Summary
Этот протокол демонстрирует выделение одного волокна из лиофилизированных скелетных мышц человека и классификацию типов волокон в соответствии с изоформой тяжелой цепи миозина (MHC) с использованием метода точечного блоттинга. Идентифицированные образцы клетчатки MHC I и II могут быть затем дополнительно проанализированы на предмет специфичных для типа волокна различий в экспрессии белка с помощью вестерн-блоттинга.
Abstract
Описанный здесь метод может быть использован для идентификации специфических изоформ тяжелой цепи миозина (MHC) в сегментах отдельных мышечных волокон с помощью точечного блоттинга, далее именуемого обнаружением тяжелой цепи Myosin методом лоттинга Dot Bдля идентификациитипа мышечных волокон (MyDoBID). Этот протокол описывает процесс сублимационной сушки скелетных мышц человека и выделения сегментов отдельных мышечных волокон. С помощью MyDoBID волокна I и II типов классифицируются с помощью MHCI- и IIa-специфических антител соответственно. Затем классифицированные волокна объединяются в специфичные для каждого типа образцы волокон для каждой биопсии.
Общий белок в каждом образце определяется с помощью додецилсульфатного полиакриламидного гель-электрофореза (SDS-PAGE) и технологии УФ-активированного геля. Тип образцов волокна валидируется с помощью вестерн-блоттинга. Также описана важность нормализации белковой нагрузки для улучшения обнаружения целевых белков при множественных вестерн-блоттингах. Преимущества консолидации классифицированных волокон в образцы для конкретных типов волокон по сравнению с одноволоконными вестерн-блотами включают универсальность образцов, повышенную пропускную способность образцов, более короткие временные затраты и меры по экономии средств, сохраняя при этом ценную информацию о типе волокна, которая часто упускается из виду при использовании гомогенизированных образцов мышц. Целью протокола является достижение точной и эффективной идентификации волокон I и II типа, выделенных из лиофилизированных образцов скелетных мышц человека.
Эти отдельные волокна впоследствии объединяются для создания образцов волокон типа I и типа II. Кроме того, протокол расширен и включает в себя идентификацию волокон типа IIx с использованием актина в качестве маркера для волокон, которые были отрицательными для MHCI и MHCIIa, которые подтверждены как волокна IIx с помощью вестерн-блоттинга. Каждый образец клетчатки, специфичный для конкретного типа, затем используется для количественной оценки экспрессии различных белков-мишеней с помощью методов вестерн-блоттинга.
Introduction
Скелетные мышцы представляют собой гетерогенную ткань с различными клеточными метаболическими и сократительными свойствами, которые зависят от того, является ли клетка (волокно) медленно сокращающейся (тип I) или быстро сокращающейся (тип II). Тип волокна может быть идентифицирован путем изучения изоформ тяжелой цепи миозина (MHC), которые отличаются друг от друга по нескольким параметрам, включая время сокращения, скорость укороченияи сопротивление усталости. Основные изоформы MHC включают тип I, тип IIa, тип IIb и тип IIx, и их метаболические профили являются либо окислительными (типы I и IIa), либо гликолитическими (IIx, IIb)1. Пропорция этих типов волокон варьируется в зависимости от типа мышц и между видами. Тип IIb широко встречается в мышцах грызунов. Мышцы человека не содержат волокон типа IIb и состоят преимущественно из изоформ MHC волокон I и IIa, с небольшой долей волокон IIx2. Профили экспрессии белков варьируются в зависимости от типа клетчатки и могут изменяться с возрастом3, физической нагрузкой 4,5 и заболеванием 6.
Измерение клеточных реакций в различных типах скелетных мышечных волокон часто упускается из виду или не представляется возможным из-за исследования мышечных гомогенатов (смесь всех типов волокон). Одноволоконный вестерн-блот позволяет исследовать несколько белков в отдельных мышечных волокнах7. Эта методология ранее использовалась для получения новых и информативных одноволоконных характеристик, которые невозможно было получить с помощью гомогенатных препаратов. Тем не менее, существуют некоторые ограничения оригинальной методики вестерн-блоттинга с одним волокном, в том числе трудоемкий характер, невозможность создания репликаций образцов и использование дорогостоящих, чувствительных реагентов усиленной хемилюминесценции (ECL). Если используется свежая ткань, этот метод дополнительно ограничен из-за временных ограничений, связанных с необходимостью изолировать отдельные волокна в течение ограниченного периода времени (например, 1-2 часа). К счастью, это ограничение смягчается путем выделения одноволокнистых сегментов из лиофилизированной ткани8. Однако сбор клетчатки из лиофилизированных образцов ограничен размером и качеством биопсированной ткани.
Идентификация типа волокна с помощью метода точечного блоттинга9 была значительно усовершенствована и расширена в этом комплексном протоколе. Ранее было продемонстрировано, что всего ~2-10 мг мышечной ткани с влажной массой достаточно для сублимационной сушки и анализа изоформы белка MHC с одним волокном9. Christensen et al.9 использовали 30% сегмента волокна ~1 мм для обнаружения изоформы MHC, присутствующей с помощью точечного блоттинга, что было подтверждено вестерн-блоттингом. Эта работа показала, что при замене вестерн-блоттинга на точечный блоттинг общие затраты были снижены в ~40 раз (для 50 сегментов волокна). Затем волокна были «объединены» в образцы типа I и типа II, что позволило провести экспериментальную репликацию9. Тем не менее, ограничением было то, что были получены только два образца волокон, специфичных для конкретного типа: тип I (MHCI положительный) и тип II (MHCII положительные волокна), при этом образцы типа II содержали смесь MHCIIa и MHCIIx 6,10. Примечательно, что текущий протокол демонстрирует, как могут быть идентифицированы чистые волокна типа IIx, и предоставляет очень подробный рабочий процесс (см. рис. 1), включая стратегии устранения распространенных проблем протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы мышц человека были получены из vastus lateralis от n = 3 (2 мужчины, 1 женщина) в возрасте 70-74 лет в стерильных условиях с использованием местной анестезии (ксилокаин) и иглы Бергстрома, модифицированной для ручного отсасывания11,12. Образцы представляли собой подмножество предыдущего исследования, одобренного Комитетом по этике исследований на людях Университета Виктории (HRETH11/221) и проведенного в соответствии с Хельсинкской декларацией13. Участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Полная информация обо всех материалах, необходимых для этого протокола, приведена в Таблице материалов. Кроме того, в таблице 1 приведен список стратегий устранения неполадок, направленных на решение распространенных проблем протокола.
1. Сублимационная сушка
- Храня биопсированные образцы мышц замороженными на сухом льду, взвесьте и упакуйте пустую замороженную пробирку на весах.
- Быстро взвесьте минимум 10 мг влажной замороженной ткани. Запишите вес с точностью до одного знака после запятой.
- Поместите салфетку в предварительно охлажденную пробирку микроцентрифуги, в крышке которой пробиты 3-4 отверстия, и поместите ее в небольшой стакан с 2-3 гранулами сухого льда.
- Следуйте инструкциям по эксплуатации производителя сублимационной сушилки.
- Убедитесь, что все клапаны на сублимационной сушилке закрыты, и включите сублимационную сушилку.
- С помощью панели управления убедитесь, что заданное значение вакуума запрограммировано на оптимальные условия сублимационной сушки тканей человека, 0,12 миллибар (мбар) (рис. 2).
- Нажмите ручную на сублимационную сушилку и подождите, пока камера остынет до −40 oC.
- Как только камера достигнет этой температуры, снимите крышку, затем стеклянную камеру и поместите стакан (с образцом мышцы) на металлический столик.
- Установите на место стеклянную камеру и крышку. Закройте вакуумный выпускной клапан на крышке и подождите, пока индикатор вакуумных весов не загорится зеленым, чтобы убедиться, что сушилка герметична.
- Образцы мышц сублимировать в течение 48 ч. После завершения сублимационной сушки выключите вакуумный насос, нажав кнопку вакуума, и откройте вакуумный клапан на крышке.
- Снимите крышку камеры и соберите сублимированный образец. Взвесьте ткань и запишите вес с точностью до одного знака после запятой.
- Рассчитать процент потери веса; Снижение веса на ~75% указывает на то, что ткань успешно сублимирована (в данной работе среднее ± SD, 76 ± 9%, n = 11 мышечных образцов).
- Нажмите AUTO, чтобы выключить вакуумный насос и морозильную камеру. Дайте устройству нагреться до температуры окружающей среды.
- Очистите охлаждающие змеевики в соответствии с инструкциями производителя и слейте скопившуюся жидкость из коллектора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор волокна может начаться немедленно. Если ткань не используется для выделения волокон, храните лиофилизированный образец при температуре -80 °C в герметичном контейнере с шариками эксикатора. ВНИМАНИЕ: Сухой лед опасен (класс 9); обратитесь к MSDS для получения рекомендаций по безопасному обращению.
2. Сбор волокна
- Подготовка к сбору клетчатки
- Промаркируйте минимум 50 пробирок для микрофуги (волокна от 1 до 50) и пипетку на 10 мкл денатурирующего буфера на каждую пробирку.
- Подготовьте зону сбора с помощью двух пар щипцов для рассечения тонких тканей, безворсовой ткани, настольной лампы, стереомикроскопа (с черной сценой вверх), вихря и настольной центрифуги.
- Поместите сублимированный образец мышц на крышку чашки Петри. Поместите крышку на предметный столик препарирующего микроскопа.
- Посмотрите видео одноволоконной диссекции. Отработайте полный протокол от сбора волокон до идентификации типа одного волокна не менее двух раз, прежде чем начинать исследование.
- Перед сбором волокна рассчитайте общий объем, необходимый для образца типа волокна из каждой биопсии , следующим образом. Например, если начальный объем 1 волокна = 10 мкл, а объем, оставшийся после MyDoBID, равен (1 волокно × 10 мкл) - 1 мкл, используемый для точечного блоттинга = 9 мкл (объем образца), рассчитайте общий необходимый объем образца, умножив объем образца (мкл) на общее количество вестерн-блоттинга, которое будет выполнено, и удвойте это количество, чтобы учесть избыточность: (9 мкл × 4 вестерн-блота) × 2 = 72 мкл. Рассчитайте необходимое количество волокон на типированный образец , разделив окончательный требуемый объем образца (мкл) на объем образца на образец для конкретного типа волокна (например, 72 мкл ÷ 9 мкл = 8 волокон на образец для конкретного типа волокна). Чтобы этого добиться, соберите в общей сложности 50 волокон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем образца является минимальной концентрацией белка, необходимой для проведения как MyDoBID, так и вестерн-блоттинга, если количество загружаемого белка эквивалентно ~3 мм клетчатки (~12 мкг сырого веса) для каждого образца (см. Дополнительный файл 1 для получения подробной информации). Однако этот объем не учитывает, требуются ли повторные гели для данного белка. ВНИМАНИЕ: Щипцы острые; Обращайтесь с ними осторожно, чтобы избежать риска прокола кожи.
- Одноволоконная изоляция
- На небольшом листе бумаги 5 см х 1 см с помощью линейки нарисуйте линию в 1 см. Отметьте через каждые 1 мм на этой линии.
- Вставьте его под крышку чашки Петри в качестве ориентира для оценки длины собранных волокон.
- Поместите лиофилизированный образец мышцы под стереомикроскоп при малом увеличении (x 7,5). Используйте одну пару щипцов для рассечения тонких тканей, чтобы удерживать лиофилизированную мышцу на месте, а другой начните разделять небольшие пучки волокон (как показано на видео).
- Изолируйте один пучок волокон и продолжайте раздвигать их до тех пор, пока отдельные сегменты волокон не будут изолированы от пучка.
- Соберите не менее 50 волокон длиной не менее ~1 мм.
- Переместите волокно в пустое место на чашке Петри. Осматривайте одноволоконные сегменты при большем увеличении (x 50). Убедитесь, что это одно волокно, дополнительно отделив волокно на конце. Если волокно разрывается, а не отделяется, это одно волокно.
- Денатурация волокон
- С помощью щипцов аккуратно соберите волокно и поместите его непосредственно в аликотируемый денатурирующий буфер (не допускайте столкновения щипцов с буфером).
- Проверьте щипцы под микроскопом, чтобы убедиться, что волокно было успешно удалено. Закройте пробирку и трижды плотно постучите по нижней части пробирки по столу, чтобы убедиться, что волокно движется в буфер.
- Протрите щипцы безворсовой салфеткой, прежде чем переходить к следующему волокну. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не соберутся все волокна.
- Встряхните образцы волокон и кратковременно центрифугируйте в течение 5 с при 2 500 × g , чтобы извлечь образец на дно пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность центрифугирования (5 с) измеряется с начала (0 × g) до достижения скорости ~ 2 500 × g. - Оставьте образцы при комнатной температуре на 1 ч. Хранить при температуре -80 °C для дальнейшего использования. Заморозьте, а затем разморозьте образцы перед использованием.
3. Точечное блоттинг
- Подготовка и активация мембраны
- Измерьте, промаркируйте и отрежьте по размеру одну мембрану из поливинилидендифторида (ПВДФ) (размер пор 0,2 мкм) для 50 образцов (~10,5 см x 5,5 см).
- Отметьте левую границу цифрами сверху вниз (от 1 до 10), а верхнюю границу в алфавитном порядке слева направо (от A до E) на расстоянии 1 см друг от друга.
- Подготовьте четыре листа фильтровальной бумаги размером 12,5 см х 7,5 см.
- Сложите два листа вместе, чтобы получилась стопка. Предварительно замочите стопку фильтровальной бумаги в 1-кратном буфере для переноса.
- Поместите мембрану в емкость. Залейте мембрану 95% этанолом, достаточным для полного погружения мембраны (10-15 мл). Взбалтывайте на коромысле в течение 1 мин.
- Соберите этанол, погрузите мембрану в буфер для переноса 1x (~15 мл) и покачайте еще 2 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как этанол, так и трансферный буфер могут быть повторно использованы для будущих экспериментов по точечному блоттингу до образования седиментации (смена после шести использований). - Положите стопку фильтровальной бумаги, пропитанную буфером, на плоскую подвижную поверхность, например, на большую крышку, и разровняйте валиком. Расположите мембрану PVDF на стеке с помощью гелевого релизера или пинцета.
- Положите один лист сухой фильтровальной бумаги поверх мембраны и проведите валиком по фильтровальной бумаге, чтобы впитать излишки буфера на поверхности мембраны. Снимите верхнюю фильтровальную бумагу, не теребя мембрану.
ВНИМАНИЕ: Метанол (класс 3, подриск 6.1) и этанол (класс 3) являются опасными. Обратитесь к паспорту безопасности материала (MSDS) для получения рекомендаций по безопасному обращению.
- Абсорбция образца на мембране
- Разморозьте образцы волокон, выполните кратковременную центрифугу (5 с) при комнатной температуре, как показано на шаге 2.3.4, и тщательно перемешайте образец.
- Не касаясь мембраны наконечником пипетки, медленно нанесите ~1 мкл капли каждого образца на мембрану в отведенном месте. Размеры выделенной площади на образец волокна ~1 см x 1 см. Стремитесь найти образец в центре этой области.
- Дайте каплям образца пропитаться через мембрану в течение не менее 15 минут. Убедитесь, что буфера образца не осталось и он полностью абсорбирован.
- С помощью пластикового пинцета осторожно снимите мембрану с влажной стопки фильтровальной бумаги, поместите ее на один сухой лист фильтровальной бумаги и обезвоживайте мембрану не менее 5 минут.
- Как только пятна образца станут полностью белыми, повторно активируйте мембрану.
- Реактивация и блокировка мембраны
- Повторно активируйте мембрану, повторив шаги 3.1.5 и 3.1.6.
- Поместите мембрану в буфер для промывки и промывайте в течение 5 минут при раскачивании. Выбросьте буфер для стирки.
- Инкубируйте мембрану в блокирующем буфере в течение 30 мин во время раскачивания.
- Промойте мембрану 3 раза буфером для промывки до тех пор, пока буфер не перестанет мутнеть.
- Оставьте мембрану в окончательной стирке на коромысле.
4. Иммуномаркировка
- Обнаружение MHCIIa
- Разбавляют первичные антитела MHCIIa в соотношении 1 к 200 в 10 мл буфера бычьего сывороточного альбумина (BSA).
- Снимите промывочный буфер с мембраны, а затем вылейте разбавленное антитело MHCIIa на мембрану.
- Поместите контейнер (с мембраной в MHCIIa) на коромысло при комнатной температуре на 2 часа или при температуре 4 °C на ночь.
- Соберите антитело MHCIIa и храните его при температуре 4 °C. Промойте мембрану с блокирующим буфером в течение 2 мин на коромысле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все первичные антитела могут быть повторно использованы до пяти раз дольше, пока буфер остается прозрачным. - Промыть еще дважды; 5 минут каждый раз; Всего три стирки.
- Разбавьте вторичные антитела к пероксидазе хрена (IgG-HRP) мышиного иммуноглобулина G (IgG-HRP) в соотношении 1 к 20 000 в 10 мл блокирующего буфера и добавьте к мембране.
- Промывочный буфер выбросьте и инкубируйте мембрану во вторичной обработке IgG-HRP мыши с раскачиванием в течение 1 ч.
- Выбросьте вторичную обмотку и промойте мембрану в буфере для промывки (2, 5, 5 мин).
- Оставьте мембрану для окончательной промывки до тех пор, пока она не будет готова к визуализации.
- Включите гелевый имидж-сканер, подождите 15 минут, пока тепловизор не достигнет требуемой рабочей температуры, а затем откройте программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов).
- В окне программного обеспечения нажмите кнопку New Single Channel Protocol (рисунок 3A). Для получения изображения мембраны в белом свете в разделе Приложения | Кляксы | выберите Колориметрический (Colorimetric ) (Рисунок 3B).
- Нажмите на область геля; Каждая опция запрограммирована на определенные размеры, чтобы соответствовать размеру различных типов гелей. Выберите подходящий вариант, который наилучшим образом соответствует размерам мембраны (рисунок 3C).
- Приготовьте ЭХЛ, комбинируя реагенты люминол и пероксидазу в соотношении 1:1. Сделайте достаточный объем смеси ECL, чтобы покрыть всю мембрану, обычно требуется общий объем 800-1000 мкл.
- Поместите мембрану на большой прозрачный пластиковый лоток и распределите смесь ECL по мембране.
- Поместите мембрану на пластину для визуализации.
- Нажмите на Position Gel (желтая кнопка), чтобы увидеть камеру в реальном времени. Нажмите и удерживайте и перетащите кнопку масштабирования, чтобы увеличить область изображения мембраны. На этом этапе при необходимости выпрямите положение мембраны.
- Нажмите Run Protocol (зеленая кнопка) и дождитесь получения колориметрического изображения мембраны. Сохраните это изображение, чтобы помочь сопоставить точки с соответствующим образцом волокна.
- Не перемещая мембрану, измените приложение в программном обеспечении, выбрав опцию биннинга 2 x 2 (Chemi High Resolution) (рис. 3D).
- В разделе «Экспозиция изображения и программное обеспечение» оптимизируйте время экспозиции нажмите «Слабые полосы » (рис. 3E) | Режим накопления сигнала.
- В разделе «Настройка» введите 1 с для первого изображения, 30 с для последнего изображения и 30 всего изображений (рис. 3F).
- Нажмите кнопку Run Protocol.
- Сохраняйте изображение на следующих этапах: до насыщения сигнала (все видимые точки черные), начального насыщения сигнала (некоторые точки начинают насыщаться) и перенасыщенных пятен (все пятна с обнаруженным сильным сигналом насыщены).
- Сохраните все необходимые изображения перед окончанием накопления сигнала. Извлеките мембрану из тепловизора.
- Используя средство для удаления геля, поместите мембрану обратно в контейнер с буфером для стирки.
- Обнаружение MHCI
- Вылейте буфер для промывки и обработайте мембрану буфером для снятия изоляции в течение 30 минут при температуре 37 °C (убедитесь, что мембрана полностью погружена).
- Соберите буфер для зачистки и промойте мембрану в буфере для промывки в течение 5 минут с покачиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для зачистки можно использовать повторно 10 раз перед выбросом. - Вылейте буфер для промывки и на этот раз нанесите первичные антитела MHCI, разведенные в начальной концентрации 1 к 200 (диапазон: от 1 к 200 до 1 к 500). Раскачивайте мембрану при комнатной температуре в течение 1 ч.
- После инкубации в первичном антителе MHCI отобрать антитело и промыть мембрану, как показано на этапах 4.1.4 и 4.1.5.
- Разбавляют вторичные антитела IgM HRP мыши в блокирующем буфере в соотношении 1 к 20 000. Вылейте блокирующий буфер из мембраны и инкубируйте во вторичной обмотке IgM мыши, как показано на шаге 4.1.7.
- Промывка и захват изображения обнаружили MHCI, как описано на шагах 4.1.8–4.1.24.
ВНИМАНИЕ: Буфер для отпарки содержит фосфин органического соединения 3-5% (класс 8). Обратитесь к MSDS для получения рекомендаций по безопасному обращению.
- Обнаружение потенциальных MHCIIx с помощью актина
- Снимите мембрану еще раз (шаги 4.2.1 и 4.2.2).
- Повторите раздел 4.1, на этот раз применяя первичные антитела к актину, разведенные в соотношении 1 к 500 в буфере BSA, а затем вторичные антитела HRP кролика, разбавленные в соотношении 1 к 20 000 в блокирующем буфере.
5. Идентификация типа волокна
- Анализ сигналов MHCI, MHCIIa и Actin
- Ознакомьтесь с панелью интенсивности сигнала (рис. 4A). Обратите внимание на шаги с 5.1.2 по 5.1.4.
- Насыщенная интенсивность сигнала качественно указывает на то, что обнаружение белка сильное.
- Умеренный указывает на то, что целевой белок присутствует на среднем уровне.
- Слабый сигнал указывает на то, что в организме мало целевого белка.
- Используйте панель интенсивности сигнала, чтобы классифицировать волокна с «насыщенной», «умеренной» или «слабой» интенсивностью сигнала (рис. 4A).
- Определите тип волокна, сначала сравнив результаты MHCIIa и MHCI (рис. 4B, левая и средняя блотины).
- Запись волокон с насыщенной или умеренной интенсивностью сигнала только одной изоформы MHC.
- Если сигнал изоформы MHC «слабый», оставьте волокно без маркировки (см. рис. 4B).
- Наконец, там, где актин наблюдается (умеренная или насыщенная интенсивность сигнала) в волокнах, где не обнаружены MHCI или IIa, запишите его как потенциальное волокно типа IIx (рис. 4B, правое блот).
- Регистрируйте волокна со слабым сигналом изоформы MHC, но актин, обнаруженный (умеренной или насыщенной интенсивности), как неидентифицированный.
- Отбракуйте образцы со слабым обнаружением или без него (без собранной клетчатки) для всех трех белков-мишеней (рисунок 4C).
- Запишите любое волокно, в котором сигналы MHCI и MHCII обнаружены с «насыщенным» или умеренным сигналом. Эти образцы не предназначены для использования в препаратах для конкретных типов волокон.
- Подготовка образцов для конкретных типов волокон
- Для каждой биопсии готовят отдельный образец I и II типа. Для образца типа II комбинируйте минимально необходимое количество волокон (рассчитанное на шаге 2.1.5), в которых MHCIIa обнаруживается на насыщенных или умеренных уровнях.
- В отдельной пробирке, помеченной как тип I, повторите этот процесс для волокон, в которых обнаружен MHCI (рис. 4D).
- Используйте волокна с умеренной интенсивностью сигнала, если волокон с насыщенными сигналами недостаточно.
- Комбинируйте любые потенциальные волокна IIx.
- Немедленно используйте образцы волокон для вестерн-блоттинга или храните их при температуре -80 °C для использования в будущем.
6. Подтверждение типа волокна вестерн-блоттингом
- Используйте 10 мкл каждого образца для конкретного типа волокна (минимальный требуемый объем образца, см. шаг 2.1.5).
- Разделяют образцы с помощью указанного сборного геля через SDS-PAGE в соответствии с протоколом производителя.
- Используйте гелевый имидж-сканер для обнаружения белка в геле в соответствии с протоколом производителя.
- Поместите гель в холодный буфер для переноса 1x на 10 минут.
- Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану размером 0,45 мкм (9,5 см x 13,5 см) в соответствии с протоколом производителя.
- После переноса кратковременно промойте мембрану сверхчистымН2Ов емкости. Вылейте сверхчистую воду.
- Добавьте 10 мл раствора усилителя сигнала антител к мембране и закажите при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Соберите раствор усилителя сигнала антител и промойте 5 раз (5 с на стирку) сверхчистым H2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор усилителя сигнала антител можно использовать 5 раз перед выбросом. - Вылейте последнюю промывку, добавьте блокирующий раствор и раскажите при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Используйте чистое лезвие скальпеля или ножницы, чтобы разрезать горизонтально через мембрану с молекулярной массой, которая гарантирует, что белки с молекулярной массой 180 кДа и выше находятся в верхней части мембраны.
- Используйте этот верхний раздел для дальнейшего подтверждения типа волокна.
- Используйте порцию ниже 180 кДа для обнаружения различных белков-мишеней.
- На верхней части мембраны следует следовать разделу 4.1 с первичным и мышиным вторичным антителом к иммуноглобулину M (IgM) HRP.
- Удалите мембрану (как описано в разделах 4.2.1 и 4.2.2) перед повторением процесса с первичными первичными антителами MHCIIa IgG и вторичными антителами IgG HRP мыши.
- Раздейте еще раз и, наконец, нанесите первичные первичные антитела MHCI IgM и вторичные антитела IgM HRP мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является качественным, поэтому любая потеря белка из-за удаления мембраны не является проблемой. - Сравните сигнал, обнаруженный различными изоформами MHC (как показано на рисунке 5B). Когда интенсивность сигнала будет обнаружена на уровнях от умеренного до насыщенного в ожидаемом образце (MHCI - тип I, MHCIIa - тип II и MHCIIx - тип IIx), образцы волокна, специфичные для конкретного типа, будут записаны как надежные для использования в будущих исследованиях.
- Запишите образец как ненадежный, если в образце одинаково обнаружено более одной изоформы MHC.
ВНИМАНИЕ: Раствор усилителя антител содержит гидроксид натрия 50%. Обратитесь к MSDS для получения рекомендаций по безопасному обращению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Идентификация отдельных мышечных волокон MHCI, MHCIIa и MHCIIx с помощью точечного блоттинга
Особенностью MyDoBID является категоризация переменной интенсивности сигнала MHC и Actin в данном волокне (рис. 4A). Тип волокна определяли по наличию или отсутствию изоформ MHCI и IIa (рис. 4B). Шесть волокон не показали обнаружения MHC или актина, что указывает на то, что волокна не были собраны. Результатами этого специфического точечного блоттинга были идентификация 22 волокон типа II, 7 волокон типа I и 3 потенциальных волокон типа IIx; 2 неопознанных образца и 6 образцов были классифицированы как «без клетчатки» (рис. 4B, C). Волокна, которые не имели какого-либо обнаруживаемого сигнала MHCI или MHCIIa, но были положительными на актин, были идентифицированы как потенциальные волокна типа IIx с помощью процесса элиминации. Используя панель интенсивности сигнала для классификации уровня сигнала MHCI и IIa, «умеренные» или «насыщенные» волокна были объединены для получения образцов типа I или II соответственно. Волокна, которые не были идентифицированы или имели слабый актин или не были обнаружены, не были включены в последующий анализ и были отброшены (рис. 4D).
Подтверждение типирования волокон с помощью вестерн-блоттинга
Специфичные для типа волокна образцы валидировали с помощью вестерн-блоттинга и MHC-специфических антител (рис. 5). Образцы волокон типа I и типа II из одной индивидуальной биопсии были обработаны вместе с образцом типа IIx, который представлял собой образец потенциальных волокон типа IIx от двух человек из-за низкого количества волокон типа IIx, присутствующих в каждой биопсии. Данные вестерн-блоттинга подтвердили, что идентификация типа волокна прошла успешно.
Рисунок 1: Краткое описание рабочего процесса, описывающее подготовку образцов, типирование волокон и подтверждение специфичности волокон методом вестерн-блоттинга . (А) Ткани человека лиофилизируют в течение 48 ч. (В,В) Отдельные сегменты волокон выделяют под препарирующим микроскопом. (D) Волокна денатурируют и (E) через 1 ч, хранят при -80 °C. (F) Порядок инкубации первичных антител. (G) Волокна были точечно блотированы, и тип волокна был идентифицирован с помощью MHCIIa (тип II), MHCI (тип I) и актина (IIx?, потенциальное волокно типа IIx). (H) Затем волокна были объединены. (I) Образцы волокон, специфичные для конкретного типа, вместе с калибровочной кривой анализируются с помощью SDS PAGE и вестерн-блоттинга. (J) Валидация идентификации типа волокна с помощью вестерн-блоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Дисплей и панель управления системой сублимационной сушки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Настройки тепловизора для захвата мембраны белым светом с последующим хемилюминесцентным обнаружением белков-мишеней. Чтобы получить изображение мембраны в белом свете, (A) выберите New Single Channel , а затем (B) Blots | colorimetric application. (C) В зависимости от размера используемого геля выберите соответствующую область изображения, а затем сделайте снимок в белом свете, нажав кнопку Run Protocol. (D) Не перемещая мембрану, повторите шаг B , но на этот раз, выбрав Кляксы | Chemi Hi Разрешение. Перед нажатием кнопки «Выполнить» выберите (E) Экспозиция изображения для оптимизации для слабых полос и (F) установите режим накопления сигнала и в первом случае установите время экспозиции для каждой секунды в общей сложности 30 секунд с отмеченными галочками «Яркие насыщенные пиксели ». Нажмите Run Protocol и дождитесь завершения прогона, прежде чем выбирать лучшие изображения для сохранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Идентификация типа волокна. (A) Типы волокон были идентифицированы относительно всех других волокон на мембране, классифицированные панелью интенсивности сигнала для каждой обнаруженной изоформы MHC (например, сигнал MHCI: насыщенный, умеренный и слабый). (B) Используя панель в (A), антитело MHCIIa идентифицировало волокна типа II (синий, левое пятно), а после удаления мембраны антитело MHCI идентифицировало волокна типа I (красный, средний блот). Антитела к актину использовали для идентификации потенциальных волокон IIx, если положительный сигнал актина был обнаружен в волокнах, где не было обнаружено предыдущего сигнала MHCI или IIa (зеленый, правое пятно). Волокна, которые не следовали этим рекомендациям, выделены фиолетовым цветом (не идентифицированы). Наконец, образцы, отрицательные на сигнал актина, указывали на то, что клетчатка не была собрана («Нет клетчатки»). (C) Таблица, показывающая маркировку волокон, соответствующую положению образца на точечных блотах, показанной в (B). (D) Схема выбора волокон для подготовки образцов для конкретных типов волокон. Цель состояла в том, чтобы собрать 10 насыщенных волокон для каждого типа волокон. Здесь для волокон II типа было идентифицировано и объединено восемь насыщенных волокон. Для волокон I типа присутствовало менее 10 насыщенных волокон, поэтому также были выбраны волокна с умеренным уровнем сигнала. Для волокон типа IIx были идентифицированы и объединены два волокна. Если идентифицировано менее 10 волокон (насыщенных и умеренных), может потребоваться дальнейший сбор волокон. ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал актина, показанный на рисунке (B), не достиг насыщения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Вестерн-блоттинг, подтверждающий идентификацию типа волокна. Идентификация типа волокна проводилась в соответствии с рисунком 4 для получения образцов типа I (~10 волокон) и типа II (~10 волокон). Поскольку из одной и той же биопсии не было идентифицировано волокон IIx, показанный здесь образец IIx был получен из более чем одного образца мышц (n = 2 человека). Небольшая аликвота каждого образца, специфичного для клетчатки, анализируется методом вестерн-блоттинга для подтверждения идентификации типа волокна. Слева указаны маркеры молекулярной массы (кДа), захваченные под белым светом без перемещения мембраны. Белки-мишени обнаруживаются в последовательности MHCIIx, MHCIIa и MHCI, при этом миозин из УФ-активированного геля визуально указывает количество белка, загруженного в образец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Стратегии устранения распространенных проблем с протоколом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Дополнительный файл 1: Расчет массы лиофилизированного волокна с использованием калибровочного графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сбор клетчатки
Основываясь на многолетнем опыте, большинство исследователей могут освоить эту технику; Тем не менее, практика приводит к более быстрому и эффективному сбору волокна для последующего анализа. Чтобы можно было выделить 30 отдельных сегментов волокна определенного качества для объединения в пул, рекомендуется собрать 50 сегментов волокна на образец. Для достижения разумного стандарта рекомендуется внимательно изучить видео по сбору волокон и после выполнения двух практических занятий (~50 волокон за сеанс). Все собранные волокна проходят MyDoBID для определения типа волокна, что покажет, насколько эффективно выполняется техника. Это будет рассматриваться как малое количество сигналов MHC «Нет волокна» или «слабых» сигналов MHC, обнаруженных в образцах волокна (см. раздел протокола 5.1).
Известно, что мышцы могут содержать гибридные волокна, в которых присутствуют как MHCI, так и MHCIIa, или MHCIIa и IIx 2,14. Ограничением MyDoBID является то, что присутствие гибридного волокна не может быть установлено, потому что образец, положительный как на MHCI, так и на MHCIIa антитела, может быть либо гибридным волокном, либо тем, что было собрано два волокна. Кроме того, MyDoBID не может обнаружить MHCIIa отдельно от гибридов MHCIIa/IIx, поскольку первичное антитело MHCIIa обнаруживает присутствие MHCIIa как в волокнах IIa, так и в волокнах IIa/IIx. По этим причинам идентификация и подготовка образцов гибридных волокон не проводилась, а образцы, содержащие сигналы MHCI и MHCIIa, выходящие за пределы диапазонов, описанных на панели интенсивности сигнала, были отброшены (рис. 4A). Еще одним ограничением является то, что доля типов мышечных волокон в образце не может быть определена с помощью MyDoBID, и для определения распределения типов волокон необходимо применение обычного иммуногистохимического анализа2.
Точечное блоттинг
Панель интенсивности сигнала и идентификатор типа волокна зависят от того, что весь образец представлен в небольшом объеме, нанесенном на точечную блоттинговую мембрану. Для этого образец тщательно перемешивается путем перемешивания перед загрузкой на мембрану. Все волокна, содержащие только одну изоформу MHC, переходят на следующую стадию объединения. На этом этапе важно, чтобы любое волокно с более чем одним MHC не переходило к следующему этапу объединения образцов. Если образец загрязнен, то весь объединенный образец должен быть выброшен, и исследователь должен вернуться к сбору волокон и повторить этапы изоляции волокна и точечной промокания.
Иммуномаркировка
Ранее сообщалось, что 5 мин – это достаточное время для блокировки неспецифических участков на мембране для обнаружения MHCI иMHCIIa 9. Для перехода на MyDoBID необходимо использовать антитела к актину. Было обнаружено, что 5-минутное время блокировки необходимо увеличить до 30 минут, как сообщается6, чтобы получить мембрану с минимальным фоном, так как 5-минутная блокировка приводит к более темному фону мембраны. Время блокировки учитывается при любом методе иммунодетекции, таком как вестерн-блоттинг или иммуногистохимия, и должно быть изменено по мере необходимости.
Зачистка мембраны
Стриппинг не может быть использован для количественного анализа15 , поскольку он также удаляет интересующие белки, но может быть использован в MyDoBID, поскольку это качественный анализ. Целью стриппинга является удаление связанных антител с поверхности мембраны, что позволяет использовать новое антитело с минимальным вмешательством со стороны предыдущего антитела. В MyDoBID есть возможность нанесения образца через две мембраны, где различные изоформы MHC обнаруживаются на отдельных мембранах. Если этот подход предпочтителен, избегайте работы с пробиркой с образцом более одного раза, загружая пятна одновременно. Это обеспечит одинаковое время сушки между каждым пятном образца (разница ~5 с) и последующие этапы, выполняемые одновременно в отдельных емкостях. Следует отметить, что этот вариант увеличит время, расход образца и расходных материалов.
Антитела применяются сначала для обнаружения волокон MHCIIa, а затем MHCI, потому что антитела MHCI всегда дают очень яркий сигнал, который было бы труднее удалить, чем MHCIIa. Актин гомогенно экспрессируется в волокнах скелетных мышц и используется для подтверждения того, что часть волокна была успешно нанесена на мембрану, как описано выше.
Визуализация, идентификация типа волокна и подготовка образцов для конкретного типа волокна
В этом протоколе был разработан новый инструмент, помогающий в идентификации типа волокна и выборе образцов для создания образцов, специфичных для конкретного типа волокна (рис. 4A). Пример, показанный на панели интенсивности сигнала, используется для определения интенсивности сигнала MHCI как: (i) насыщенная, (ii) умеренная или (iii) слабая. Для объединения волокон в образцы для конкретных типов волокон сначала выбираются волокна с насыщенной интенсивностью сигнала, а при необходимости добавляются волокна с умеренной интенсивностью сигнала. При подготовке образцов I и II типов обычно имеется достаточное количество «насыщенных» и «умеренных» волокон, чтобы волокна, отнесенные к категории «слабых» или неидентифицированных, можно было отбросить.
Новизна использования актина вместо антител MHCIIx для идентификации чистых волокон типа IIx
Ранее, для идентификации чистых волокон IIx, сигнал MHCIIx субъективно сравнивался с сигналом MHCI и MHCIIa на точечном блоте, и путем исключения волокна без сигнала MHCI или IIa, но с сигналом MHCIIx, были идентифицированы как чистые IIx. Однако проблемы могут возникнуть при использовании двух мышиных первичных антител IgM (MHCIIx и MHCI) на одной мембране. Несмотря на разрыв мембраны между первичными антителами, может быть обнаружен остаточный сигнал антител. Использование первичных антител кролика к актину предотвращает возникновение этой проблемы. Здесь мы использовали актин, чтобы подтвердить, что волокно было собрано, и в отсутствие как MHCI, так и MHCIIa, указывает на присутствие волокна IIx. Затем потенциальные волокна IIx подтверждаются вестерн-блоттингом с использованием MHCIIx-специфического антитела (см. рисунок 5 в этой статье и рисунок 2 в9). Былопоказано, что антитело 6H1 обнаруживает электрофоретически разделенную полосу, соответствующую MHCIIx, в скелетных мышцах крыс и мечет волокна типа IIx в поперечных срезах мышц мыши, крысы ичеловека.
Подтверждение типа волокна методом вестерн-блоттинга
Рекомендуется проводить все образцы волокон, специфичные для конкретного типа, из одной и той же биопсии на одном и том же геле. Поскольку антитела MHCI требуют того же вторичного антитела, что и MHCIIx, образцы типов I и IIx должны быть разделены по крайней мере одной полосой на данном геле, как показано на рисунке 5. Поскольку содержание белка будет варьироваться в разных образцах с конкретным типом волокна из-за различного размера волокна, первый гель следует использовать для определения объема образца, который необходимо загрузить в последующие прогоны геля для достижения одинакового количества белка во всех образцах. Для этого общий белок в данном образце определяется с помощью технологии визуализации геля, активируемой УФ-излучением, для визуализации всех белковых полос, которые были разделены в геле с помощью SDS-PAGE перед переносом. Общий белок в каждом образце определяется по изображению геля и используется для коррекции неравномерной нагрузки при следующем прогоне вестерн-блоттинга, при условии, что калибровочная кривая нескольких известных масс скелетной мышечной ткани проводится вместе с образцами, специфичными для типа волокна 3,4,6,17. Кроме того, нет необходимости использовать «хозяйственный» белок, такой как актин, для определения общего белка, что также потребовало бы собственной калибровочной кривой15. Эта технология является экономящим время и точным методом определения общего белка и может быть выполнена с очень небольшим количеством образца (т.е. ~1/5 клетчатки 9) без необходимости использования дополнительных реагентов или белковых стандартов, при этом максимально используя все участки мембраны для обнаружения интересующих белков.
Когда дело доходит до иммуномечения на этапе вестерн-блоттинга, антитела MHCIIx применяются в первую очередь из-за относительно низкого содержания MHCIIx по сравнению с другими изоформами MHC. После того, как мембрана готова к обнаружению антител к MHCI, она должна пройти два этапа зачистки (т.е. после обнаружения MHCIIx и MHCIIa). Следовательно, обнаружение MHCI должно быть обнаружено в первую очередь в образце типа I, с минимальным остаточным сигналом, обнаруженным от предыдущих антител MHC (рис. 5). Вестерн-блоттинг используется для подтверждения чистоты каждого образца волокна, специфичного для конкретного типа, с использованием всех трех антител MHC на одном участке мембраны. Тем не менее, необходимость в раздевании была бы устранена, если бы антитела MHCI или MHCIIx были выращены у другого вида-хозяина, такого как кролик или коза.
Приложений
Методология, описанная здесь, может быть использована для типирования отдельных сегментов волокон из свежих или лиофилизированных скелетных мышц для изучения экспрессии специфического белка типа волокна в скелетных мышцах человека. Кроме того, при использовании свежих образцов мышц можно использовать как неповрежденные, так и механически очищенные волокна6. Использование клетчатки с кожей позволяет дополнительно исследовать экспрессию белка в субклеточных компартментах, таких как в цитозольных и мембранных компартментах. Это приложение ранее использовалось для измерения количества гликогена, связанного по сравнению с несвязанным в сегментах волокон с механически очищенной кожей у здоровых людей и людей с диабетом6. Важно отметить, что MyDoBID полезен для экспериментов, в которых используются только денатурированные образцы, и не подходит для исследований, требующих белков в их естественном состоянии. Хотя возможно, что другие анализы, такие как ферментативный анализ или протеомные подходы в растворе, могут быть выполнены в нативных условиях, потребуется дальнейшая оптимизация, чтобы часть волокна могла быть удалена для идентификации изоформы MHC с помощью MyDoBID.
Таким образом, типы I, II и IIx могут быть успешно идентифицированы путем применения простого метода с использованием легкодоступных расходных материалов, обычно используемых для вестерн-блоттинга. Мы включаем обширную практическую информацию, где при успешном завершении производства образцов волокна определенного типа, которые отличаются наилучшим качеством, целостностью и надежностью для будущих исследований. Этот метод является практичным и предпочтительным подходом к выполнению фиброспецифического биохимического анализа скелетных мышц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Антитела против MHC I (A4.840) и MHCIIa (A4.74), использованные в этом исследовании, были разработаны доктором Х. М. Блау, а антитела против MHCIIx (6H1) были разработаны доктором К. А. Лукасом и получены из Банка гибридом исследований развития (DSHB) благодаря поддержке Национального института детского здоровья и развития человека и поддерживаемому Университетом Айовы. Факультет биологических наук (Айова-Сити, штат Айова). Мы благодарим Викторию Л. Виккельсма (Victoria L. Wyckelsma) за предоставление образцов мышц человека для этого исследования. Большинство изображений на рисунке 1 были получены из BioRender.com.
Финансирование:
Это исследование не получило внешнего финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J.
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
