Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tredimensjonal bioprinting av humane iPSC-avledede nevron-astrocytt-kokulturer for screeningapplikasjoner

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65856
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1MSD Research Laboratories, London, UK, 2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere 3D-bioprintede kokulturer av iPSC-avledede nevroner og astrocytter. Denne kokulturmodellen, generert i et hydrogelstillas i 96- eller 384-brønnformater, demonstrerer høy levedyktighet etter utskrift og nevrittutvekst innen 7 dager og viser uttrykket av modenhetsmarkører for begge celletyper.

Abstract

For at en cellemodell skal være levedyktig for legemiddelscreening, må systemet oppfylle krav til gjennomstrømning og homogenitet sammen med å ha en effektiv utviklingstid. Mange publiserte 3D-modeller tilfredsstiller imidlertid ikke disse kriteriene. Dette begrenser derfor deres nytte i tidlige legemiddeloppdagelsesapplikasjoner. Tredimensjonal (3D) bioprinting er en ny teknologi som kan brukes til utvikling av 3D-modeller for å fremskynde utviklingstiden, øke standardiseringen og øke gjennomstrømningen. Her presenterer vi en protokoll for å utvikle 3D bioprintede kokulturmodeller av humane induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede glutamaterge nevroner og astrocytter. Disse kokulturene er innebygd i en hydrogelmatrise av bioaktive peptider, fulllengde ekstracellulære matriksproteiner (ECM), og med en fysiologisk stivhet på 1, 1 kPa. Modellen kan raskt etableres i 96-brønns og 384-brønns formater og gir en gjennomsnittlig levedyktighet etter utskrift på 72%. Astrocytt-til-nevronforholdet i denne modellen er vist å være 1: 1, 5, som er innenfor det fysiologiske området for den menneskelige hjerne. Disse 3D-bioprintede cellepopulasjonene viser også uttrykk for modne nevrale celletypemarkører og vekst av neuritt- og astrocytprojeksjoner innen 7 dager etter kultur. Som et resultat er denne modellen egnet for analyse ved hjelp av cellefarger og immunfargingsteknikker sammen med nevrittutvekstanalyser. Evnen til å produsere disse fysiologisk representative modellene i stor skala gjør dem ideelle for bruk i screeninganalyser med middels til høy gjennomstrømning for nevrovitenskapsmål.

Introduction

Forskning på sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) i legemiddelforskningsindustrien utvides1. Imidlertid har mange utbredte CNS-sykdommer som epilepsi, schizofreni og Alzheimers sykdom fortsatt ingen kurative behandlinger 2,3,4. Mangelen på effektive terapeutiske midler på tvers av CNS-sykdommer kan, i det minste delvis, tilskrives mangel på nøyaktige in vitro-modeller av hjernen5. Dette har resultert i et translasjonsgap mellom nåværende in vitro-modeller og in vivo-data og en påfølgende flaskehals i forskningsinnsatsen.

Drevet av dette translasjonsgapet har det vært en betydelig økning i utviklingen av nye 3D-cellemodeller de siste årene, inkludert nevrale organoider, nevrosfæroider og stillasbaserte modeller6. 3D-strukturen til disse modellene hjelper til med å rekapitulere det nevrale mikromiljøet, inkludert biomekaniske påkjenninger, cellekontakter og hjernens ekstracellulære matrise (ECM)7. Hjernens ECM er et dynamisk element i nevrofysiologi som opptar mellomrommet mellom nevrale celletyper, inkludert nevroner, astrocytter, oligodendrocytter og den nevrovaskulære enheten7. Rekapitulering av hjernens ECM har vist seg å påvirke nevronal morfologi og nevronavfyring, og mange komplekse 3D-modeller av hjernen har vist avsetning av ECM-proteiner av nevrale celletyper 8,9,10,11. Stillasbaserte modeller består av modne nevrale kokulturer suspendert i en porøs syntetisk eller biologisk hydrogelmatrise som representerer hjernen ECM12. I motsetning til organoide og sfæroide systemer, tillater stillasbaserte 3D-modeller tilpasning av ECM-proteiner som er tilstede og har den ekstra fordelen av tunabilitet av hydrogelstivhet for å etterligne biomekaniske påkjenninger13,14.

Selv om et overveldende flertall av 3D-nevrale modeller viser en økt rekapitulering av hjernens mikromiljø, er ikke alle modeller godt egnet til å implementere legemiddeloppdagelsesapplikasjoner15. For at en 3D-modell skal kunne implementeres i industrielle prosesser, må systemet oppfylle gjennomstrømningskrav for screeningapplikasjoner og ha relativt kort utviklingstid16. 3D Bioprinting er en ny teknologi som gir potensial til å lage 3D-stillasbaserte nevrale modeller med rask utviklingstid, økt gjennomstrømning og høyere nivåer av presisjonskontroll, sammen med fjerning av variabilitet forårsaket av menneskelig feil17. Denne protokollen presenterer en 3D-kokulturmodell av humane iPSC-avledede glutamaterge nevroner og astrocytter i et hydrogelstillas. Dette hydrogelstillaset inneholder fysiologisk representative bioaktive peptider (RGD, IKVAV, YIGSR) og ECM-proteiner innenfor en mimetisk biomekanisk stivhet. Disse ECM-proteinene i full lengde inkluderer laminin-211 i full lengde og hyaluronsyre, rikelig i den humane cortex, med en stivhet på 1,1 kPa i tråd med in vivo-målinger 18. Denne modellen er designet med praktisk for narkotikaforskning, og er opprettet ved hjelp av en 3D-bioprinter i et 96-brønns eller 384-brønns plateformat egnet for screeninganalyse ved hjelp av bildebehandlingsteknikker med cellefarger og antistoffer, sammen med nevrittutvekstanalyser. Celler viser uttrykk for nevrale celletypemarkører og vekst av nevritt- og astrocytiske projeksjoner innen 7 dager etter kultur. Dermed vil denne protokollen presentere metodikken for å utvikle en 3D-nevral kokulturmodell med høy gjennomstrømning for bruk i legemiddeloppdagelsesapplikasjoner.

Figure 1
Figur 1: Illustrerende oversikt over metodikk brukt til 3D-bioprint-kokulturer. Humane iPSC-avledede nevroner og astrocytter kombineres med aktivator- og bioblekkløsninger som inneholder bioaktive peptider og bioprintes til hydrogelstillas i 96-brønns eller 384-brønnformater ved hjelp av drop-on-demand bioprintingsteknologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Bioprinting av 3D-modeller

  1. Generere platekart og utskriftsfil
    1. Før modellgenerering, generer et platekart, en protokoll og en utskriftsfil ved hjelp av programvaren for platekart. Åpne platekartprogramvaren og velg alternativet Kulturceller i 3D .
    2. Velg modelltypen som skal bioprintes fra de tilgjengelige alternativene på rullegardinmenyen. denne modellen er validert i bildemodell - og HTP-modellformatene . Velg bildemodell for 96-brønnsplater og HTP for 384-brønnsplater.
    3. I vinduet Matrix Selection velger du Hydrogel Px02.53, som inneholder Laminin-211 og hyaluronsyreproteiner, med IKVAV-, RGD- og YIGSR-peptider.
    4. I popup-vinduet skriver du inn celletypene som glutamatergiske nevroner og astrocytter og angir celletettheten som 20 millioner celler/ml.
    5. Bruk programvaren til å designe ønsket platekart ved å markere brønner på skjermplaten. Inkluder minst 1 rad 2D-kontroll på plast i designet. 2D-styring på plastbrønner består av celler avsatt direkte i brønnen uten hydrogelstillas; Belegg disse brønnene i henhold til trinn 1.2.
    6. Kontroller at platemodellen som er oppført øverst i vinduet, endres til den tiltenkte platemodellen for bruk (se Materialfortegnelse).
    7. Last ned protokollen og utskriftsfilen for platekartet ved hjelp av nedlastingsknappene, og lagre dem på den bioprinterkoblede datamaskinen.
  2. Belegg av 2D-kontroll på plastbrønner
    1. Minst 24 timer før utskrift, belegg brønnene for 2D-kontrollmodellene for celleadherens og vekst. 3D-modellbrønner krever ingen forbelegg. Alle prosesser skal foregå i et biosikkerhetsskap med mindre annet er angitt. Plater kan belegges og tilberedes opptil 7 dager før utskrift.
    2. Lag 50 ml 1x boratbuffer ved å fortynne 2,5 ml 20x boratstamløsning med 47,5 ml steril dH2O.
    3. Tilsett 100 μL 50 % (w/v) polyetylenimin (PEI) til 50 ml 1x boratbuffer for å lage en 0,1 % (w/v) PEI-løsning og sterilt filter gjennom et 0,22 μm filter.
    4. Legg til 0,1 % (w/v) PEI-løsning til hver 2D-kontrollbrønn, som indikert av platekartet som ble generert i trinn 1.1. Legg til 100 μL / brønn hvis du bruker en 96-brønnplate eller 25 μL / brønn hvis du bruker en 384-brønnplate.
    5. Inkuber platen i 2 timer ved 37 °C før du aspirerer PEI-oppløsningen på 0,1 % (w/v) og skyller brønnene 5x med PBS. La brønnene tørke helt i biosikkerhetsskapet.
    6. Fortynn 100 mikrol 1 mg/ml lamininoppløsning i 5 ml nevrobasalt medium. Legg 100 μL til hver 2D-kontrollbrønn hvis du bruker en 96-brønnsplate eller 25 μL hvis du bruker en 384-brønnplate. Inkuber i 4 timer ved 37 °C.
    7. Ved oppbevaring av plater, la lamininoppløsningen være på plass etter inkubering og oppbevares ved 4 °C.  Forvarm platene i 1 time ved 37 °C før bruk.
  3. 3D bioprinting av kokulturmodeller
    1. Oppretthold alltid en steril teknikk når du bruker bioprinteren, og tørk hansker, patroner og kulturplater med 70 % EtOH før du setter den inn i skriveren. Med mindre annet er angitt, utfør alle prosesser utenfor bioprinteren i et biosikkerhetsskap.
    2. Slå på kompressoren for bioprinteren og initialiser skriveren ved å velge Initialiser-knappen på bioprinterprogramvaren. Når luftstrømmen i skriveren har startet, tørker du av overflater inne i skriveren med en 70 % EtOH-serviett.
    3. På utskriftsdagen gjennomfører du den veiledede Start of Day Greenlighting-prosessen for å sikre riktig dysestatus for trykkkjøringen (minimum dysestatus 2A2B).
    4. Ta en bioprinterpatron fra den sterile emballasjen, tilsett 20 ml steril dH2O i rom A, og tilsett 6 ml sterilfiltrert 70% EtOH til rom B1-4. Sett kassetten inn i den venstre patronholderen inne i bioprinteren og plasser platelokket i den dedikerte lokkholderen.
    5. Velg Grønt lys-knappen på programvarens startskjerm og bekreft i programvaren at kassetten er på plass i bioprinteren og at lokket er fjernet. Start prosessen med grønt lys.
    6. Når du blir bedt om det av programvaren, må du bekrefte at ingen konsekvente drypp kan sees fra verken venstre eller høyre nål. Deretter, når du blir bedt om det av programvaren, må du bekrefte at vann er til stede i B7- og B8-rommene.
    7. Etter at bioprinteren har fullført det selvstyrte greenlight-trinnet, setter du inn en ubelagt steril 96-brønns flat bunnplate (atskilt fra den belagte platen for bioprinting-kokulturer) og setter denne nye platen inn i den høyre plateholderdelen av bioprinteren når programvaren ber om det. Forsikre deg om at plateholderen er satt til høyprofilplate, og at lokket er fjernet og plassert i den dedikerte lokkholderen før du begynner neste trinn.
    8. Bioprinteren vil deponere vanndråper i hver brønn på 96-brønnplaten. Når du er ferdig, plasserer du platen fra bioprinteren og bekrefter at vanndråper er tilstede i hver brønn på platen.
    9. Kast platen med 96 brønner som brukes til grønt lys, og la bioprinteren fullføre grønnbelysningsprosessen. Når den er ferdig, vil programvaren angi dysestatusen til bioprinteren og bekrefte at bioprinteren er klar til å skrive ut modeller. Sett lokket på fargepatronen og sett det ut i biosikkerhetsskapet for de neste trinnene.
    10. Bruk bioprinterprogramvaren til å laste utskriftsfilen (generert i trinn 1.1) inn i programvaren ved hjelp av Print Run-programvareknappen og åpne PDF-filen for utskriftsprotokollen.
    11. Hent bioblekk og aktivatorvæsker, som angitt på utskriftsprotokollens pdf, fra -20 °C og tine ved romtemperatur (RT) i 40 minutter. For hydrogelmatriks Px02.53 vil dette omfatte: 1x hetteglass F32, 1xhetteglass F3, 1x hetteglass F261, 1x hetteglass F299. Ikke tine bioblekk og aktivatorvæsker i hender eller vannbad.
    12. Ta med 50 ml komplette medier med doksysyklin og ROCK-hemmer (komplett media +DOX/ROCKi) (se trinn 2.2) til RT mens bioblekk og aktivatorvæsker tiner.
    13. Når bioblekk og aktivatorer er tint, klargjør du utskriftskassetten som beskrevet på de to siste sidene i pdf-filen med den genererte utskriftsprotokollen. Grønnlyspatronen vil bli gjenbrukt for modellutskriftstrinnene.
      1. Sørg for at det er 40 ml dH2O i rom A1 og 8 ml 70 % EtOH i rom B1 og B2. Tilsett 1,2 ml aktivator F32 til C1, 1,2 ml F3 til C2 og 200 μL F261 til C4.
      2. Hent PEI og lamininbelagt plate fra inkubatoren og plasser den inne i skriveren i høyre plateholderrom. Ikke fjern lamininmedieoppløsningen fra brønnene på dette tidspunktet. Forsikre deg om at plateholderrommet er satt til lavprofilplate og at lokket er fjernet og i lokkholderen.
    14. Plasser blekkpatronen i bioprinteren, sørg for at lokket er fjernet og plassert i holderen, og start utskriftskjøringen på programvaren ved å velge knappen Skriv ut inert sokkel på bioprinterprogramvaren.
    15. Mens den inerte basen skrives ut, hent hetteglassene med glutamaterge nevroner og astrocytter fra lagring av flytende nitrogen, tine og resuspendere i henhold til instruksjonene i avsnitt 2.
    16. Når cellene er tint, og 8 ml komplett media +DOX/ROCKi er tilsatt hver celletype separat (i henhold til avsnitt 2), sentrifugerer cellene ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
    17. Aspirer supernatanten og resuspender begge celletypene separat i 1 ml komplett media +DOX/ROCKi.
    18. Tilsett 20 μL cellesuspensjon til 20 μL trypanblått og bland før du teller celler for å bestemme levedyktig cellekonsentrasjon per ml for hver celletype.
    19. Kombiner totalt 3 millioner glutamaterge nevroner med 1 million astrocytter i et 15 ml rør. Legg til medier for å lage et totalt volum på 8 ml.
    20. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
    21. Aspirer så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre cellepelleten og resuspender cellepelleten i 200 μL aktivatorvæske F299.
    22. Legg merke til at aktivatorvæsken er tyktflytende; pipette opp og ned for å resuspendere pelleten helt. Celletypene er delikate; Minimer skjæring og bobler ved å bruke en pipettespiss med bred boring og omvendt pipetteringsteknikk. Pipett opp og ned fast ikke mer enn 3 ganger for å forhindre celletap.
    23. Når det inerte basistrinnet er ferdig med utskriften, plasser lokkene på kassetten og kulturplaten, fjern begge fra bioprinteren og sett dem i biosikkerhetsskapet.
    24. Tilsett 200 μL cellesuspensjon i F299 til brønn C3 på fargepatronen, sett kassetten inn i bioprinteren igjen, fjern lokket og legg den i lokkholderen. Ikke sett kulturplaten inn igjen.
    25. Start fasen Utskriftsmodeller av utskriftskjøringen . Mens bioprinteren primer væsker, fjern lamininmedieløsningen fra 2D-kontrollbrønnene på platen og erstatt den med 150 μL komplette medier +DOX/ROCKi i hver 2D-kontrollbrønn hvis du bruker en 96-brønnsplate og 50 μL komplett media +DOX/ROCKi hvis du bruker en 384-brønnsplate.
    26. Etter at væskene er primet, setter du bioprint-målplaten inn i bioprinteren, fjerner lokket og legger det i lokkholderen.
    27. Start målrettingsprosessen for bioprinter.
      1. Når bioprintingsprogramvaren ber deg om det, fjerner du målplaten fra bioprinteren.
      2. Bruk veiledningen til å velge hvor dråper kan observeres på platen. Sett målplaten inn i bioprinteren igjen, og gjenta dråpeutskrifts- og utvelgelsesprosessen.
      3. Når du blir bedt om det, fjerner du målplaten igjen, og erstatter den deretter med cellekulturplaten (som inneholder medier i 2D-kontrollbrønnene i henhold til trinn 1.3.25). Forsikre deg om at lokket på kulturplaten er av og plassert i holderen. Bioprinteren vil fullføre modellutskriften.
    28. Når modellutskriften er fullført, følger du cellekulturmetodene i seksjon 2 (trinn 2.8) for å legge til medier i brønnene.
    29. Start rengjøringsprosessen for bioprinteren, og kast kassettene og gjenværende væsker i henhold til laboratorieprotokollene når den er fullført.

2. Cellekultur

  1. Modeller genereres ved hjelp av 1x hetteglass med glutamatergiske nevroner (>5 millioner celler per hetteglass) og 1x hetteglass med astrocytter (>1 millioner celler per hetteglass).
  2. Forvarm vannbadet til 37 °C.
  3. Transporter begge hetteglassene med celler til laboratoriet på tørris og nedsenket i et vannbad umiddelbart etter fjerning fra tørris. Tine begge hetteglassene samtidig.
  4. Fjern hetteglassene fra vannbadet når bare en liten iskrystall gjenstår; Dette vil ta ca. 3 min etter nedsenking. Ikke virvle eller bland cellene i vannbadet.
  5. Spray hetteglassene med 70 % EtOH og overfør dem til biosikkerhetsskapet.
  6. Tilsett 500 mikrol komplette medier +DOX/ROCKi dråpevis i hvert hetteglass før hver suspensjon overføres til separate 15 ml rør.
  7. Fyll på mediet i hvert rør til 8 ml og fortsett med bioprintingstrinn i henhold til trinn 1.3.
  8. Etter bioprintingsmodeller (trinn 1.3), tilsett umiddelbart komplette medier +DOX/ROCKi til alle 3D-kokulturbrønner og plasser modellene i en inkubator ved 37 oC og 5% CO2. Hvis du bruker en 96-brønnsplate, tilsett 150 μL media per brønn; Hvis du bruker en 384-brønnplate, bruk 50 μL media per brønn.
  9. Ingen medieendringer er nødvendig for de første 48 årene av kulturen.
  10. Når du utfører medieendringer på 2D-kontroller og modeller, bør det utvises forsiktighet for å unngå å indusere mekanisk stress, noe som kan løsne 2D-kulturer eller forårsake deformasjon av hydrogelen. Utfør medieaspirasjon og tilsetning sakte ved hjelp av en mikropipette som peker nedover siden av brønnen.
  11. Etter 48 timer, utfør en 90% medieendring på alle brønner og fjern ROCKi fra mediekomposisjonen (se trinn 2.14).
  12. Etter 96-timer, utfør ytterligere 90 % mediebytte på alle brønner for å fjerne DOX fra mediesammensetningen (se trinn 2.14).
  13. Etter de to 90 % medieendringene ved 48 timer og 96 timer, utfør 50 % medieskift hver 48. time, hvor 50 % av mediene aspireres og erstattes med nye komplette medier
  14. Komposisjon i media:
    1. Komplett media: Nevrobasale medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF.
    2. Komplett media pluss doksysyklin (DOX): Nevrobasale medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml nevrotrofin-3 (NT3), 5 ng/μL hjernederivert nevrotrofisk faktor (BDNF) og 1 μg/ml doksysyklin.
    3. Komplett media pluss DOX/ROCK-hemmer (ROCKi): Nevrobasale medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/ml doksysyklin og 10 μM ROCK-hemmer.

3. Analyse av nevrittvekst

  1. Plasser celler i et levende cellemikroskop for lysfeltavbildning umiddelbart etter at media er lagt til etter bioprinting.
  2. Bruk mikroskopprogramvare til å planlegge celler som skal avbildes ved 4x forstørrelse i hver brønn, inkludert 2D-kontroller, hver 12. time i minst 7 dager.
  3. Utfør medieendringer hver 48. time, som beskrevet i avsnitt 2, og plasser cellene tilbake i mikroskopet etter medieendringer hver gang.
  4. Etter 7 dager med data, eksporter bildene fra programvaren i .jpg-format
  5. Importer alle bildene .jpg til ImageJ-programvaren og konverter filer til 8-biters format. Last inn NeuronJ-pluginet og spor nevrittvekst i bilder, inkludert grenpunkter, ved hjelp av sporingsverktøyet.
  6. Bruk nevrittsporingsdataene generert fra NeuronJ til å plotte nevrittutvekst over tid.

4. Celle levedyktighetsanalyse

  1. Ved hvert 24-timers tidspunkt i kultur, flekk 3 eller flere brønner for celle levedyktighetsanalyse ved hjelp av et levende / dødt levedyktighetssett. Gjenta dette trinnet ved 24 timer eller 48 timer i løpet av studien.
  2. Forbered levende / døde reagensmedier ved å suspendere levende cellereagens (1x Calcein-AM) og dødcellereagens (1x ethidiumhomodimer-1) og 1x levende celle nukleær flekk (Hoechst 33342) i 10 ml reduserte serummedier uten fenolrødt (Opti-MEM) 30 minutter før avbildning. La levende/døde reagensmedier komme til RT. Oppbevar levende/døde reagensmedier uten direkte lys på grunn av fluorescensbleking.
  3. Fjern media fra 3 brønner som inneholder cellemodeller/2D-kontroller, og unngå gelforstyrrelser forsiktig. Vask cellemodellene én gang med RT steril PBS. Tilsett 100 μL levende/døde reagensmedier til hver brønn for en 96-brønnsplate eller 25 μL for en 384-brønnplate.
  4. Inkuber modellene i 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
  5. Etter inkubasjon er modellene klare for avbildning. Utfør avbildning på et hvilket som helst standard mikroskop med røde (647 nm, døde celler), grønne (488 nm, levende celler) og blå (405 nm, kjernefysisk flekk) eksitasjonskanaler. For best resultat i 3D-modeller, bildemodeller som bruker et konfokalmikroskop med høyt innhold og utfører avbildning ved hjelp av en Z-stack-funksjon ved 4x eller 10x forstørrelse.
    MERK: I denne studien ble cellemodeller avbildet ved hjelp av INCell Analyzer 6500HS (high-content imaging system), og analysen ble utført ved hjelp av Signals Image Artist (bildeanalyseplattform, se trinn 4.7).
  6. Etter at avbildningen er fullført, returneres cellemodeller til cellekulturinkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2. Imidlertid utelate cellemodeller som brukes til levedyktighetsanalyse fra videre studier på grunn av levende / døde reagensmedier på langsiktig levedyktighet.
  7. Analyse av bilder på bildeanalyseplattformen
    1. Velg hvert plan av Z-stack-bildet i programvaren. Kombiner planbilder som et projeksjonsbilde med maksimal intensitet.
    2. Opprett en ny analyse ved å velge den bioprintede modellen som et interesseområde (ROI) ved å identifisere fluorescens fra den aktive cellekanalen ved 488 nm (sørg for at alle celler er valgt under ROI).
    3. Innenfor interesseområdet, bruk bildebehandlingsprogramvaren til å identifisere antall celler i avkastningen gjennom den kjernefysiske flekkkanalen (405 nm), antall levende celler i avkastningen ved hjelp av 488 nm-kanalen og antall døde celler i avkastningen ved bruk av 647 nm-kanalen.
    4. Kjør analysen på alle levende / døde behandlede cellemodellbrønner og eksporter datatabellen som inneholder avkastningsområde, totalt celleantall, antall levende celler og antall døde celler.
    5. Beregn antall levende og døde celler i prosent av totalt celletall per analysedag.

5. Immunfarging og cellepopulasjonsanalyse

  1. Før fiksering, fjern media fra cellemodellene og vask modellene en gang i PBS.
  2. Fest celler med 4% (v / v) paraformaldehyd i PBS ved RT i 20 minutter.
    FORSIKTIG: Alt arbeid med paraformaldehyd må utføres i henhold til laboratorieprosedyrer.
  3. Aspirer 4% (v / v) paraformaldehydoppløsning fra modellene og vask modellene fire ganger i PBS for å fjerne paraformaldehyd helt.
  4. Permeabiliser cellemodellene med 0,2% triton-X i 30 min ved RT og vask tre ganger med PBS.
  5. Blokker cellemodellene med 10% (v / v) normalt eselserum (NDS) i 3 timer ved RT.
  6. Fjern blokkeringsoppløsningen og tilsett primære antistoffer (fortynnet i 1 % v/v NDS i PBS) til modellene. Hvis du utfører analyse av cellepopulasjonsforhold (se trinn 5.11), må du sørge for å inkludere cellemodeller som er samfarget for Β-III tubulin (med rød AF647-konjugering) og GFAP (med grønn AF488-konjugering). Inkuber modeller med primære antistoffer i 24 timer ved 4 °C.
  7. Etter primær inkubasjon, vask modellene farget med konjugerte primære antistoffer tre ganger i PBS og motflekk med 20 μM Hoechst i 30 minutter. Bilde som beskrevet i trinn 5.10.
  8. Vask modellene farget med ukonjugerte primære antistoffer tre ganger i PBS og legg til sekundære antistoffer (fortynnet i 1% v / v NDS i PBS). Inkuber i 24 timer ved 4 °C.
  9. Fjern sekundære antistoffer ved å vaske tre ganger i PBS, og motflekk modeller med 20 μM Hoechst i 30 minutter før avbildning.
  10. Utfør avbildning på standard mikroskoper med røde (647 nm) og grønne (488 nm) eksitasjonskanaler. For best resultat i 3D-modeller, bildemodeller som bruker et konfokalmikroskop med høyt innhold og utfører avbildning ved hjelp av en Z-stack-funksjon ved 4x eller 10x forstørrelse.
  11. Analyse av cellepopulasjonsforhold på bildeanalyseplattformen
    1. Oppnå en analyse av cellepopulasjoner ved hjelp av modeller co-farget for GFAP (med AF488 konjugering) og Β-III tubulin (med AF647 konjugering).
    2. Velg hvert plan i Z-stack-bildet i programvaren og kombiner planbildene som et projeksjonsbilde med maksimal intensitet.
    3. Opprett en ny analyse ved å velge den bioprintede modellen som en avkastning ved å identifisere fluorescens fra Β-III tubulinkanalen ved 647 nm (sørg for at alt celleholdig område er valgt under ROI).
    4. Innenfor avkastningen, bruk programvaren til å identifisere antall celler i Hoechst-kanalen (405 nm), antall GFAP + astrocytter i avkastningen ved hjelp av 488 nm-kanalen og antall Β-III tubulin + -celler i avkastningen ved hjelp av 647 nm-kanalen.
    5. Kjør analysen på alle co-fargede cellemodellbrønner og eksporter datatabellen som inneholder ROI-areal, totalt celleantall, antall GFAP+-celler og antall Β-III tubulin+-celler.
    6. Beregn antall GFAP+ og Β-III tubulin+ celler i prosent av totalt celleantall.

Representative Results

Analyse av nevrittvekst
I denne protokollen ble iPSC-avledede glutamatergiske nevroner og astrocytter bioprintet i kokultur til en hydrogelmatrise ved bruk av 3D-bioprinteren. I løpet av de første 7 dagene etter utskrift ble celler avbildet hver 12. time ved hjelp av et levende cellemikroskop. Etter bioprinting bør cellene ha en avrundet morfologi og bør spres gjennom hydrogelmatrisen, og gradvis endres for å danne mindre celleklynger med få fremspring i løpet av de første dagene av kulturen (se tilleggsvideo 1 for representativ sunn cellevekst). Ved dag 4 vil friske celler migrere gjennom gelen for å danne større klynger, som er forbundet gjennom nevrittutvekster. På dag 7 skal nesten ingen enkeltceller forbli, de sammenhengende buntene av nevritter og astrocytiske projeksjoner skal virke befestet, og mange mindre nevrittutvekster kan sees dannes fra klyngene (figur 2A). Ved hjelp av en serie levende celle brightfield-bilder tatt over den 7-dagers vekstperioden, ble en analyse av nevrittutvekst utført som beskrevet i avsnitt 3. Denne analysen viste at nevrittutvekst øker på en nær lineær måte (R2-verdi = 0,84) mellom 12 timer og 156 timer (figur 2B). I løpet av denne perioden med nevrittutvekst øker også celleklynger i størrelse (se tilleggsvideo 1), noe som indikerer cellemigrasjon gjennom hydrogelen.

Celle levedyktighet og befolkningsforhold
I denne protokollen brukes en konsentrasjon på 20 millioner celler/ml, bestående av 15 millioner nevroner/ml og 5 millioner astrocytter/ml, til bioprinting av cellemodellene. Ved hjelp av levende cellefarging med calcein-AM (levende celler), ethidium homodimer-1 (døde celler) og en kjernefysisk flekk, kan antall celler som overlever over en 7-dagers periode beregnes i henhold til seksjon 4 (figur 3A). Cellelevedyktighetsresultater for representative kulturer er vist for dag 4, hvor 72 % ± 1 % (gjennomsnitt ± SEM) av totale celler er levende og viser farging for Calcein-AM, mens 29 % ± 2 % (gjennomsnittlig ± SEM) totale celler er døde og viser farging med ethidium homodimer-1 (figur 3B). Representative bilder av cellefarging med Calcein-AM og ethidium homodimer-1 finnes i tilleggsfigur 1. Det skal bemerkes at celleoverlevelsesverdier for 3D-kulturer ikke kan sammenlignes direkte med 2D-kulturer, da døde celler beholdes i hydrogelen og ikke vil bli fjernet under cellefôringsprosesser.

Ved bruk av immunfluorescerende farging for Β-III tubulin og GFAP, som beskrevet i avsnitt 5 og i figur 4, kan bildeanalyse utføres for å bestemme cellepopulasjonsforhold mellom nevroner og astrocytter (figur 3A). Av totale celler per modell i representative kulturer representerer Β-III tubulin positive nevroner 49% ± 3% (gjennomsnittlig ± SEM), mens GFAP-positive astrocytter representerer 30% ± 4% (gjennomsnittlig ± SEM). Dette gir et forhold på henholdsvis 1:1,5, astrocytter og nevroner. Dette etterlater en rest på 21% totale celler per modell, som ikke flekker for noen av cellemarkørene. Siden cellelevedyktighetsanalyse viste at en middelverdi på 29% av cellene ikke er levedyktige på dag 4, er det sannsynlig at disse cellene er døde i hydrogelen.

Uttrykk for cellemerker
Morfologien til de bioprintede nevronene og astrocyttene ble undersøkt ved immunfarging for nevroncelletypemarkør (Β-III tubulin) og astrocytær markør (GFAP). I de representative kulturene som er vist, er immunfarging lokalisert til individuelle celletyper, som viser sunn cellemorfologi, med begge celletyper som viser utvekst av cellulære fremspring (figur 4A, B). Siden hydrogel- og cellestrukturene er tredimensjonale, representerer hvert bilde bare ett stykke gjennom strukturen i figur 4A, B. Figur 4C viser en sammenslått stabel med bilder gjennom hydrogelen, som viser visninger av cellelokalisering i X-, Y- og Z-planene. Figur 4D viser immunfarging kun for Β-III tubulin; fremhever finere nevrittutvekster fra celleklyngene. For ytterligere å undersøke fenotypen til de glutamatergiske nevronene, kan immunfarging for den glutamatergiske ionreseptormarkøren, GluR2, utføres. Innenfor figur 4E er område 4E.1 (innfelt) uthevet for å vise punkteringsfarging med høyere oppløsning langs nevrittbuntene. Dette bekrefter derfor at nevroner i denne kokulturen har en glutamaterg fenotype. På tvers av alle immunfargingsbilder kan immunfluorescerende fargede ikke-cellestrukturer observeres rundt celleklyngene og nevrittene. Det er sannsynlig at disse strukturene representerer rusk som holdes i hydrogelen i kombinasjon med mindre mengder ikke-spesifikt antistoff som binder seg til hydrogelen. Dette forventes i bioprintede kulturer, da i 3D-stillasmodeller fjernes ikke døde celler og rusk under cellefôring. Et representativt negativt kontrollimmunfargingsbilde er vist i tilleggsfigur 2 for påvisning av hydrogel uspesifikk binding av sekundære antistoffer.

Figure 2
Figur 2: Glutamaterge nevroner og astrocytter ble bioprintet inn i hydrogelmatrisen ved hjelp av bioprinteren og ble avbildet hver 12. time ved hjelp av et brightfield-mikroskop . (A) Et eksempel på lysfeltbilde tatt av cellekulturer under analyse. Bildet representerer 156 timer, og skalalinjen representerer 400 μm. (B) Den gjennomsnittlige lengden av nevrittutvekster (μm) fra kulturene målt ved hjelp av NeuronJ-pakken for ImageJ. Hvert datapunkt er n = 3 nevritter, og data vises som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: En konsentrasjon på 20 millioner celler / ml aktivatorløsning ble brukt til bioprinting av cellemodellene. (A) Cellens levedyktighet ble beregnet ved hjelp av levende / døde cellefarger (henholdsvis Calcein-AM og ethidium homodimer-1). Verdier viser at 72 % ± 1 % (gjennomsnitt ± SEM, n = 3) av totale celler per brønn er aktive og 29 % ± 2 % (gjennomsnitt ± SEM, n = 3) av cellene er døde for total cellepopulasjon per brønn på dag 4. Viste verdier representerer gjennomsnittlig ± SEM. (B) Cellepopulasjoner, prosentandel av nevroner og astrocytter per brønn ble beregnet ved hjelp av bildeanalyse av farging vist i figur 4. Nevroner representerer prosentandelen av celler som farget positivt for Β-III tubulin ved dag 7 (49 % ± 3 %, gjennomsnittlig ± SEM, n = 3), mens astrocytter representerer prosentandelen celler som farget positivt for GFAP på dag 7 (30 % ± 4 %, gjennomsnittlig ± SEM, n = 3). Verdiene som vises, representerer gjennomsnitt ± SEM. All avbildning til beregninger vist i figur 3 ble utført på et konfokal avbildningssystem, og alle analyser ble utført på bildeanalyseplattformen og GraphPad Prism etter metoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Ekspresjon av nevrale celletypemarkører i 3D bioprintede kokulturer av glutamaterge nevroner og astrocytter ved dag 7 . (A,B) Immunfluorescerende farging av nevronmarkør Β-III tubulin og astrocyttmarkør GFAP, avbildet på en invertert mikroskopplattform ved 10x forstørrelse. Skalastenger representerer 100 μm. (C) Immunfluorescerende farging av nevronmarkør β-III tubulin og astrocyttmarkør GFAP farget sammen med Hoechst, vist i XYZ-planvisning, avbildet på et konfokalt avbildningssystem ved 10x forstørrelse. Opprettet på bildeanalyseplattformen. Skalastangen representerer 100 μm. (D) Immunfluorescerende farging av nevronmarkør β-III tubulin farget sammen med Hoechst, avbildet på et konfokal bildesystem ved 20x forstørrelse. Skala bar representerer 100 μm. (E) Immunfluorescerende farging av glutamatergisk markør GluR2 co-farget med Hoechst, avbildet på en invertert mikroskopplattform ved 10x forstørrelse. Boks 3E.1 viser uthevede områder med GluR2-farging. Skalastangen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsvideo 1: Glutamaterge nevroner og astrocytter ble bioprintet inn i hydrogelmatrisen ved hjelp av bioprinteren og ble avbildet hver 12. time ved hjelp av et brightfield-mikroskop. Video av lysfeltbilder tatt av cellekulturer under analyse, tidspunkter er angitt nederst i høyre hjørne, og skalastenger representerer 400 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 1: Eksempelbilder av levende/døde analyser av bioprintede nevroner og astrocytter på dag 4. Calcein-AM flekk vist i grønt (488 nm), og ethidium homodimer flekk vist i rødt (647 nm). Bildet vises i XYZ-planvisning, opprettet på bildeanalyseplattformen . Skalastangen representerer 100 μm. (A) Avbildning ble utført ved hjelp av et konfokal bildesystem ved 4x forstørrelse. (B) Avbildning ble utført ved hjelp av et konfokal bildebehandlingssystem ved 10x forstørrelse Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Eksempel på negativt kontrollbilde etter immunfluorescerende farging. Primære antistoffer ble utelatt, og grønne (488 nm) og røde (647 nm) sekundære antistoffer ble brukt i henhold til immunfargingsprotokoller. Bildet vises i XYZ-planvisning, opprettet på bildeanalyseplattformen. Skalastangen representerer 100 μm. Avbildning ble utført ved hjelp av et konfokal bildebehandlingssystem ved 10x forstørrelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Behovet for nøyaktige modeller av CNS har aldri vært høyere, og begrensninger i todimensjonale (2D) tradisjonelle cellekulturmodeller har drevet en generasjon komplekse CNS-modeller de siste årene19. Imidlertid har mange komplekse 3D-modeller som representerer interaksjoner mellom nevrale celletyper og ECM begrensninger som vil forhindre anvendelse av disse modellene i industrielle prosesser 6,20,21. I denne protokollen utvikler vi en 3D-kokulturmodell av humane iPSC-avledede nevroner og astrocytter, som tar sikte på å løse noen av disse begrensningene ved hjelp av 3D bioprinting-teknologi for å skape et bioaktivt hydrogelstillas i 96-brønns og 384-brønnformater.

Metodikken for å utvikle disse modellene har blitt forenklet gjennom programvaren for platekartdesign, automatisk genererte utskriftsprotokoller og veiledet utskriftsprosess fra bioprinteren. På grunn av den følsomme naturen til de følsomme iPSC-avledede celletypene som brukes i denne protokollen, bør det imidlertid utvises forsiktighet med følgende kritiske trinn i tining og kultur. For det første har inkluderingen av ROCK-inhibitor (ROCKi) flere fordeler gjennom bioprintingsprosessen og i tidlig kultur. Celletining er et kritisk punkt der nevronene kan oppleve en stressrespons, og feil tineprotokoller kan redusere sjansene for overlevelse22. Det anbefales vanligvis å tine celler, legge til media og heve celler til inkubatortemperatur så effektivt som mulig23. Under bioprintingsprosessen beskrevet i denne protokollen er det imidlertid nødvendig at nevroner og astrocytter resuspenderes i en aktivatorløsning i stedet for media, og celler vil ikke bli hevet over romtemperatur før slutten av utskriftskjøringen (opptil 30 minutter etter tining). Dermed er tilsetningen av ROCKi til mediet umiddelbart etter tining og inkludert dette under de to sentrifugeringstrinnene (trinn 2.1--2.7 og 1.3.15-1.3.20) avgjørende for å hemme cellespenningsveier, noe som vil resultere i lavere levedyktighetsnivåer24. Videre har ROCKi vist seg å fremme nevrittutvekst og forbedre nevronmodning25. Dermed fortsetter ROCKi-tilskudd i 48 timer etter bioprinting. Det er imidlertid viktig å fjerne ROCKi-tilskudd etter 48 timer for å sikre fullstendig vask under de påfølgende medieendringene før celler brukes til analyse.

Et ytterligere skritt som krever kritisk oppmerksomhet er under post-print media tillegg og medieendringer (trinn 2.8-2.13). Det biotrykte hydrogelstillaset har en ekvivalent biomekanisk stivhet på bare 1,1 kPa, tilsvarende grå substans. Som beskrevet i trinn 2.10 er det avgjørende å pipette forsiktig inn i siden av brønnen under medietilsetning og aspirasjon for å forhindre forstyrrelser. Dette er spesielt relevant for 384-brønnsplater, hvor gelnivået tar opp en høyere andel av totalt brønnvolum. Denne metoden bør også brukes i 2D-kontrollbrønner for å forhindre kantløfting av celler og skjæring av nevrittutvekster. Forfatterne ønsker også å fremheve viktigheten av steril teknikk i bioprinteren, som bør behandles med tilsvarende forsiktighet som et biosikkerhetsskap som brukes til iPSC-avledede cellekulturer. Dette inkluderer steril filtrering av 70 % EtOH og dH2O som brukes i prosedyrene for grønt lys og utskrift, å holde lokk på blekkpatronene og platene mens du beveger hendene inn og ut av bioprinteren, og dekontaminering av overflater inne i bioprinteren med 70 % etanolservietter før og etter utskrift.

Det biotrykte hydrogelstillaset, dannet av bioblekk- og aktivatorløsninger, valgt for å utvikle denne modellen, er valgt fra en rekke bioblekk- og aktivatorløsninger utviklet av Inventia Life Science for bruk i RASTRUM-bioprinteren. Laminin og hyaluronsyre ble identifisert som molekyler av relevans for iPSC-avledet nevronmodning på grunn av deres rolle i aksonal veiledning, synapsedannelse og dannelse av det perinevrale nettet26,27. Videre ble en biomekanisk stivhet på 1,1 kPa valgt, da hydrogeler med lavere tetthet har vist seg å muliggjøre bedre nevrittutvekst fra nevroner12. Hvis det gjøres endringer i protokollen ved å bruke nevroner og astrocytter som har blitt differensiert internt eller fra en annen kommersiell leverandør, vil det bli anbefalt å gjøre en matrisevalgstest for å bestemme det mest støttende hydrogelstillaset15. Videre kan celletetthet også måtte optimaliseres dersom endringer i cellekilder gjøres for å sikre optimal levedyktighet og forhindre hydrogeloverbefolkning. For alle modifikasjoner og feilsøking relatert til bioprinterfunksjonen, anbefaler forfatterne å kontakte produsenter og referere til produsentprotokoller.

CNS inneholder et bredt spekter av nevrale subtyper og gliaceller, som alle eksisterer i forskjellige hjernenisjer og har spesifikke roller som bidrar til nevral funksjon28. Innenfor rammen av dette brede omfanget representerer denne modellen bare de to mest tallrike celletypene (astrocytter og eksitatoriske glutamaterge nevroner). Viktige celletyper som mikroglia, oligodendrocytter og blod-hjernebarrieredannende endotelceller er utelatt fra dette systemet. Inklusjon av mikroglia kan være relevant for fokus på nevroimmune interaksjoner, og oligodendrocytter kan være av interesse ved sykdommer som påvirker sentral myelinisering. I tillegg til deres rolle i patologi, skiller celler som blod-hjernebarrieredannende endotelceller ut legemiddelmetaboliserende enzymer, noe som kan påvirke bruken av denne modellen for farmakokinetiske analyser29. En ytterligere begrensning av modellen kan være forholdet mellom astrocytter og nevroner; Forholdet mellom astrocytter og nevroner varierer sterkt mellom hjernegrupper, med foreslåtte verdier på mellom 1: 1 og 1: 330,31. Denne modellen har et omtrentlig forhold på 1: 1, 5 astrocytter til nevroner; Dermed kan denne modellen ikke være relevant for å modellere hjerneområder der astrocytter er mer rikelig, for eksempel i hvite substansområder30.

Andre protokoller for å utvikle 3D bioprintede kokulturmodeller har blitt publisert de siste årene. En publikasjon av Sullivan et al., 2021, presenterte en 3D bioprintet nevral modell ved bruk av iPSC-avledede nevrale stamceller, som demonstrerer høy levedyktighet etter utskrift og forbedring av nevronfunksjon sammenlignet med 2D-kulturer32. I denne protokollen ble imidlertid nevrale stamceller brukt som cellekilde og ble opprettholdt i kultur i 4 uker. I denne protokollen ble kommersielt tilgjengelige iPSC-avledede glutamaterge nevroner og astrocytter brukt. Dette gjør at et 3D-nettverk av samdyrkede celler kan etableres på så lite som 7 dager; Som demonstrert ved nevrittvekstanalyse, begynner nevrittutvekst innen 24 timer og fortsetter på en lineær måte gjennom hele 156 timers perioden for hvilken cellevekst ble overvåket. Den raske etableringen av disse nettverkene kan delvis tilskrives bruken av glutamatergiske nevroner som bruker optimalisert doksycyklininduserbart genuttrykk av NGN2, som viser uttrykk for modne neuronale subtypemarkører innen 7 dager, selv i 2D-kultur33. Forkortelsen av denne vekstperioden ved hjelp av denne teknikken er viktig for å implementere modeller innen biofarmasøytisk industri, da analyseutvikling krever rask behandlingstid og utvikling av cellemodeller15.

Avslutningsvis viser denne modellen potensial for en 3D-modell av nevroner og astrocytter, som etableres raskt og praktisk for screeningformål. Fremtidige applikasjoner for denne modelltypen kan være for legemiddeloppdagelsesarbeid på tvers av forskjellige CNS-sykdommer, med mulighet til å utvide til forskjellige sykdommer ved hjelp av pasient- eller genredigerte sykdoms-iPSC-linjer. Videre tillater bruken av doksycyklininduserbare NGN2-uttrykk iPSC-avledede glutamatergiske nevroner celler å nå modenhet på kortere tid, noe som kan brukes til å utvikle modeller av den aldrende hjernen for nevrodegenerasjonsforskning. Dette systemet kan også utvides ved bruk av flere celletyper i kokultur, inkludert mikroglia og oligodendrocytter.

Disclosures

CW, NC og JB er ansatte i Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, London, Storbritannia. YH er ansatt i Merck Sharp & Dohme LLC, et datterselskap av Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.

Figur én ble laget ved hjelp av Biorender.com.

Acknowledgments

Forfatterne takker Alex Volkerling, Martin Engel og Rachel Bleach for deres hjelp med å utvikle protokollen og tilbakemeldinger på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermofisher 31350010
384-well plate PerkinElmer 6057300
96-well plate PerkinElmer 6055300
Activator fluid F299 Inventia Life Science N/A
Activator fluid F3 Inventia Life Science N/A
B27 (50x) minus Vit A Thermofisher 12587010
Bioink fluid F261 Inventia Life Science N/A
Bioink fluid F32 Inventia Life Science N/A
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D5207
GlutaMAX (100x) Thermofisher 35050061
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 Abcam ab150115
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Hoechst Abcam ab228551
Human BDNF Recombinant Protein Thermofisher PHC7074
Human NT3 Recombinant Protein Thermofisher PHC7036
iCell Astrocytes Fujifilm CDI 1434
INCell Analyser 6500HS Molecular Devices N/A high content imaging system
Incucyte S3 Sartorius  N/A
ioGlutamatergic Neurons (Large vial) Bit.bio e001
Laminin (1 mg/mL) Sigma Aldrich L2020
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) Invitrogen L3224
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated R&D systems SC024
Neurobasal media Thermofisher 21103049
Normal Donkey Serum Abcam ab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342) Thermofisher R37605
Opti-MEM Thermofisher 11058021
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
PEI 50% in H2O Sigma Aldrich 181978
Pierce Borate Buffer 20x Thermofisher 28341
Prism GraphPad Data analysis software
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) Abcam ab206293
RASTRUM(TM) Bioprinter Inventia Life Science N/A Bioprinter
RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges Inventia Life Science N/A Bioprinter Cartridges
RASTRUM(TM) Targeting plate Inventia Life Science N/A Targeting plate
Rho kinase (ROCK) inhibitor Abcam ab120129
Sheep anti-GFAP NL493 conjugated R&D systems SC024
Signals Image Artist  PerkinElmer  N/A Image analysis platform
Triton X-100 Thermofisher HFH10
Zeiss Axio Observer Zeiss N/A Inverted microscope platform 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
  2. Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1 (2020).
  3. Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , Springer, Singapore. (2019).
  4. Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22 (2021).
  5. Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
  6. Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
  7. Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
  8. Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
  9. Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159 (2019).
  10. Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760 (2022).
  11. Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242 (2019).
  12. Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
  13. Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165 (2018).
  14. Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
  15. Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876 (2021).
  16. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  17. Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
  18. Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
  19. Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328 (2020).
  20. de Souza, N. Organoid variability examined. Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).
  21. Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
  22. Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960 (2021).
  23. Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
  24. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799 (2022).
  25. Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
  26. Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
  27. Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
  28. Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
  29. Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
  30. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
  33. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).

Tags

Tredimensjonal bioprinting humane IPSC-avledede nevron-astrocytt-kokulturer screeningapplikasjoner cellemodell legemiddelscreening gjennomstrømning homogenitet utviklingstid 3D-modeller bioprinting kokulturmodeller induserte pluripotente stamceller (iPSC) glutamaterge nevroner astrocytter hydrogelmatrise bioaktive peptider ekstracellulære matriksproteiner (ECM) fysiologisk stivhet levedyktighet astrocytt-til-nevronforhold modne nevrale celletypemarkører nevrittutvekstanalyser
Tredimensjonal bioprinting av humane iPSC-avledede nevron-astrocytt-kokulturer for screeningapplikasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Whitehouse, C. A., He, Y.,… More

Whitehouse, C. A., He, Y., Brownlees, J., Corbett, N. Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. J. Vis. Exp. (199), e65856, doi:10.3791/65856 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter