Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tredimensionel bioprint af humane iPSC-afledte neuron-astrocyt-kokulturer til screeningsapplikationer

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65856
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1MSD Research Laboratories, London, UK, 2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

Summary

Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af 3D-bioprintede cokulturer af iPSC-afledte neuroner og astrocytter. Denne samkulturmodel, der genereres inden for et hydrogelstillads i 96- eller 384-brøndformater, demonstrerer høj levedygtighed efter udskrivning og neuritvækst inden for 7 dage og viser ekspressionen af modenhedsmarkører for begge celletyper.

Abstract

For at en cellemodel skal være levedygtig til lægemiddelscreening, skal systemet opfylde krav til gennemstrømning og homogenitet sammen med at have en effektiv udviklingstid. Mange offentliggjorte 3D-modeller opfylder dog ikke disse kriterier. Dette begrænser derfor deres anvendelighed i tidlige lægemiddelopdagelsesapplikationer. Tredimensionel (3D) bioprint er en ny teknologi, der kan anvendes til udvikling af 3D-modeller for at fremskynde udviklingstiden, øge standardiseringen og øge gennemstrømningen. Her præsenterer vi en protokol til udvikling af 3D bioprintede cokulturmodeller af humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte glutamaterge neuroner og astrocytter. Disse cokulturer er indlejret i en hydrogelmatrix af bioaktive peptider, ekstracellulære matrixproteiner (ECM) i fuld længde og med en fysiologisk stivhed på 1,1 kPa. Modellen kan hurtigt etableres i 96-brønds og 384-brønds formater og giver en gennemsnitlig levedygtighed efter tryk på 72%. Astrocyt-til-neuron-forholdet i denne model er vist at være 1:1,5, hvilket er inden for det fysiologiske område for den menneskelige hjerne. Disse 3D bioprintede cellepopulationer viser også udtryk for modne neurale celletype markører og vækst af neurit og astrocyt fremskrivninger inden for 7 dage efter kultur. Som et resultat er denne model velegnet til analyse ved hjælp af cellefarvestoffer og immunfarvningsteknikker sammen med neuritudvækstassays. Evnen til at producere disse fysiologisk repræsentative modeller i stor skala gør dem ideelle til brug i screeningsassays med medium til høj gennemstrømning til neurovidenskabelige mål.

Introduction

Forskning i sygdomme i centralnervesystemet (CNS) i lægemiddelforskningsindustrien udvides1. Imidlertid har mange udbredte CNS-sygdomme som epilepsi, skizofreni og Alzheimers sygdom stadig ingen helbredende behandlinger 2,3,4. Manglen på effektive behandlinger på tværs af CNS-sygdomme kan, i det mindste delvist, tilskrives manglen på nøjagtige in vitro-modeller af hjernen5. Dette har resulteret i en translationel kløft mellem nuværende in vitro-modeller og in vivo-data og en efterfølgende flaskehals i forskningsindsatsen.

Drevet af dette translationelle hul har der været en betydelig stigning i udviklingen af nye 3D-cellemodeller inden for de seneste år, herunder neurale organoider, neurosfæroider og stilladsbaserede modeller6. 3D-strukturen af disse modeller hjælper med at rekapitulere det neurale mikromiljø, herunder biomekaniske belastninger, celle-cellekontakter og hjernens ekstracellulære matrix (ECM)7. Hjernens ECM er et dynamisk element i neurofysiologi, der optager rummet mellem neurale celletyper, herunder neuroner, astrocytter, oligodendrocytter og den neurovaskulære enhed7. Rekapitulation af hjernens ECM har vist sig at påvirke neuronal morfologi og neuronal fyring, og mange komplekse 3D-modeller af hjernen har vist aflejring af ECM-proteiner ved neurale celletyper 8,9,10,11. Stilladsbaserede modeller består af modne neurale cokulturer suspenderet i en porøs, syntetisk eller biologisk hydrogelmatrix, som repræsenterer hjernens ECM12. I modsætning til organoid- og sfæroidsystemer tillader stilladsbaserede 3D-modeller tilpasning af tilstedeværende ECM-proteiner og har den ekstra fordel ved tunbarhed af hydrogelstivhed for at efterligne biomekaniske belastninger13,14.

Selvom et overvældende flertal af neurale 3D-modeller viser en øget rekapitulation af hjernens mikromiljø, er ikke alle modeller velegnede til implementering af lægemiddelopdagelsesapplikationer15. For at en 3D-model kan implementeres i industrielle processer, skal systemet opfylde gennemløbskrav til screeningsansøgninger og have en relativt kort udviklingstid16. 3D Bioprinting er en ny teknologi, der giver mulighed for at skabe 3D-stilladsbaserede neurale modeller med hurtig udviklingstid, øget gennemstrømning og højere niveauer af præcisionskontrol sammen med fjernelse af variabilitet forårsaget af menneskelige fejl17. Denne protokol præsenterer en 3D-samkulturmodel af humane iPSC-afledte glutamaterge neuroner og astrocytter i et hydrogelstillads. Dette hydrogelstillads indeholder fysiologisk repræsentative bioaktive peptider (RGD, IKVAV, YIGSR) og ECM-proteiner inden for en mimetisk biomekanisk stivhed. Disse ECM-proteiner i fuld længde omfatter laminin-211 i fuld længde og hyaluronsyre, der er rigelig i den menneskelige cortex, med en stivhed på 1,1 kPa i overensstemmelse med in vivo-målinger 18. Denne model er designet med praktisk anvendelighed til lægemiddelopdagelse og er oprettet ved hjælp af en 3D-bioprinter i et 96-brønds eller 384-brønds pladeformat, der er egnet til screeningsanalyse ved hjælp af billeddannelsesteknikker med cellefarvestoffer og antistoffer sammen med neuritudvækstassays. Celler viser ekspression af neurale celletypemarkører og vækst af neurit og astrocytiske fremskrivninger inden for 7 dage efter kultur. Således vil denne protokol præsentere metoden til at udvikle en højkapacitets 3D neural cokulturmodel til brug i lægemiddelopdagelsesapplikationer.

Figure 1
Figur 1: Illustrativ oversigt over metoder anvendt til 3D-bioprint-samkulturer. Humane iPSC-afledte neuroner og astrocytter kombineres med aktivator- og bioblækopløsninger, der indeholder bioaktive peptider, og bioprintes til hydrogelstilladser i 96-brønds- eller 384-brøndformater ved hjælp af drop-on-demand bioprintteknologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Bioprint af 3D-modeller

  1. Generering af pladekort og udskriftsfil
    1. Før modelgenerering skal du generere en pladekort, protokol og udskriftsfil ved hjælp af pladekortsoftwaren. Åbn pladekortsoftwaren, og vælg indstillingen Kulturceller i 3D.
    2. Vælg den modeltype, der skal bioprintes, fra de tilgængelige indstillinger i rullemenuen; denne model er blevet valideret i billedbehandlingsmodel - og HTP-modelformaterne . Vælg billedbehandlingsmodel for plader med 96 brønde og HTP for plader med 384 brønde.
    3. I vinduet Valg af matrix skal du vælge Hydrogel Px02.53, der indeholder Laminin-211 og hyaluronsyreproteiner, med IKVAV-, RGD- og YIGSR-peptider.
    4. I pop op-vinduet skal du indtaste celletyperne som glutamaterge neuroner og astrocytter og indtaste celletætheden som 20 millioner celler / ml.
    5. Brug softwaren til at designe det ønskede pladekort ved at fremhæve brønde på skærmpladen. Medtag mindst 1 række 2D-kontrol på plast i designet. 2D-kontrol på plastbrønde består af celler, der deponeres direkte i brønden uden hydrogelstillads; Overtræk disse brønde i henhold til trin 1.2.
    6. Sørg for, at plademodellen, der er angivet øverst i vinduet, ændres til den tilsigtede plademodel til brug (se Materialetabel).
    7. Download protokollen og udskriftsfilen til pladekortet ved hjælp af downloadknapperne, og gem dem på den bioprinter-linkede computer.
  2. Belægning af 2D-styring på plastbrønde
    1. Mindst 24 timer før udskrivning skal hullerne til 2D-kontrolmodellerne for cellevedhæftning og vækst belægges. 3D-modelbrønde kræver ingen forbelægning. Alle processer skal udføres i et biosikkerhedsskab, medmindre andet er angivet. Plader kan belægges og klargøres op til 7 dage før udskrivning.
    2. Der fremstilles 50 ml 1x boratbuffer ved at fortynde 2,5 ml 20x boratstamopløsning med 47,5 ml sterildH2O.
    3. Tilsæt 100 μL 50% (w / v) polyethyleneimin (PEI) til 50 ml 1x boratbuffer for at skabe en 0,1% (w / v) PEI-opløsning og sterilt filter gennem et 0,22 μm filter.
    4. Tilføj 0,1% (w / v) PEI-opløsning til hver 2D-kontrolbrønd, som angivet af pladekortet genereret i trin 1.1. Der tilsættes 100 μL/brønd, hvis der anvendes en plade med 96 brønde, eller 25 μL/brønd, hvis der anvendes en plade med 384 brønde.
    5. Pladen inkuberes i 2 timer ved 37 °C, før 0,1 % (w/v) PEI-opløsningen suges op, og hullerne skylles 5x med PBS. Lad brøndene tørre helt i biosikkerhedsskabet.
    6. 100 μL 1 mg/ml lamininopløsning fortyndes i 5 ml neurobasalt medium. Der tilsættes 100 μL til hver 2D-kontrolbrønd, hvis der anvendes en plade med 96 huller, eller 25 μL, hvis der anvendes en plade med 384 brønde. Der inkuberes i 4 timer ved 37 °C.
    7. Ved opbevaring af plader lades lamininopløsningen på plads efter inkubation og opbevares ved 4 °C.  Forvarm pladerne i 1 time ved 37 °C før brug.
  3. 3D bioprint af samkulturmodeller
    1. Oprethold altid en steril teknik, når du bruger bioprinteren, og tør handsker, patroner og kulturplader af med 70% EtOH, før de sættes i printeren. Medmindre andet er angivet, skal du udføre alle processer uden for bioprinteren i et biosikkerhedsskab.
    2. Tænd kompressoren for bioprinteren, og initialiser printeren ved at vælge knappen Initialiser på bioprintersoftwaren. Når luftstrømmen i printeren er startet, skal du tørre overflader inde i printeren af med en 70% EtOH-serviet.
    3. På udskrivningsdagen skal du gennemføre den guidede Start of Day Greenlighting-proces for at sikre den korrekte dysestatus for udskriften (minimum dysestatus 2A2B).
    4. Tag en bioprinterpatron fra den sterile emballage, tilsæt 20 ml steril dH2O i rum A, og tilsæt 6 ml sterilfiltreret 70% EtOH til rum B1-4. Sæt cylinderampullen i den venstre cylinderampulholder inde i bioprinteren, og placer pladelåget i den dedikerede lågholder.
    5. Vælg knappen Greenlighting på softwarens startskærm, og bekræft på softwaren, at patronen er på plads i bioprinteren, og at låget er fjernet. Start greenlighting-processen.
    6. Når du bliver bedt om det af softwaren, skal du bekræfte, at der ikke kan ses konsistente dryp fra hverken venstre eller højre nål. Efterfølgende, når du bliver bedt om det af softwaren, skal du bekræfte, at der er vand til stede i B7- og B8-rummene.
    7. Når bioprinteren har gennemført det selvstyrede greenlighting-trin, skal du indsætte en ubelagt steril 96-brønds flad bundplade (adskilt fra den coatede plade til bioprint-cokulturer) og indsætte denne nye plade i højre pladeholdersektion på bioprinteren, når softwaren beder om det. Sørg for, at pladeholderen er indstillet til High Profile Plate, og at låget fjernes og placeres i den dedikerede lågholder, før du begynder det næste trin.
    8. Bioprinteren vil deponere vanddråber i hver brønd på 96-brøndpladen. Når du er færdig, skal du placere pladen fra bioprinteren og bekræfte, at der er vanddråber til stede i hvert hul på pladen.
    9. Bortskaf den 96-brønds plade, der bruges til greenlighting, og lad bioprinteren afslutte greenlighting-processen. Når softwaren er færdig, angiver den dysestatus for bioprinteren og bekræfter, at bioprinteren er klar til at udskrive modeller. Placer låget på blækpatronen, og fjern det til biosikkerhedsskabet for de næste trin.
    10. Brug bioprintersoftwaren til at indlæse udskriftsfilen (genereret i trin 1.1) i softwaren ved hjælp af knappen Udskriv kørselssoftware og åbne udskrivningsprotokollen pdf.
    11. Udtag bioblæk og aktivatorvæsker, som angivet på udskriftsprotokollen pdf, fra -20 °C og tø op ved stuetemperatur (RT) i 40 minutter. For hydrogelmatrix Px02.53 vil dette omfatte: 1x hætteglas F32, 1xvial F3, 1x hætteglas F261, 1x hætteglas F299. Optø ikke bioblæk og aktivatorvæsker i hænder eller vandbad.
    12. Bring 50 ml komplette medier med doxycyclin og ROCK-hæmmer (komplet medie +DOX/ROCKi) (se trin 2.2) til RT, mens bioblæk og aktivatorvæsker tøer op.
    13. Når bioblæk og aktivatorer er optøet, skal du forberede blækpatronen som anvist på de sidste to sider i den genererede udskrivningsprotokol pdf. Greenlighting-printerpatronen genbruges til modeludskrivningsfaserne.
      1. Sørg for, at der er 40 ml dH2O i rum A1 og 8 ml 70 % EtOH i rum B1 og B2. Der tilsættes 1,2 ml aktivator F32 til C1, 1,2 ml F3 til C2 og 200 μL F261 til C4.
      2. Hent PEI og lamininbelagt plade fra inkubatoren og placer den inde i printeren i højre pladeholderrum. Fjern ikke laminin-media-opløsningen fra brøndene på dette tidspunkt. Sørg for, at pladeholderrummet er indstillet til Lavprofilplade , og at låget er fjernet og i lågholderen.
    14. Anbring blækpatronen i bioprinteren, og sørg for, at låget fjernes og placeres i holderen, og start udskrivningen af softwaren ved at vælge knappen Print Inert Base på bioprintersoftwaren.
    15. Mens den inaktive base udskrives, hentes hætteglassene med glutamaterge neuroner og astrocytter fra opbevaring af flydende nitrogen, optøes og resuspenderes i henhold til instruktionerne i afsnit 2.
    16. Når cellerne er optøet, og 8 ml komplet medie +DOX/ROCKi er tilsat hver celletype separat (i henhold til sektion 2), centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
    17. Supernatanten suges til syn, og begge celletyper opslæmmes separat i 1 ml hele medie +DOX/ROCKi.
    18. Tilsæt 20 μL cellesuspension til 20 μL trypanblåt og bland, før cellerne tælles for at bestemme levedygtig cellekoncentration pr. ml for hver celletype.
    19. Kombiner i alt 3 millioner glutamaterge neuroner med 1 million astrocytter i et 15 ml rør. Tilføj medier for at oprette en samlet volumen på 8 ml.
    20. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
    21. Opsug så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre cellepellet, og opslæft cellepillen igen i 200 μl aktivatorvæske F299.
    22. Bemærk, at aktivatorvæsken er tyktflydende; pipette op og ned for at resuspendere pelleten helt. Celletyperne er sarte; Minimer klipning og bobler ved hjælp af en pipettespids med bred boring og reverse pipetteringsteknikken. Pipetten pipetteres fast op og ned højst 3 gange for at forhindre celletab.
    23. Når det inaktive basistrin er færdigtrykt, skal du placere lågene på patronen og dyrkningspladen, fjerne begge fra bioprinteren og placere dem i biosikkerhedsskabet.
    24. Tilsæt 200 μL cellesuspension i F299 til hul C3 i blækpatronen, sæt cylinderampullen i bioprinteren igen, fjern låget, og sæt den i lågholderen. Sæt endnu ikke kulturpladen i igen.
    25. Start fasen Udskriv modeller i udskriftskørslen. Mens bioprinteren primer væsker, fjernes laminin-media-opløsningen fra pladens 2D-kontrolhuller, og den erstattes med 150 μL komplet medie +DOX/ROCKi i hver 2D-kontrolbrønd, hvis der anvendes en plade med 96 huller, og 50 μL komplet medie +DOX/ROCKi, hvis der anvendes en plade med 384 brønde.
    26. Når væskerne er grundet, skal du indsætte målretningspladen til bioudskrivning i bioprinteren, fjerne låget og placere det i lågholderen.
    27. Start målretningsprocessen for bioprintere.
      1. Når du bliver bedt om det af bioprintsoftwaren, skal du fjerne målpladen fra bioprinteren.
      2. Brug guiden til at vælge, hvor dråber kan observeres på pladen. Sæt målpladen i bioprinteren igen, og gentag dråbeudskrivnings- og udvælgelsesprocessen.
      3. Når du bliver bedt om det, skal du igen fjerne målpladen og derefter erstatte den med cellekulturpladen (indeholdende medier i 2D-kontrolhullerne i henhold til trin 1.3.25). Sørg for, at kulturpladelåget er af og sat i holderen. Bioprinteren afslutter modeludskrivningen.
    28. Når modeludskrivningen er færdig, skal du følge cellekulturmetoderne i afsnit 2 (trin 2.8) for at tilføje medier til hullerne.
    29. Start bioprinterrensningsprocessen, og når den er færdig, skal du bortskaffe patroner og resterende væsker i henhold til laboratorieprotokoller.

2. Cellekultur

  1. Modeller genereres ved hjælp af 1x hætteglas med glutamaterge neuroner (>5 millioner celler pr. hætteglas) og 1x hætteglas med astrocytter (>1 million celler pr. hætteglas).
  2. Forvarm vandbadet til 37 °C.
  3. Transporter begge hætteglas med celler til laboratoriet på tøris og nedsænket i et vandbad umiddelbart efter fjernelse fra tøris. Optø begge hætteglas samtidigt.
  4. Fjern hætteglassene fra vandbadet, når der kun er en lille iskrystal tilbage; Dette tager ca. 3 minutter efter nedsænkning. Du må ikke hvirvle eller blande cellerne i vandbadet.
  5. Sprøjt hætteglassene med 70% EtOH og overfør dem til biosikkerhedsskabet.
  6. Tilsæt 500 μL komplet medie +DOX/ROCKi dråbevis i hvert hætteglas, før hver suspension overføres til separate 15 ml reagensglas.
  7. Fyld mediet i hvert rør op til 8 ml, og fortsæt med bioudskrivningstrin i henhold til trin 1.3.
  8. Efter bioprintmodeller (trin 1.3) tilsættes straks komplette medier + DOX / ROCKi til alle 3D-samkulturbrønde og placeres i en inkubator ved 37 oC og 5% CO2. Hvis du bruger en plade med 96 brønde, tilsættes 150 μL medier pr. hul; Hvis du bruger en plade med 384 brønde, skal du bruge 50 μL medier pr. hul.
  9. Der kræves ingen medieændringer i de første 48 timers kultur.
  10. Når du udfører medieændringer på 2D-kontroller og modeller, skal du sørge for at undgå at fremkalde mekanisk belastning, som kan løsne 2D-kulturer eller forårsage deformation af hydrogelen. Udfør medieaspiration og tilsætning langsomt ved hjælp af en mikropipette, der peger ned ad siden af brønden.
  11. Efter 48 timer udføres et 90 % medieskift på alle huller, og ROCKi fjernes fra mediesammensætningen (se trin 2.14).
  12. Efter 96 timer udføres yderligere 90 % medieskift på alle huller for at fjerne DOX fra mediesammensætningen (se trin 2.14).
  13. Efter de to 90 % medieskift ved 48 timer og 96 timer skal du udføre 50 % medieskift hver 48. time, hvor 50 % af mediet suges op og erstattes med friske komplette medier
  14. Mediekomposition:
    1. Komplette medier: Neurobasale medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF.
    2. Komplette medier plus doxycyclin (DOX): Neurobasale medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/ml neurotrophin-3 (NT3), 5 ng/μL hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) og 1 μg/ml doxycyclin.
    3. Komplette medier plus DOX/ROCK-hæmmer (ROCKi): Neurobasale medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/ml doxycyclin og 10 μM ROCK-hæmmer.

3. Neurit vækst analyse

  1. Placer celler i et levende cellemikroskop til brightfield-billeddannelse umiddelbart efter tilsætning af medier efter bioprintning.
  2. Brug mikroskopsoftware til at planlægge celler, der skal afbildes ved 4x forstørrelse i hver brønd, inklusive 2D-kontroller, hver 12. time i mindst 7 dage.
  3. Udfør medieskift hver 48. time, som beskrevet i afsnit 2, og læg cellerne tilbage i mikroskopet efter medieskift hver gang.
  4. Efter 7 dages data skal du eksportere billederne fra softwaren i .jpg format
  5. Importer alle .jpg billeder til ImageJ-software og konverter filer til 8-bit format. Indlæs NeuronJ-plugin'et , og spor neuritvækst i billeder, herunder grenpunkter, ved hjælp af sporingsværktøjet.
  6. Brug neuritsporingsdata genereret fra NeuronJ til at plotte neuritudvækst over tid.

4. Analyse af cellelevedygtighed

  1. På hvert 24-timers tidspunkt i kulturen pletter 3 eller flere brønde til cellelevedygtighedsanalyse ved hjælp af et levende / dødt levedygtighedssæt. Gentag dette trin ved 24 timer eller 48 timers tidspunkter i løbet af undersøgelsen.
  2. Klargør levende/døde reagensmedier ved at suspendere levende cellereagens (1x Calcein-AM) og døde cellereagens (1x ethidiumhomodimer-1) og 1x nuklearcellepletter (Hoechst 33342) i 10 ml reducerede serummedier uden phenolrød (Opti-MEM) 30 minutter før billeddannelse. Lad levende/døde reagensmedier komme til RT. Opbevar levende/døde reagensmedier ude af direkte lys på grund af fluorescensblegning.
  3. Fjern medier fra 3 huller, der indeholder cellemodeller/2D-kontroller, og undgå omhyggeligt gelforstyrrelser. Cellemodellerne vaskes én gang med RT steril PBS. Der tilsættes 100 μL levende/døde reagensmedier til hvert hul for en plade med 96 huller eller 25 μL for en plade med 384 huller.
  4. Inkuber modellerne i 30 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
  5. Efter inkubation er modellerne klar til billeddannelse. Udfør billeddannelse på ethvert standardmikroskop med røde (647 nm, døde celler), grønne (488 nm, levende celler) og blå (405 nm, nuklear plet) excitationskanaler. For de bedste resultater i 3D-modeller skal du billedmodeller bruge et konfokalmikroskop med højt indhold og udføre billeddannelse ved hjælp af en Z-stack-funktion ved 4x eller 10x forstørrelse.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev cellemodeller afbildet ved hjælp af INCell Analyzer 6500HS (billeddannelsessystem med højt indhold), og analysen blev udført ved hjælp af Signals Image Artist (billedanalyseplatform, se trin 4.7).
  6. Når billeddannelsen er afsluttet, returneres cellemodellerne til cellekulturinkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Udelad dog cellemodeller, der anvendes til levedygtighedsanalyse fra yderligere undersøgelser på grund af de levende/døde reagensmedier på lang sigt.
  7. Analyse af billeder på billedanalyseplatformen
    1. Vælg hvert plan i Z-stack-billedet i softwaren. Kombiner planbilleder som et projektionsbillede med maksimal intensitet.
    2. Opret en ny analyse ved at vælge den bioprintede model som et interesseområde (ROI) ved at identificere fluorescens fra live-cellekanalen ved 488 nm (sørg for, at alle celler er valgt under ROI).
    3. Inden for interesseområdet skal du bruge billedbehandlingssoftwaren til at identificere antallet af celler i ROI gennem den nukleare pletkanal (405 nm), antallet af levende celler i ROI ved hjælp af 488 nm-kanalen og antallet af døde celler i ROI ved hjælp af 647 nm-kanalen.
    4. Kør analysen på alle levende/døde behandlede cellemodelbrønde, og eksporter datatabellen, der indeholder ROI-areal, samlet celleantal, antal levende celler og antal døde celler.
    5. Beregn antallet af levende og døde celler som en procentdel af det samlede celleantal pr. analysedag.

5. Immunfarvning og cellepopulationsanalyse

  1. Før fiksering fjernes medier fra cellemodellerne, og modellerne vaskes én gang i PBS.
  2. Fix celler med 4% (v / v) paraformaldehyd i PBS ved RT i 20 min.
    FORSIGTIG: Alt arbejde med paraformaldehyd skal udføres i henhold til laboratorieprocedurer.
  3. Opsug 4% (v/v) paraformaldehydopløsning fra modellerne, og vask modellerne fire gange i PBS for helt at fjerne paraformaldehyd.
  4. Permeabiliser cellemodellerne med 0,2% triton-X i 30 minutter ved RT og vask tre gange med PBS.
  5. Bloker cellemodellerne ved hjælp af 10% (v / v) normalt æselserum (NDS) i 3 timer ved RT.
  6. Den blokerende opløsning fjernes, og der tilsættes primære antistoffer (fortyndet i 1% v/v NDS i PBS) til modellerne. Hvis du udfører cellepopulationsforholdsanalyse (se trin 5.11), skal du sørge for at inkludere cellemodeller, der er co-farvede for Β-III tubulin (med rød AF647-konjugering) og GFAP (med grøn AF488-konjugering). Inkuber modeller med primære antistoffer i 24 timer ved 4 °C.
  7. Efter primær inkubation vaskes modellerne farvet med konjugerede primære antistoffer tre gange i PBS og modbejdses med 20 μM Hoechst i 30 minutter. Billedet er beskrevet i trin 5.10.
  8. Modellerne farvet med ukonjugerede primære antistoffer vaskes tre gange i PBS og tilsættes sekundære antistoffer (fortyndet i 1% v/v NDS i PBS). Der inkuberes i 24 timer ved 4 °C.
  9. Sekundære antistoffer fjernes ved at vaske tre gange i PBS og modvirke pletmodeller med 20 μM Hoechst i 30 minutter før billeddannelse.
  10. Udfør billeddannelse på standardmikroskoper med røde (647 nm) og grønne (488 nm) excitationskanaler. For at opnå de bedste resultater i 3D-modeller skal du dog billedmodellere bruge et konfokalmikroskop med højt indhold og udføre billeddannelse ved hjælp af en Z-stack-funktion ved 4x eller 10x forstørrelse.
  11. Analyse af cellepopulationsforhold på billedanalyseplatformen
    1. Få en analyse af cellepopulationer ved hjælp af modeller co-farvet for GFAP (med AF488 konjugering) og Β-III tubulin (med AF647 konjugering).
    2. Vælg hvert plan i Z-stack-billedet i softwaren, og kombiner planbillederne som et projektionsbillede med maksimal intensitet.
    3. Opret en ny analyse ved at vælge den bioprintede model som en ROI ved at identificere fluorescens fra Β-III tubulinkanalen ved 647 nm (sørg for, at alt celleholdigt område er valgt under ROI).
    4. Inden for ROI skal softwaren bruges til at identificere antallet af celler i Hoechst-kanalen (405 nm), antallet af GFAP+-astrocytter i ROI ved hjælp af 488 nm-kanalen og antallet af Β-III tubulin+-celler i ROI ved hjælp af 647 nm-kanalen.
    5. Kør analysen på alle co-farvede cellemodelbrønde, og eksporter datatabellen, der indeholder ROI-areal, samlet celleantal, antal GFAP + celler og antal Β-III tubulin + celler.
    6. Beregn antallet af GFAP+ og Β-III tubulin+ celler som en procentdel af det samlede celleantal.

Representative Results

Neurit vækst analyse
I denne protokol blev iPSC-afledte glutamaterge neuroner og astrocytter bioprintet i samkultur til en hydrogelmatrix ved hjælp af 3D-bioprinteren. I løbet af de første 7 dage efter udskrivning blev celler afbildet hver 12. time ved hjælp af et levende cellemikroskop. Efter bioprintning skal celler have en afrundet morfologi og skal spredes gennem hydrogelmatrixen og gradvist skifte til dannelse af mindre celleklynger med få fremspring i løbet af de første par dage af kulturen (se supplerende video 1 for repræsentativ sund cellevækst). På dag 4 vil sunde celler migrere gennem gelen for at danne større klynger, som er forbundet gennem neuritudvækst. På dag 7 bør næsten ingen enkeltceller forblive, de sammenkoblede bundter af neuritter og astrocytiske fremskrivninger skal fremstå befæstede, og mange mindre neuritudvækst kan ses dannes fra klyngerne (figur 2A). Ved hjælp af en række levende celle brightfield billeder taget over 7-dages vækstperioden blev der udført en analyse af neurit udvækst som beskrevet i afsnit 3. Denne analyse viste, at neuritudvækst stiger næsten lineært (R2-værdi = 0,84) mellem12 timer og 156 timer (figur 2B). I løbet af denne periode med neuritudvækst øges cellekropsklynger også i størrelse (se supplerende video 1), hvilket er tegn på cellemigration gennem hydrogelen.

Cellelevedygtighed og befolkningsforhold
I denne protokol anvendes en koncentration på 20 millioner celler / ml, bestående af 15 millioner neuroner / ml og 5 millioner astrocytter / ml, til bioprint af cellemodellerne. Ved hjælp af levende cellefarvning med calcein-AM (levende celler), ethidium homodimer-1 (døde celler) og en nuklear plet kan antallet af celler, der overlever over en 7-dages periode, beregnes i henhold til afsnit 4 (figur 3A). Cellelevedygtighedsresultater for repræsentative kulturer vises for dag 4, hvor 72% ± 1% (gennemsnit ± SEM) af de samlede celler er levende og viser farvning for Calcein-AM, mens 29% ± 2% (gennemsnit ± SEM) samlede celler er døde og viser farvning med ethidium homodimer-1 (figur 3B). Repræsentative billeder af cellefarvning med Calcein-AM og ethidium homodimer-1 kan ses i supplerende figur 1. Det skal bemærkes, at celleoverlevelsesværdier for 3D-kulturer ikke kan sammenlignes direkte med 2D-kulturer, da døde celler bevares i hydrogelen og ikke fjernes under cellefodringsprocesser.

Ved anvendelse af immunfluorescerende farvning for Β-III tubulin og GFAP, som beskrevet i afsnit 5 og i figur 4, kan billedanalyse udføres for at bestemme cellepopulationsforhold mellem neuroner og astrocytter (figur 3A). Af samlede celler pr. model i repræsentative kulturer repræsenterer Β-III tubulinpositive neuroner 49% ± 3% (gennemsnitlig ± SEM), mens GFAP-positive astrocytter repræsenterer 30% ± 4% (gennemsnitlig ± SEM). Dette giver et forhold på henholdsvis 1:1,5, astrocytter til neuroner. Dette efterlader en rest på 21% samlede celler pr. model, som ikke pletter for nogen af cellemarkørerne. Da cellelevedygtighedsanalyse viste, at en middelværdi på 29% af cellerne ikke er levedygtige på dag 4, er det sandsynligt, at disse celler er døde i hydrogelen.

Ekspression af cellemarkører
Morfologi af de bioprintede neuroner og astrocytter blev vurderet gennem immunfarvning for neuronal celletypemarkør (Β-III tubulin) og astrocytisk markør (GFAP). I de viste repræsentative kulturer er immunfarvning lokaliseret til individuelle celletyper, der viser sund cellemorfologi, hvor begge celletyper udviser udvækst af cellulære fremspring (figur 4A, B). Da hydrogel- og cellestrukturerne er tredimensionelle, repræsenterer hvert billede kun et udsnit gennem strukturen i figur 4A, B. Figur 4C viser en fusioneret stak af billeder i hele hydrogelen, der viser visninger af cellelokalisering i X-, Y- og Z-planerne. Figur 4D viser kun immunfarvning for Β-III tubulin; Fremhævning af finere neuritudvækst fra cellekroppens klynger. For yderligere at undersøge fænotypen af de glutamaterge neuroner kan immunfarvning for den glutamaterge ionreceptormarkør, GluR2, udføres. Inden for figur 4E er område 4E.1 (indsat) fremhævet for at vise punktfarvning med højere opløsning langs neuritbundterne. Dette bekræfter derfor, at neuroner i denne cokultur har en glutamaterg fænotype. På tværs af alle immunfarvningsbilleder kan immunofluorescerende farvede ikke-cellestrukturer observeres omkring celleklyngerne og neuritterne. Det er sandsynligt, at disse strukturer repræsenterer affald, der tilbageholdes i hydrogelen i kombination med mindre mængder ikke-specifikt antistofbinding til hydrogelen. Dette forventes i bioprintede kulturer, da døde celler og snavs ikke fjernes under cellefodring inden for 3D-stilladsmodeller. Et repræsentativt immunfarvningsbillede med negativ kontrol er vist i supplerende figur 2 for en påvisning af hydrogels ikke-specifikke binding af sekundære antistoffer.

Figure 2
Figur 2: Glutamaterge neuroner og astrocytter blev bioprintet ind i hydrogelmatrixen ved hjælp af bioprinteren og blev afbildet hver 12. time ved hjælp af et brightfield-mikroskop . (A) Et eksempel på brightfield-billede taget af cellekulturer under analyse. Billedet repræsenterer tidspunktet 156 timer, og skalabjælken repræsenterer 400 μm. (B) Den gennemsnitlige længde af neuritudvækst (μm) fra kulturerne målt ved hjælp af NeuronJ-pakken til ImageJ. Hvert datapunkt er n = 3 neuritter, og data vises som middelværdi ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: En koncentration på 20 millioner celler/ml aktivatoropløsning blev anvendt til bioprint af cellemodellerne. (A) Cellelevedygtigheden blev beregnet ved hjælp af levende/døde cellefarvestoffer (henholdsvis Calcein-AM og ethidium homodimer-1). Værdier viser, at 72% ± 1% (gennemsnit ± SEM, n = 3) af de samlede celler pr. brønd er levende, og 29% ± 2% (gennemsnit ± SEM, n = 3) af cellerne er døde af den samlede cellepopulation pr. Brønd på dag 4. De viste værdier repræsenterer gennemsnittet ± SEM. (B) Cellepopulationer procentdel af neuroner og astrocytter pr. brønd blev beregnet gennem billedanalyse af farvning vist i figur 4. Neuroner repræsenterer procentdelen af celler, der pletter positivt for Β-III tubulin på dag 7 (49% ± 3%, gennemsnit ± SEM, n = 3), mens astrocytter repræsenterer procentdelen af celler, der pletter positivt for GFAP på dag 7 (30% ± 4%, gennemsnit ± SEM, n = 3). De viste værdier repræsenterer middelværdien ± SEM. Al billeddannelse til beregninger vist i figur 3 blev udført på et konfokal billeddannelsessystem, og alle analyser blev udført på billedanalyseplatformen og GraphPad Prism i henhold til metoder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Ekspression af neurale celletypemarkører i 3D-bioprintede cokulturer af glutamaterge neuroner og astrocytter på dag 7 . (A,B) Immunofluorescerende farvning af neuronal markør Β-III tubulin og astrocytmarkør GFAP, afbildet på en inverteret mikroskopplatform ved 10x forstørrelse. Skalabjælker repræsenterer 100 μm. (C) Immunofluorescerende farvning af neuronal markør β-III tubulin og astrocytmarkør GFAP co-farvet med Hoechst, vist i XYZ-planvisning, afbildet på et konfokal billeddannelsessystem ved 10x forstørrelse. Oprettet på billedanalyseplatformen. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. (D) Immunofluorescerende farvning af neuronal markør β-III tubulin co-farvet med Hoechst, afbildet på et konfokal billeddannelsessystem ved 20x forstørrelse. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. (E) Immunofluorescerende farvning af glutamaterg markør GluR2 farves sammen med Hoechst, afbildet på en inverteret mikroskopplatform ved 10x forstørrelse. Boks 3E.1 viser fremhævede områder med GluR2-farvning. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende video 1: Glutamaterge neuroner og astrocytter blev bioprintet ind i hydrogelmatrixen ved hjælp af bioprinteren og blev afbildet hver 12. time ved hjælp af et brightfield-mikroskop. Video af brightfield-billeder taget af cellekulturer under analyse, tidspunkter er angivet i nederste højre hjørne, og skalabjælker repræsenterer 400 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 1: Eksempelbilleder af levende/døde analyser af bioprintede neuroner og astrocytter på dag 4. Calcein-AM plet vist i grønt (488 nm), og ethidium homodimer plet vist i rødt (647 nm). Billedet vises i XYZ-planvisning, oprettet på billedanalyseplatformen . Skalabjælken repræsenterer 100 μm. (A) Billeddannelse blev udført ved hjælp af et konfokal billeddannelsessystem ved 4x forstørrelse. (B) Billeddannelse blev udført ved hjælp af et konfokal billeddannelsessystem ved 10x forstørrelse Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Eksempel på negativt kontrolbillede efter immunofluorescerende farvning. Primære antistoffer blev udeladt, og grønne (488 nm) og røde (647 nm) sekundære antistoffer blev anvendt i henhold til immunfarvningsprotokoller. Billedet vises i XYZ-planvisning, oprettet på billedanalyseplatformen. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Billeddannelse blev udført ved hjælp af et konfokal billeddannelsessystem ved 10x forstørrelse. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Behovet for nøjagtige modeller af CNS har aldrig været højere, og begrænsninger af todimensionelle (2D) traditionelle cellekulturmodeller har drevet en generation af komplekse CNS-modeller i de senere år19. Imidlertid har mange komplekse 3D-modeller, der repræsenterer interaktioner mellem neurale celletyper og ECM, begrænsninger, der forhindrer anvendelsen af disse modeller i industrielle processer 6,20,21. I denne protokol udvikler vi en 3D-samkulturmodel af humane iPSC-afledte neuroner og astrocytter, som sigter mod at løse nogle af disse begrænsninger ved hjælp af 3D-bioprintteknologi til at skabe et bioaktivt hydrogelstillads i 96-brønd og 384-brøndformater.

Metoden til udvikling af disse modeller er blevet forenklet gennem pladekortdesignsoftwaren, automatisk genererede udskrivningsprotokoller og guidet udskrivningsproces fra bioprinteren. På grund af den følsomme karakter af de følsomme iPSC-afledte celletyper, der anvendes i denne protokol, skal der dog udvises forsigtighed med følgende kritiske trin i optøning og dyrkning. For det første har inkluderingen af ROCK-hæmmer (ROCKi) flere fordele gennem hele bioprintprocessen og under tidlig kultur. Celleoptøning er et kritisk punkt, hvor neuronerne kan opleve et stressrespons, og ukorrekte optøningsprotokoller kan mindske chancerne for overlevelse22. Det anbefales typisk at optø celler, tilføje medier og hæve celler til inkubatortemperatur så effektivt som muligt23. Under bioprintprocessen beskrevet i denne protokol er det imidlertid nødvendigt, at neuroner og astrocytter resuspenderes i en aktivatoropløsning snarere end medier, og celler hæves ikke over stuetemperatur før slutningen af udskriftskørslen (op til 30 minutter efter optøning). Tilsætningen af ROCKi til mediet umiddelbart efter optøning og inkludering heraf under de to centrifugeringstrin (trin 2.1--2.7 og 1.3.15-1.3.20) er således bydende nødvendig for at hæmme cellestressveje, hvilket ville resultere i lavere levedygtighedsniveauer24. Desuden har ROCKi vist sig at fremme neuritudvækst og forbedre neuronal modning25. Således fortsættes ROCKi-tilskud i 48 timer efter bioprint. Men, Det er bydende nødvendigt at fjerne ROCKi tilskud efter 48 timer for at sikre fuldstændig afvaskning under de efterfølgende medieændringer, før celler anvendes til analyse.

Et yderligere trin, der kræver kritisk opmærksomhed, er under tilføjelse af medier efter udskrivning og medieændringer (trin 2.8-2.13). Det bioprintede hydrogelstillads har en tilsvarende biomekanisk stivhed på kun 1,1 kPa, svarende til gråt stof. Som beskrevet i trin 2.10 er det afgørende at pipette forsigtigt ind i siden af brønden under tilsætning af medier og aspiration for at forhindre forstyrrelser. Dette er især relevant for 384-brøndplader, hvor gelniveauet optager en højere andel af det samlede brøndvolumen. Denne metode bør også anvendes i 2D-kontrolbrønde for at forhindre kantløft af celler og klipning af neuritudvækst. Forfatterne vil også gerne fremhæve betydningen af steril teknik i bioprinteren, som bør behandles med samme forsigtighed som et biosikkerhedsskab, der anvendes til iPSC-afledte cellekulturer. Dette omfatter steril filtrering af 70 % EtOH og dH2O, der anvendes i grønlysnings- og udskrivningsprocedurerne, opbevaring af låg på patroner og plader, mens hænderne flyttes ind og ud af bioprinteren, og dekontaminering af overflader inde i bioprinteren med 70 % ethanolservietter før og efter udskrivning.

Det bioprintede hydrogelstillads, der er dannet af bioblæk- og aktivatorløsninger, der er udvalgt til at udvikle denne model, er udvalgt blandt en række bioblæk- og aktivatorløsninger udviklet af Inventia Life Science til brug i RASTRUM-bioprinteren. Laminin og hyaluronsyre blev identificeret som molekyler af relevans for iPSC-afledt neuronal modning på grund af deres rolle i aksonal vejledning, synapsedannelse og dannelse af det perineuronale net26,27. Desuden blev en biomekanisk stivhed på 1,1 kPa valgt, da hydrogeler med lavere densitet har vist sig at muliggøre bedre neuritudvækst fra neuroner12. Hvis der foretages ændringer i protokollen ved hjælp af neuroner og astrocytter, der er blevet differentieret internt eller fra en anden kommerciel leverandør, anbefales det at foretage en matrixudvælgelsestest for at bestemme det mest støttende hydrogelstillads15. Desuden kan det også være nødvendigt at optimere celletætheden, hvis der foretages ændringer i cellekilder for at sikre optimal levedygtighed og forhindre overfyldning af hydrogel. For alle ændringer og fejlfinding relateret til bioprinterfunktionen anbefaler forfatterne at kontakte producenter og henvise til producentprotokoller.

CNS indeholder en bred vifte af neuronale undertyper og gliaceller, som alle findes i forskellige hjernenicher og har specifikke roller, der bidrager til neurale funktioner28. Inden for rammerne af dette brede anvendelsesområde repræsenterer denne model kun de to mest rigelige celletyper (astrocytter og excitatoriske glutamaterge neuroner). Vigtige celletyper såsom mikroglia, oligodendrocytter og blod-hjerne-barrieredannende endotelceller udelades fra dette system. Inkluderingen af microglia kan være relevant i fokus på neuroimmune interaktioner, og oligodendrocytter kan være af interesse for sygdomme, der påvirker central myelinisering. Ud over deres rolle i patologi udskiller celler såsom blod-hjerne-barrieredannende endotelceller lægemiddelmetaboliserende enzymer, hvilket kan påvirke brugen af denne model til farmakokinetiske assays29. En yderligere begrænsning af modellen kan være forholdet mellem astrocytter og neuroner; Forholdet mellem astrocytter og neuroner varierer meget mellem hjerneområder med foreslåede værdier på mellem 1:1 og 1:330,31. Denne model har et omtrentligt forhold på 1: 1,5 astrocytter til neuroner; Således er denne model muligvis ikke relevant for modelhjerneområder, hvor astrocytter er mere rigelige, såsom i hvide substansområder30.

Andre protokoller til udvikling af 3D bioprintede samkulturmodeller er blevet offentliggjort i de senere år. En publikation af Sullivan et al., 2021, præsenterede en 3D bioprintet neural model ved hjælp af iPSC-afledte neurale stamceller, som demonstrerer høj levedygtighed efter udskrivning og forbedring af neuronal funktion sammenlignet med 2D-kulturer32. I denne protokol blev neurale stamceller imidlertid anvendt som cellekilde og blev opretholdt i kultur i 4 uger. I denne protokol blev kommercielt tilgængelige iPSC-afledte glutamaterge neuroner og astrocytter anvendt. Dette gør det muligt at etablere et 3D-netværk af samdyrkede celler på så lidt som 7 dage; Som det fremgår af neuritvækstanalysen, begynder neuritudvæksten inden for 24 timer og fortsætter lineært i hele 156 timer-perioden, for hvilken cellevækst blev overvåget. Den hurtige etablering af disse netværk kan delvis tilskrives brugen af glutamaterge neuroner, der bruger optimeret doxycyclin-inducerbar genekspression af NGN2, som viser ekspression af modne neuronale subtypemarkører inden for 7 dage, selv i 2D-kultur33. Forkortelsen af denne vækstperiode ved hjælp af denne teknik er vigtig for implementering af modeller inden for den biofarmaceutiske industri, da analyseudvikling kræver hurtig vending og udvikling af cellemodeller15.

Afslutningsvis viser denne model potentiale for en 3D-model af neuroner og astrocytter, som etableres hurtigt og bekvemt til screeningsformål. Fremtidige applikationer til denne modeltype kunne være til lægemiddelopdagelsesindsats på tværs af forskellige CNS-sygdomme med mulighed for at udvide til forskellige sygdomme ved hjælp af patient- eller genredigerede sygdoms-iPSC-linjer. Desuden tillader brugen af doxycyclin-inducerbare NGN2-ekspression iPSC-afledte glutamaterge neuroner celler at nå modenhed på kortere tid, hvilket kan bruges til at udvikle modeller af den aldrende hjerne til neurodegenerationsforskning. Dette system kan også udvides ved brug af yderligere celletyper i samkultur, herunder mikroglia og oligodendrocytter.

Disclosures

CW, NC og JB er ansatte hos Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, London, Storbritannien. YH er ansat hos Merck Sharp & Dohme LLC, et datterselskab af Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.

Figur et blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Alex Volkerling, Martin Engel og Rachel Bleach for deres hjælp med at udvikle protokollen og feedback på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermofisher 31350010
384-well plate PerkinElmer 6057300
96-well plate PerkinElmer 6055300
Activator fluid F299 Inventia Life Science N/A
Activator fluid F3 Inventia Life Science N/A
B27 (50x) minus Vit A Thermofisher 12587010
Bioink fluid F261 Inventia Life Science N/A
Bioink fluid F32 Inventia Life Science N/A
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D5207
GlutaMAX (100x) Thermofisher 35050061
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 Abcam ab150115
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Hoechst Abcam ab228551
Human BDNF Recombinant Protein Thermofisher PHC7074
Human NT3 Recombinant Protein Thermofisher PHC7036
iCell Astrocytes Fujifilm CDI 1434
INCell Analyser 6500HS Molecular Devices N/A high content imaging system
Incucyte S3 Sartorius  N/A
ioGlutamatergic Neurons (Large vial) Bit.bio e001
Laminin (1 mg/mL) Sigma Aldrich L2020
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) Invitrogen L3224
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated R&D systems SC024
Neurobasal media Thermofisher 21103049
Normal Donkey Serum Abcam ab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342) Thermofisher R37605
Opti-MEM Thermofisher 11058021
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
PEI 50% in H2O Sigma Aldrich 181978
Pierce Borate Buffer 20x Thermofisher 28341
Prism GraphPad Data analysis software
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) Abcam ab206293
RASTRUM(TM) Bioprinter Inventia Life Science N/A Bioprinter
RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges Inventia Life Science N/A Bioprinter Cartridges
RASTRUM(TM) Targeting plate Inventia Life Science N/A Targeting plate
Rho kinase (ROCK) inhibitor Abcam ab120129
Sheep anti-GFAP NL493 conjugated R&D systems SC024
Signals Image Artist  PerkinElmer  N/A Image analysis platform
Triton X-100 Thermofisher HFH10
Zeiss Axio Observer Zeiss N/A Inverted microscope platform 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
  2. Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1 (2020).
  3. Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , Springer, Singapore. (2019).
  4. Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22 (2021).
  5. Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
  6. Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
  7. Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
  8. Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
  9. Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159 (2019).
  10. Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760 (2022).
  11. Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242 (2019).
  12. Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
  13. Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165 (2018).
  14. Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
  15. Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876 (2021).
  16. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  17. Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
  18. Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
  19. Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328 (2020).
  20. de Souza, N. Organoid variability examined. Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).
  21. Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
  22. Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960 (2021).
  23. Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
  24. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799 (2022).
  25. Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
  26. Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
  27. Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
  28. Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
  29. Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
  30. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
  33. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).

Tags

Tredimensionel bioprintning humane IPSC-afledte neuron-astrocyt-kokulturer screeningsapplikationer cellemodel lægemiddelscreening gennemstrømning homogenitet udviklingstid 3D-modeller bioprint cokulturmodeller induceret pluripotent stamcelle (iPSC) glutamaterge neuroner astrocytter hydrogelmatrix bioaktive peptider ekstracellulære matrixproteiner (ECM) fysiologisk stivhed levedygtighed astrocyt-til-neuron-forhold modne neurale celletypemarkører neuritudvækstassays
Tredimensionel bioprint af humane iPSC-afledte neuron-astrocyt-kokulturer til screeningsapplikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Whitehouse, C. A., He, Y.,… More

Whitehouse, C. A., He, Y., Brownlees, J., Corbett, N. Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. J. Vis. Exp. (199), e65856, doi:10.3791/65856 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter