Fibertypeidentifikasjon av menneskelig skjelettmuskulatur

Summary

Denne protokollen demonstrerer enkeltfiberisolasjon fra frysetørket human skjelettmuskulatur og fibertypeklassifisering i henhold til Myosin heavy chain (MHC) isoform ved bruk av prikkblottingsteknikken. Identifiserte MHC I og II fiberprøver kan deretter analyseres videre for fibertypespesifikke forskjeller i proteinuttrykk ved bruk av vestlig blotting.

Abstract

Teknikken beskrevet her kan brukes til å identifisere spesifikke myosin heavy chain (MHC) isoformer i segmenter av individuelle muskelfibre ved hjelp av dot blotting, heretter referert til som Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Denne protokollen beskriver prosessen med frysetørking av menneskelig skjelettmuskulatur og isolering av segmenter av enkeltmuskelfibre. Ved bruk av MyDoBID klassifiseres type I- og II-fibre med henholdsvis MHCI- og IIa-spesifikke antistoffer. Klassifiserte fibre blir deretter kombinert i fibertypespesifikke prøver for hver biopsi.

Det totale proteinet i hver prøve bestemmes av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og UV-aktivert gelteknologi. Fibertypen av prøver valideres ved hjelp av vestlig blotting. Viktigheten av å utføre normalisering av proteinbelastning for å forbedre målproteindeteksjon over flere vestlige flekker er også beskrevet. Fordelene ved å konsolidere klassifiserte fibre i fibertypespesifikke prøver sammenlignet med enkeltfiber vestlige blots, inkluderer prøveallsidighet, økt prøvegjennomstrømning, kortere tidsinvestering og kostnadsbesparende tiltak, samtidig som verdifull fibertypespesifikk informasjon som ofte overses ved hjelp av homogeniserte muskelprøver. Formålet med protokollen er å oppnå nøyaktig og effektiv identifisering av type I- og type II-fibre isolert fra frysetørkede humane skjelettmuskelprøver.

Disse individuelle fibrene blir deretter kombinert for å lage type I og type II fibertypespesifikke prøver. Videre er protokollen utvidet til å omfatte identifisering av type IIx-fibre, ved bruk av aktin som markør for fibre som var negative for MHCI og MHCIIa, som er bekreftet som IIx-fibre ved vestlig blotting. Hver fibertypespesifikk prøve brukes deretter til å kvantifisere uttrykket av forskjellige målproteiner ved hjelp av vestlige blottingsteknikker.

Introduction

Skjelettmuskulatur er et heterogent vev, med distinkte cellulære metabolske og kontraktile egenskaper som er avhengig av om cellen (fiber) er langsom rykk (type I) eller rask rykning (type II). Fibertypen kan identifiseres ved å undersøke isoformene myosin heavy chain (MHC), som avviger fra hverandre på flere måter, inkludert sammentrekningstid, forkortelseshastighet og utmattelsesmotstand¹. Store MHC-isoformer inkluderer type I, type IIa, type IIb og type IIx, og deres metabolske profiler er enten oksidative (type I og IIa) eller glykolytiske (IIx, IIb)¹. Andelen av disse fibertypene varierer i muskeltype og mellom arter. Type IIb er mye funnet i gnagermuskel. Menneskelige muskler inneholder ingen type IIb-fibre og består hovedsakelig av MHC-isoformer type I- og IIa-fibre, med en liten andel IIx-fibre². Proteinuttrykksprofiler varierer mellom forskjellige fibertyper og kan endres med aldring³, øvelse ^4,5 og sykdom⁶.

Måling av cellulære responser i forskjellige skjelettmuskelfibertyper blir ofte oversett eller ikke mulig på grunn av undersøkelse av muskelhomogenater (en blanding av alle fibertyper). Single-fiber western blot tillater undersøkelse av flere proteiner i individuelle muskelfibre⁷. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å produsere nye og informative enkeltfiberegenskaper som ikke var mulig å oppnå ved bruk av homogenatpreparater. Imidlertid er det noen begrensninger i den opprinnelige single-fiber western blot-metoden, inkludert den tidkrevende naturen, manglende evne til å generere prøvereplikater og bruk av dyre, følsomme forbedrede kjemiluminescensreagenser (ECL). Hvis ferskt vev brukes, er denne metoden ytterligere begrenset på grunn av tidsbegrensningene for å måtte isolere individuelle fibre innen en begrenset tidsramme (dvs. 1-2 timer). Heldigvis reduseres denne begrensningen ved å isolere enkeltfibersegmenter fra frysetørket vev⁸. Imidlertid er fiberinnsamling fra frysetørkede prøver begrenset av størrelsen og kvaliteten på det biopsierte vevet.

Fibertypeidentifikasjon ved hjelp av punktblottingsmetoden⁹ har blitt betydelig utdypet og utvidet i denne omfattende protokollen. Tidligere har det blitt vist at så lite som ~ 2-10 mg våtvekt muskelvev er tilstrekkelig for frysetørking og enkeltfiber MHC isoform proteinanalyse⁹. Christensen et ^al.9 brukte 30% av et ~ 1 mm fibersegment for å oppdage MHC-isoformen tilstede ved prikkblotting, som ble bekreftet av vestlig blotting. Dette arbeidet viste at ved å erstatte vestlig blotting med prikkblotting, ble de totale kostnadene redusert med ~ 40 ganger (for 50 fibersegmenter). Fibre ble deretter "samlet" i type I og type II prøver, som tillot eksperimentell replikasjon⁹. Likevel var en begrensning at bare to fibertypespesifikke prøver ble oppnådd: type I (MHCI positiv) og type II (MHCII positive fibre), med type II-prøver som inneholdt en blanding av MHCIIa og MHCIIx ^6,10. Spesielt demonstrerer den nåværende protokollen hvordan rene type IIx-fibre kan identifiseres og gir en svært detaljert arbeidsflyt (oppsummert i figur 1), inkludert feilsøkingsstrategier for vanlige protokollproblemer.

Protocol

Humane muskelprøver ble tatt fra vastus lateralis fra n = 3 (2 menn, 1 kvinne), i alderen 70-74 år under sterile forhold ved bruk av lokalbedøvelse (Xylocaine) og en Bergstrom nål modifisert for manuell suging^11,12. Prøvene var en undergruppe av en tidligere studie godkjent av Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) og utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen¹³. Deltakerne ga skriftlig, informert samtykke til å delta i denne studien. Fullstendige detaljer om alt materiale som kreves for denne protokollen, vises i materialfortegnelsen. I tillegg finnes det en liste over feilsøkingsstrategier som løser vanlige protokollproblemer i tabell 1.

1. Frysetørking

1. Mens du holder de biopsierte muskelprøvene frosset på tørris, veier og tarer du et tomt frossent rør på vekten.
2. Vei raskt minst 10 mg våtvekt frosset vev. Registrer tykkelsen til én desimal.
3. Legg vevet i det forkjølte mikrosentrifugerøret som har fått 3-4 hull stukket inn i lokket og legg det i et lite beger med 2-3 pellets tørris.
4. Følg produsentens bruksanvisning for frysetørkeren.
5. Forsikre deg om at alle ventilene på frysetørkeren er lukket, og slå på frysetørkeren.
6. Bruk kontrollpanelet til å kontrollere at vakuumsettpunktet er programmert for optimale frysetørkingsforhold for humant vev, 0,12 millibar (mBar) (figur 2).
7. Trykk manuelt på frysetørkeren og vent til kammeret er avkjølt til -40 ^oC.
8. Når kammeret har nådd den temperaturen, fjern lokket, deretter glasskammeret, og plasser begeret (med muskelprøve) på metalltrinnet.
9. Sett glasskammeret og lokket på plass. Lukk vakuumutløsningsventilen på lokket og vent til vakuumvektlyset lyser grønt for å sikre at tørketrommelen er vakuumforseglet.
10. Frysetørke muskelprøvene i 48 timer. Når frysetørkingen er fullført, slår du av vakuumpumpen ved å trykke på vakuumknappen og åpner vakuumutløsningsventilen på lokket.
11. Fjern lokket på kammeret og samle den frysetørkede prøven. Vei vevet og registrer vekten til ett desimal.
12. Beregn prosentvis tap av vekt; ~ 75% reduksjon i vekt indikerer at vevet er vellykket frysetørket (i dette arbeidet, gjennomsnitt ± SD, 76 ± 9%, n = 11 muskelprøver).
13. Trykk på AUTO for å slå av vakuumpumpen og fryseren. La enheten nå omgivelsestemperatur.
14. Rengjør kjølespolene i henhold til produsentens instruksjoner og tøm akkumulert væske fra oppsamleren.
    MERK: Fiberinnsamling kan starte umiddelbart. Når vev ikke brukes til fiberisolering, skal frysetørket prøve oppbevares ved -80 °C i en forseglet beholder med tørkekuler.  FORSIKTIG: Tørris er farlig (klasse 9); Se MSDS for anbefalt sikker håndtering.

2. Fiber samling

1. Forberedelse av fibersamling
   1. Merk minst 50 mikrofugerør (fiber 1 til 50) og pipette 10 μL denatureringsbuffer til hvert rør.
   2. Forbered oppsamlingsområdet med to par finvevsdissekerende tang, lofritt vev, en benchtop-lampe, et stereomikroskop (med den svarte scenen opp), en virvel og en benkesentrifuge.
   3. Legg den frysetørkede muskelprøven på et petriskållokk. Plasser lokket på scenen av dissekeringsmikroskopet.
   4. Se videoen av single-fiber disseksjon. Øv den komplette protokollen fra fiberinnsamling til enkeltfibertypeidentifikasjon minst to ganger før du starter en studie.
   5. Før fiberinnsamling, beregne det totale volumet som kreves for en fibertypeprøve fra hver biopsi som følger. Hvis for eksempel startvolumet på 1 fiber = 10 μL og gjenværende volum etter MyDoBID er (1 fiber × 10 μL) - 1 μL brukt til punktblotting = 9 μL (prøvevolum), beregner du det totale prøvevolumet som kreves ved å multiplisere prøvevolumet (μL) med det totale antallet vestlige flekker som skal kjøres, og doble dette beløpet for å ta hensyn til redundans: (9 μL × 4 vestlige flekker) × 2 = 72 μL. Beregn antall fibre som kreves per maskinskrevne prøve ved å dividere det endelige prøvevolumet som kreves (μL) med prøvevolumet per fibertypespesifikk prøve (f.eks. 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibre per fibertypespesifikk prøve). For at dette skal oppnås, samle totalt 50 fibre.
      MERK: Prøvevolumet som kreves er den minste proteinkonsentrasjonen som kreves for å kjøre både MyDoBID og western blotting hvis mengden protein som lastes tilsvarer en ~ 3 mm fiber (~ 12 μg våtvekt) for hver prøve (se tilleggsfil 1 for detaljer). Dette volumet har imidlertid ingen betydning for om gjentatte geler er nødvendige for et gitt protein.  FORSIKTIG: Tang er skarp; Håndter dem med forsiktighet for å unngå risiko for hudpunktering.
2. Enkeltfiberisolasjon
   1. På et lite stykke papir 5 cm x 1 cm, bruk en linjal til å tegne en 1 cm linje. Merk hver 1 mm på den linjen.
   2. Sett dette inn under petriskållokket som en veiledning for å estimere lengden på fibrene som samles inn.
   3. Plasser den frysetørkede muskelprøven under stereomikroskopet ved lav forstørrelse (x 7,5). Bruk ett par finvevsdissekerende tang for å holde den frysetørkede muskelen på plass, og med den andre begynner å skille små bunter av fibre (som vist i videoen).
   4. Isoler en bunt fibre og fortsett å erte fra hverandre til enkeltfibersegmenter er isolert fra bunten.
   5. Samle minst 50 fibre som er minst ~ 1 mm i lengde.
   6. Flytt fiberen til et tomt rom på petriskålen. Inspiser enkeltfibersegmenter under høyere forstørrelse (x 50). Forsikre deg om at det er en enkelt fiber ved å separere fiberen ytterligere på enden. Hvis fiberen går i stykker i stedet for å skille seg, er det en enkelt fiber.
3. Denaturering av fibre
   1. Bruk tang til å samle fiberen forsiktig og plassere den direkte i den aliciserte denatureringsbufferen (ikke la tangen møte bufferen).
   2. Kontroller tangen under mikroskopet for å sikre at fiberen er fjernet. Lukk røret og bank bunnen av røret fast på benken tre ganger for å sikre at fiberen beveger seg inn i bufferen.
   3. Tørk tangen ren med lofritt vev før du går videre til neste fiber. Gjenta denne prosessen til alle fibrene er samlet.
   4. Virvel fiberprøvene og sentrifuge kort i 5 s ved 2,500 × g for å trekke prøven til bunnen av røret.
      MERK: Sentrifugeringsvarigheten (5 s) er tidsbestemt fra starten (0 × g) til hastigheten når ~ 2,500 × g.
   5. La prøvene stå i romtemperatur i 1 time. Oppbevares ved -80 °C for fremtidig bruk. Frys og tine deretter prøvene før bruk.

3. Prikkblotting

1. Membranforberedelse og aktivering
   1. Mål, merk og kutt til størrelse en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (0,2 μm porestørrelse) for å passe 50 prøver (~ 10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Merk venstre kantlinje numerisk fra topp til bunn (1 til 10) og den øverste kantlinjen alfabetisk fra venstre mot høyre (A til E) fordelt 1 cm fra hverandre.
   3. Forbered fire ark filterpapir med dimensjonene 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Stable to ark sammen for å danne en stabel. Bløtlegg filterpapirbunken i 1x overføringsbuffer.
   5. Plasser membranen i en beholder. Hell 95% etanol over membranen, med nok volum til å fordype membranen helt (10-15 ml). Rør på vippen i 1 min.
   6. Samle etanolen, senk membranen i 1x overføringsbuffer (~ 15 ml), og rock i ytterligere 2 minutter.
      MERK: Både etanol og overføringsbuffer kan gjenbrukes for fremtidige punktblottingseksperimenter til sedimenteringsformer (endres etter seks bruksområder).
   7. Legg filterpapirbunken gjennomvåt av overføringsbuffer på en flat, bevegelig overflate, for eksempel et stort lokk, og flat med rullen. Plasser PVDF-membranen på stabelen ved hjelp av en gelutløser eller pinsett.
   8. Legg et enkelt ark med tørt filterpapir på toppen av membranen og flytt rullen over filterpapiret for å suge opp overflødig buffer på membranoverflaten. Fjern det øverste filterpapiret uten å gni membranen.
      FORSIKTIG: Metanol (klasse 3, underrisiko 6.1) og etanol (klasse 3) er farlige. Se sikkerhetsdatabladet (MSDS) for anbefalinger for sikker håndtering.
2. Prøveabsorpsjon til membranen
   1. Tine fiberprøvene, utfør en kort sentrifuge (5 s) ved romtemperatur som i trinn 2.3.4 og bland prøven grundig.
   2. Uten å berøre membranen med pipettespissen, avsett sakte en ~ 1 μL dråpe av hver prøve på membranen i det angitte området. Dimensjonene til det angitte området per fiberprøve er ~ 1 cm x 1 cm. Ta sikte på å få øye på prøven i midten av dette området.
   3. La prøvedråpene trekke gjennom membranen i minst 15 minutter. Forsikre deg om at ingen prøvebuffer forblir og absorberes fullstendig.
   4. Bruk plastpinsett, løft membranen forsiktig av den fuktige filterpapirbunken, legg den på et enkelt tørt ark med filterpapir og dehydrer membranen i minst 5 minutter.
   5. Når prøveflekkene blir helt hvite, aktiverer du membranen igjen.
3. Membranreaktivering og blokk
   1. Aktiver membranen på nytt ved å gjenta trinn 3.1.5 og 3.1.6.
   2. Legg membranen i vaskebuffer og skyll i 5 min med gynging. Kast vaskebufferen.
   3. Inkuber membranen i blokkeringsbuffer i 30 minutter mens du gynger.
   4. Skyll membranen 3x med vaskebuffer til bufferen ikke lenger er uklar.
   5. La membranen stå i den endelige vasken på vippen.

4. Immunmerking

1. Påvisning av MHCIIa
   1. Fortynn det primære antistoffet MHCIIa ved 1 av 200 i 10 ml buffer av bovint serumalbumin (BSA).
   2. Kast vaskebufferen fra membranen og hell deretter det fortynnede MHCIIa-antistoffet på membranen.
   3. Plasser beholderen (med membranen i MHCIIa) på vipperen ved romtemperatur i 2 timer eller ved 4 °C over natten.
   4. Samle opp MHCIIa-antistoffet og oppbevar det ved 4 °C. Vask membranen med blokkeringsbuffer i 2 min på vippen.
      MERK: Alle primære antistoffer kan gjenbrukes opptil fem ganger så lenge bufferen er klar.
   5. Skyll to ganger til; 5 min hver gang; Tre vasker totalt.
   6. Fortynn mus Immunoglobulin G pepperrotperoksidase (IgG-HRP) sekundært antistoff ved 1 i 20.000 i 10 ml blokkerende buffer og legg til membranen.
   7. Kast vaskebufferen og inkuber membranen i musens IgG-HRP sekundært med gynging i 1 time.
   8. Kast sekundæret og vask membranen i vaskebuffer (2, 5, 5 min).
   9. La membranen ligge i bløt i den endelige vasken til den er klar for avbildning.
   10. Slå på gelavbildningen, vent i 15 minutter til bildeapparatet når ønsket driftstemperatur, og åpne deretter bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse).
   11. I programvarevinduet klikker du på New Single Channel Protocol (figur 3A). For et hvitt lysbilde av membranen, under Applikasjoner | Blots | klikk på Kolorimetrisk (figur 3B).
   12. Klikk på gelområdet; Hvert alternativ er programmert for spesifikke dimensjoner for å passe til størrelsen på forskjellige geltyper. Velg riktig alternativ som passer best til membranens dimensjoner (figur 3C).
   13. Forbered ECL ved å kombinere luminol- og peroksidasereagenser i forholdet 1:1. Lag et tilstrekkelig volum ECL-blanding for å dekke hele membranen, vanligvis kreves et totalt volum på 800-1,000 μL.
   14. Plasser membranen på et stort, klart plastbrett og spre ECL-blandingen på membranen.
   15. Plasser membranen på bildeplaten.
   16. Klikk på Position Gel (gul knapp) for en live kameravisning. Klikk på hold og dra zoomknappen for å maksimere bildeområdet til membranen. På dette tidspunktet må du rette membranens posisjon om nødvendig.
   17. Klikk Kjør protokoll (grønn knapp) og vent på at et kolorimetrisk bilde av membranen skal produseres. Lagre dette bildet for å hjelpe til med å matche prikkene til den tilsvarende fiberprøven.
   18. Uten å flytte membranen, endrer du programmet på programvaren ved å klikke på alternativet for en 2 x 2 binning (Chemi High Resolution) (figur 3D).
   19. Under Bildeeksponering og programvare optimaliserer du eksponeringstiden og klikker på Svake bånd (figur 3E) | Signalakkumuleringsmodus.
   20. Under Oppsett skriver du inn 1 s for det første bildet, 30 s for det siste bildet og 30 bilder totalt (figur 3F).
   21. Klikk på Kjør protokoll.
   22. Lagre et bilde i følgende stadier: før signalmetning (alle synlige prikker er svarte), innledende signalmetning (noen prikker begynner å mette) og overmettede flekker (alle flekker med sterkt signal oppdaget er mettede).
   23. Lagre alle nødvendige bilder før du avslutter signalakkumuleringen. Ta membranen ut av bildet.
   24. Bruk gelutløseren til å plassere membranen tilbake i beholderen med vaskebufferen.
2. Påvisning av MHCI
   1. Hell vaskebufferen ut og behandle membranen med strippebuffer i 30 min ved 37 °C (sørg for at membranen er helt nedsenket).
   2. Samle strippebufferen på nytt og skyll membranen i vaskebuffer i 5 min med vipping.
      MERK: Strippebuffer kan gjenbrukes 10x før kassering.
   3. Hell ut vaskebufferen og påfør denne gangen MHCI primærantistoff fortynnet i en startkonsentrasjon på 1 av 200 (område: 1 i 200 til 1 i 500). Rock membranen ved romtemperatur i 1 time.
   4. Etter inkubering i MHCI primært antistoff, samle antistoffet og vask membranen som i trinn 4.1.4 og 4.1.5.
   5. Fortynn mus IgM HRP sekundært antistoff i blokkering buffer på 1 i 20.000. Hell ut blokkeringsbufferen fra membranen og inkuber i musen IgM sekundær som i trinn 4.1.7.
   6. Vask og bildeopptak oppdaget MHCI som i trinn 4.1.8 til 4.1.24.
      FORSIKTIG: Strippebuffer inneholder organisk fosfin 3-5% (klasse 8). Se HMS-databladet for anbefalinger for sikker håndtering.
3. Påvisning av potensiell MHCIIx ved bruk av aktin
   1. Strip membranen en gang til (trinn 4.2.1 og 4.2.2).
   2. Gjenta pkt. 4.1, denne gangen ved bruk av primært aktinantistoff fortynnet ved 1 av 500 i BSA-buffer og deretter kanin HRP sekundært antistoff fortynnet ved 1 av 20 000 i blokkerende buffer.

5. Identifikasjon av fibertype

1. MHCI-, MHCIIa- og aktinsignalanalyse
   1. Bli kjent med signalintensitetspanelet (figur 4A). Noter trinnene 5.1.2 til 5.1.4.
   2. En mettet signalintensitet indikerer kvalitativt at proteindeteksjonen er sterk.
   3. En moderat indikerer at målproteinet er tilstede på et middels nivå.
   4. Et svakt signal indikerer at lite målprotein er tilstede.
   5. Bruk signalintensitetspanelet til å kategorisere fibre med "mettet", "moderat" eller "svakt" signalintensitet (figur 4A).
   6. Utfør fibertypeidentifikasjon ved å sammenligne MHCIIa- og MHCI-resultater først (figur 4B, venstre og midtre flekker).
   7. Ta opp fibre med mettet eller moderat signalintensitet på bare en MHC-isoform.
   8. Hvis MHC-isoformsignalet er "svakt", la fiberen være umerket (se figur 4B).
   9. Til slutt, hvor aktin observeres (moderat eller mettet signalintensitet) i fibrene uten at MHCI eller IIa oppdages, registrer det som en potensiell type IIx-fiber (figur 4B, høyre flekk).
   10. Ta opp fibre med svakt MHC-isoformsignal, men aktin påvist (moderat eller mettet intensitet) som uidentifisert.
   11. Kast prøver med svak eller ingen deteksjon (ingen fiber samlet) for alle tre målproteinene (figur 4C).
   12. Ta opp fiber der både MHCI- og MHCII-signaler oppdages med et "mettet" eller moderat signal. Disse prøvene er ikke til bruk i fibertypespesifikt preparat.
2. Fremstilling av fibertypespesifikke prøver
   1. Forbered en separat type I og type II prøve for hver biopsi. For en type II-prøve, kombiner det minste nødvendige antall fibre (beregnet i trinn 2.1.5) der MHCIIa detekteres ved mettede eller moderate nivåer.
   2. I et separat rør merket som type I, gjenta denne prosessen for fibre der MHCI oppdages (figur 4D).
   3. Bruk fibre med moderat signalintensitet hvis det ikke er nok fibre med mettede signaler.
   4. Kombiner eventuelle IIx-fibre.
   5. Bruk umiddelbart fibertypespesifikke prøver for vestlig blotting eller oppbevar dem ved -80 °C for fremtidig bruk.

6. Western blot fiber type bekreftelse

1. Bruk 10 μL av hver fibertypespesifikke prøve (minimum prøvevolum som kreves, se trinn 2.1.5).
2. Separate prøver ved bruk av spesifisert prefabrikert gel via SDS-PAGE i henhold til produsentens protokoll.
3. Bruk et gelbildeapparat for å oppdage proteinet i gelen i henhold til produsentens protokoll.
4. Sett gelen i kald 1x overføringsbuffer i 10 minutter.
5. Våt overføring av proteinene til en 0,45 μm nitrocellulosemembran (9,5 cm x 13,5 cm) i henhold til produsentens protokoll.
6. Etter overføring, skyll membranen kort med ultraren H₂O i en beholder. Hell ut det ultrarene vannet.
7. Tilsett 10 ml antistoffsignalforsterkerløsning til membranen og rock ved romtemperatur i 10 minutter.
8. Samle antistoffsignalforsterkerløsningen og vask 5x (5 s per vask) med ultraren H₂O.
   MERK: Antistoffsignalforsterkerløsning kan brukes 5x før kassering.
9. Hell ut den siste vasken, tilsett blokkeringsløsningen og rock ved romtemperatur i 1 time.
10. Bruk et rent skalpellblad eller saks til å skjære horisontalt over membranen med en molekylvekt som sikrer at proteiner som er 180 kDa og over er på den øverste delen av membranen.
11. Bruk denne øverste delen for ytterligere fibertypebekreftelse.
12. Bruk delen under 180 kDa for å oppdage forskjellige målproteiner.
13. På den øverste delen av membranen, følg pkt. 4.1 med MHCIIx primært og mus immunglobulin M (IgM) HRP sekundært antistoff.
14. Strip membranen (som beskrevet i pkt. 4.2.1 og 4.2.2) før prosessen gjentas med MHCIIa IgG primær og mus IgG HRP sekundært antistoff.
15. Strip en gang til og til slutt bruke MHCI IgM primære og mus IgM HRP sekundære antistoff.
    MERK: Dette trinnet er kvalitativt, og derfor er noe proteintap på grunn av membranstripping ikke et problem.
16. Sammenlign signalet oppdaget over de forskjellige MHC-isoformene (som vist i figur 5B). Når signalintensiteten oppdages ved moderate til mettede nivåer i den forventede prøven (MHCI - type I, MHCIIa - type II og MHCIIx - type IIx), vil fibertypespesifikke prøver bli registrert som pålitelige for bruk i fremtidige studier.
17. Registrer prøven som upålitelig når mer enn én MHC-isoform oppdages likt i en prøve.
    FORSIKTIG: Antistoffforsterkerløsning inneholder natriumhydroksid 50%. Se MSDS for anbefalinger for sikker håndtering.

Representative Results

Identifisering av individuelle MHCI-, MHCIIa- og MHCIIx-muskelfibre ved bruk av prikkblotting
Et trekk ved MyDoBID er kategoriseringen av den varierende MHC- og aktinsignalintensitetsstyrken i en gitt fiber (figur 4A). Fibertype ble identifisert ved tilstedeværelse eller fravær av MHCI- og IIa-isoformer (figur 4B). Seks fibre viste ingen MHC- eller aktindeteksjon, noe som indikerte at det ikke var oppsamlet fiber. Resultatene av denne spesifikke prikkflekken var identifiseringen av 22 type II-fibre, 7 type I-fibre og 3 potensielle type IIx-fibre; 2 uidentifiserte prøver og 6 prøver ble klassifisert som 'No Fiber' samlet inn (figur 4B, C). Fibre som ikke hadde noe påviselig MHCI- eller MHCIIa-signal ennå, var positive for aktin, ble identifisert som potensielle type IIx-fibre ved en eliminasjonsprosess. Ved å bruke signalintensitetspanelet til å klassifisere MHCI- og IIa-signalstyrke, ble "moderate" eller "mettede" fibre kombinert for å produsere henholdsvis type I- eller II-prøver. Fibre som ikke ble identifisert eller hadde svak eller ingen aktin påvist, ble ikke inkludert i påfølgende analyse og ble kassert (figur 4D).

Bekreftelse av fiberskriving ved hjelp av vestlig blotting
De fibertypespesifikke prøvene ble validert ved hjelp av western blotting og MHC-spesifikke antistoffer (figur 5). Type I og type II fiberprøver fra en individuell biopsi ble kjørt sammen med en type IIx-prøve, som var en prøve av potensielle type IIx-fibre fra to individer på grunn av det lave antallet type IIx-fibre som var tilstede i hver biopsi. Western blot-data bekreftet at fibertypeidentifikasjonen var vellykket.

Figur 1: Sammendrag av arbeidsflyt som beskriver prøvepreparering, fibertyping og western blot-bekreftelse av fiberspesifisitet . (A) Humant vev frysetørkes i 48 timer. (B,C) Enkeltfibersegmenter isoleres under et dissekerende mikroskop. (D) Fibrene denatureres og (E) etter 1 time, lagres ved -80 °C. (F) Primær antistoffinkubasjonsrekkefølge. (G) Fibre ble prikkblottet og fibertype identifisert ved hjelp av MHCIIa (type II), MHCI (type I) og aktin (IIx?, potensiell type IIx fiber). (H) Fibre ble deretter samlet. (I) Fibertypespesifikke prøver sammen med en kalibreringskurve analyseres via SDS PAGE og vestlig blotting. (J) Validering av fibertypeidentifikasjon ved hjelp av vestlig blotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjerm og kontrollpanel for frysetørkingssystemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Bildeinnstillinger for hvit lysfangst av membranen etterfulgt av kjemiluminescerende deteksjon av målproteiner. For å avbilde membranen under hvitt lys, (A) velg Ny enkeltkanal etterfulgt av (B) Blots | kolorimetrisk applikasjon. (C) Basert på størrelsen på gelen som brukes, velg riktig bildeområde, og ta deretter et hvitt lysbilde ved å trykke på Kjør protokoll. (D) Uten å flytte membranen, gjenta trinn B , men denne gangen, velge Blots | Chemi Hi-oppløsning. Før du trykker på kjør, velger du (E) Bildeeksponering for å optimalisere for svake bånd og (F) konfigurerer signalakkumuleringsmodus og angir i første omgang eksponeringstiden for hvert sekund i totalt 30 sekunder med merket av for høylysmettede piksler . Trykk på Kjør protokoll og la kjøringen fullføres før du velger de beste bildene for lagring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Identifikasjon av fibertype. (A) Fibertyper ble identifisert i forhold til alle andre fibre på membranen, kategorisert av signalintensitetspanelet for hver MHC-isoform som ble oppdaget (f.eks. MHCI-signal: mettet, moderat og svak). (B) Ved bruk av panelet i (A) identifiserte MHCIIa-antistoffet type II-fibre (blått, venstre blott), og etter stripping av membranen identifiserte MHCI-antistoffet type I-fibre (rød, midtblot). Aktinantistoff ble brukt til å identifisere potensielle IIx-fibre hvis et positivt aktinsignal ble detektert i fibre der det ikke ble påvist noe tidligere MHCI- eller IIa-signal (grønt, høyre blott). Fibre som ikke fulgte disse retningslinjene er uthevet i lilla (uidentifisert). Til slutt indikerte prøver som var negative for aktinsignalet at ingen fiber hadde blitt samlet inn ("No Fiber"). (C) Tabell som viser fibermerking som tilsvarer prøveposisjonen på prikkflekker vist i (B). (D) Oversikt over fibervalg for fremstilling av fibertypespesifikke prøver. Målet var å samle 10 mettede fibre for hver fibertype. Her, for type II-fibre, ble åtte mettede fibre identifisert og samlet. For type I-fibre var mindre enn 10 mettede fibre tilstede, så fibre med moderat signalstyrke ble også valgt. For type IIx-fibre ble to fibre identifisert og samlet. Hvis mindre enn 10 fibre (mettet og moderat) identifiseres, kan det være nødvendig med ytterligere fiberinnsamling.  MERK: Aktinsignalet vist i (B) har ikke nådd metning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Western blot-bekreftelse av fibertypeidentifikasjon. Fibertypeidentifikasjon ble utført i henhold til figur 4 for å generere type I (~ 10 fibre) og type II (~ 10 fibre) prøver. Siden det ikke var identifisert IIx-fibre fra samme biopsi, ble IIx-prøven vist her produsert fra mer enn én muskelprøve (n = 2 individer). En liten alikot av hver fiberspesifikk prøve analyseres ved vestlig blotting for å bekrefte fibertypeidentifikasjon. Molekylvektmarkører (kDa) er indikert til venstre, fanget under hvitt lys uten å bevege membranen. Målproteiner oppdages i sekvensen av MHCIIx, MHCIIa og MHCI, med myosinet fra den UV-aktiverte gelen som visuelt indikerer mengden protein lastet per prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Feilsøkingsstrategier for vanlige protokollproblemer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Beregning av frysetørket fibermasse ved hjelp av en kalibreringskurve. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Fiber samling
Basert på flere års erfaring kan de fleste forskere mestre denne teknikken; Praksis fører imidlertid til raskere og mer effektiv fiberinnsamling for nedstrømsanalyser. For å kunne isolere 30 enkeltfibersegmenter av en kvalitet for sammenslåing, anbefales det at det samles inn 50 fibersegmenter per prøve. Det anbefales å studere fiberinnsamlingsvideoen nøye og etter å ha utført to treningsøkter (~ 50 fibre per økt) for å oppnå en rimelig standard. Alle innsamlede fibre gjennomgår MyDoBID for å identifisere fibertypen, noe som vil avsløre hvor effektivt teknikken utføres. Dette vil bli sett på som et lavt antall 'Ingen fiber' eller 'svakt' MHC-signal detektert i fiberprøver (se protokoll pkt. 5.1).

Det er kjent at muskler kan inneholde hybridfibre, hvor både MHCI og MHCIIa er til stede, eller MHCIIa og IIx ^2,14. En begrensning av MyDoBID er at tilstedeværelsen av en hybridfiber ikke kan fastslås fordi en prøve positiv for både MHCI- og MHCIIa-antistoffer kan være enten en hybridfiber eller at to fibre ble samlet. Videre kan MyDoBID ikke oppdage MHCIIa separat fra MHCIIa/IIx-hybrider, da det primære MHCIIa-antistoffet vil oppdage tilstedeværelsen av MHCIIa i både IIa- og IIa/IIx-fibre. Av disse grunner ble det ikke utført identifisering og klargjøring av prøver av hybridfibre, og prøver som har både MHCI- og MHCIIa-signaler som falt utenfor områdene beskrevet i signalintensitetspanelet, ble kassert (figur 4A). En ytterligere begrensning er at andelen muskelfibertyper i en prøve ikke kan bestemmes ved hjelp av MyDoBID, og bruk av konvensjonelle immunhistokjemiske analyser er nødvendig for å bestemme fibertypefordeling².

Prikkblotting
Signalintensitetspanelet og fibertype-ID er avhengig av at hele prøven er representert i det lille volumet som påføres punktblottingsmembranen. For å oppnå dette blandes prøven grundig ved omrøring før den legges på membranen. Alle fibre med bare en MHC-isoform går videre til neste trinn i sammenslåingen. På dette stadiet er det viktig at fiber med mer enn en MHC ikke må gå videre til dette neste trinnet med å kombinere prøver. Hvis en prøve er forurenset, må hele den samlede prøven kasseres, og forskeren må gå tilbake til fiberinnsamling og gjenta fiberisolasjons- og prikkblottingstrinnene.

Immunmerking
Tidligere ble det rapportert at 5 min er tilstrekkelig tid til å blokkere ikke-spesifikke steder på membranen for påvisning av MHCI og MHCIIa⁹. For å fremme teknikken til MyDoBID må det brukes et aktinantistoff. Det ble funnet at 5 min blokktid måtte økes til 30 min, som rapportert⁶, for å oppnå en membran med minimal bakgrunn, da 5 min blokkering resulterte i en mørkere membranbakgrunn. Blokkeringstid er en vurdering i enhver immundeteksjonsteknikk, for eksempel vestlig blotting eller immunhistokjemi, og bør modifiseres etter behov.

Stripping membranen
Stripping kan ikke brukes til kvantitative analyser¹⁵ fordi det også fjerner proteiner av interesse, men kan brukes i MyDoBID siden det er en kvalitativ analyse. Hensikten med stripping er å fjerne de bundne antistoffene fra overflaten av membranen, slik at et nytt antistoff kan brukes med minimal interferens fra det tidligere antistoffet. I MyDoBID er det mulighet for å påføre prøven over to membraner, hvor de forskjellige MHC-isoformene detekteres på separate membraner. Hvis denne tilnærmingen er å foretrekke, unngå å håndtere prøverøret mer enn én gang ved å laste flekkene samtidig. Dette vil sikre at tørketiden mellom hvert prøvepunkt er lik (~5 s forskjell) og påfølgende trinn utføres samtidig i separate beholdere. Det må bemerkes at dette alternativet vil øke tids-, prøve- og forbruksforbruket.

Antistoffer brukes til først å oppdage MHCIIa-fibre, etterfulgt av MHCI, fordi MHCI-antistoffet alltid gir et veldig lyst signal, noe som ville være vanskeligere å stripe enn MHCIIa. Aktin uttrykkes homogent i skjelettmuskulaturfibre og brukes til å bekrefte at en del av fiberen ble vellykket påført membranen som beskrevet ovenfor.

Avbildning, identifisering av fibertype og klargjøring av fibertypespesifikke prøver
Et nytt verktøy er utviklet i denne protokollen for å hjelpe til med fibertypeidentifikasjon og prøvevalg for å lage fibertypespesifikke prøver (figur 4A). Eksemplet vist i signalintensitetspanelet brukes til å definere MHCI-signalintensitet som: (i) mettet, (ii) moderat eller (iii) svak. For å samle fibre i fibertypespesifikke prøver, velges fibre som viser mettet signalintensitet først, og om nødvendig tilsettes fibre med moderat signalintensitet. Ved fremstilling av type I- og II-prøver er det vanligvis nok "mettede" og "moderate" fibre slik at fibre kategorisert som "svake" eller uidentifiserte kan kasseres.

Nyhet ved å bruke aktin i stedet for MHCIIx antistoff for å identifisere rene type IIx fibre
Tidligere, for å identifisere rene IIx-fibre, ble MHCIIx-signalet subjektivt sammenlignet med MHCI- og MHCIIa-signalet på en punktflekk, og ved en elimineringsprosess ble fibrene uten MHCI- eller IIa-signal, men med MHCIIx-signal, identifisert som rent IIx. Imidlertid kan det oppstå problemer når du bruker to primære antistoffer mot mus IgM (MHCIIx og MHCI) på samme membran. Til tross for stripping av membranen mellom primære antistoffer, kan gjenværende antistoffsignal påvises. Bruk av kaninantiaktin primærantistoff forhindrer at dette problemet oppstår. Her brukte vi Actin for å bekrefte at en fiber ble samlet inn og i fravær av både MHCI og MHCIIa, indikerer at en IIx fiber var tilstede. Potensielle IIx-fibre bekreftes deretter ved vestlig blotting ved bruk av MHCIIx-spesifikt antistoff (se figur 5 i denne artikkelen og figur 2 i⁹). 6H1-antistoffet har blitt vist¹⁶ for å oppdage det elektroforetisk separerte båndet som tilsvarer MHCIIx i rotteskjelettmuskulatur og merker type IIx-fibre i tverrsnitt av mus, rotte og menneskelige muskler².

Western blot fiber type bekreftelse
Det er best å kjøre alle fibertypespesifikke prøver fra samme biopsi på samme gel. Med MHCI-antistoff som krever samme sekundære antistoff som MHCIIx, bør type I- og IIx-prøver skilles med minst ett kjørefelt på en gitt gel, som vist i figur 5. Siden proteininnholdet vil variere over fibertypespesifikke prøver på grunn av variabel fiberstørrelse, bør den første gelen brukes til å bestemme volumet av prøve som må lastes i påfølgende gelkjøringer for å oppnå tilsvarende mengder protein på tvers av alle prøver. For å gjøre dette bestemmes det totale proteinet i en gitt prøve ved hjelp av UV-aktivert gelavbildningsteknologi for å visualisere alle proteinbånd som er separert i gelen av SDS-PAGE før overføring. Det totale proteinet i hver prøve bestemmes fra gelbildet og brukes til å korrigere ulik belastning i neste vestlige blot-løp, forutsatt at en kalibreringskurve av flere kjente masser av skjelettmuskelvev kjøres sammen med fibertypespesifikke prøver 3,4,6,17. Det er heller ikke nødvendig å bruke et "husholdningsprotein" som aktin for å bestemme det totale proteinet, noe som også vil kreve sin egen kalibreringskurve¹⁵. Denne teknologien er en tidsbesparende og nøyaktig metode for å bestemme det totale proteinet og kan utføres med svært liten prøve (dvs. ~ 1/5^th av en fiber⁹) uten behov for ekstra reagenser eller proteinstandarder, samtidig som alle deler av membranen maksimeres for å oppdage proteiner av interesse.

Når det gjelder immunmerking under det vestlige blot-trinnet, brukes MHCIIx-antistoffet først på grunn av den relativt lave overflod av MHCIIx sammenlignet med de andre MHC-isoformene. Når membranen er klar for MHCI-antistoffdeteksjon, ville den ha gjennomgått to trinn med stripping (dvs. post MHCIIx og MHCIIa-deteksjon). Deteksjon av MHCI bør derfor primært påvises i en type I-prøve, med minimalt restsignal påvist fra tidligere MHC-antistoffer (figur 5). Western blotting brukes til å bekrefte renheten til hver fibertypespesifikk prøve ved å bruke alle tre MHC-antistoffene på samme membrandel. Imidlertid ville behovet for stripping bli eliminert hvis enten MHCI eller MHCIIx antistoffer ble hevet i en annen vertsart som kanin eller geit.

Programmer
Metodikken beskrevet her kan brukes til fibertyping av enkeltfibersegmenter fra fersk eller frysetørket skjelettmuskulatur for å undersøke fibertypespesifikt proteinuttrykk i menneskelig skjelettmuskulatur. I tillegg kan bruk av ferske muskelprøver, enten intakte eller mekanisk flådde fibre brukes⁶. Ved hjelp av en skinnet fiber tillater videre undersøkelse av proteinuttrykk i subcellulære rom som de i cytosol- og membranrommene. Denne applikasjonen har tidligere blitt brukt til å måle mengden glykogen som er bundet vs. ubundet i mekanisk skinnede fibersegmenter fra friske og diabetiske individer⁶. Det er viktig at MyDoBID er gunstig for eksperimenter som bare bruker denaturerte prøver og ikke vil være passende for studier som krever proteiner i sin opprinnelige tilstand. Selv om det er mulig at andre analyser som enzymatiske analyser eller proteomiske tilnærminger i løsningen kan utføres under opprinnelige forhold, vil ytterligere optimalisering være nødvendig slik at en del av fiberen kan fjernes for MHC-isoformidentifikasjon ved hjelp av MyDoBID.

Oppsummert kan type I, type II og type IIx med hell identifiseres ved bruk av en enkel teknikk med lett tilgjengelige forbruksvarer som vanligvis brukes til vestlig blotting. Vi inkluderer omfattende praktisk informasjon, hvor etter vellykket gjennomføring vil produsere fibertypespesifikke prøver som er av best mulig kvalitet, integritet og pålitelighet for fremtidige studier. Denne teknikken er den praktiske og foretrukne tilnærmingen til å utføre fiberspesifikk biokjemisk analyse av skjelettmuskulatur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.