieren Sie sich die Schritte 5.1.2 bis 5.1.4.
- Eine gesättigte Signalintensität zeigt qualitativ an, dass die Proteindetektion stark ist.
- Ein moderater Wert zeigt an, dass das Zielprotein auf einem mittleren Niveau vorhanden ist.
- Ein schwaches Signal zeigt an, dass nur wenig Zielprotein vorhanden ist.
- Verwenden Sie das Signalintensitätsfeld, um Fasern mit "gesättigter", "mäßiger" oder "schwacher" Signalintensität zu kategorisieren (Abbildung 4A).
- Führen Sie die Identifizierung des Fasertyps durch, indem Sie zuerst die MHCIIa- und MHCI-Ergebnisse vergleichen (Abbildung 4B, linke und mittlere Blots).
- Zeichnen Sie Fasern mit gesättigter oder mittlerer Signalintensität von nur einer MHC-Isoform auf.
- Wenn das MHC-Isoformsignal "schwach" ist, lassen Sie die Faser unmarkiert (siehe Abbildung 4B).
- Wenn schließlich Aktin (moderate oder gesättigte Signalintensität) in den Fasern beobachtet wird, ohne dass MHCI oder IIa nachgewiesen wurde, wird es als potenzielle Typ-IIx-Faser aufgezeichnet (Abbildung 4B, rechter Blot).
- Aufzeichnung von Fasern mit schwachem MHC-Isoformsignal, aber Aktin (moderate oder gesättigte Intensität) als nicht identifiziert.
- Verwerfen Sie Proben mit schwachem oder keinem Nachweis (keine Faser gesammelt) für alle drei Zielproteine (Abbildung 4C).
- Zeichnen Sie jede Faser auf, bei der sowohl MHCI- als auch MHCII-Signale mit einem "gesättigten" oder moderaten Signal erkannt werden. Diese Proben sind nicht für die Verwendung in fasertypspezifischen Präparaten bestimmt.
- Aufbereitung von fasertypspezifischen Proben
- Bereiten Sie für jede Biopsie eine separate Typ-I- und Typ-II-Probe vor. Für eine Typ-II-Probe ist die erforderliche Mindestanzahl von Fasern (berechnet in Schritt 2.1.5) zu kombinieren, in der MHCIIa in gesättigten oder moderaten Mengen nachgewiesen wird.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang in einem separaten Röhrchen, das als Typ I gekennzeichnet ist, für Fasern, in denen MHCI nachgewiesen wird (Abbildung 4D).
- Verwenden Sie Fasern mit moderater Signalintensität, wenn nicht genügend Fasern mit gesättigten Signalen vorhanden sind.
- Kombinieren Sie alle potentiellen IIx-Fasern.
- Verwenden Sie sofort fasertypspezifische Proben für das Western Blot oder lagern Sie sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
6. Bestätigung des Western-Blot-Fasertyps
- Verwenden Sie 10 μl jeder fasertypspezifischen Probe (das erforderliche Mindestprobenvolumen, siehe Schritt 2.1.5).
- Trennen Sie die Proben mit dem angegebenen Fertiggel über SDS-PAGE gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Verwenden Sie einen Gel-Imager, um das Protein im Gel gemäß dem Protokoll des Herstellers nachzuweisen.
- Geben Sie das Gel für 10 Minuten in einen kalten 1x Transferpuffer.
- Die Proteine werden gemäß dem Protokoll des Herstellers nass auf eine 0,45 μm große Nitrozellulosemembran (9,5 cm x 13,5 cm) übertragen.
- Nach dem Transfer die Membran kurz mit hochreinemH2Oin einem Behälter abspülen. Gießen Sie das Reinstwasser aus.
- Geben Sie 10 ml der Antikörper-Signalverstärkungslösung zur Membran und zum Gestein bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Nehmen Sie die Antikörper-Signalverstärkungslösung auf und waschen Sie sie 5x (5 s pro Waschgang) mit hochreinemH2O.
HINWEIS: Die Lösung zur Verbesserung des Antikörpersignals kann 5x verwendet werden, bevor sie verworfen wird. - Gießen Sie die letzte Wäsche aus, fügen Sie Blockierlösung hinzu und rocken Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie ein sauberes Skalpell, eine Klinge oder eine Schere, um horizontal mit einem Molekulargewicht über die Membran zu schneiden, das sicherstellt, dass sich Proteine mit einer Größe von 180 kDa und mehr auf dem oberen Abschnitt der Membran befinden.
- Verwenden Sie diesen oberen Abschnitt zur weiteren Bestätigung des Fasertyps.
- Verwenden Sie den Anteil unter 180 kDa, um verschiedene Zielproteine zu detektieren.
- Auf dem oberen Abschnitt der Membran folgen Sie Abschnitt 4.1 mit dem primären MHCIIx- und dem Maus-Immunglobulin M (IgM) HRP-Sekundärantikörper.
- Die Membran wird abgezogen (wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 beschrieben), bevor der Vorgang mit dem primären MHCIIa-IgG-Antikörper und dem Maus-IgG-HRP-Sekundärantikörper wiederholt wird.
- Streifen Sie noch einmal ab und tragen Sie schließlich den primären MHCI-IgM- und den Maus-IgM-HRP-Sekundärantikörper auf.
HINWEIS: Dieser Schritt ist qualitativ und daher ist ein Proteinverlust aufgrund des Membranstrippings kein Problem. - Vergleichen Sie das Signal, das in den verschiedenen MHC-Isoformen detektiert wurde (wie in Abbildung 5B dargestellt). Wenn die Signalintensität in der erwarteten Probe (MHCI - Typ I, MHCIIa - Typ II und MHCIIx - Typ IIx) bei moderaten bis gesättigten Werten nachgewiesen wird, werden die fasertypspezifischen Proben als zuverlässig für die Verwendung in zukünftigen Studien aufgezeichnet.
- Zeichnen Sie die Probe als unzuverlässig auf, wenn mehr als eine MHC-Isoform gleichzeitig in einer Probe nachgewiesen wird.
ACHTUNG: Antikörper-Enhancer-Lösung enthält 50% Natriumhydroxid. In den Sicherheitsdatenblättern finden Sie Empfehlungen zur sicheren Handhabung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifizierung einzelner MHCI-, MHCIIa- und MHCIIx-Muskelfasern mittels Dot Blot
Ein Merkmal von MyDoBID ist die Kategorisierung der variierenden MHC- und Aktin-Signalintensitätsstärke in einer bestimmten Faser (Abbildung 4A). Der Fasertyp wurde durch das Vorhandensein oder Fehlen von MHCI- und IIa-Isoformen identifiziert (Abbildung 4B). Sechs Fasern zeigten keine MHC- oder Aktin-Detektion, was darauf hindeutet, dass keine Faser gesammelt wurde. Die Ergebnisse dieses spezifischen Dot-Blots waren die Identifizierung von 22 Typ-II-Fasern, 7 Typ-I-Fasern und 3 potenziellen Typ-IIx-Fasern; 2 nicht identifizierte Proben und 6 Proben wurden als "No Fiber" klassifiziert (Abbildung 4B, C). Fasern, die kein nachweisbares MHCI- oder MHCIIa-Signal aufwiesen, aber positiv für Actin waren, wurden durch einen Eliminierungsprozess als potenzielle Typ-IIx-Fasern identifiziert. Unter Verwendung des Signalintensitätspanels zur Klassifizierung der MHCI- und IIa-Signalstärke wurden "mäßige" oder "gesättigte" Fasern kombiniert, um Proben vom Typ I bzw. II zu erzeugen. Fasern, die nicht identifiziert wurden oder bei denen schwaches oder gar kein Aktin nachgewiesen wurde, wurden nicht in die nachfolgende Analyse einbezogen und verworfen (Abbildung 4D).
Bestätigung der Fasertypisierung mit Western Blot
Die fasertypspezifischen Proben wurden mittels Western Blot und MHC-spezifischen Antikörpern validiert (Abbildung 5). Typ-I- und Typ-II-Faserproben aus einer einzelnen Biopsie wurden zusammen mit einer Typ-IIx-Probe durchgeführt, bei der es sich aufgrund der geringen Anzahl von Typ-IIx-Fasern in jeder Biopsie um eine Probe potenzieller Typ-IIx-Fasern von zwei Individuen handelte. Western-Blot-Daten bestätigten, dass die Identifizierung des Fasertyps erfolgreich war.
Abbildung 1: Zusammenfassung des Arbeitsablaufs, in der die Probenvorbereitung, die Fasertypisierung und die Western-Blot-Bestätigung der Faserspezifität beschrieben sind . (A) Menschliches Gewebe wird 48 Stunden lang gefriergetrocknet. (B,C) Einzelne Fasersegmente werden unter einem Präpariermikroskop isoliert. (D) Die Fasern werden denaturiert und (E) nach 1 h bei -80 °C gelagert. (F) Reihenfolge der Inkubation der primären Antikörper. (G) Die Fasern wurden mit einem Punkt-Blot versehen und der Fasertyp mit MHCIIa (Typ II), MHCI (Typ I) und Aktin (IIx?, potenzielle Typ IIx-Faser) identifiziert. (H) Die Fasern wurden dann gepoolt. (I) Fasertypspezifische Proben werden zusammen mit einer Kalibrierungskurve mittels SDS, PAGE und Western Blot analysiert. (J) Validierung der Identifizierung von Fasertypen mittels Western Blotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bildschirm und Bedienfeld der Gefriertrocknungsanlage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Imager-Einstellungen für die Weißlichterfassung der Membran mit anschließender chemilumineszierender Detektion von Zielproteinen. Um die Membran unter weißem Licht abzubilden, wählen Sie (A) Neuer Einzelkanal gefolgt von (B) Blots | kolorimetrische Anwendung. (C) Wählen Sie basierend auf der Größe des verwendeten Gels den entsprechenden Bildgebungsbereich aus und nehmen Sie dann ein Weißlichtbild auf, indem Sie auf Protokoll ausführen drücken. (D) Wiederholen Sie Schritt B , ohne die Membran zu bewegen, aber diesmal mit Blots | Chemi Hi Auflösung. Bevor Sie auf "Ausführen" drücken, wählen Sie (E) Bildbelichtung , um für schwache Bänder zu optimieren, und (F) richten Sie den Signalakkumulationsmodus ein und stellen Sie zunächst die Belichtungszeit für jede Sekunde für insgesamt 30 Sekunden ein, wobei gesättigte Pixel hervorgehoben werden. Drücken Sie auf Protokoll ausführen und warten Sie, bis die Ausführung abgeschlossen ist, bevor Sie die besten Bilder zum Speichern auswählen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Identifizierung des Fasertyps. (A) Die Fasertypen wurden relativ zu allen anderen Fasern auf der Membran identifiziert, kategorisiert durch das Signalintensitätspanel für jede detektierte MHC-Isoform (z. B. MHCI-Signal: Gesättigt, Mäßig und Schwach). (B) Unter Verwendung des Panels in (A) identifizierte der MHCIIa-Antikörper Typ-II-Fasern (blau, linker Blot), und nach dem Abstreifen der Membran identifizierte der MHCI-Antikörper Typ-I-Fasern (rot, mittlerer Blot). Aktin-Antikörper wurden verwendet, um potenzielle IIx-Fasern zu identifizieren, wenn ein positives Actin-Signal in Fasern nachgewiesen wurde, bei denen zuvor kein MHCI- oder IIa-Signal detektiert wurde (grün, rechter Blot). Fasern, die diesen Richtlinien nicht entsprachen, sind violett hervorgehoben (nicht identifiziert). Schließlich zeigten Proben, die negativ für das Aktin-Signal waren, an, dass keine Fasern gesammelt worden waren ("Keine Faser"). (C) Tabelle mit der Fasermarkierung entsprechend der Probenposition auf den in (B) gezeigten Punktflecken. (D) Skizze der Faserauswahl für die Vorbereitung fasertypspezifischer Proben. Ziel war es, für jeden Fasertyp 10 gesättigte Fasern zu sammeln. Hier wurden für Typ-II-Fasern acht gesättigte Fasern identifiziert und gepoolt. Bei Typ-I-Fasern waren weniger als 10 gesättigte Fasern vorhanden, so dass auch Fasern mit moderater Signalstärke ausgewählt wurden. Für Typ-IIx-Fasern wurden zwei Fasern identifiziert und gepoolt. Wenn weniger als 10 Fasern (gesättigt und mäßig) identifiziert werden, kann eine weitere Fasersammlung erforderlich sein. HINWEIS: Das in (B) gezeigte Aktinsignal hat die Sättigung nicht erreicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Western-Blot-Bestätigung der Identifizierung des Fasertyps. Die Identifizierung des Fasertyps wurde gemäß Abbildung 4 durchgeführt, um Proben des Typs I (~10 Fasern) und des Typs II (~10 Fasern) zu generieren. Da bei derselben Biopsie keine IIx-Fasern identifiziert wurden, wurde die hier gezeigte IIx-Probe aus mehr als einer Muskelprobe (n = 2 Personen) hergestellt. Ein kleines Aliquot jeder faserspezifischen Probe wird mittels Western Blot analysiert, um die Identifizierung des Fasertyps zu bestätigen. Auf der linken Seite sind Molekulargewichtsmarker (kDa) angedeutet, die unter weißem Licht aufgenommen wurden, ohne die Membran zu bewegen. Zielproteine werden in der Sequenz von MHCIIx, MHCIIa und MHCI detektiert, wobei das Myosin aus dem UV-aktivierten Gel die Menge des pro Probe geladenen Proteins visuell anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 1: Berechnung der gefriergetrockneten Fasermasse anhand einer Kalibrierkurve. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammlung von Fasern
Basierend auf mehrjähriger Erfahrung können die meisten Forscher diese Technik beherrschen; Die Praxis führt jedoch zu einer schnelleren und effizienteren Fasersammlung für nachgelagerte Analysen. Um 30 einzelne Fasersegmente einer Qualität für das Pooling isolieren zu können, wird empfohlen, 50 Fasersegmente pro Probe zu sammeln. Es wird empfohlen, das Video zur Fasersammlung sorgfältig und nach Durchführung von zwei Übungssitzungen (~50 Fasern pro Sitzung) zu studieren, um einen angemessenen Standard zu erreichen. Alle gesammelten Fasern werden MyDoBID unterzogen, um den Fasertyp zu identifizieren, der Aufschluss darüber gibt, wie effektiv die Technik durchgeführt wird. Dies würde als eine geringe Anzahl von "Keine Faser"- oder "schwachen" MHC-Signalen in Faserproben angesehen werden (siehe Protokollabschnitt 5.1).
Es ist bekannt, dass Muskeln Hybridfasern enthalten können, in denen sowohl MHCI als auch MHCIIa oder MHCIIa und IIx 2,14 vorhanden sind. Eine Einschränkung des MyDoBID besteht darin, dass das Vorhandensein einer Hybridfaser nicht festgestellt werden kann, da eine Probe, die sowohl für MHCI- als auch für MHCIIa-Antikörper positiv ist, entweder eine Hybridfaser sein kann oder dass zwei Fasern gesammelt wurden. Darüber hinaus kann MyDoBID MHCIIa nicht getrennt von MHCIIa/IIx-Hybriden nachweisen, da der MHCIIa-Primärantikörper das Vorhandensein von MHCIIa sowohl in IIa- als auch in IIa/IIx-Fasern nachweisen würde. Aus diesen Gründen wurde die Identifizierung und Vorbereitung von Proben von Hybridfasern nicht durchgeführt, und Proben, die sowohl MHCI- als auch MHCIIa-Signale enthielten, die außerhalb der im Signalintensitätspanel beschriebenen Bereiche lagen, wurden verworfen (Abbildung 4A). Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass der Anteil der Muskelfasertypen in einer Probe nicht mit MyDoBID bestimmt werden kann und die Anwendung konventioneller immunhistochemischer Analysen erforderlich ist, um die Verteilung der Fasertypen zu bestimmen2.
Dot Blotting
Das Signalintensitätspanel und die Fasertyp-ID beruhen darauf, dass die gesamte Probe in dem kleinen Volumen dargestellt wird, das auf die Dot-Blotting-Membran aufgetragen wird. Um dies zu erreichen, wird die Probe durch Rühren gründlich vermischt, bevor sie auf die Membran geladen wird. Alle Fasern mit nur einer MHC-Isoform gelangen zum nächsten Schritt des Poolings. In dieser Phase ist es wichtig, dass keine Faser mit mehr als einem MHC zu diesem nächsten Schritt der Kombination von Proben übergeht. Wenn eine Probe kontaminiert ist, muss die gesamte gepoolte Probe verworfen werden, und der Forscher muss zur Fasersammlung zurückkehren und die Schritte zur Faserisolierung und zum Dot-Blotting wiederholen.
Immunmarkierung
Zuvor wurde berichtet, dass 5 min eine angemessene Zeit ist, um unspezifische Stellen auf der Membran für den Nachweis von MHCI und MHCIIa9 zu blockieren. Um die Technik auf MyDoBID weiterzuentwickeln, muss ein Aktin-Antikörper verwendet werden. Es wurde festgestellt, dass die 5-minütige Blockzeit auf 30 Minuten erhöht werden musste, wie berichtet6, um eine Membran mit minimalem Hintergrund zu erhalten, da eine 5-minütige Blockierung zu einem dunkleren Membranhintergrund führte. Die Blockierungszeit ist bei jeder Immunnachweistechnik, wie z. B. Western Blot oder Immunhistochemie, eine Rolle und sollte entsprechend modifiziert werden.
Abisolieren der Membran
Das Stripping kann nicht für quantitative Analysen verwendet werden15 , da es auch Proteine von Interesse entfernt, kann aber in MyDoBID verwendet werden, da es sich um einen qualitativen Assay handelt. Der Zweck des Strippings besteht darin, die gebundenen Antikörper von der Oberfläche der Membran zu entfernen, so dass ein neuer Antikörper mit minimaler Beeinträchtigung durch den vorherigen Antikörper verwendet werden kann. In MyDoBID besteht die Möglichkeit, die Probe über zwei Membranen aufzubringen, wobei die verschiedenen MHC-Isoformen auf separaten Membranen nachgewiesen werden. Wenn dieser Ansatz bevorzugt wird, vermeiden Sie es, das Probenröhrchen mehr als einmal zu handhaben, indem Sie die Punkte gleichzeitig laden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Trocknungszeit zwischen den einzelnen Probenpunkten ähnlich ist (~5 s Unterschied) und die nachfolgenden Schritte gleichzeitig in separaten Behältern durchgeführt werden. Es muss beachtet werden, dass diese Option den Zeit-, Proben- und Verbrauchsmaterialverbrauch erhöhen würde.
Antikörper werden verwendet, um zuerst MHCIIa-Fasern nachzuweisen, gefolgt von MHCI, da der MHCI-Antikörper immer ein sehr helles Signal gibt, das schwieriger zu wäre als der MHCIIa. Aktin wird homogen in Skelettmuskelfasern exprimiert und wird verwendet, um zu bestätigen, dass ein Teil der Faser erfolgreich auf die Membran aufgebracht wurde, wie oben beschrieben.
Bildgebung, Identifizierung von Fasertypen und Präparation von fasertypspezifischen Proben
In diesem Protokoll wurde ein neues Werkzeug entwickelt, das bei der Identifizierung von Fasertypen und der Probenauswahl hilft, um fasertypspezifische Proben zu erstellen (Abbildung 4A). Das im Signalintensitätsbereich gezeigte Beispiel wird verwendet, um die MHCI-Signalintensität wie folgt zu definieren: (i) gesättigt, (ii) mäßig oder (iii) schwach. Für das Pooling von Fasern zu fasertypspezifischen Proben werden zuerst Fasern mit gesättigter Signalintensität ausgewählt und bei Bedarf Fasern mit moderater Signalintensität hinzugefügt. Bei der Vorbereitung von Typ-I- und Typ-II-Proben sind in der Regel genügend "gesättigte" und "mäßige" Fasern vorhanden, so dass Fasern, die als "schwach" oder nicht identifiziert eingestuft wurden, verworfen werden können.
Neuheit der Verwendung von Aktin anstelle von MHCIIx-Antikörpern zur Identifizierung reiner Typ-IIx-Fasern
Zuvor wurde zur Identifizierung reiner IIx-Fasern das MHCIIx-Signal subjektiv mit dem MHCI- und MHCIIa-Signal auf einem Punktfleck verglichen, und durch einen Eliminierungsprozess wurden die Fasern ohne MHCI- oder IIa-Signal, aber mit MHCIIx-Signal, als reines IIx identifiziert. Probleme können jedoch auftreten, wenn zwei Maus-IgM-Primärantikörper (MHCIIx und MHCI) auf derselben Membran verwendet werden. Trotz des Abstreifens der Membran zwischen den Primärantikörpern kann ein Restantikörpersignal nachgewiesen werden. Die Verwendung von Kaninchen-Anti-Aktin-Primärantikörpern verhindert das Auftreten dieses Problems. Hier haben wir Actin verwendet, um zu bestätigen, dass eine Faser gesammelt wurde, und in Abwesenheit von MHCI und MHCIIa zeigt dies an, dass eine IIx-Faser vorhanden war. Potentielle IIx-Fasern werden dann durch Western Blot mit dem MHCIIx-spezifischen Antikörper bestätigt (siehe Abbildung 5 in dieser Arbeit und Abbildung 2 in9). Es wurde gezeigt, dass der 6H1-Antikörper16 die elektrophoretisch getrennte Bande, die MHCIIx entspricht, im Skelettmuskel der Ratte nachweist und Typ-IIx-Fasern in Querschnitten von Maus-, Ratten- und menschlichen Muskeln markiert2.
Bestätigung des Western-Blot-Fasertyps
Es hat sich bewährt, alle fasertypspezifischen Proben aus derselben Biopsie auf demselben Gel laufen zu lassen. Da MHCI-Antikörper den gleichen Sekundärantikörper wie MHCIIx erfordern, sollten Typ-I- und IIx-Proben durch mindestens eine Spur auf einem bestimmten Gel getrennt werden, wie in Abbildung 5 dargestellt. Da der Proteingehalt aufgrund der variablen Fasergröße zwischen den fasertypspezifischen Proben variiert, sollte das erste Gel verwendet werden, um das Probenvolumen zu bestimmen, das in nachfolgenden Gelläufen geladen werden muss, um ähnliche Proteinmengen über alle Proben hinweg zu erhalten. Zu diesem Zweck wird das Gesamtprotein in einer bestimmten Probe mit Hilfe der UV-aktivierten Gel-Imaging-Technologie bestimmt, um alle Proteinbanden sichtbar zu machen, die vor dem Transfer im Gel durch SDS-PAGE getrennt wurden. Das Gesamtprotein in jeder Probe wird aus dem Gelbild bestimmt und verwendet, um die ungleiche Beladung im nächsten Western-Blot-Lauf zu korrigieren, vorausgesetzt, dass eine Kalibrierungskurve mehrerer bekannter Massen von Skelettmuskelgewebe entlang der fasertypspezifischen Proben 3,4,6,17 durchgeführt wird. Es ist auch nicht erforderlich, ein "Housekeeping"-Protein wie Aktin zu verwenden, um das Gesamtprotein zu bestimmen, was auch eine eigene Kalibrierungskurve erfordern würde15. Diese Technologie ist eine zeitsparende und genaue Methode zur Bestimmung des Gesamtproteins und kann mit sehr wenig Probe (d. h. ~1/5 einer Faser 9) durchgeführt werden, ohne dass zusätzliche Reagenzien oder Proteinstandards erforderlich sind, während alle Abschnitte der Membran für den Nachweis von Proteinen von Interesse maximiert werden.
Bei der Immunmarkierung während des Western-Blot-Schritts wird der MHCIIx-Antikörper aufgrund der im Vergleich zu den anderen MHC-Isoformen relativ geringen Häufigkeit von MHCIIx zuerst angewendet. Sobald die Membran für den MHCI-Antikörpernachweis bereit ist, muss sie zwei Schritte des Strippings durchlaufen haben (d. h. nach dem MHCIIx- und MHCIIa-Nachweis). Folglich sollte der Nachweis von MHCI in erster Linie in einer Typ-I-Probe erfolgen, wobei ein minimales Restsignal von früheren MHC-Antikörpern nachgewiesen werden sollte (Abbildung 5). Western Blotting wird verwendet, um die Reinheit jeder fasertypspezifischen Probe mit allen drei MHC-Antikörpern auf demselben Membranabschnitt zu bestätigen. Die Notwendigkeit des Strippings würde jedoch entfallen, wenn entweder MHCI- oder MHCIIx-Antikörper in einer anderen Wirtsspezies wie Kaninchen oder Ziege gezüchtet würden.
Anträge
Die hier beschriebene Methodik kann für die Fasertypisierung einzelner Fasersegmente aus frischer oder gefriergetrockneter Skelettmuskulatur verwendet werden, um die fasertypspezifische Proteinexpression in der menschlichen Skelettmuskulatur zu untersuchen. Darüber hinaus können unter Verwendung frischer Muskelproben entweder intakte oder mechanisch gehäutete Fasern verwendet werden6. Die Verwendung einer gehäuteten Faser ermöglicht eine weitere Untersuchung der Proteinexpression in subzellulären Kompartimenten, z. B. im Zytosol- und Membrankompartiment. Diese Anwendung wurde zuvor verwendet, um die Menge an Glykogen zu messen, die in mechanisch gehäuteten Fasersegmenten von gesunden und diabetischen Personen gebunden und nicht gebunden ist6. Wichtig ist, dass MyDoBID für Experimente von Vorteil ist, bei denen nur denaturierte Proben verwendet werden, und nicht für Studien geeignet ist, die Proteine in ihrem nativen Zustand benötigen. Es ist zwar möglich, dass andere Analysen wie enzymatische Assays oder In-Solution-Proteomik-Ansätze unter nativen Bedingungen durchgeführt werden könnten, aber es wäre eine weitere Optimierung erforderlich, damit ein Teil der Faser für die MHC-Isoform-Identifizierung mit MyDoBID entfernt werden könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Typ I, Typ II und Typ IIx durch die Anwendung einer einfachen Technik mit leicht verfügbaren Verbrauchsmaterialien, die üblicherweise für Western Blot verwendet werden, erfolgreich identifiziert werden können. Wir enthalten umfangreiche praktische Informationen, die nach erfolgreichem Abschluss fasertypspezifische Proben produzieren, die von bestmöglicher Qualität, Integrität und Zuverlässigkeit für zukünftige Studien sind. Diese Technik ist der praktische und bevorzugte Ansatz zur Durchführung einer faserspezifischen biochemischen Analyse der Skelettmuskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Die in dieser Studie verwendeten Antikörper gegen MHC I (A4.840) und MHCIIa (A4.74) wurden von Dr. H. M. Blau entwickelt, und der Antikörper gegen MHCIIx (6H1) wurde von Dr. C. A. Lucas entwickelt und von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft des National Institute of Child Health and Human Development bezogen und von der University of Iowa unterhalten. Fachbereich Biologische Wissenschaften (Iowa City, IA). Wir danken Victoria L. Wyckelsma für die Bereitstellung der menschlichen Muskelproben für diese Studie. Der Großteil der Bilder in Abbildung 1 stammt aus BioRender.com.
Finanzierung:
Diese Studie erhielt keine Drittmittel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J.
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
