Fibertypsidentifiering av mänsklig skelettmuskulatur

Summary

Detta protokoll demonstrerar isolering av enstaka fibrer från frystorkad mänsklig skelettmuskulatur och fibertypsklassificering enligt isoform av Myosin heavy chain (MHC) med hjälp av dot blotting-tekniken. Identifierade MHC I- och II-fiberprover kan sedan analyseras ytterligare för fibertypsspecifika skillnader i proteinuttryck med hjälp av western blotting.

Abstract

Tekniken som beskrivs här kan användas för att identifiera specifika isoformer av tunga myosinkedjor (MHC) i segment av enskilda muskelfibrer med hjälp av punktblotting, hädanefter kallad Myosin heavy chain detection genom Dot B-lottningför ID-entifieringav muskelfibertyp (MyDoBID). Detta protokoll beskriver processen att frystorka mänsklig skelettmuskulatur och isolera segment av enstaka muskelfibrer. Med hjälp av MyDoBID klassificeras typ I- och II-fibrer med MHCI- respektive IIa-specifika antikroppar. Klassificerade fibrer kombineras sedan till fibertypspecifika prover för varje biopsi.

Det totala proteinet i varje prov bestäms av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och UV-aktiverad gelteknik. Fibertypen av prover valideras med hjälp av western blotting. Vikten av att utföra normalisering av proteinbelastning för att förbättra detektionen av målproteiner över flera västerländska fläckar beskrivs också. Fördelarna med att konsolidera klassificerade fibrer till fibertypsspecifika prover jämfört med enfiberiga western blots, inkluderar provmångsidighet, ökad provgenomströmning, kortare tidsinvestering och kostnadsbesparande åtgärder, samtidigt som värdefull fibertypspecifik information som ofta förbises med hjälp av homogeniserade muskelprover. Syftet med protokollet är att uppnå noggrann och effektiv identifiering av typ I- och typ II-fibrer isolerade från frystorkade mänskliga skelettmuskelprover.

Dessa enskilda fibrer kombineras sedan för att skapa typ I- och typ II-fibertypspecifika prover. Dessutom utvidgas protokollet till att omfatta identifiering av typ IIx-fibrer, med aktin som markör för fibrer som var negativa för MHCI och MHCIIa, vilka bekräftas som IIx-fibrer genom western blotting. Varje fibertypsspecifikt prov används sedan för att kvantifiera uttrycket av olika målproteiner med hjälp av western blotting-tekniker.

Introduction

Skelettmuskulatur är en heterogen vävnad, med distinkta cellulära metaboliska och kontraktila egenskaper som är beroende av om cellen (fibern) är långsam ryckning (typ I) eller snabb ryckning (typ II). Fibertypen kan identifieras genom att undersöka isoformerna av myosin tung kedja (MHC), som skiljer sig från varandra på flera sätt, inklusive kontraktionstid, förkortningshastighet och utmattningsbeständighet¹. Viktiga MHC-isoformer inkluderar typ I, typ IIa, typ IIb och typ IIx och deras metaboliska profiler är antingen oxidativa (typ I och IIa) eller glykolytiska (IIx, IIb)¹. Andelen av dessa fibertyper varierar i muskeltyp och mellan arter. Typ IIb finns ofta i gnagarmuskulaturen. Mänskliga muskler innehåller inga typ IIb-fibrer och består huvudsakligen av MHC-isoformer typ I- och IIa-fibrer, med en liten andel IIx-fibrer². Proteinuttrycksprofilerna varierar mellan olika fibertyper och kan förändras^{med 3 års} ålder, träning ^4,5 och sjukdom⁶.

Att mäta cellulära svar i olika typer av skelettmuskelfibrer förbises ofta eller är inte möjligt på grund av undersökningen av muskelhomogenat (en blandning av alla fibertyper). Enkelfibervästlig fläck gör det möjligt att undersöka flera proteiner i enskilda muskelfibrer⁷. Denna metodik har tidigare använts för att producera nya och informativa enkelfiberegenskaper som inte var möjliga att erhålla med homogena preparat. Det finns dock vissa begränsningar med den ursprungliga enkelfiber-western blot-metoden, inklusive den tidskrävande karaktären, oförmågan att generera provreplikat och användningen av dyra, känsliga ECL-reagenser (Enhanced Chemiluminescence). Om färsk vävnad används är denna metod ytterligare begränsad på grund av tidsbegränsningarna för att behöva isolera enskilda fibrer inom en begränsad tidsram (dvs. 1-2 timmar). Lyckligtvis mildras denna återhållsamhet genom att isolera enfibersegment från frystorkad vävnad⁸. Fiberinsamlingen från frystorkade prover begränsas dock av storleken och kvaliteten på den biopsierade vävnaden.

Identifiering av fibertyp med hjälp av dot blotting-metoden⁹ har utvecklats avsevärt och utökats i detta omfattande protokoll. Tidigare har det visats att så lite som ~2-10 mg våt muskelvävnad är tillräcklig för frystorkning och enfiberig MHC-isoformproteinanalys⁹. Christensen et ^al.9 använde 30 % av ett ~1 mm fibersegment för att detektera MHC-isoformen som finns vid punktblotting, vilket bekräftades genom western blotting. Detta arbete visade att genom att ersätta western blotting med dot blotting minskade de totala kostnaderna med ~40 gånger (för 50 fibersegment). Fibrerna "poolades" sedan i typ I- och typ II-prover, vilket möjliggjorde experimentell replikering⁹. En begränsning var dock att endast två fibertypsspecifika prover erhölls: typ I (MHCI-positiva) och typ II (MHCII-positiva fibrer), med typ II-prover som innehöll en blandning av MHCIIa och MHCIIx ^6,10. Det nuvarande protokollet visar hur rena typ IIx-fibrer kan identifieras och ger ett mycket detaljerat arbetsflöde (sammanfattat i figur 1), inklusive felsökningsstrategier för vanliga protokollproblem.

Protocol

Humana muskelprover erhölls från vastus lateralis från n = 3 (2 hanar, 1 kvinna), i åldern 70-74 år under sterila förhållanden med lokalbedövning (Xylocaine) och en Bergstrom-nål modifierad för manuell sugning^11,12. Proverna var en delmängd av en tidigare studie som godkänts av Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen¹³. Deltagarna gav skriftligt, informerat samtycke till att delta i denna studie. Fullständig information om allt material som krävs för detta protokoll visas i materialtabellen. Dessutom finns en lista över felsökningsstrategier som hanterar vanliga protokollproblem i tabell 1.

1. Frystorkning

1. Medan du håller de biopsierade muskelproverna frysta på torris, väg och tarera ett tomt fruset rör på vågen.
2. Väg snabbt upp minst 10 mg våtvikt fryst vävnad. Anteckna vikten med en decimal.
3. Sätt in vävnaden i det förkylda mikrocentrifugröret som har haft 3-4 hål genomborrade i locket och placera det i en liten bägare med 2-3 pellets torris.
4. Följ frystorkarens bruksanvisning.
5. Se till att alla ventiler på frystorken är stängda och slå på frystorken.
6. Använd kontrollpanelen för att kontrollera att vakuumbörvärdet är programmerat för optimala frystorkningsförhållanden för mänsklig vävnad, 0.12 millibar (mBar) (Figur 2).
7. Tryck på manual på frystorken och vänta tills kammaren har svalnat till −40 ^oC.
8. När kammaren har nått den temperaturen, ta bort locket, sedan glaskammaren och placera bägaren (med muskelprov) på metallsteget.
9. Sätt tillbaka glaskammaren och locket. Stäng vakuumutlösningsventilen på locket och vänta tills vakuumskalans lampa lyser grönt för att säkerställa att torktumlaren är vakuumförseglad.
10. Frystorka muskelproverna i 48 timmar. När frystorkningen är klar, stäng av vakuumpumpen genom att trycka på vakuumknappen och öppna vakuumutlösningsventilen på locket.
11. Ta av locket på kammaren och samla upp det frystorkade provet. Väg vävnaden och anteckna vikten med en decimal.
12. Beräkna den procentuella viktminskningen; ~75 % viktminskning indikerar att vävnaden är framgångsrikt frystorkad (i detta arbete medelvärde ± SD, 76 ± 9 %, n = 11 muskelprover).
13. Tryck på AUTO för att stänga av vakuumpumpen och frysen. Låt enheten nå omgivningstemperatur.
14. Rengör kylslingorna enligt tillverkarens anvisningar och töm ackumulerad vätska från uppsamlaren.
    OBS: Fiberinsamling kan påbörjas omedelbart. Om vävnad inte används för fiberisolering, förvara det frystorkade provet vid -80 °C i en förseglad behållare med exsickatorpärlor.  VARNING: Torris är farligt (klass 9); Se säkerhetsdatabladet för rekommenderad säker hantering.

2. Insamling av fibrer

1. Förberedelse av fiberuppsamling
   1. Märk minst 50 mikrofugerör (fiber 1 till 50) och pipettera 10 μL denatureringsbuffert till varje rör.
   2. Förbered uppsamlingsområdet med två par finvävnadsdissekerande pincett, luddfri vävnad, en bänklampa, ett stereomikroskop (med det svarta steget uppe), en virvel och en bänkcentrifug.
   3. Lägg det frystorkade muskelprovet på ett petriskållock. Placera locket på stage av dissekeringsmikroskopet.
   4. Titta på videon om dissektion av en fiber. Öva på hela protokollet från fiberinsamling till identifiering av enkelfibertyp minst två gånger innan du påbörjar en studie.
   5. Före fiberinsamling, beräkna den totala volymen som krävs för ett fibertypprov från varje biopsi enligt följande. Till exempel, om startvolymen på 1 fiber = 10 μL och volymen som återstår efter MyDoBID är (1 fiber × 10 μL) - 1 μL som används för punktblotting = 9 μL (provvolym), beräkna den totala provvolymen som krävs genom att multiplicera provvolymen (μL) med det totala antalet Western Blots som kommer att köras och fördubbla detta belopp för att ta hänsyn till redundans: (9 μL × 4 Western blots) × 2 = 72 μL. Beräkna antalet fibrer som krävs per typat prov genom att dividera den slutliga provvolymen som krävs (μL) med provvolymen per fibertypsspecifikt prov (t.ex. 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibrer per fibertypsspecifikt prov). För att uppnå detta, samla totalt 50 fibrer.
      OBS: Sample volymen som krävs är den minsta proteinkoncentration som krävs för att köra både MyDoBID och western blotting om mängden protein som laddas motsvarar en ~3 mm fiber (~12 μg våtvikt) för varje sample (se Supplementary File 1 för detaljer). Denna volym tar dock inte hänsyn till om upprepade geler krävs för ett visst protein.  VARNING: Tången är vass; Hantera dem varsamt för att undvika risken för punktering av huden.
2. Isolering med en fiber
   1. På ett litet papper 5 cm x 1 cm använder du en linjal för att rita en linje på 1 cm. Markera var 1 mm på den linjen.
   2. Sätt in den under petriskålens lock som en guide för att uppskatta längden på de uppsamlade fibrerna.
   3. Placera det frystorkade muskelprovet under stereomikroskopet vid låg förstoring (x 7,5). Använd en finvävnadsdissekerande pincett för att hålla den frystorkade muskeln på plats och med den andra börja separera små buntar av fibrer (som ses i videon).
   4. Isolera ett knippe fibrer och fortsätt att reta isär tills enstaka fibersegment är isolerade från bunten.
   5. Samla minst 50 fibrer som är minst ~1 mm långa.
   6. Flytta fibern till ett tomt utrymme på petriskålen. Inspektera enfibersegment under högre förstoring (x 50). Se till att det är en enda fiber genom att ytterligare separera fibern i slutet. Om fibern går sönder istället för att separera är det en enda fiber.
3. Denaturering av fibrer
   1. Använd en pincett, samla försiktigt upp fibern och placera den direkt i den aliciterade denatureringsbufferten (låt inte pincetten stöta på bufferten).
   2. Kontrollera pincetten under mikroskopet för att säkerställa att fibern har tagits bort. Stäng röret och knacka botten av röret ordentligt på bänken tre gånger för att säkerställa att fibern rör sig in i bufferten.
   3. Torka av pincetten med luddfri vävnad innan du går vidare till nästa fiber. Upprepa denna process tills alla fibrer har samlats in.
   4. Virvla fiberproverna och centrifugera kort i 5 s vid 2 500 × g för att dra provet till botten av röret.
      OBS: Centrifugeringstiden (5 s) är tidsinställd från början (0 × g) tills hastigheten når ~2 500 × g.
   5. Låt proverna stå i rumstemperatur i 1 timme. Förvaras vid -80 °C för framtida bruk. Frys och tina sedan proverna före användning.

3. Blotting av prickar

1. Förberedelse och aktivering av membran
   1. Mät, märk och skär till ett polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) (0,2 μm porstorlek) så att det passar 50 prover (~10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Markera den vänstra kanten numeriskt uppifrån och ned (1 till 10) och den övre kanten alfabetiskt från vänster till höger (A till E) med 1 cm mellanrum.
   3. Förbered fyra ark filterpapper med måtten 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Stapla två ark tillsammans för att bilda en stapel. Blötlägg filterpappersbunten i 1x överföringsbuffert.
   5. Placera membranet i en behållare. Häll 95 % etanol över membranet, med tillräcklig volym för att helt sänka ner membranet (10-15 ml). Skaka på vippan i 1 min.
   6. Samla upp etanolen, sänk ner membranet i 1x överföringsbuffert (~15 ml) och gunga i ytterligare 2 minuter.
      OBS: Både etanol och överföringsbuffert kan återanvändas för framtida dot blotting-experiment tills sedimentering bildas (byt efter sex användningar).
   7. Lägg den buffertindränkta filterpappersbunten på en plan, rörlig yta, t.ex. ett stort lock, och platta till med rullen. Placera PVDF-membranet på stacken med hjälp av en gelfrigörare eller pincett.
   8. Lägg ett enda ark torrt filterpapper ovanpå membranet och flytta rullen över filterpapperet för att suga upp eventuell överflödig buffert på membranytan. Ta bort det övre filterpapperet utan att gnugga membranet.
      VARNING: Metanol (klass 3, delrisk 6.1) och etanol (klass 3) är farliga. Se säkerhetsdatabladet (MSDS) för rekommendationer om säker hantering.
2. Provabsorption till membranet
   1. Tina fiberproverna, utför en kort centrifugering (5 s) vid rumstemperatur som i steg 2.3.4 och blanda provet noggrant.
   2. Utan att vidröra membranet med pipettspetsen, deponera långsamt en ~1 μL droppe av varje sample på membranet i det avsedda området. Måtten på det angivna området per fiberprov är ~1 cm x 1 cm. Sikta på att placera provet i mitten av detta område.
   3. Låt provdropparna tränga igenom membranet i minst 15 minuter. Se till att ingen sample buffert finns kvar och är helt absorberad.
   4. Använd en plastpincett, lyft försiktigt bort membranet från den fuktiga filterpappersbunten, placera det på ett enda torrt ark filterpapper och torka membranet i minst 5 minuter.
   5. När provfläckarna blir helt vita, återaktivera membranet.
3. Reaktivering och blockering av membran
   1. Återaktivera membranet genom att upprepa steg 3.1.5 och 3.1.6.
   2. Lägg membranet i tvättbufferten och skölj i 5 min med gungning. Kassera tvättbufferten.
   3. Inkubera membranet i blockerande buffert i 30 minuter medan du gungar.
   4. Skölj membranet 3 gånger med tvättbuffert tills bufferten inte längre är grumlig.
   5. Låt membranet ligga kvar i den sista tvätten på vippan.

4. Immunmärkning

1. Påvisande av MHCIIa
   1. Späd den primära MHCIIa-antikroppen vid 1:200 i 10 ml buffert av bovint serumalbumin (BSA).
   2. Kassera tvättbufferten från membranet och häll sedan den utspädda MHCIIa-antikroppen på membranet.
   3. Placera behållaren (med membranet i MHCIIa) på vippan i rumstemperatur i 2 timmar eller vid 4 °C över natten.
   4. Samla ihop MHCIIa-antikroppen och förvara den vid 4 °C. Tvätta membranet med blockeringsbuffert i 2 min på vippan.
      OBS: Alla primära antikroppar kan återanvändas upp till fem gånger så länge bufferten förblir fri.
   5. Skölj två gånger till; 5 min varje gång; Tre tvättar totalt.
   6. Späd musimmunglobulin G pepparrotsperoxidas (IgG-HRP) sekundär antikropp med 1 på 20 000 i 10 ml blockerande buffert och tillsätt till membranet.
   7. Kassera tvättbufferten och inkubera membranet i mus IgG-HRP sekundärt med gungning i 1 timme.
   8. Kassera sekundären och tvätta membranet i tvättbuffert (2, 5, 5 min).
   9. Låt membranet ligga i blöt i den sista tvätten tills det är klart för avbildning.
   10. Slå på gelkameran, vänta 15 minuter tills kameran når önskad driftstemperatur och öppna sedan bildbehandlingsprogrammet (se materialförteckning).
   11. I programvarufönstret klickar du på New Single Channel Protocol (Bild 3A). För en bild av membranet med vitt ljus, under Applikationer | Fläckar | klicka på Kolorimetrisk (Figur 3B).
   12. Klicka på gelområdet; Varje alternativ är programmerat för specifika dimensioner för att passa storleken på olika geltyper. Välj lämpligt alternativ för att bäst passa membranets dimensioner (Figur 3C).
   13. Bered ECL genom att kombinera luminol- och peroxidasreagenser i förhållandet 1:1. Gör en tillräcklig volym ECL-blandning för att täcka hela membranet, vanligtvis krävs en total volym på 800-1 000 μL.
   14. Placera membranet på en stor genomskinlig plastbricka och sprid ECL-blandningen på membranet.
   15. Placera membranet på bildplattan.
   16. Klicka på Position Gel (gul knapp) för en livekameravy. Klicka, håll ned och dra zoomknappen för att maximera membranets bildområde. Räta nu ut membranets position om det behövs.
   17. Klicka på Kör protokoll (grön knapp) och vänta på att en kolorimetrisk bild av membranet ska produceras. Spara den här bilden för att hjälpa till att matcha prickarna till motsvarande fibersample.
   18. Utan att flytta membranet, ändra applikationen på programvaran genom att klicka på alternativet för en 2 x 2 binning (Chemi High Resolution) (Figur 3D).
   19. Under Bildexponering och programvara optimerar du exponeringstiden och klickar på Svaga band (Figur 3E) | Läge för signalackumulering.
   20. Under Inställningar skriver du in 1 s för den första bilden, 30 s för den sista bilden och 30 bilder totalt (bild 3F).
   21. Klicka på Kör protokoll.
   22. Spara en bild i följande steg: före signalmättnad (alla synliga punkter är svarta), initial signalmättnad (vissa punkter börjar mättas) och övermättade fläckar (alla punkter med stark signal detekterad är mättade).
   23. Spara alla nödvändiga bilder innan du avslutar signalackumuleringen. Ta ut membranet ur kameran.
   24. Använd gelfrigöraren och sätt tillbaka membranet i behållaren med tvättbufferten.
2. Detektering av MHCI
   1. Häll ut tvättbufferten och behandla membranet med strippbuffert i 30 minuter vid 37 °C (se till att membranet är helt nedsänkt).
   2. Samla ihop strippningsbufferten och skölj membranet i tvättbufferten i 5 min med gungning.
      OBS: Strippningsbufferten kan återanvändas 10 gånger innan den kasseras.
   3. Häll ut tvättbufferten och applicera denna gång MHCI primär antikropp utspädd med en startkoncentration på 1 på 200 (intervall: 1 på 200 till 1 på 500). Gunga membranet i rumstemperatur i 1 timme.
   4. Efter inkubation i primär MHCI-antikropp, samla ihop antikroppen och skölj membranet enligt steg 4.1.4 och 4.1.5.
   5. Späd sekundär IgM HRP-antikropp från möss i blockerande buffert med 1 på 20 000. Häll ut blockeringsbufferten från membranet och inkubera i musens IgM sekundärt som i steg 4.1.7.
   6. Tvätt och bildtagning detekterade MHCI som i steg 4.1.8 till 4.1.24.
      VARNING: Strippningsbuffert innehåller organofosfin 3-5 % (klass 8). Se säkerhetsdatabladet för rekommendationer om säker hantering.
3. Detektion av potentiell MHCIIx med Actin
   1. Skala av membranet en gång till (punkt 4.2.1 och 4.2.2).
   2. Upprepa avsnitt 4.1, denna gång med aktin primär antikropp utspädd med 1 på 500 i BSA-buffert och sedan kanin HRP sekundär antikropp utspädd med 1 på 20 000 i blockerande buffert.

5. Identifiering av fibertyp

1. MHCI-, MHCIIa- och aktinsignalanalys
   1. Bekanta dig med signalintensitetspanelen (Figur 4A). Anteckna steg 5.1.2 till 5.1.4.
   2. En mättad signalintensitet indikerar kvalitativt att proteindetektionen är stark.
   3. En måttlig indikerar att målproteinet är närvarande på en medelnivå.
   4. En svag signal indikerar att det inte finns något målprotein.
   5. Använd signalintensitetspanelen för att kategorisera fibrer med "mättad", "måttlig" eller "svag" signalintensitet (Figur 4A).
   6. Utför identifiering av fibertyp genom att jämföra MHCIIa- och MHCI-resultat först (Figur 4B, vänster och mellersta fläckar).
   7. Spela in fibrer med mättad eller måttlig signalintensitet av endast en MHC-isoform.
   8. Om MHC-isoformsignalen är "svag", lämna fibern omärkt (se figur 4B).
   9. Slutligen, om aktin observeras (måttlig eller mättad signalintensitet) i fibrerna utan att MHCI eller IIa detekteras, registrera det som en potentiell typ IIx-fiber (figur 4B, höger fläck).
   10. Registrera fibrer med svag MHC-isoformsignal men aktin detekteras (måttlig eller mättad intensitet) som oidentifierad.
   11. Kassera prover med svag eller ingen detektion (ingen fiber samlad) för alla tre målproteinerna (Figur 4C).
   12. Spela in alla fibrer där både MHCI- och MHCII-signaler detekteras med en "mättad" eller måttlig signal. Dessa samples är inte avsedda för användning i fibertypspecifik beredning.
2. Beredning av fibertypspecifika prover
   1. Förbered ett separat typ I- och typ II-prov för varje biopsi. För ett typ II-prov, kombinera det minsta erforderliga antalet fibrer (beräknat i steg 2.1.5) i vilka MHCIIa detekteras vid mättade eller måttliga nivåer.
   2. I ett separat rör märkt som typ I, upprepa denna process för fibrer där MHCI detekteras (Figur 4D).
   3. Använd fibrer med måttlig signalintensitet om det inte finns tillräckligt med fibrer med mättade signaler.
   4. Kombinera eventuella IIx-fibrer.
   5. Använd omedelbart fibertypsspecifika prover för western blotting eller förvara dem vid -80 °C för framtida bruk.

6. Bekräftelse av Western blot-fibertyp

1. Använd 10 μL av varje fibertypsspecifik sample (den minsta sample volym som krävs, se steg 2.1.5).
2. Separera prover med den specificerade prefabricerade gelen via SDS-PAGE enligt tillverkarens protokoll.
3. Använd en gelkamera för att detektera proteinet i gelen enligt tillverkarens protokoll.
4. Lägg gelen i kall 1x överföringsbuffert i 10 minuter.
5. Våtöverför proteinerna till ett 0,45 μm nitrocellulosamembran (9,5 cm x 13,5 cm) enligt tillverkarens protokoll.
6. Efter överföring, skölj membranet kort med ultrarent H₂O i en behållare. Häll ut det ultrarena vattnet.
7. Tillsätt 10 ml antikroppssignalförstärkare till membranet och gunga i rumstemperatur i 10 minuter.
8. Samla ihop antikroppssignalförstärkarlösningen och tvätta 5 gånger (5 s per tvätt) med ultraren H₂O.
   OBS: Antikroppssignalförstärkare kan användas 5 gånger innan kassering.
9. Häll ut den sista tvätten, tillsätt blockeringslösning och gunga i rumstemperatur i 1 timme.
10. Använd ett rent skalpellblad eller en sax för att klippa horisontellt över membranet med en molekylvikt som säkerställer att proteiner som är 180 kDa och högre finns på den övre delen av membranet.
11. Använd den här övre delen för ytterligare bekräftelse av fibertyp.
12. Använd andelen under 180 kDa för att detektera olika målproteiner.
13. På den övre delen av membranet följer avsnitt 4.1 med primär MHCIIx-antikropp och sekundär HRP-antikropp mot immunglobulin M (IgM) hos möss.
14. Avlägsna membranet (enligt beskrivningen i avsnitt 4.2.1 och 4.2.2) innan processen upprepas med primär MHCIIa IgG och sekundär IgG HRP-antikropp från möss.
15. Strippa en gång till och applicera slutligen MHCI IgM primär och mus IgM HRP sekundär antikropp.
    OBS: Detta steg är kvalitativt och därför är eventuell proteinförlust på grund av membranstrippning inte ett problem.
16. Jämför signalen som detekteras över de olika MHC-isoformerna (som visas i figur 5B). När signalintensiteten detekteras vid måttliga till mättade nivåer i det förväntade provet (MHCI - typ I, MHCIIa - typ II och MHCIIx - typ IIx) kommer de fibertypspecifika proverna att registreras som tillförlitliga för användning i framtida studier.
17. Registrera provet som otillförlitligt när mer än en MHC-isoform detekteras på samma sätt i ett prov.
    VARNING: Antikroppsförstärkarlösning innehåller 50 % natriumhydroxid. Se säkerhetsdatabladet för rekommendationer om säker hantering.

Representative Results

Identifiering av individuella MHCI-, MHCIIa- och MHCIIx-muskelfibrer med hjälp av dot blotting
En egenskap hos MyDoBID är kategoriseringen av den varierande MHC- och aktinsignalintensiteten i en given fiber (figur 4A). Fibertypen identifierades genom närvaron eller frånvaron av MHCI- och IIa-isoformer (figur 4B). Sex fibrer visade ingen MHC- eller aktindetektion, vilket indikerar att det inte fanns någon fiber insamlad. Resultaten av denna specifika punktfläck var identifieringen av 22 typ II-fibrer, 7 typ I-fibrer och 3 potentiella typ IIx-fibrer; 2 oidentifierade prover och 6 prover klassificerades som "fiberfria" insamlade (figur 4B, C). Fibrer som inte hade någon detekterbar MHCI- eller MHCIIa-signal men som var positiva för aktin identifierades som potentiella typ IIx-fibrer genom en elimineringsprocess. Med hjälp av signalintensitetspanelen för att klassificera MHCI- och IIa-signalstyrka kombinerades "måttliga" eller "mättade" fibrer för att producera typ I- respektive II-prover. Fibrer som var oidentifierade eller hade svagt eller inget aktin detekterades inkluderades inte i efterföljande analys och kasserades (Figur 4D).

Bekräftelse av fibertypning med västerländsk blotting
De fibertypsspecifika proverna validerades med hjälp av western blotting och MHC-specifika antikroppar (figur 5). Typ I- och typ II-fiberprover från en individuell biopsi kördes tillsammans med ett typ IIx-prov, som var ett prov av potentiella typ IIx-fibrer från två individer på grund av det låga antalet typ IIx-fibrer som fanns i varje biopsi. Western blot-data bekräftade att identifieringen av fibertypen lyckades.

Figur 1: Sammanfattning av arbetsflödet som beskriver provberedning, fibertypning och western blot-bekräftelse av fiberspecificitet . (A) Mänsklig vävnad frystorkas i 48 timmar. (B,C) Enstaka fibersegment isoleras under ett dissekerande mikroskop. (D) Fibrerna denatureras och (E) efter 1 timme, lagras vid -80 °C. (F) Primär inkubationsordning för antikroppar. (G) Fibrerna var punktblottade och fibertypen identifierades med hjälp av MHCIIa (typ II), MHCI (typ I) och aktin (IIx?, potentiell typ IIx-fiber). (H) Fibrerna poolades sedan. (I) Fibertypsspecifika prover längs en kalibreringskurva analyseras via SDS PAGE och western blotting. (J) Validering av fibertypsidentifiering med hjälp av western blotting. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Frystorkningssystemets skärm och kontrollpanel. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Imager-inställningar för infångning av membranet med vitt ljus följt av kemiluminiscensdetektion av målproteiner. För att avbilda membranet under vitt ljus, (A) välj Ny enkelkanal följt av (B) Fläckar | kolorimetrisk applikation. (C) Baserat på storleken på gelen som används, välj lämpligt bildområde och ta sedan en bild med vitt ljus genom att trycka på Kör protokoll. (D) Upprepa steg B utan att flytta membranet, men den här gången väljer du Blots | Chemi Hi Resolution. Innan du trycker på kör, välj (E) Bildexponering för att optimera för svaga band och (F) ställ in signalackumuleringsläget och ställ i första hand in exponeringstiden för varje sekund i totalt 30 s med Markera mättade pixlar markerade . Tryck på Kör protokoll och låt körningen slutföras innan du väljer de bästa bilderna för att spara. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Identifiering av fibertyp. (A) Fibertyper identifierades i förhållande till alla andra fibrer på membranet, kategoriserade av signalintensitetspanelen för varje MHC-isoform som detekterades (t.ex. MHCI-signal: mättad, måttlig och svag). (B) Med hjälp av panelen i (A) identifierade MHCIIa-antikroppen typ II-fibrer (blå, vänster fläck), och efter att membranet tagits bort identifierade MHCI-antikroppen typ I-fibrer (röd, mellersta fläck). Aktinantikroppar användes för att identifiera potentiella IIx-fibrer om en positiv aktinsignal detekterades i fibrer där ingen tidigare MHCI- eller IIa-signal detekterades (grön, höger blot). Fibrer som inte följde dessa riktlinjer är markerade i lila (oidentifierade). Slutligen visade prover som var negativa för aktinsignalen att ingen fiber hade samlats in ("No Fiber"). (C) Tabell som visar fibermärkning som motsvarar provpositionen på punktfläckar som visas i (B). (D) Översikt över fiberval för beredning av fibertypspecifika prover. Målet var att samla in 10 mättade fibrer för varje fibertyp. Här, för typ II-fibrer, identifierades åtta mättade fibrer och poolades. För typ I-fibrer fanns mindre än 10 mättade fibrer, så fibrer med måttlig signalstyrka valdes också. För typ IIx-fibrer identifierades och poolades två fibrer. Om mindre än 10 fibrer (mättade och måttliga) identifieras, kan ytterligare fiberinsamling vara nödvändig.  OBS: Actin-signalen som visas i (B) har inte nått mättnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Western blot-bekräftelse av identifiering av fibertyp. Identifiering av fibertyp utfördes enligt figur 4 för att generera prover av typ I (~10 fibrer) och typ II (~10 fibrer). Eftersom det inte fanns några IIx-fibrer identifierade från samma biopsi, producerades IIx-provet som visas här från mer än ett muskelprov (n = 2 individer). En liten alikvot av varje fiberspecifikt prov analyseras genom western blotting för att bekräfta identifiering av fibertyp. Molekylviktsmarkörer (kDa) anges till vänster, fångade under vitt ljus utan att membranet flyttas. Målproteiner detekteras i sekvensen MHCIIx, MHCIIa och MHCI, där myosinet från den UV-aktiverade gelen visuellt indikerar mängden protein som laddas per prov. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Felsökningsstrategier för vanliga protokollproblem. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tilläggsfil 1: Beräkning av frystorkad fibermassa med hjälp av en kalibreringskurva. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Insamling av fibrer
Baserat på flera års erfarenhet kan de flesta forskare behärska denna teknik; Övning leder dock till snabbare och effektivare fiberinsamling för nedströmsanalyser. För att kunna isolera 30 enkelfibersegment av en kvalitet för poolning, rekommenderas att 50 fibersegment samlas in per prov. Att studera fiberinsamlingsvideon noggrant och efter att ha utfört två övningssessioner (~50 fibrer per session) rekommenderas för att uppnå en rimlig standard. Alla fibrer som samlas in genomgår MyDoBID för att identifiera fibertypen, vilket kommer att avslöja hur effektivt tekniken utförs. Detta skulle ses som ett lågt antal "ingen fiber" eller "svag" MHC-signal detekterad i fiberprover (se protokollavsnitt 5.1).

Det är känt att muskler kan innehålla hybridfibrer, där både MHCI och MHCIIa är närvarande, eller MHCIIa och IIx ^2,14. En begränsning med MyDoBID är att förekomsten av en hybridfiber inte kan fastställas eftersom ett prov som är positivt för både MHCI- och MHCIIa-antikroppar kan vara antingen en hybridfiber eller att två fibrer samlades in. Vidare kan MyDoBID inte detektera MHCIIa separat från MHCIIa/IIx-hybrider eftersom den primära MHCIIa-antikroppen skulle detektera närvaron av MHCIIa i både IIa- och IIa/IIx-fibrer. Av dessa skäl utfördes inte identifiering och beredning av prover av hybridfibrer, och prover som har både MHCI- och MHCIIa-signaler som föll utanför de intervall som beskrivs i signalintensitetspanelen kasserades (figur 4A). En ytterligare begränsning är att andelen muskelfibertyper i ett prov inte kan bestämmas med hjälp av MyDoBID, och att tillämpa konventionella immunhistokemiska analyser är nödvändiga för att bestämma fibertypsfördelning².

Blotting av prickar
Signalintensitetspanelen och fibertyps-ID:t är beroende av att hela sample representeras i den lilla volymen som appliceras på punktblottingmembranet. För att åstadkomma detta blandas provet noggrant genom omrörning innan det laddas på membranet. Alla fibrer med endast en MHC-isoform går vidare till nästa steg i poolningen. I detta skede är det viktigt att någon fiber med mer än en MHC inte får gå vidare till nästa steg för att kombinera prover. Om ett prov är kontaminerat måste hela det poolade provet kasseras och forskaren måste gå tillbaka till fiberinsamlingen och upprepa stegen för fiberisolering och punktblotting.

Immunmärkning
Tidigare har det rapporterats att 5 minuter är en tillräcklig tid för att blockera icke-specifika platser på membranet för detektion av MHCI och MHCIIa⁹. För att avancera tekniken till MyDoBID krävs att en aktinantikropp används. Det visade sig att blockeringstiden på 5 minuter behövde ökas till 30 minuter, som rapporterats⁶, för att få ett membran med minimal bakgrund, eftersom 5 minuters blockering resulterade i en mörkare membranbakgrund. Blockeringstid är en faktor att ta hänsyn till i alla immundetektionstekniker, såsom western blotting eller immunohistokemi, och bör modifieras på lämpligt sätt.

Strippning av membranet
Strippning kan inte användas för kvantitativa analyser¹⁵ eftersom det också tar bort proteiner av intresse, men kan användas i MyDoBID eftersom det är en kvalitativ analys. Syftet med strippning är att avlägsna de bundna antikropparna från membranets yta, vilket gör att en ny antikropp kan användas med minimal interferens från den tidigare antikroppen. I MyDoBID finns det möjlighet att applicera provet över två membran, där de olika MHC-isoformerna detekteras på separata membran. Om detta tillvägagångssätt föredras, undvik att hantera provröret mer än en gång genom att ladda fläckarna samtidigt. Detta kommer att säkerställa att torktiden mellan varje provplats är likartad (~5 s skillnad) och efterföljande steg utförs samtidigt i separata behållare. Det måste noteras att detta alternativ skulle öka tiden, provet och förbrukningen.

Antikroppar appliceras för att först detektera MHCIIa-fibrer, följt av MHCI, eftersom MHCI-antikroppen alltid ger en mycket ljus signal, som skulle vara svårare att ta bort än MHCIIa. Aktin uttrycks homogent i skelettmuskelfibrer och används för att bekräfta att en del av fibern framgångsrikt applicerades på membranet enligt beskrivningen ovan.

Avbildning, identifiering av fibertyp och beredning av fibertypspecifika prover
Ett nytt verktyg har utvecklats i detta protokoll för att hjälpa till med identifiering av fibertyp och provval för att skapa fibertypsspecifika prover (figur 4A). Exemplet som visas i signalintensitetspanelen används för att definiera MHCI-signalintensitet som: (i) mättad, (ii) måttlig eller (iii) svag. För att poola fibrer i fibertypsspecifika prover väljs fibrer som visar mättad signalintensitet först och vid behov tillsätts fibrer med måttlig signalintensitet. Vid beredning av typ I- och II-prover finns det vanligtvis tillräckligt med "mättade" och "måttliga" fibrer så att fibrer som kategoriseras som "svaga" eller oidentifierade kan kasseras.

Nyheten att använda aktin istället för MHCIIx-antikroppar för att identifiera rena typ IIx-fibrer
Tidigare, för att identifiera rena IIx-fibrer, jämfördes MHCIIx-signalen subjektivt med MHCI- och MHCIIa-signalen på en punktbloss, och genom en elimineringsprocess identifierades fibrerna utan MHCI- eller IIa-signal, men med MHCIIx-signal, som ren IIx. Problem kan dock uppstå när man använder två primära IgM-antikroppar från möss (MHCIIx och MHCI) på samma membran. Trots att membranet mellan de primära antikropparna har strippats kan kvarvarande antikroppssignal detekteras. Att använda primär anti-Actin-antikropp mot kanin förhindrar att detta problem uppstår. Här använde vi Actin för att bekräfta att en fiber samlades in och i frånvaro av både MHCI och MHCIIa, indikerar att en IIx-fiber var närvarande. Potentiella IIx-fibrer bekräftas sedan genom western blotting med hjälp av den MHCIIx-specifika antikroppen (se figur 5 i detta dokument och figur 2 i⁹). 6H1-antikroppen har visat sig¹⁶ detektera det elektroforetiskt separerade bandet som motsvarar MHCIIx i råttskelettmuskulatur och märker typ IIx-fibrer i tvärsnitt av mus-, rått- och mänskliga muskler².

Bekräftelse av Western blot-fibertyp
Det är bästa praxis att köra alla fibertypsspecifika prover från samma biopsi på samma gel. Med MHCI-antikroppar som kräver samma sekundära antikropp som MHCIIx bör typ I- och IIx-prover separeras med minst en körsträcka på en given gel, såsom visas i figur 5. Eftersom proteininnehållet kommer att variera mellan fibertypsspecifika prover på grund av varierande fiberstorlek, bör den första gelen användas för att bestämma provvolymen som behöver laddas i efterföljande gelkörningar för att uppnå liknande mängder protein över alla prover. För att göra detta bestäms det totala proteinet i ett givet prov med hjälp av UV-aktiverad gelavbildningsteknik för att visualisera alla proteinband som har separerats i gelen av SDS-PAGE före överföring. Det totala proteinet i varje prov bestäms från gelbilden och används för att korrigera ojämn belastning i nästa western blot-körning, förutsatt att en kalibreringskurva för flera kända massor av skelettmuskelvävnad körs tillsammans med de fibertypsspecifika proverna 3,4,6,17. Det finns inte heller något behov av att använda ett "hushållsprotein" som Actin för att bestämma det totala proteinet, vilket också skulle kräva en egen kalibreringskurva¹⁵. Denna teknik är en tidsbesparande och noggrann metod för att bestämma det totala proteinet och kan utföras med mycket lite prov (dvs. ~1/5 av en fiber⁹) utan behov^av ytterligare reagenser eller proteinstandarder samtidigt som alla delar av membranet maximeras för att detektera proteiner av intresse.

När det gäller immunmärkning under western blot-steget appliceras MHCIIx-antikroppen först på grund av den relativt låga förekomsten av MHCIIx jämfört med de andra MHC-isoformerna. När membranet är redo för detektion av MHCI-antikroppar skulle det ha genomgått två steg av strippning (dvs. efter MHCIIx- och MHCIIa-detektion). Följaktligen bör detektionen av MHCI i första hand detekteras i ett typ I-prov, med minimal restsignal detekterad från tidigare MHC-antikroppar (figur 5). Western blotting används för att bekräfta renheten hos varje fibertypsspecifikt prov med hjälp av alla tre MHC-antikroppar på samma membrandel. Behovet av strippning skulle dock elimineras om antingen MHCI- eller MHCIIx-antikroppar odlades i en annan värdart, t.ex. kanin eller get.

Program
Metodiken som beskrivs här kan användas för fibertypning av enstaka fibersegment från färsk eller frystorkad skelettmuskulatur för att undersöka fibertypsspecifikt proteinuttryck i mänsklig skelettmuskulatur. Dessutom, med hjälp av färska muskelprover, kan antingen intakta eller mekaniskt flådda fibrer användas⁶. Genom att använda en skinnad fiber kan man ytterligare undersöka proteinuttrycket i subcellulära fack, t.ex. i cytosol- och membranfacken. Denna applikation har tidigare använts för att mäta mängden glykogen som är bundet kontra obundet i mekaniskt flådda fibersegment från friska och diabetiska individer⁶. Det är viktigt att MyDoBID är fördelaktigt för experiment som endast använder denaturerade prover och inte skulle vara lämpligt för studier som kräver proteiner i sitt naturliga tillstånd. Även om det är möjligt att andra analyser såsom enzymatiska analyser eller proteomikmetoder i lösning skulle kunna utföras under naturliga förhållanden, skulle ytterligare optimering krävas så att en del av fibern kan avlägsnas för MHC-isoformidentifiering med hjälp av MyDoBID.

Sammanfattningsvis kan typ I, typ II och typ IIx framgångsrikt identifieras genom tillämpning av en enkel teknik med lättillgängliga förbrukningsvaror som vanligtvis används för western blotting. Vi inkluderar omfattande praktisk information, där vi efter framgångsrikt slutförande kommer att producera fibertypspecifika prover som är av bästa möjliga kvalitet, integritet och tillförlitlighet för framtida studier. Denna teknik är det praktiska och föredragna tillvägagångssättet för att utföra fiberspecifik biokemisk analys av skelettmuskulaturen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.