Summary
이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.
Abstract
여기에 설명된 기술은 도트 블로팅(dot blotting)을 사용하여 개별 근육 섬유의 세그먼트에서 특정 미오신 중쇄(MHC) 동형을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이하 MyDoBID(Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type)에 의한 Myosin 중쇄 검출이라고 합니다. 이 프로토콜은 인간의 골격근을 동결 건조시키고 단일 근육 섬유의 세그먼트를 분리하는 과정을 설명합니다. MyDoBID를 사용하여 유형 I 및 II 섬유는 각각 MHCI 및 IIa 특이적 항체로 분류됩니다. 그런 다음 분류된 섬유는 각 생검을 위해 섬유 유형별 샘플로 결합됩니다.
각 샘플의 총 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 및 UV 활성 겔 기술에 의해 결정됩니다. 섬유 유형의 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 검증됩니다. 여러 웨스턴 블롯에서 표적 단백질 검출을 향상시키기 위해 단백질 로딩 정규화를 수행하는 것의 중요성도 설명합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯과 비교하여 분류된 섬유를 섬유 유형별 샘플로 통합하면 시료의 다양성, 시료 처리량 증가, 투자 시간 단축 및 비용 절감 조치의 이점이 있으며, 균질화된 근육 시료를 사용하여 자주 간과되는 중요한 섬유 유형별 정보를 유지할 수 있습니다. 프로토콜의 목적은 동결 건조된 인간 골격근 샘플에서 분리된 유형 I 및 유형 II 섬유를 정확하고 효율적으로 식별하는 것입니다.
이러한 개별 섬유는 이후에 결합되어 유형 I 및 유형 II 섬유 유형별 샘플을 생성합니다. 또한, 프로토콜은 웨스턴 블로팅에 의해 IIx 섬유로 확인된 MHCI 및 MHCIIa에 대해 음성인 섬유에 대한 마커로 Actin을 사용하여 IIx 유형 섬유의 식별을 포함하도록 확장됩니다. 그런 다음 각 섬유 유형별 샘플을 사용하여 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 다양한 표적 단백질의 발현을 정량화합니다.
Introduction
골격근은 세포(섬유)가 느린 경련(유형 I)인지 빠른 경련(유형 II)인지에 따라 달라지는 뚜렷한 세포 대사 및 수축 특성을 가진 이질적인 조직입니다. 섬유 유형은 수축 시간, 단축 속도 및 피로 저항을 포함하여 여러 면에서 서로 다른 미오신 중쇄(MHC) 동형을 검사하여 식별할 수 있습니다1. 주요 MHC 동형에는 유형 I, 유형 IIa, 유형 IIb 및 유형 IIx가 포함되며 대사 프로파일은 산화(유형 I 및 IIa) 또는 해당작용(IIx, IIb)입니다1. 이러한 섬유 유형의 비율은 근육 유형과 종에 따라 다릅니다. IIb형은 설치류 근육에서 널리 발견됩니다. 인체 근육은 IIb형 섬유를 포함하지 않으며 주로 MHC 동형 I형 및 IIa 섬유로 구성되며 IIx 섬유의 비율은 적습니다2. 단백질 발현 프로파일은 섬유질 유형에 따라 다르며 노화3, 운동4,5 및 질병6에 따라 변경될 수 있습니다.
다양한 골격근 섬유 유형에서 세포 반응을 측정하는 것은 근육 균질화(모든 섬유 유형의 혼합)의 검사로 인해 종종 간과되거나 불가능합니다. 단일 섬유 웨스턴 블롯은 개별 근육 섬유에서 여러 단백질을 조사할 수 있습니다7. 이 방법론은 이전에 균질한 제제를 사용하여 얻을 수 없었던 새롭고 유익한 단일 섬유 특성을 생성하는 데 활용되었습니다. 그러나 원래의 단일 섬유 웨스턴 블롯 방법론에는 시간이 많이 걸리는 특성, 샘플 복제를 생성할 수 없음, 고가의 고감도 ECL(enhanced chemiluminescence) 시약 사용 등 몇 가지 한계가 있습니다. 신선한 조직을 사용하는 경우 이 방법은 제한된 시간(즉, 1-2시간) 내에 개별 섬유를 분리해야 하는 시간 제약으로 인해 더욱 제한됩니다. 다행히도, 이러한 억제는 동결 건조된 조직으로부터 단일 섬유 분절을 분리함으로써 완화된다8. 그러나 동결 건조된 샘플에서 섬유를 수집하는 것은 생검 조직의 크기와 품질에 의해 제한됩니다.
도트 블로팅 방법(dot blotting method)9을 이용한 섬유 유형 식별은 이 포괄적인 프로토콜에서 상당히 정교화되고 확장되었다. 이전에, 2~10 mg의 습식 근육 조직이 동결 건조 및 단일 섬유 MHC 동형 단백질 분석에 적합하다는 것이 입증되었다9. Christensen et al.9은 ~1mm 섬유 세그먼트의 30%를 사용하여 도트 블로팅에 의해 존재하는 MHC 동형을 검출했으며, 이는 웨스턴 블로팅으로 확인되었습니다. 이 연구는 웨스턴 블로팅을 도트 블로팅으로 대체함으로써 전체 비용이 ~40배(50개 섬유 세그먼트의 경우) 감소했음을 보여주었습니다. 그런 다음 섬유를 유형 I 및 유형 II 샘플로 "통합"하여 실험적 복제를 허용했습니다9. 그럼에도 불구하고 한계는 유형 I(MHCI 양성) 및 유형 II(MHCII 양성 섬유)의 두 가지 섬유 유형 특이적 샘플만 획득되었으며 유형 II 샘플에는 MHCIIa와 MHCIIx 6,10의 혼합물이 포함되어 있습니다. 특히, 현재 프로토콜은 순수 IIx 유형 광섬유를 식별하는 방법을 보여주며 일반적인 프로토콜 문제에 대한 문제 해결 전략을 포함하여 매우 상세한 워크플로(그림 1에 요약됨)를 제공합니다.
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Protocol
인간 근육 샘플은 국소 마취 (Xylocaine) 및 수동 흡입을 위해 수정 된 Bergstrom 바늘을 사용하여 무균 조건에서 70-74 세의 n = 3 (남성 2 명, 여성 1 명)의 vastus lateralis에서 얻었다11,12. 샘플은 빅토리아 대학교 인간 연구 윤리 위원회(HRETH11/221)에서 승인하고 헬싱키 선언13에 따라 수행된 이전 연구의 하위 집합이었습니다. 참가자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜에 필요한 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다. 또한 일반적인 프로토콜 문제를 해결하는 문제 해결 전략 목록이 표 1에 나와 있습니다.
1. 동결 건조
- 생검된 근육 샘플을 드라이아이스에 냉동 상태로 유지하면서 체중을 측정하고 저울에 빈 냉동 튜브를 올려 놓습니다.
- 최소 10mg의 습식 냉동 티슈를 빠르게 계량합니다. 가중치를 소수점 이하 한 자리까지 기록합니다.
- 뚜껑에 3-4개의 구멍이 뚫린 미리 냉각된 미세 원심분리기 튜브에 조직을 넣고 드라이아이스 펠릿 2-3개가 있는 작은 비커에 넣습니다.
- 동결 건조기 제조업체의 작동 지침을 따르십시오.
- 동결 건조기의 모든 밸브가 닫혀 있는지 확인하고 동결 건조기를 켭니다.
- 제어판을 사용하여 진공 설정점이 인체 조직에 대한 최적의 동결 건조 조건( 0.12mBar) 으로 프로그래밍되었는지 확인합니다(그림 2).
- 동결 건조기의 설명서를 누르고 챔버가 -40 oC로 냉각될 때까지 기다립니다.
- 챔버가 해당 온도에 도달하면 뚜껑을 제거한 다음 유리 챔버를 제거하고 비커(근육 샘플 포함)를 금속 스테이지에 놓습니다.
- 유리 챔버와 뚜껑을 교체합니다. 뚜껑의 진공 해제 밸브를 닫고 진공 눈금 표시등이 녹색으로 바뀔 때까지 기다렸다가 건조기가 진공 밀봉되었는지 확인합니다.
- 근육 샘플을 48시간 동안 동결 건조합니다. 동결 건조가 완료되면 진공 버튼을 눌러 진공 펌프를 끄고 뚜껑의 진공 해제 밸브를 엽니다.
- 챔버의 뚜껑을 제거하고 동결 건조된 샘플을 수집합니다. 조직의 무게를 측정하고 소수점 이하 한 자리까지 무게를 기록합니다.
- 체중 손실 비율을 계산하십시오. ~75%의 체중 감소는 조직이 성공적으로 동결 건조되었음을 나타냅니다(이 연구에서 평균 ± SD, 76 ± 9%, n = 11개의 근육 샘플).
- AUTO를 눌러 진공 펌프와 냉동고를 끕니다. 장치가 주변 온도에 도달하도록 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 냉각 코일을 청소하고 수집기에서 축적된 액체를 배출하십시오.
알림: 섬유 수집은 즉시 시작할 수 있습니다. 섬유 분리를 위해 조직을 사용하지 않을 때는 동결 건조된 샘플을 -80°C에서 건조 비드가 있는 밀봉된 용기에 보관하십시오. 주의 : 드라이 아이스는 위험합니다 (클래스 9). 권장되는 안전한 취급을 위해 MSDS를 참조하십시오.
2. 섬유 수집
- 섬유 수집 준비
- 최소 50개의 미세분리 튜브(Fiber 1 - 50)와 피펫 10μL의 변성 완충액을 각 튜브에 라벨링합니다.
- 두 쌍의 미세 조직 해부 집게, 보푸라기가 없는 조직, 탁상용 램프, 실체현미경(검은색 스테이지가 위로 향함), 소용돌이 및 탁상용 원심분리기로 수집 영역을 준비합니다.
- 동결 건조된 근육 샘플을 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다. s에 뚜껑을 놓습니다.tage 해부 현미경의.
- 단일 섬유 해부 비디오를 시청하십시오. 연구를 시작하기 전에 섬유 수집에서 단일 섬유 유형 식별에 이르는 전체 프로토콜을 최소 두 번 연습하십시오.
- 섬유를 채취하기 전에 다음과 같이 각 생검에서 섬유형 검체에 필요한 총 부피 를 계산합니다. 예를 들어, 1 fiber의 시작 부피 = 10 μL이고 MyDoBID 후 남은 부피가 (1 fiber × 10 μL) - 도트 블로팅에 사용된 1 μL = 9 μL(샘플 부피)인 경우, 샘플 부피(μL)에 실행할 총 웨스턴 블롯 수를 곱하고 중복성을 고려하여 이 양을 두 배로 늘려 필요한 총 샘플 부피 를 계산합니다. (9 μL × 4 웨스턴 블롯) × 2 = 72 μL. 필요한 최종 샘플 부피(μL)를 섬유 유형별 샘플당 샘플 부피로 나누어 유형화된 샘플당 필요한 섬유 수를 계산합니다(예: 72μL ÷ 9μL = 섬유 유형별 샘플당 8개의 섬유). 이를 위해서는 총 50개의 섬유를 수집해야 합니다.
참고: 로드된 단백질의 양이 각 샘플에 대해 ~3mm 섬유(~12μg의 습식 중량)와 동일한 경우 필요한 샘플 부피는 MyDoBID와 웨스턴 블로팅을 모두 실행하는 데 필요한 최소 단백질 농도입니다(자세한 내용은 보충 파일 1 참조). 그러나, 이 양은 반복 젤이 주어진 단백질을 위해 요구된다는 것을 고려하지 않습니다. 주의 : 집게는 날카롭습니다. 피부 펑크의 위험을 피하기 위해 주의해서 다루십시오.
- 단일 광섬유 절연
- 5cm x 1cm의 작은 종이에 자를 사용하여 1cm 선을 그립니다. 그 선에 1mm마다 표시하십시오.
- 수집된 섬유의 길이를 추정하기 위한 가이드로 이것을 페트리 접시 뚜껑 아래에 삽입하십시오.
- 동결 건조된 근육 샘플을 실체현미경 아래에 저배율(x 7.5)로 놓습니다. 한 쌍의 미세 조직 해부 집게를 사용하여 동결 건조된 근육을 제자리에 고정하고 다른 쌍으로 작은 섬유 다발을 분리하기 시작합니다(비디오에서 볼 수 있음).
- 섬유 다발 하나를 분리하고 단일 섬유 세그먼트가 다발에서 분리될 때까지 계속 떼어냅니다.
- 길이가 최소 ~50mm인 섬유를 1개 이상 수집합니다.
- 섬유질을 페트리 접시의 빈 공간으로 옮깁니다. 단일 섬유 세그먼트를 더 높은 배율(x 50)에서 검사합니다. 끝에서 섬유를 추가로 분리하여 단일 섬유인지 확인하십시오. 섬유가 분리되지 않고 끊어지면 단일 섬유입니다.
- 섬유의 변성
- 겸자를 사용하여 섬유를 부드럽게 모아 분취된 변성 완충액에 직접 넣습니다(겸자가 완충액에 닿지 않도록 하십시오).
- 현미경으로 집게를 확인하여 섬유가 성공적으로 제거되었는지 확인하십시오. 튜브를 닫고 튜브 바닥을 벤치에 세 번 단단히 두드려 섬유가 완충액으로 이동하는지 확인합니다.
- 다음 섬유로 이동하기 전에 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 집게를 깨끗이 닦으십시오. 모든 섬유가 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다.
- 섬유 샘플을 소용돌이치고 2,500× g 에서 5초 동안 잠시 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥으로 끌어당깁니다.
알림: 원심분리 시간(5초)은 시작(0 ×g)부터 속도가 ~2,500×g에 도달할 때까지 시간이 정해집니다. - 샘플을 실온에 1시간 동안 그대로 둡니다. 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 샘플을 얼렸다가 해동하십시오.
3. 도트 블로팅
- 멤브레인 준비 및 활성화
- 50개의 샘플(~10.5cm x 5.5cm)에 맞도록 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 1개(0.2μm 공극 크기)를 측정, 라벨링 및 절단합니다.
- 왼쪽 테두리는 위에서 아래로(1-10) 숫자로 표시하고 위쪽 테두리는 왼쪽에서 오른쪽으로(A에서 E) 알파벳순으로 1cm 간격으로 표시합니다.
- 12.5cm x 7.5cm 크기의 여과지 4장을 준비합니다.
- 두 장을 함께 쌓아 쌓습니다. 필터 용지 스택을 1x 전사 버퍼에 미리 담그십시오.
- 멤브레인을 용기에 넣습니다. 멤브레인 위에 95% 에탄올을 붓고 멤브레인을 완전히 잠글 수 있는 충분한 양(10-15mL)을 붓습니다. 1분 동안 로커를 저어줍니다.
- 에탄올을 회수하고 멤브레인을 1x 전달 완충액(~15mL)에 담그고 2분 더 담급니다.
참고: 에탄올과 전사 완충액은 침전물이 형성될 때까지 향후 도트 블로팅 실험에 재사용할 수 있습니다(6회 사용 후 변경). - 전사 완충액에 적신 여과지 더미를 큰 뚜껑과 같은 평평하고 움직일 수 있는 표면에 놓고 롤러로 평평하게 펴십시오. 젤 이형제 또는 핀셋을 사용하여 스택에 PVDF 멤브레인을 배치합니다.
- 멤브레인 위에 마른 여과지 한 장을 놓고 롤러를 여과지 위로 움직여 멤브레인 표면의 과도한 완충액을 흡수합니다. 멤브레인을 문지르지 않고 상단 여과지를 제거합니다.
주의: 메탄올(3등급, 하위 위험 6.1) 및 에탄올(3등급)은 위험합니다. 안전한 취급 권장 사항은 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.
- 멤브레인에 시료 흡수
- 섬유 샘플을 해동하고 5단계에서와 같이 실온에서 간단한 원심분리기(2.3.4초)를 수행하고 샘플을 완전히 혼합합니다.
- 피펫 팁으로 멤브레인을 건드리지 않고 각 샘플의 ~1μL 방울을 지정된 영역의 멤브레인에 천천히 증착합니다. 섬유 샘플당 지정된 영역의 치수는 ~1cm x 1cm입니다. 이 영역의 중앙에서 샘플을 찾는 것을 목표로 합니다.
- 샘플 방울이 멤브레인을 통해 최소 15분 동안 스며들도록 합니다. 샘플 버퍼가 남아 있지 않고 완전히 흡수되었는지 확인합니다.
- 플라스틱 핀셋을 사용하여 젖은 여과지 스택에서 멤브레인을 조심스럽게 들어 올려 마른 여과지 한 장 위에 놓고 멤브레인을 최소 5분 동안 탈수합니다.
- 샘플 스폿이 완전히 흰색으로 변하면 멤브레인을 다시 활성화합니다.
- 멤브레인 재활성화 및 차단
- 3.1.5 및 3.1.6 단계를 반복하여 멤브레인을 다시 활성화합니다.
- 멤브레인을 세척 버퍼에 넣고 흔들어 5분 동안 헹굽니다. 세척 버퍼를 버리십시오.
- 흔들면서 30분 동안 차단 완충액에 멤브레인을 배양합니다.
- 버퍼가 더 이상 흐리지 않을 때까지 세척 버퍼로 멤브레인을 3번 헹굽니다.
- 로커의 최종 세척에 멤브레인을 그대로 두십시오.
4. 면역표지
- MHCIIa 검출
- MHCIIa 1차 항체를 소 혈청 알부민(BSA) 완충액 10mL에 200분의 1로 희석합니다.
- 멤브레인에서 세척 완충액을 버리고 희석된 MHCIIa 항체를 멤브레인에 붓습니다.
- 용기(MHCIIa의 멤브레인 포함)를 실온에서 2시간 또는 4°C에서 밤새 로커에 놓습니다.
- MHCIIa 항체를 회수하여 4°C에서 보관합니다. 차단 완충액으로 로커에서 2분 동안 멤브레인을 세척합니다.
참고: 모든 1차 항체는 완충액이 투명하게 유지되는 한 최대 5배까지 재사용할 수 있습니다. - 두 번 더 헹굽니다. 매번 5분; 총 3 회 세탁.
- 마우스 면역글로불린 G 서양고추냉이 과산화효소(IgG-HRP) 2차 항체를 10mL의 차단 완충액에 20,000분의 1로 희석하여 막에 첨가합니다.
- 세척 완충액을 버리고 1시간 동안 흔들면서 2차 마우스 IgG-HRP에서 멤브레인을 배양합니다.
- 2 차는 버리고 멤브레인을 세척 완충액으로 세척합니다 (2, 5, 5 분).
- 이미징할 준비가 될 때까지 멤브레인을 최종 세척에 담그십시오.
- 겔 이미저를 켜고 이미저가 필요한 작동 온도에 도달할 때까지 15분 동안 기다린 다음 이미징 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조).
- 소프트웨어 창에서 New Single Channel Protocol(새 단일 채널 프로토콜)을 클릭합니다(그림 3A). 멤브레인의 백색광 이미지의 경우 Applications | 얼룩 | Colorimetric(색도계)을 클릭합니다(그림 3B).
- 젤 영역을 클릭하십시오. 각 옵션은 다양한 겔 유형의 크기에 맞게 특정 치수에 맞게 프로그래밍됩니다. 멤브레인의 치수에 가장 잘 맞는 적절한 옵션을 선택합니다(그림 3C).
- 루미놀과 과산화효소 시약을 1:1 비율로 결합하여 ECL을 준비합니다. 전체 멤브레인을 덮을 수 있는 충분한 양의 ECL 혼합물을 만들며, 일반적으로 800-1,000μL의 총 부피가 필요합니다.
- 멤브레인을 크고 투명한 플라스틱 트레이에 놓고 ECL 혼합물을 멤브레인에 분산시킵니다.
- 멤브레인을 이미징 플레이트에 놓습니다.
- Position Gel(노란색 버튼)을 클릭하면 라이브 카메라 뷰를 볼 수 있습니다. zoom 버튼을 클릭한 상태로 드래그하여 멤브레인의 이미징 영역을 최대화합니다. 이 시점에서 필요한 경우 멤브레인의 위치를 곧게 펴십시오.
- Run Protocol(프로토콜 실행)(녹색 버튼)을 클릭하고 멤브레인의 비색 이미지가 생성될 때까지 기다립니다. 이 이미지를 저장하면 해당 섬유 샘플과 점을 일치시키는 데 도움이 됩니다.
- 멤브레인을 이동하지 않고 2 x 2 비닝 (Chemi High Resolution) 옵션을 클릭하여 소프트웨어에서 응용 프로그램을 변경할 수 있습니다(그림 3D).
- Image exposure and software(이미지 노출 및 소프트웨어)에서 노출 시간 최적화(Optimize the exposure time)에서 Faint Bands(희미한 밴드)를 클릭합니다(그림 3E) | 신호 축적 모드.
- Setup(설정)에서 첫 번째 이미지에 1초, 마지막 이미지에 30초, 총 30개의 이미지를 입력합니다(그림 3F).
- Run Protocol(프로토콜 실행)을 클릭합니다.
- 신호 포화 전(보이는 모든 도트가 검은색으로 표시됨), 초기 신호 포화 전(일부 도트가 포화 상태가 시작됨) 및 과포화 스폿(강한 신호가 감지된 모든 스폿이 포화 상태임) 단계에서 이미지를 저장합니다.
- 신호 축적을 종료하기 전에 필요한 모든 이미지를 저장하십시오. 이미저에서 멤브레인을 꺼냅니다.
- 젤 이형제를 사용하여 멤브레인을 세척 버퍼가 있는 용기에 다시 넣습니다.
- MHCI 검출
- 세척 버퍼를 붓고 멤브레인을 스트리핑 버퍼로 30°C에서 37분 동안 처리합니다(멤브레인이 완전히 잠겼는지 확인).
- 스트리핑 버퍼를 회수하고 세척 버퍼에서 멤브레인을 흔들면서 5분 동안 헹굽니다.
알림: 스트리핑 버퍼는 폐기하기 전에 10번 재사용할 수 있습니다. - 세척 완충액을 붓고 이번에는 200분의 1(범위: 200분의 1에서 500분의 1)의 시작 농도로 희석된 MHCI 1차 항체를 적용합니다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 흔듭니다.
- MHCI 1차 항체에서 배양한 후, 항체를 회수하고 단계 4.1.4 및 4.1.5에서와 같이 멤브레인을 세척합니다.
- 차단 완충액에 마우스 IgM HRP 2차 항체를 20,000분의 1로 희석합니다. 막에서 차단 완충액을 붓고 단계 4.1.7에서와 같이 마우스 IgM 2차에서 배양합니다.
- 세척 및 이미지 캡처는 4.1.8 - 4.1.24 단계에서와 같이 MHCI를 감지했습니다.
주의: 스트리핑 버퍼에는 유기 포스핀 3-5%(클래스 8)가 포함되어 있습니다. 안전한 취급 권장 사항은 MSDS를 참조하십시오.
- Actin을 사용한 잠재적 MHCIIx 검출
- 멤브레인을 한 번 더 벗겨냅니다(4.2.1 및 4.2.2단계).
- 섹션 4.1을 반복하되, 이번에는 BSA 완충액에서 500분의 1로 희석한 액틴 1차 항체를 적용한 다음 차단 완충액에서 20,000분의 1로 희석한 토끼 HRP 2차 항체를 적용합니다.
5. 섬유 유형 식별
- MHCI, MHCIIa 및 Actin 신호 분석
- 신호 강도 패널에 익숙해지십시오(그림 4A). 5.1.2단계부터 5.1.4단계까지 기록해 둡니다.
- 포화 신호 강도는 단백질 검출이 강하다는 것을 정성적으로 나타냅니다.
- 보통은 표적 단백질이 중간 수준으로 존재함을 나타냅니다.
- 희미한 신호는 표적 단백질이 거의 존재하지 않음을 나타냅니다.
- 신호 강도 패널을 사용하여 신호 강도가 '포화', '보통' 또는 '희미한' 신호 강도로 광섬유를 분류합니다(그림 4A).
- MHCIIa와 MHCI 결과를 먼저 비교하여 섬유 유형 식별을 수행합니다(그림 4B, 왼쪽 및 중간 블롯).
- 하나의 MHC 동형의 포화 또는 중간 신호 강도를 가진 광섬유를 기록합니다.
- MHC 동형 신호가 '희미한' 경우 광섬유를 표시하지 않은 상태로 둡니다( 그림 4B 참조).
- 마지막으로, MHCI 또는 IIa가 검출되지 않은 광섬유에서 Actin이 관찰되는 경우(중간 또는 포화 신호 강도) 이를 잠재적인 IIx 광섬유로 기록합니다(그림 4B, 오른쪽 블롯).
- 희미한 MHC 동형 신호가 있는 섬유를 기록하지만 Actin이 식별되지 않은 것으로 감지됨(중간 또는 포화 강도).
- 세 가지 표적 단백질 모두에 대해 희미하거나 검출되지 않은 샘플(섬유가 수집되지 않음)은 폐기합니다(그림 4C).
- MHCI 및 MHCII 신호가 모두 '포화' 또는 중간 신호로 감지되는 광섬유를 기록합니다. 이 샘플은 섬유 유형별 준비에 사용할 수 없습니다.
- 섬유 유형별 시료 준비
- 각 생검에 대해 별도의 유형 I 및 유형 II 샘플을 준비합니다. 유형 II 샘플의 경우 MHCIIa가 포화 또는 중간 수준에서 검출되는 최소 요구 섬유 수(2.1.5단계에서 계산)를 결합합니다.
- 유형 I로 표시된 별도의 튜브에서 MHCI가 검출되는 섬유에 대해 이 과정을 반복합니다(그림 4D).
- 포화 신호가 있는 광섬유가 충분하지 않은 경우 신호 강도가 중간 정도인 광섬유를 사용하십시오.
- 잠재적인 IIx 섬유를 결합합니다.
- 웨스턴 블로팅을 위해 섬유 유형별 샘플을 즉시 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관하십시오.
6. 웨스턴 블롯 섬유 유형 확인
- 각 섬유 유형별 샘플 10μL를 활용합니다(필요한 최소 샘플 부피, 2.1.5단계 참조).
- 제조업체의 프로토콜에 따라 SDS-PAGE를 통해 지정된 프리캐스트 겔을 사용하여 샘플을 분리합니다.
- 겔 이미저를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 겔의 단백질을 검출합니다.
- 겔을 차가운 1x 전사 버퍼에 10분 동안 넣습니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질을 0.45μm 니트로셀룰로오스 막(9.5cm x 13.5cm)에 습식 전사합니다.
- 이송 후 용기에 초순수 H2O로 멤브레인을 잠시 헹굽니다. 초순수를 붓습니다.
- 멤브레인에 항체 신호 증진제 용액 10mL를 넣고 실온에서 10분 동안 담급합니다.
- 항체 신호 증진제 용액을 회수하고 초순수 H2O로 5 회 세척 (세척 당 5 초)합니다.
알림: 항체 신호 강화제 용액은 폐기하기 전에 5번 사용할 수 있습니다. - 마지막 세척을 붓고 차단 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.
- 깨끗한 메스 칼날이나 가위를 사용하여 180kDa 이상의 단백질이 막의 상단 부분에 오도록 분자량으로 막을 가로질러 수평으로 자릅니다.
- 추가 섬유 유형 확인을 위해 이 상단 섹션을 사용하십시오.
- 180kDa 미만의 부분을 사용하여 다양한 표적 단백질을 검출합니다.
- 멤브레인의 상단 섹션에서 MHCIIx 1차 및 마우스 면역글로불린 M(IgM) HRP 2차 항체로 섹션 4.1을 따릅니다.
- MHCIIa IgG 1차 및 마우스 IgG HRP 2차 항체로 이 과정을 반복하기 전에 멤브레인을 벗겨냅니다(섹션 4.2.1 및 4.2.2에 설명된 대로).
- 한 번 더 벗겨내고 마지막으로 MHCI IgM 1차 항체 및 마우스 IgM HRP 2차 항체를 적용합니다.
참고: 이 단계는 정성적이므로 멤브레인 박리로 인한 단백질 손실은 문제가 되지 않습니다. - 서로 다른 MHC 동형에서 검출된 신호를 비교합니다( 그림 5B 참조). 신호 강도가 예상 샘플(MHCI - 유형 I, MHCIIa - 유형 II 및 MHCIIx - 유형 IIx)에서 중간에서 포화 수준으로 감지되면 광섬유 유형별 샘플은 향후 연구에서 사용할 수 있도록 신뢰할 수 있는 것으로 기록됩니다.
- 샘플에서 둘 이상의 MHC 동형이 동일하게 검출되는 경우 샘플을 신뢰할 수 없는 것으로 기록합니다.
주의: 항체 증강 용액에는 수산화나트륨 50%가 포함되어 있습니다. 안전한 취급 권장 사항은 MSDS를 참조하십시오.
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Representative Results
도트 블로팅을 사용한 개별 MHCI, MHCIIa 및 MHCIIx 근육 섬유 식별
MyDoBID의 특징은 주어진 광섬유에서 다양한 MHC 및 Actin 신호 강도 강도를 분류하는 것입니다(그림 4A). 섬유 유형은 MHCI 및 IIa 동형의 존재 유무에 의해 식별되었습니다(그림 4B). 6개의 섬유는 MHC 또는 액틴 검출이 나타나지 않았으며, 이는 수집된 섬유가 없음을 나타냅니다. 이 특정 도트 블롯의 결과는 22개의 유형 II 섬유, 7개의 유형 I 섬유 및 3개의 잠재적인 유형 IIx 섬유의 식별이었습니다. 2개의 미확인 샘플과 6개의 샘플이 '섬유질 없음'으로 분류되었습니다(그림 4B, C). 검출 가능한 MHCI 또는 MHCIIa 신호가 없지만 Actin에 대해 양성인 섬유는 제거 과정을 통해 잠재적인 IIx 유형 섬유로 식별되었습니다. MHCI 및 IIa 신호 강도를 분류하기 위해 신호 강도 패널을 사용하여 '보통' 또는 '포화' 광섬유를 결합하여 각각 유형 I 또는 II 샘플을 생성했습니다. 확인되지 않았거나 희미하거나 Actin이 검출되지 않은 섬유는 후속 분석에 포함되지 않고 폐기되었습니다(그림 4D).
웨스턴 블로팅(western blotting)을 이용한 섬유 타이핑 확인
섬유 유형 특이적 샘플은 웨스턴 블로팅 및 MHC 특이적 항체를 사용하여 검증되었습니다(그림 5). 한 개별 생검에서 얻은 유형 I 및 유형 II 섬유 샘플은 각 생검에 존재하는 유형 IIx 섬유의 수가 적기 때문에 두 개인의 잠재적인 유형 IIx 섬유 샘플인 유형 IIx 샘플과 함께 실행되었습니다. 웨스턴 블롯 데이터는 섬유 유형 식별이 성공적임을 확인했습니다.
그림 1: 시료 전처리, 섬유 타이핑, 섬유 특이성의 웨스턴 블롯 확인을 설명하는 워크플로우 요약 . (A) 인체 조직을 48시간 동안 동결 건조합니다. (B,C) 단일 섬유 세그먼트는 해부 현미경으로 분리됩니다. (D) 섬유를 변성시키고 (E) -80°C에서 보관한 후 1시간 후에 보관합니다. (F) 1차 항체 배양 순서. (G) 섬유는 MHCIIa(유형 II), MHCI(유형 I) 및 액틴(IIx?, 잠재적 유형 IIx 섬유)을 사용하여 도트 블롯 및 섬유 유형을 식별했습니다. (H) 그런 다음 섬유를 모았습니다. (I) 검량선과 함께 섬유 유형별 샘플은 SDS PAGE 및 웨스턴 블로팅을 통해 분석됩니다. (J) 웨스턴 블로팅을 이용한 섬유 유형 식별 검증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 동결 건조 시스템의 디스플레이 화면과 제어판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 멤브레인의 백색광 포획 후 표적 단백질의 화학발광 검출을 위한 이미저 설정. 백색광 아래에서 멤브레인을 이미지화하려면 (A) New Single Channel 을 선택한 다음 (B) Blots | colorimetric application을 선택합니다. (C) 사용된 겔의 크기에 따라 적절한 이미징 영역을 선택한 다음 Run Protocol을 눌러 백색광 이미지를 촬영합니다. (D) 멤브레인을 이동하지 않고 B 단계를 반복하되 이번에는 블롯 | Chemi 안녕하세요 해상도입니다. 실행을 누르기 전에 (E) 이미지 노출을 선택하여 희미한 대역에 최적화하고 (F) 신호 축적 모드를 설정하고 먼저 집중 포화 픽셀 강조를 선택한 상태에서 총 30초 동안 초당 노출 시간을 설정합니다. Run Protocol(프로토콜 실행)을 누르고 저장에 가장 적합한 이미지를 선택하기 전에 실행이 완료될 때까지 기다립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 파이버 유형 식별. (A) 섬유 유형은 멤브레인 상의 다른 모든 섬유에 대해 식별되었으며, 검출된 각 MHC 동형에 대한 신호 강도 패널에 의해 분류되었습니다(예: MHCI 신호: 포화, 중간 및 희미함). (B) (A)의 패널을 사용하여 MHCIIa 항체는 II형 섬유(파란색, 왼쪽 블롯)를 식별하고, 멤브레인을 박리한 후 MHCI 항체는 I형 섬유(빨간색, 중간 블롯)를 식별했습니다. 액틴 항체는 이전의 MHCI 또는 IIa 신호가 검출되지 않은 섬유에서 양성 액틴 신호가 검출된 경우(녹색, 오른쪽 얼룩) 잠재적인 IIx 섬유를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 지침을 따르지 않은 섬유는 보라색(식별되지 않음)으로 강조 표시됩니다. 마지막으로, Actin 신호에 대해 음성인 샘플은 섬유질이 수집되지 않았음을 나타냅니다('섬유질 없음'). (C) (B)에 표시된 도트 블롯의 샘플 위치에 해당하는 섬유 라벨링을 보여주는 표. (D) 섬유 유형별 시료 준비를 위한 섬유 선택 개요. 목표는 각 섬유 유형에 대해 10개의 포화 섬유를 수집하는 것이었습니다. 여기에서, 유형 II 섬유의 경우, 8개의 포화 섬유가 확인되고 통합되었습니다. 유형 I 광섬유의 경우 10개 미만의 포화 광섬유가 존재하므로 중간 정도의 신호 강도를 가진 광섬유도 선택되었습니다. IIx 유형 섬유의 경우 두 개의 섬유가 식별되고 통합되었습니다. 10개 미만의 섬유(포화 및 중등도)가 확인되면 추가 섬유 수집이 필요할 수 있습니다. 알림: (B)에 표시된 Actin 신호는 포화에 도달하지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 섬유 유형 식별의 웨스턴 블롯 확인. 섬유 유형 식별은 유형 I(~10 섬유) 및 유형 II(~10 섬유) 샘플을 생성하기 위해 그림 4 와 같이 수행되었습니다. 동일한 생검에서 확인된 IIx 섬유가 없었기 때문에 여기에 표시된 IIx 샘플은 하나 이상의 근육 샘플(n=2개체)에서 생성되었습니다. 각 섬유 특이적 샘플의 작은 부분 표본을 웨스턴 블로팅으로 분석하여 섬유 유형 식별을 확인합니다. 분자량 마커(kDa)는 왼쪽에 표시되며 멤브레인을 움직이지 않고 백색광 아래에서 캡처됩니다. 표적 단백질은 MHCIIx, MHCIIa 및 MHCI의 서열에서 검출되며, UV 활성화 겔의 미오신 (myosin)은 샘플당 로드된 단백질의 양을 시각적으로 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 일반적인 프로토콜 문제에 대한 문제 해결 전략. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 검량선을 이용한 동결 건조 섬유 질량 계산. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
섬유 수집
수년간의 경험을 바탕으로 대부분의 연구원은 이 기술을 마스터할 수 있습니다. 그러나 연습을 통해 다운스트림 분석을 위한 더 빠르고 효율적인 섬유 수집이 가능합니다. 풀링을 위해 품질의 단일 섬유 세그먼트 30개를 분리할 수 있으려면 샘플당 50개의 섬유 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다. 섬유 수집 비디오를 주의 깊게 연구하고 두 번의 연습 세션(세션당 ~50개의 섬유)을 수행한 후 합리적인 기준을 달성하는 것이 좋습니다. 수집된 모든 섬유는 섬유 유형을 식별하기 위해 MyDoBID를 거치며, 이를 통해 기술이 얼마나 효과적으로 수행되고 있는지 알 수 있습니다. 이는 광섬유 샘플에서 감지된 낮은 수의 '광섬유 없음' 또는 '희미한' MHC 신호로 볼 수 있습니다(프로토콜 섹션 5.1 참조).
근육은 MHCI와 MHCIIa가 모두 존재하는 하이브리드 섬유 또는 MHCIIa 및 IIx 2,14를 포함할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. MyDoBID의 한계는 MHCI 및 MHCIIa 항체 모두에 대해 양성 샘플이 하이브리드 섬유이거나 두 개의 섬유가 수집될 수 있기 때문에 하이브리드 섬유의 존재를 확인할 수 없다는 것입니다. 또한, MHCIIa 1차 항체는 IIa 및 IIa/IIx 섬유 모두에서 MHCIIa의 존재를 검출하기 때문에 MyDoBID는 MHCIIa/IIx 하이브리드와 별도로 MHCIIa를 검출할 수 없습니다. 이러한 이유로, 하이브리드 광섬유의 샘플을 식별하고 준비하는 작업은 수행되지 않았으며, 신호 강도 패널에 설명된 범위를 벗어난 MHCI 및 MHCIIa 신호가 모두 있는 샘플은 폐기되었습니다(그림 4A). 또 다른 한계는 MyDoBID를 사용하여 샘플에서 근섬유 유형의 비율을 측정할 수 없으며, 섬유 유형 분포를 결정하기 위해 기존의 면역조직화학적 분석을 적용해야 한다는 것입니다2.
도트 블로팅(Dot blotting)
신호 강도 패널과 광섬유 유형 ID는 도트 블로팅 멤브레인에 적용된 소량으로 표현되는 전체 샘플에 의존합니다. 이를 달성하기 위해 샘플은 멤브레인에 로딩되기 전에 교반에 의해 완전히 혼합됩니다. 하나의 MHC 동형만 있는 모든 섬유는 풀링의 다음 단계로 이동합니다. 이 단계에서 둘 이상의 MHC가 있는 광섬유는 샘플 결합의 다음 단계로 진행해서는 안 됩니다. 샘플이 오염된 경우 풀링된 전체 샘플을 폐기해야 하며 연구원은 섬유 수집으로 돌아가 섬유 분리 및 도트 블로팅 단계를 반복해야 합니다.
면역 라벨링
이전에는 MHCI 및 MHCIIa9의 검출을 위해 멤브레인의 비특이적 부위를 차단하기에 5분이 적절한 시간이라고 보고되었습니다. 이 기술을 MyDoBID로 발전시키려면 Actin 항체를 사용해야 합니다. 5분 차단은 멤브레인 배경을 더 어둡게 만들기 때문에 최소한의 배경을 가진 멤브레인을 얻기 위해보고된 6분과 같이 5분 블록 시간을 30분으로 늘려야 하는 것으로 나타났습니다. 차단 시간은 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 모든 면역검출 기법에서 고려해야 할 사항이며 적절하게 수정해야 합니다.
멤브레인 스트리핑
스트리핑은 또한 관심 단백질을 제거하기 때문에 정량 분석(15 )에 사용할 수 없지만, 정성적 분석(qualitative assay)이기 때문에 MyDoBID에서 사용할 수 있다. 스트리핑의 목적은 멤브레인 표면에서 결합된 항체를 제거하여 이전 항체의 간섭을 최소화하면서 새로운 항체를 사용할 수 있도록 하는 것입니다. MyDoBID에는 서로 다른 MHC 동형이 별도의 멤브레인에서 검출되는 두 개의 멤브레인에 샘플을 적용하는 옵션이 있습니다. 이 방법을 선호하면 스팟을 동시에 로드하여 샘플 튜브를 두 번 이상 취급하지 마십시오. 이렇게 하면 각 샘플 스폿 간의 건조 시간이 유사하고(~5초 차이) 후속 단계가 별도의 용기에서 동시에 수행되도록 할 수 있습니다. 이 옵션은 시간, 샘플 및 소모품 소비를 증가시킨다는 점에 유의해야 합니다.
MHCIIa 섬유를 먼저 검출하기 위해 항체를 적용한 다음 MHCI를 검출하는데, MHCI 항체는 항상 MHCIIa보다 제거하기 어려운 매우 밝은 신호를 제공하기 때문입니다. 액틴은 골격근 섬유에서 균질하게 발현되며, 섬유의 일부가 상술한 바와 같이 막에 성공적으로 도포되었는지를 확인하는데 사용된다.
이미징, 섬유 유형 식별 및 섬유 유형별 시료 준비
이 프로토콜에서는 섬유 유형별 시료를 생성하기 위한 섬유 유형 식별 및 시료 선택을 지원하기 위해 새로운 도구가 개발되었습니다(그림 4A). 신호 강도 패널에 표시된 예는 MHCI 신호 강도를 (i) 포화, (ii) 보통 또는 (iii) 희미하게 정의하는 데 사용됩니다. 광섬유를 광섬유 유형별 샘플로 풀링하기 위해 포화 신호 강도를 나타내는 광섬유를 먼저 선택하고 필요한 경우 중간 정도의 신호 강도를 가진 광섬유를 추가합니다. 유형 I 및 II 샘플을 준비할 때 일반적으로 '희미한' 또는 미확인으로 분류된 섬유를 폐기할 수 있도록 충분한 '포화' 및 '보통' 섬유가 있습니다.
순수한 IIx 유형 섬유를 식별하기 위해 MHCIIx 항체 대신 Actin을 사용하는 참신함
이전에는 순수한 IIx 광섬유를 식별하기 위해 MHCIIx 신호를 도트 블롯의 MHCI 및 MHCIIa 신호와 주관적으로 비교했으며, 제거 과정을 통해 MHCI 또는 IIa 신호가 없지만 MHCIIx 신호가 있는 광섬유를 순수한 IIx로 식별했습니다. 그러나 동일한 막에 두 개의 마우스 IgM 1차 항체(MHCIIx 및 MHCI)를 사용할 때 문제가 발생할 수 있습니다. 1차 항체 사이의 막을 벗겨냈음에도 불구하고 잔류 항체 신호가 검출될 수 있습니다. 토끼 항액틴 1차 항체를 사용하면 이러한 문제가 발생하지 않습니다. 여기서 우리는 Actin을 사용하여 섬유가 수집되었음을 확인하고 MHCI와 MHCIIa가 모두 없는 경우 IIx 섬유가 존재했음을 나타냅니다. 그런 다음 잠재적인 IIx 섬유는 MHCIIx 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅으로 확인합니다(이 논문의 그림 5 및9의 그림 2 참조). 6H1 항체는 쥐의 골격근에서 MHCIIx에 해당하는 전기영동으로 분리된 띠를검출하고 마우스, 쥐 및 인간 근육의 단면에서 IIx 섬유를 표지하는 것으로 나타났다2.
웨스턴 블롯 섬유 유형 확인
동일한 겔에서 동일한 생검의 모든 섬유 유형별 샘플을 실행하는 것이 가장 좋습니다. MHCIIx와 동일한 2차 항체가 필요한 MHCI 항체의 경우, 그림 5와 같이 I형 및 IIx 시료는 주어진 겔에서 적어도 하나의 레인으로 분리되어야 합니다. 단백질 함량은 다양한 섬유 크기로 인해 섬유 유형별 샘플에 따라 달라지므로, 첫 번째 겔을 사용하여 모든 샘플에서 유사한 양의 단백질을 얻기 위해 후속 겔 실행에서 로드해야 하는 샘플의 부피를 결정해야 합니다. 이를 위해, 주어진 샘플의 총 단백질은 UV 활성화 겔 이미징 기술을 사용하여 결정되어 이동 전에 SDS-PAGE에 의해 겔에서 분리된 모든 단백질 밴드를 시각화합니다. 각 샘플의 총 단백질은 겔 이미지로부터 결정되고 골격근 조직의 여러 알려진 질량의 보정 곡선이 섬유 유형 특이적 샘플 3,4,6,17과 함께 실행되는 경우 다음 웨스턴 블롯 실행에서 불균등한 로딩을 수정하는 데 사용됩니다. 또한 총 단백질을 측정하기 위해 Actin과 같은 '하우스키핑(housekeeping)' 단백질을 사용할 필요가 없으며, 이는 또한 자체 보정 곡선(15)을 필요로 한다. 이 기술은 총 단백질을 측정하는 시간을 절약하고 정확한 방법이며, 관심 단백질을 검출하기 위해 멤브레인의 모든 부분을 최대화하면서 추가 시약이나 단백질 표준물질 없이 매우 적은 샘플(즉, 섬유의 ~1/59)로 수행할 수 있습니다.
웨스턴 블롯 단계 중 면역 표지의 경우, 다른 MHC 동형에 비해 MHCIIx의 함량이 상대적으로 낮기 때문에 MHCIIx 항체가 먼저 적용됩니다. 멤브레인이 MHCI 항체 검출을 위해 준비되면 두 단계의 스트리핑(즉, MHCIIx 및 MHCIIa 검출 후)을 거쳤을 것입니다. 결과적으로, MHCI의 검출은 주로 유형 I 샘플에서 검출되어야 하며, 이전 MHC 항체에서 검출된 최소한의 잔류 신호와 함께 검출되어야 합니다(그림 5). 웨스턴 블로팅은 동일한 멤브레인 부분에서 3개의 MHC 항체를 모두 사용하여 각 섬유 유형별 샘플의 순도를 확인하는 데 사용됩니다. 그러나, MHCI 또는 MHCIIx 항체가 토끼 또는 염소와 같은 다른 숙주 종에서 사육되는 경우 스트리핑의 필요성이 제거될 것입니다.
응용 프로그램
여기에 설명된 방법론은 인간 골격근에서 섬유 유형 특이적 단백질 발현을 검사하기 위해 신선 또는 동결 건조된 골격근에서 단일 섬유 세그먼트를 타이핑하는 섬유에 활용할 수 있습니다. 또한, 신선한 근육 샘플을 사용하여 온전한 섬유 또는 기계적으로 껍질을 벗긴 섬유를 사용할 수 있습니다6. 껍질을 벗긴 섬유를 사용하면 세포질 및 막 구획과 같은 세포 내 구획에서 단백질 발현을 추가로 검사할 수 있습니다. 이 응용 프로그램은 이전에 건강한 사람과 당뇨병 환자의 기계적으로 껍질을 벗긴 섬유 세그먼트에서 결합되는 글리코겐과 결합되지 않은 글리코겐의 양을 측정하는 데 사용되었습니다6. 중요한 것은 MyDoBID가 변성된 샘플만 사용하는 실험에 유용하며 원래 상태의 단백질이 필요한 연구에는 적합하지 않다는 것입니다. 효소 분석 또는 용액 내 단백질체 접근법과 같은 다른 분석이 기본 조건에서 수행될 수 있지만, MyDoBID를 사용하여 MHC 동형 식별을 위해 섬유의 일부를 제거할 수 있도록 추가 최적화가 필요합니다.
요약하면, 유형 I, 유형 II 및 유형 IIx는 웨스턴 블로팅에 일반적으로 사용되는 쉽게 구할 수 있는 소모품과 함께 간단한 기술을 적용하여 성공적으로 식별할 수 있습니다. 여기에는 광범위한 실용적인 정보가 포함되어 있으며, 성공적으로 완료되면 향후 연구를 위해 가능한 최고의 품질, 무결성 및 신뢰성을 갖춘 섬유 유형별 샘플을 생산할 수 있습니다. 이 기술은 섬유 특이적 골격근 생화학 분석을 수행하는 데 실용적이고 선호되는 접근 방식입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구에 사용된 MHC I(A4.840) 및 MHCIIa(A4.74)에 대한 항체는 H. M. Blau 박사에 의해 개발되었으며 MHCIIx(6H1)에 대한 항체는 Dr. C. A. Lucas에 의해 개발되었으며 National Institute of Child Health and Human Development의 후원 덕분에 Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)에서 획득했으며 아이오와 대학교에서 유지 관리했습니다. 생명과학부(아이오와주 아이오와시티). 이 연구를 위해 인체 근육 샘플을 제공한 Victoria L. Wyckelsma에게 감사드립니다. 그림 1의 이미지 대부분은 BioRender.com 에서 가져온 것입니다.
자금:
이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
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