Summary
ここでは、iPS細胞由来のニューロンとアストロサイトの3Dバイオプリント共培養を行うためのプロトコルを紹介します。この共培養モデルは、96ウェルまたは384ウェルフォーマットのハイドロゲル足場内で生成され、7日以内に高いポストプリント生存率と神経突起伸長を示し、両方の細胞タイプの成熟マーカーの発現を示します。
Abstract
細胞モデルを薬物スクリーニングに利用するためには、効率的な開発時間を確保しながら、スループットと均質性の要件を満たす必要があります。ただし、公開されている多くの 3D モデルは、これらの基準を満たしていません。そのため、早期創薬用途での有用性は限定的です。3次元(3D)バイオプリンティングは、3Dモデルの開発に適用して、開発期間の短縮、標準化の促進、スループットの向上を実現できる新しい技術です。ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来のグルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトの3Dバイオプリント共培養モデルを開発するためのプロトコルを紹介します。これらの共培養物は、生理活性ペプチド、完全長細胞外マトリックス(ECM)タンパク質のハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれており、生理学的剛性は1.1 kPaです。このモデルは、96ウェルおよび384ウェルフォーマットで迅速に確立でき、平均72%の印刷後生存率を実現します。このモデルにおけるアストロサイトとニューロンの比率は1:1.5であることが示されており、これはヒトの脳の生理学的範囲内である。これらの3Dバイオプリント細胞集団は、成熟した神経細胞タイプマーカーの発現と、培養後7日以内に神経突起および星状細胞突起の成長も示しています。その結果、このモデルは、神経突起伸長アッセイと並行して細胞色素や免疫染色技術を用いた分析に適しています。これらの生理学的に代表的なモデルを大規模に作成できるため、神経科学ターゲットのミディアムスループットからハイスループットのスクリーニングアッセイでの使用に最適です。
Introduction
創薬業界における中枢神経系(CNS)疾患の研究は拡大しています1.しかし、てんかん、統合失調症、アルツハイマー病など、多くの中枢神経系疾患には、いまだに根治的な治療法がありません2,3,4。中枢神経系疾患における効果的な治療法の欠如は、少なくとも部分的には、脳の正確なin vitroモデルの欠如に起因している可能性があります5。その結果、現在のin vitroモデルとin vivoデータの間にトランスレーショナルギャップが生じ、その後の研究活動のボトルネックとなっています。
このトランスレーショナルギャップにより、近年、神経オルガノイド、ニューロスフェロイド、足場ベースのモデルなど、新しい3D細胞モデルの開発が大幅に増加しています6。これらのモデルの3D構造は、生体力学的ストレス、細胞間接触、脳細胞外マトリックス(ECM)などの神経微小環境の再現に役立ちます7。脳ECMは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、および神経血管ユニット7を含む神経細胞タイプ間の空間を占める神経生理学の動的要素である。脳ECMの再現は、ニューロンの形態とニューロンの発火に影響を与えることが示されており、脳の多くの複雑な3Dモデルは、神経細胞タイプによるECMタンパク質の沈着を実証しています8,9,10,11。足場ベースのモデルは、脳ECM12を表す多孔質の合成または生物学的ハイドロゲルマトリックスに懸濁された成熟神経共培養からなる。オルガノイドやスフェロイド系とは異なり、足場ベースの3Dモデルでは、存在するECMタンパク質のカスタマイズが可能であり、生体力学的ストレスを模倣するためのハイドロゲルの剛性の調整可能性という利点もあります13,14。
3Dニューラルモデルの圧倒的多数は、脳微小環境の再現の増加を示していますが、すべてのモデルが創薬アプリケーションの実装に適しているわけではありません15。3Dモデルを産業プロセスに実装するには、システムがスクリーニングアプリケーションのスループット要件を満たし、比較的短い開発時間が必要です16。3Dバイオプリンティングは、人為的ミスによって引き起こされるばらつきを排除するとともに、開発時間の短縮、スループットの向上、より高いレベルの精密制御を備えた3D足場ベースのニューラルモデルを作成する可能性を提供する新しい技術です17。このプロトコルは、ヒドロゲル足場中のヒトiPS細胞由来のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトの3D共培養モデルを提示します。このハイドロゲル足場には、生理学的に代表的な生理活性ペプチド(RGD、IKVAV、YIGSR)およびECMタンパク質が模倣生体力学的剛性内に含まれています。これらの完全長ECMタンパク質には、ヒト皮質に豊富に存在する完全長ラミニン-211とヒアルロン酸が含まれ、 in vivo 測定で1.1 kPaの剛性があります18。このモデルは、創薬の実用性を考慮して設計されており、神経突起伸長アッセイと並行して、細胞色素と抗体を用いたイメージング技術を用いたスクリーニング解析に適した96ウェルまたは384ウェルプレートフォーマットの3Dバイオプリンターを使用して作成されます。細胞は、培養後7日以内に神経細胞タイプマーカーの発現と神経突起および星状突起の増殖を示します。したがって、このプロトコルは、創薬アプリケーションで使用するためのハイスループット3D神経共培養モデルを開発するための方法論を提示します。
図1:共培養の3Dバイオプリントに使用される方法論の実例的な概要。 ヒトiPS細胞由来のニューロンとアストロサイトは、生理活性ペプチドを含むアクチベーターおよびバイオインク溶液と組み合わされ、ドロップオンデマンドバイオプリンティング技術を使用して、96ウェルまたは384ウェルフォーマットのハイドロゲルスキャフォールドにバイオプリントされます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Protocol
1. 3Dモデルのバイオプリンティング
- プレートマップと印刷ファイルの生成
- モデルを生成する前に、プレートマップソフトウェアを使用して、プレートマップ、プロトコル、および印刷ファイルを生成します。プレートマップソフトウェアを開き、[ 細胞を3Dで培養 ]オプションを選択します。
- ドロップダウンメニューの利用可能なオプションからバイオプリントするモデルタイプを選択します。このモデルは、イメージングモデルおよびHTPモデル形式で検証されています。96ウェルプレートにはイメージングモデルを、384ウェルプレートにはHTPを選択します。
- マトリックス選択ウィンドウで、ラミニン-211およびヒアルロン酸タンパク質を含むハイドロゲルPx02.53と、IKVAV、RGD、およびYIGSRペプチドを選択します。
- ポップアップウィンドウで、細胞タイプに 「Glutamatergic Neurons and Astrocytes 」、細胞密度に「2,000万細胞/mL」と入力します。
- ソフトウェアを使用して、画面上のプレート上のウェルを強調表示することにより、目的のプレートマップを設計します。設計には、 プラスチック上の 2D コントロール を少なくとも 1 行含めます。 プラスチックウェルの2D制御 は、ハイドロゲルの足場なしでウェルに直接堆積されたセルで構成されています。ステップ1.2に従ってこれらのウェルをコーティングします。
- ウィンドウの上部にリストされているプレートモデルが、使用するプレートモデルに変更されていることを確認します( 材料表を参照)。
- ダウンロードボタンを使用してプレートマップのプロトコルと印刷ファイルをダウンロードし、バイオプリンターにリンクされたコンピューターに保存します。
- プラスチックウェルへの2D制御のコーティング
- プリントの少なくとも24時間前に、細胞の接着と増殖のために2Dコントロールモデル用のウェルをコーティングします。3Dモデルウェルは、事前コーティングを必要としません。すべてのプロセスは、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで実施する必要があります。版は、印刷の7日前までコーティングして準備することができます。
- 2.5 mL の 20 倍ホウ酸ストック溶液を 47.5 mL の滅菌 dH2O で希釈して、50 mL の 1x ホウ酸バッファーを調製します。
- 100 μL の 50% (w/v) ポリエチレンイミン (PEI) を 50 mL の 1x ホウ酸バッファーに添加して 0.1% (w/v) PEI 溶液を調製し、0.22 μm フィルターを通して滅菌フィルターを通します。
- ステップ 1.1 で生成したプレートマップに示されているように、各 2D コントロールウェルに 0.1% (w/v) PEI 溶液を追加します。96ウェルプレートを使用する場合は100 μL/ウェル、384ウェルプレートを使用する場合は25 μL/ウェルを添加します。
- プレートを37°Cで2時間インキュベートしてから、0.1%(w/v)PEI溶液を吸引し、ウェルをPBSで5回すすぎます。バイオセーフティキャビネットでウェルを完全に乾燥させます。
- 100 μL の 1 mg/mL ラミニン溶液を 5 mL の神経基底培地で希釈します。96ウェルプレートを使用する場合は各2Dコントロールウェルに100 μL、384ウェルプレートを使用する場合は25 μLを添加します。37°Cで4時間インキュベートします。
- プレートを保存する場合は、インキュベーション後にラミニン溶液をそのままにして、4°Cで保存してください。 使用前にプレートを37°Cで1時間予熱してください。
- 共培養モデルの3Dバイオプリンティング
- バイオプリンターを使用する際は、常に滅菌技術を維持し、手袋、カートリッジ、培養プレートを70%EtOHで拭いてからプリンター内部に入れてください。特に明記されていない限り、バイオプリンターの外部ですべてのプロセスをバイオセーフティキャビネットで実行してください。
- バイオプリンターのコンプレッサーをオンにし、バイオプリンターソフトウェアの[初期化]ボタンを選択してプリンターを 初期化 します。プリンタ内の空気の流れが始まったら、70%EtOHワイプでプリンタ内部の表面を拭きます。
- 印刷当日に、ガイド付きの Start of Day Greenlighting プロセスを実行して、印刷実行の正しいノズル状態(最小ノズル状態2A2B)を確認します。
- 滅菌パッケージからバイオプリンターカートリッジを取り出し、コンパートメントAに滅菌dH2Oを20 mL添加し、コンパートメントB1〜4に滅菌ろ過した70%EtOHを6 mL加えます。カートリッジをバイオプリンター内部の左側のカートリッジホルダーに挿入し、プレートの蓋を専用の蓋ホルダーに入れます。
- ソフトウェアのホーム画面で [グリーンライト ]ボタンを選択し、カートリッジがバイオプリンター内の所定の位置にあり、蓋が取り外されていることをソフトウェアで確認します。グリーンライト プロセスを開始します。
- ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、左右の針から一貫した滴りが見られないことを確認します。続いて、ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、B7およびB8コンパートメントに水が存在することを確認します。
- バイオプリンターがセルフガイドのグリーンライトステップを完了した後、コーティングされていない滅菌済み96ウェルフラットボトムプレート(バイオプリンティング共培養用のコーティングプレートとは別)を挿入し、ソフトウェアのプロンプトに従ってこの新しいプレートをバイオプリンターの右側のプレートホルダーセクションに挿入します。次の手順を開始する前に、プレートホルダーが ハイプロファイルプレートに設定され、蓋を取り外して専用の蓋ホルダーに配置していることを確認してください。
- バイオプリンターは、96ウェルプレートの各ウェルに水滴を堆積させます。完了したら、バイオプリンターからプレートを置き、プレートの各ウェルに水滴が存在することを確認します。
- グリーンライティングに使用した96ウェルプレートを廃棄し、バイオプリンターがグリーンライトプロセスを終了するのを待ちます。完了すると、ソフトウェアはバイオプリンターのノズルの状態を示し、バイオプリンターがモデルを印刷する準備ができていることを確認します。プリントカートリッジに蓋を置き、次のステップのためにバイオセーフティキャビネットに取り外します。
- バイオプリンターソフトウェアを使用して、印刷実行ソフトウェアボタンを使用して印刷ファイル(ステップ1.1で生成) をソフトウェアに ロードし、印刷プロトコルpdfを開きます。
- 印刷プロトコルのPDFに示されているように、バイオインクとアクチベーター液を-20°Cから取り出し、室温(RT)で40分間解凍します。ハイドロゲルマトリックス Px02.53 の場合、これには 1x バイアル F32、1xvial F3、1x バイアル F261、1x バイアル F299 が含まれます。バイオインクや活性剤の液体を手や水浴で解凍しないでください。
- バイオインクとアクチベーター液を融解している間に、ドキシサイクリンとROCK阻害剤を含む完全培地(完全培地+DOX/ROCKi)(ステップ2.2を参照)をRTに50 mL持ち込みます。
- バイオインクと活性剤が解凍されたら、生成された印刷プロトコルpdfの最後の2ページの指示に従って印刷カートリッジを準備します。グリーンライトプリンターカートリッジは、モデルの印刷段階で再利用されます。
- 区画 A1 に 40 mL の dH2O があり、区画 B1 および B2 に 8 mL の 70% EtOH があることを確認します。活性化剤 F32 1.2 mL を C1 に、F3 1.2 mL を C2 に、F261 200 μL を C4 に加えます。
- インキュベーターからPEIとラミニンコーティングされたプレートを取り出し、プリンター内の右側のプレートホルダーコンパートメントに置きます。この時点では、ラミニン培地溶液をウェルから取り出さないでください。プレートホルダーコンパートメントが ロープロファイルプレート に設定され、蓋が取り外されて蓋ホルダーに入れられていることを確認します。
- プリントカートリッジをバイオプリンターに挿入し、蓋が取り外されてホルダーに入れられていることを確認し、バイオプリンターソフトウェアの [不活性ベースの 印刷]ボタンを選択して、ソフトウェアで印刷の実行を開始します。
- 不活性塩基が印刷されている間に、グルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトのバイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、セクション2の指示に従って再懸濁します。
- 細胞を融解し、8 mLの完全培地+DOX/ROCKiを各細胞タイプに別々に添加したら(セクション2に従って)、細胞を300 x g で5分間室温で遠心分離します。
- 上清を吸引し、両方の細胞タイプを1 mLの完全培地+DOX/ROCKiに別々に再懸濁します。
- 20 μL の細胞懸濁液を 20 μL のトリパンブルーに加え、細胞を計数する前に混合して、各細胞タイプの mL あたりの生細胞濃度を決定します。
- 合計 300 万個のグルタミン酸作動性ニューロンと 100 万個のアストロサイトを 15 mL チューブで組み合わせます。培地を添加して、合計容量8 mLにします。
- 細胞を300 x g で5分間室温で遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引し、細胞ペレットを200μLの活性剤液F299に再懸濁します。
- アクティベーター液は粘性があることに注意してください。ピペットを上下に動かして、ペレットを完全に再懸濁します。細胞の種類はデリケートです。せん断や気泡を最小限に抑えるには、口径の広いピペットチップとリバースピペッティング技術を使用します。細胞の損失を防ぐために、ピペットでしっかりと上下に3回以内にしてください。
- 不活性ベースステージの印刷が終了したら、カートリッジと培養プレートに蓋を置き、両方をバイオプリンターから取り外してバイオセーフティキャビネットに入れます。
- F299の細胞懸濁液200 μLをプリントカートリッジのウェルC3に加え、カートリッジをバイオプリンターに再挿入し、蓋を外して蓋ホルダーに入れます。培養プレートをまだ再挿入しないでください。
- 印刷実行の 印刷モデル ステージを開始します。バイオプリンターが液体をプライミングしている間に、プレートの2Dコントロールウェルからラミニン培地溶液を取り出し、96ウェルプレートを使用する場合は各2Dコントロールウェルで150 μLの完全培地+DOX/ROCKiと交換し、384ウェルプレートを使用する場合は50 μLの完全培地+DOX/ROCKiと交換します。
- 液体がプライミングされたら、バイオプリンティングターゲティングプレートをバイオプリンターに挿入し、蓋を外して蓋ホルダーに入れます。
- バイオプリンターのターゲット設定プロセスを開始します。
- バイオプリンティングソフトウェアのプロンプトが表示されたら、バイオプリンターからターゲティングプレートを取り外します。
- ガイドを使用して、プレート上の液滴を観察できる場所を選択します。ターゲットプレートをバイオプリンターに再挿入し、液滴の印刷と選択プロセスを繰り返します。
- プロンプトが表示されたら、ターゲティングプレートを再度取り外し、細胞培養プレート(ステップ 1.3.25 に従って 2D コントロールウェルに培地を含む)と交換します。培養プレートの蓋が外れ、ホルダーに置かれていることを確認します。バイオプリンターが模型印刷を終了します。
- モデルプリントが完了したら、セクション2(ステップ2.8)の細胞培養方法に従って、ウェルに培地を添加します。
- バイオプリンターのクリーニングプロセスを開始し、完了したら、ラボのプロトコルに従ってカートリッジと残りの液体を廃棄します。
2. 細胞培養
- モデルは、グルタミン酸作動性ニューロンのバイアル1本(バイアルあたり500万>細胞)とアストロサイトのバイアル1本(バイアルあたり>100万細胞)を使用して生成されます。
- ウォーターバスを37°Cに予熱します。
- 両方の細胞バイアルをドライアイス上でラボに輸送し、ドライアイスから取り出した直後に水浴に浸します。両方のバイアルを同時に解凍します。
- 小さな氷の結晶だけが残っているときに、水浴からバイアルを取り出します。浸漬後、約3分かかります。水浴で細胞を渦巻かせたり混ぜたりしないでください。
- バイアルに70%EtOHをスプレーし、バイオセーフティキャビネットに移します。
- 500 μL の完全培地 +DOX/ROCKi を各バイアルに滴下してから、各懸濁液を別々の 15 mL チューブに移します。
- 各チューブの培地を 8 mL に補充し、ステップ 1.3 に従ってバイオプリンティングステップに進みます。
- バイオプリンティングモデル(ステップ1.3)に続いて、直ちにすべての3D共培養ウェルに完全な培地+ DOX / ROCKiを追加し、モデルを37 °Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。96ウェルプレートを使用する場合は、ウェルあたり150 μLの培地を添加します。384ウェルプレートを使用する場合は、ウェルあたり50 μLの培地を使用します。
- 培養の最初の48時間には培地の交換は必要ありません。
- 2Dコントロールおよびモデルで培地交換を行う場合は、2D培養液の剥離やハイドロゲルの変形を引き起こす可能性のある機械的ストレスを誘発しないように注意する必要があります。培地の吸引と添加は、ウェルの側面を下向きにしたマイクロピペットを使用してゆっくりと行います。
- 48時間後、すべてのウェルで90%の培地交換を行い、培地組成物からROCKiを除去します(ステップ2.14を参照)。
- 96-時間後、すべてのウェルでさらに90%の培地交換を行い、培地組成物からDOXを除去します(ステップ2.14を参照)。
- 48時間と96時間の2回の90%培地交換に続いて、48時間ごとに50%の培地交換を行い、培地の50%を吸引し、新しい完全な培地と交換します
- メディア構成:
- コンプリート培地:GlutaMAX 1x GlutaMAX、B27 x 12.5 nM 2-メルカプトエタノール、NT3 10 ng/mL、BDNF 5 ng/μL を含む神経基底培地。
- 完全培地とドキシサイクリン(DOX):GlutaMAX 1 個、B27 1 個、12.5 nM 2-メルカプトエタノール、10 ng/mL のニューロトロフィン-3(NT3)、5 ng/μL の脳由来神経栄養因子(BDNF)、1 μg/mL のドキシサイクリンを含む神経基底培地。
- 完全培地とDOX/ROCK阻害剤(ROCKi):GlutaMAX 1個、B27 個1個、12.5 nM 2-メルカプトエタノール、NT3 10 ng/mL、BDNF 5 ng/μL、ドキシサイクリン1 μg/mL、ROCK阻害剤10 μMを含む神経基底培地。
3. 神経突起成長解析
- バイオプリンティング後の培地添加後すぐに明視野イメージングのために細胞を生細胞顕微鏡に入れます。
- 顕微鏡ソフトウェアを使用して、2Dコントロールを含むすべてのウェルで、12時間ごとに少なくとも7日間、細胞を4倍の倍率でイメージングするようにスケジュールします。
- セクション2で詳述したように、48時間ごとに培地交換を行い、その都度培地交換後に細胞を顕微鏡に戻します。
- 7日間のデータの後、ソフトウェアから.jpg形式で画像をエクスポートします
- .jpg画像をすべてImageJソフトウェアにインポートし、ファイルを8ビット形式に変換します。 NeuronJ プラグインをロードし、トレース ツールを使用して、分岐点を含む画像内の神経突起の成長を追跡します。
- NeuronJ から生成された神経突起追跡データを使用して、神経突起伸長を経時的にプロットします。
4. 細胞生存率解析
- 培養の24時間ごとに、生/死生存率キットを使用して細胞生存率分析のために3つ以上のウェルを染色します。研究期間中、24時間または48時間の時点でこのステップを繰り返します。
- イメージングの30分前に、生細胞試薬(1x Calcein-AM)と死細胞試薬(1x ethidium homodimer-1)および1x 生細胞核染色試薬(Hoechst 33342)をフェノールレッドを含まない還元血清培地(Opti-MEM)10 mLに懸濁して、生/死試薬培地を調製します。生/死試薬培地をRTに取り込みます。 生試薬/死試薬培地は、蛍光漂白により直射日光を避けて保管してください。
- 細胞モデル/2Dコントロールを含む3つのウェルから培地を除去し、ゲルの乱れを慎重に防止します。細胞モデルをRT滅菌PBSで一度洗浄します。96ウェルプレートの場合は各ウェルに100 μL、384ウェルプレートの場合は25 μLの生試薬/死試薬培地を添加します。
- モデルを37°C、5%CO2で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、モデルはイメージングの準備が整います。赤(647 nm、死細胞)、緑(488 nm、生細胞)、青(405 nm、核染色)の励起チャンネルを備えた標準的な顕微鏡でイメージングを行います。3Dモデルで最良の結果を得るには、ハイコンテント共焦点顕微鏡を使用してモデルを画像化し、4倍または10倍の倍率でZスタック機能を使用してイメージングを実行します。
注:この研究では、INCell Analyzer 6500HS(ハイコンテントイメージングシステム)を使用して細胞モデルをイメージングし、Signals Image Artist(画像解析プラットフォーム、ステップ4.7を参照)を使用して分析を行いました。 - イメージングが完了したら、細胞モデルを37°C、5%CO2 の細胞培養インキュベーターに戻します。ただし、生存率分析に用いた細胞モデルは、長期生存率に関する生死試薬培地のため、さらなる研究から除外してください。
- 画像解析プラットフォーム上での画像解析
- ソフトウェアでZスタックイメージの各平面を選択します。平面イメージを最大強度投影イメージとして結合します。
- 488 nmの生細胞チャンネルからの蛍光を同定し、バイオプリントモデルを関心領域(ROI)として選択して、新しい分析を作成します(ROIですべての細胞が選択されていることを確認します)。
- 関心領域内で、イメージングソフトウェアを使用して、核染色チャンネル(405 nm)を介してROI内の細胞数を、488 nmチャネルを使用してROI内の生細胞数を、647 nmチャネルを使用してROI内の死細胞数を特定します。
- すべての生細胞/死細胞モデルウェルで解析を実行し、ROI面積、総細胞数、生細胞数、死細胞数を含むデータテーブルをエクスポートします。
- 生細胞と死細胞の数を、分析日ごとの総細胞数に対する割合として計算します。
5. 免疫染色と細胞集団解析
- 固定する前に、細胞モデルから培地を取り除き、PBSでモデルを一度洗浄します。
- 細胞をPBS中の4%(v/v)パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。
注意: パラホルムアルデヒドを使用するすべての作業は、実験室の手順に従って実行する必要があります。 - モデルから4%(v/v)のパラホルムアルデヒド溶液を吸引し、PBSでモデルを4回洗浄してパラホルムアルデヒドを完全に除去します。
- 細胞モデルを0.2%トリトン-Xで室温で30分間透過処理し、PBSで3回洗浄します。
- 10%(v/v)の正常ロバ血清(NDS)を用いて、室温で3時間細胞モデルをブロッキングします。
- ブロッキング溶液を除去し、一次抗体(PBS中の1% v/v NDSに希釈)をモデルに添加します。細胞集団比解析(ステップ5.11参照)を行う場合は、Β-IIIチューブリン(赤色AF647結合)およびGFAP(緑色AF488結合)を共染色した細胞モデルを必ず含めてください。一次抗体を含むモデルを4°Cで24時間インキュベートします。
- 一次インキュベーション後、標識一次抗体で染色したモデルをPBSで3回洗浄し、20 μM Hoechstで30分間対比染色します。手順5.10で詳述した画像。
- 非標識一次抗体で染色したモデルをPBSで3回洗浄し、二次抗体(PBSで1%v/v NDSに希釈)を添加します。4°Cで24時間インキュベートします。
- PBSで3回洗浄して二次抗体を除去し、イメージング前に20 μM Hoechstで30分間対比染色します。
- 赤色(647 nm)と緑色(488 nm)の励起チャンネルを備えた標準的な顕微鏡でイメージングを行います。ただし、3Dモデルで最良の結果を得るには、ハイコンテント共焦点顕微鏡を使用してモデルを画像化し、4倍または10倍の倍率でZスタック機能を使用してイメージングを実行します。
- 画像解析プラットフォーム上での細胞集団率の解析
- GFAP(AF488 結合)と Β-III チューブリン(AF647 結合)を共染色したモデルを使用して、細胞集団の解析を行います。
- ソフトウェアで Z スタック イメージの各平面を選択し、平面イメージを最大強度の投影イメージとして結合します。
- 647 nmのΒ-IIIチューブリンチャネルからの蛍光を同定し、バイオプリントモデルをROIとして選択して、新しい分析を作成します(ROIですべての細胞含有領域が選択されていることを確認してください)。
- ROI内で、ソフトウェアを使用して、Hoechstチャネル(405 nm)の細胞数、488 nmチャネルを使用してROI内のGFAP+アストロサイトの数、および647 nmチャネルを使用してROI内のΒ-IIIチューブリン+細胞の数を特定します。
- 共染色したすべての細胞モデルウェルで分析を実行し、ROI面積、総細胞数、GFAP+細胞数、およびΒ-IIIチューブリン+細胞数を含むデータテーブルをエクスポートします。
- GFAP+およびΒ-IIIチューブリン+細胞の数を、総細胞数に対する割合として計算します。
Representative Results
神経突起成長解析
このプロトコルでは、iPS細胞由来のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトを、3Dバイオプリンターを使用して共培養でハイドロゲルマトリックスにバイオプリントしました。プリント後の最初の7日間は、生細胞顕微鏡を使用して12時間ごとに細胞を画像化しました。バイオプリンティング後、細胞は丸みを帯びた形態を持ち、ハイドロゲルマトリックス全体に分散し、培養の最初の数日間で徐々に変化して突起の少ない小さな細胞クラスターを形成する必要があります(代表的な健康な細胞の増殖については、補足ビデオ1を参照してください)。4日目までに、健康な細胞はゲル全体に移動してより大きなクラスターを形成し、神経突起伸長を介して接続されます。7日目までに、単一の細胞はほとんど残らず、神経突起と星状突起の相互接続束が強化されているように見え、クラスターから多くの小さな神経突起の成長が形成されているのが見られます(図2A)。7日間の増殖期間にわたって撮影された一連の生細胞明視野画像を用いて、セクション3に詳述したように神経突起伸長の分析を行った。この分析により、神経突起伸長は12時間から156時間の間にほぼ直線的に増加することが示されました(図2B)。この神経突起伸長期には、細胞体クラスターも大きくなり(補足ビデオ1参照)、これはハイドロゲル全体の細胞移動を示しています。
細胞生存率と個体数比
このプロトコルでは、1,500,000,000のニューロン/mLおよび5,000,000,000のastrocytes/mLから成り立つ2,000,000,000のcells/mLの集中が細胞モデルのbioprintingのために使用されます。カルセイン-AM(生細胞)、エチジウムホモ二量体-1(死細胞)、および核染色による生細胞染色を使用して、7日間にわたって生存する細胞の数をセクション4に従って計算できます(図3A)。代表的な培養物の細胞生存率の結果は4日目に示されており、全細胞の72%±1%(平均±SEM)が生きており、Calcein-AMの染色が見られ、全細胞の29%±2%(平均±SEM)が死滅し、エチジウムホモ二量体-1による染色が見られます(図3B)。カルセイン-AMおよびエチジウムホモ二量体-1による細胞染色の代表的な画像を補足 図1 に示します。死細胞はハイドロゲルに保持され、細胞供給プロセス中に除去されないため、3D培養の細胞生存値は2D培養と直接比較できないことに注意する必要があります。
セクション5および 図4に記載されているように、Β-IIIチューブリンおよびGFAPの免疫蛍光染色を使用して、画像解析を実施して、ニューロンとアストロサイト間の細胞集団比を決定することができます(図3A)。代表的な培養におけるモデルあたりの総細胞数のうち、Β-IIIチューブリン陽性ニューロンは49%±3%(平均±SEM)を占め、GFAP陽性アストロサイトは30%±4%(平均±SEM)を占めています。これにより、アストロサイトとニューロンの比率はそれぞれ1:1.5になります。これにより、モデルあたりの総細胞数が21%残り、どちらの細胞マーカーでも染色されません。細胞生存率分析では、4日目に29%の細胞が生存不能であることが示されたため、これらの細胞はハイドロゲル内で死滅している可能性があります。
細胞マーカーの発現
バイオプリントされたニューロンとアストロサイトの形態は、ニューロン細胞タイプマーカー(Β-IIIチューブリン)およびアストロサイトティックマーカー(GFAP)の免疫染色によって評価されました。示した代表的な培養物では、免疫染色は個々の細胞タイプに局在しており、健康な細胞形態を示し、両方の細胞タイプで細胞突起の伸長が見られます(図4A、B)。ハイドロゲルと細胞の構造は3次元であるため、各画像は図4A、Bの構造を通る1つのスライスのみを表しています。図4Cは、ハイドロゲル全体の画像のマージスタックを示しており、X、Y、およびZ平面での細胞局在の図を示しています。図4Dは、Β-IIIチューブリンのみの免疫染色を示しています。細胞体クラスターからのより細かい神経突起伸長を強調します。グルタミン酸作動性ニューロンの表現型をさらに調べるために、グルタミン酸作動性イオン受容体マーカーであるGluR2の免疫染色を行うことができます。図4E内では、領域4E.1(挿入図)が強調表示されており、神経突起束に沿った高解像度の点状染色が示されています。したがって、このことは、この共培養のニューロンがグルタミン酸作動性表現型を有することを裏付けている。すべての免疫染色画像において、免疫蛍光染色された非細胞構造が細胞クラスターおよび神経突起を取り囲んで観察することができます。これらの構造は、ヒドロゲルに結合する少量の非特異的抗体と組み合わさってヒドロゲル内に保持されたデブリを表している可能性が高い。これは、3D足場モデル内では、細胞供給中に死んだ細胞や破片が除去されないため、バイオプリント培養では予想されます。二次抗体のヒドロゲル非特異的結合を実証するために、代表的なネガティブコントロール免疫染色画像を補足図2に示します。
図2:グルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトをバイオプリンターを使用してハイドロゲルマトリックスにバイオプリントし、明視野顕微鏡を使用して12時間ごとにイメージングしました 。 (A)解析中の細胞培養の明視野画像の例。画像は 156 時間、スケールバーは 400 μm を表します。 (B)ImageJのNeuronJパッケージを用いて測定した培養物からの神経突起伸長の平均長さ(μm)。各データポイントはn = 3ニューライトであり、データはSEM±平均として示されています。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:2,000万細胞/mLの濃度の活性剤溶液を細胞モデルのバイオプリンティングに使用しました 。 (A)細胞生存率は、生細胞/死細胞色素(それぞれカルセイン-AMおよびエチジウムホモ二量体-1)を用いて計算しました。値は±4日目にウェルあたりの全細胞集団の72%1%(平均±SEM、n = 3)が生きており、29%±2%(平均±SEM、n = 3)の細胞が死滅していることを示しています。示されている値は、SEM±平均値を表しています。 (B)ウェルあたりの細胞集団のニューロンおよびアストロサイトの割合は、 図4に示す染色の画像解析により計算しました。ニューロンは、7日目にΒ-IIIチューブリン陽性に染色された細胞の割合(49%±3%、SEM±平均、n = 3)を表し、アストロサイトは、7日目にGFAP陽性に染色された細胞の割合(30%±4%、SEM±平均、n = 3)を表します。表示されている値は、SEM±平均値を表しています。 図3 に示す計算のためのすべてのイメージングは共焦点イメージングシステムで行い、すべての分析は画像解析プラットフォームとGraphPad Prismでメソッドに従って実行しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:7日目のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトの3Dバイオプリント共培養における神経細胞タイプマーカーの発現 。 (A,B)ニューロンマーカーΒ-IIIチューブリンとアストロサイトマーカーGFAPの免疫蛍光染色を倒立顕微鏡プラットフォーム上で10倍の倍率で画像化。スケールバーは 100 μm を表します。 (C)Hoechstと共染色したニューロンマーカー β-IIIチューブリンおよびアストロサイトマーカーGFAPの免疫蛍光染色をXYZ平面図に示し、共焦点イメージングシステムで10倍の倍率で画像化。画像解析プラットフォーム上で作成。スケールバーは 100 μm を表します。 (D)Hoechstと共染色したニューロンマーカー β-IIIチューブリンの免疫蛍光染色、共焦点イメージングシステムで20倍の倍率でイメージング。スケールバーは100μmを表します。 (E)ヘキストと共染色したグルタミン酸作動性マーカーGluR2の免疫蛍光染色を、倒立顕微鏡プラットフォーム上で10倍の倍率で画像化。ボックス 3E.1 は、GluR2 染色の強調表示された領域を示しています。スケールバーは100μmを表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足動画1: グルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトは、バイオプリンターを使用してハイドロゲルマトリックスにバイオプリントされ、明視野顕微鏡を使用して12時間ごとに画像化されました。分析中の細胞培養の明視野画像のビデオ、右下隅に時点が示され、スケールバーは400μmを表します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:4日目のバイオプリントニューロンとアストロサイトの生死解析の画像例。 Calcein-AM染色試薬は緑色(488 nm)、エチジウムホモ二量体染色試薬は赤色(647 nm)で示しています。画像は、画像解析プラットフォーム上で作成されたXYZ平面ビューで表示されます。スケールバーは100μmを表す。 (A)イメージングは、共焦点イメージングシステムを用いて、倍率4倍で行った。(B)共焦点イメージングシステムを用いて倍率10倍でイメージングを行った こちらをクリックしてダウンロード してください。
補足図2:免疫蛍光染色後のネガティブコントロール画像の例。 一次抗体は省略し、緑色(488 nm)および赤色(647 nm)の二次抗体を免疫染色プロトコルに従って使用しました。画像は、画像解析プラットフォーム上で作成されたXYZ平面ビューで表示されます。スケールバーは100μmを表します。イメージングは、10倍の倍率で共焦点イメージングシステムを使用して行った。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
中枢神経系の正確なモデルの必要性はかつてないほど高まっており、2次元(2D)の従来の細胞培養モデルの限界により、近年、複雑な中枢神経系モデルが生成されています19。しかし、神経細胞タイプとECMの間の相互作用を表す多くの複雑な3Dモデルには、これらのモデルを工業プロセスに適用できない限界があります6,20,21。このプロトコルでは、ヒトiPS細胞由来のニューロンとアストロサイトの3D共培養モデルを開発し、3Dバイオプリンティング技術を使用してこれらの制限のいくつかを解決し、96ウェルおよび384ウェルフォーマットの生理活性ハイドロゲル足場を作成することを目的としています。
これらのモデルを開発するための方法論は、プレートマップ設計ソフトウェア、自動生成された印刷プロトコル、およびバイオプリンターからのガイド付き印刷プロセスによって簡素化されています。ただし、このプロトコルで使用される感受性iPS細胞由来細胞の種類は繊細であるため、融解と培養において以下の重要なステップに注意する必要があります。第一に、ROCK阻害剤(ROCKi)の含有は、バイオプリンティングプロセス全体および初期培養中にいくつかの利点があります。細胞の融解は、ニューロンがストレス反応を経験する可能性のある臨界点であり、不適切な融解プロトコルは生存の可能性を低下させる可能性があります22。通常、細胞を融解し、培地を添加し、細胞をできるだけ効率的にインキュベーター温度まで上昇させることが推奨されます23。但し、このプロトコルで記述されているbioprintingプロセスの間に、ニューロンおよびastrocytesは媒体よりもむしろ活性剤の解決で再懸濁されることが必要であり、細胞は印刷の操業の終わりまで室温より高く上げられない(解凍後30分まで)。したがって、融解直後にROCKiを培地に添加し、2つの遠心分離ステップ(ステップ2.1--2.7および1.3.15-1.3.20)でこれを含めることは、細胞ストレス経路を阻害するために不可欠であり、その結果、生存率レベルが低下します24。さらに、ROCKiは神経突起伸長を促進し、神経細胞の成熟を改善することが示されている25。したがって、ROCKiの補給はバイオプリンティング後48時間継続されます。ただし、細胞をアッセイに使用する前に、その後の培地交換時に完全にウォッシュオフするために、48時間後にROCKi添加物を除去することが不可欠です。
さらに注意が必要なステップは、印刷後のメディアの追加とメディアの交換(ステップ2.8-2.13)です。バイオプリントされたハイドロゲルの足場は、灰白質と同等のわずか1.1 kPaの同等の生体力学的剛性を持っています。ステップ2.10で説明したように、培地の添加および吸引中は、妨害を防ぐためにウェルの側面にピペットで静かに移すことが重要です。これは、ゲルレベルがウェルの総容量に占める割合が高い 384 ウェルプレートに特に関連しています。この方法は、細胞のエッジリフトや神経突起伸長の剪断を防ぐために、2Dコントロールウェルでも使用する必要があります。また、著者らは、iPS細胞由来の細胞培養に使用されるバイオセーフティキャビネットと同等の注意を払って取り扱う必要があるバイオプリンター内の無菌技術の重要性を強調したいと考えています。これには、グリーンライトと印刷手順で使用される70%EtOHおよびdH2Oの滅菌ろ過、バイオプリンターに手を出し入れしながらカートリッジとプレートの蓋を保管すること、印刷前後に70%エタノールワイプでバイオプリンター内の表面を除染することが含まれます。
このモデルを開発するために選ばれたバイオインクと活性剤溶液から形成されたバイオプリントハイドロゲル足場は、RASTRUMバイオプリンターで使用するためにInventia Life Scienceが開発したさまざまなバイオインクと活性剤溶液から選択されています。ラミニンとヒアルロン酸は、軸索誘導、シナプス形成、および神経周囲網の形成における役割により、iPS細胞由来の神経細胞の成熟に関連する分子として同定されました26,27。さらに、低密度のハイドロゲルがニューロンからのより優れた神経突起伸長を可能にすることが示されているため、1.1 kPaの生体力学的剛性が選択されました12。社内または別の商用サプライヤーから分化したニューロンおよびアストロサイトを使用してプロトコルに変更を加える場合は、最も支持的なハイドロゲル足場を決定するためにマトリックス選択試験を行うことが推奨されるであろう15。さらに、最適な生存率を確保し、ハイドロゲルの過密状態を防ぐために細胞源を変更する場合は、細胞密度を最適化する必要もあります。著者らは、バイオプリンター機能に関連するすべての変更とトラブルシューティングについて、メーカーに連絡し、メーカーのプロトコルを参照することを推奨しています。
中枢神経系には、幅広い神経細胞のサブタイプとグリア細胞が含まれており、それらはすべて異なる脳のニッチに存在し、神経機能に寄与する特定の役割を持っています28。この広い範囲の文脈の中で、このモデルは最も豊富な2つの細胞タイプ(星状細胞と興奮性グルタミン酸作動性ニューロン)のみを表しています。ミクログリア、オリゴデンドロサイト、血液脳関門形成内皮細胞などの重要な細胞型は、このシステムから除外されています。ミクログリアを含めることは、神経免疫相互作用に焦点を当てる上で関連性がある可能性があり、オリゴデンドロサイトは中枢髄鞘形成に影響を与える疾患に関心がある可能性があります。病理学におけるそれらの役割に加えて、血液脳関門形成内皮細胞などの細胞は薬物代謝酵素を排泄し、薬物動態アッセイのためのこのモデルの使用に影響を与える可能性があります29。モデルのさらなる制限は、ニューロンに対するアストロサイトの比率である可能性があります。アストロサイトとニューロンの比率は脳領域によって大きく異なり、推奨値は1:1から1:3の間である30,31。このモデルのアストロサイトとニューロンの比率はおおよそ1:1.5です。したがって、このモデルは、白質野など、アストロサイトがより豊富にある脳領域のモデルには関係がない可能性があります30。
近年、3Dバイオプリント共培養モデルを開発するための他のプロトコルが発表されています。Sullivan et al., 2021の論文では、iPS細胞由来の神経前駆細胞を用いた3Dバイオプリントされた神経モデルが発表され、2D培養と比較して、プリント後の高い生存率と神経機能の増強が実証されています32。但し、このプロトコルでは、神経の前駆細胞は細胞源として使用され、4週間培養で維持された。このプロトコルでは、市販のiPS細胞由来のグルタミン酸作動性ニューロンとアストロサイトを使用しました。これにより、共培養細胞の3Dネットワークをわずか7日で確立できます。神経突起増殖解析によって実証されているように、神経突起伸長は24時間以内に始まり、細胞増殖がモニターされた156時間にわたって直線的に継続します。これらのネットワークの急速な確立は、NGN2の最適化されたドキシサイクリン誘導性遺伝子発現を使用するグルタミン酸作動性ニューロンの使用に部分的に起因しており、2D培養でも7日以内に成熟ニューロンサブタイプマーカーの発現を示す33。アッセイ開発には細胞モデルの迅速なターンアラウンドと開発が必要であるため、この技術を使用してこの成長期間を短縮することは、バイオ医薬品業界内でモデルを実装するために重要です15。
結論として、このモデルは、ニューロンとアストロサイトの3Dモデルの可能性を示しており、スクリーニング目的で迅速かつ便利に確立されます。将来的には、このモデルタイプは、さまざまな中枢神経系疾患の創薬活動に応用される可能性があり、患者や遺伝子編集された疾患のiPS細胞株を使用して、さまざまな疾患に拡大する機会があります。さらに、ドキシサイクリン誘導性NGN2発現iPS細胞由来グルタミン酸作動性ニューロンを用いることで、細胞をより短時間で成熟させることができ、神経変性研究のための老化脳モデルの開発に活用することができます。このシステムは、ミクログリアやオリゴデンドロサイトなど、共培養における追加の細胞タイプの使用によっても拡張できます。
Disclosures
CW、NC、JBは、英国ロンドンのMerck Sharp & Dohme (UK) Limitedの従業員です。YHは、Merck & Co., Inc.(米国ニュージャージー州ラーウェイ)の子会社であるMerck Sharp & Dohme LLCの従業員です。
図 1 は Biorender.com を使用して作成されました。
Acknowledgments
著者らは、プロトコルの開発と原稿へのフィードバックに協力してくれたAlex Volkerling、Martin Engel、Rachel Bleachに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 384-well plate | PerkinElmer | 6057300 | |
| 96-well plate | PerkinElmer | 6055300 | |
| Activator fluid F299 | Inventia Life Science | N/A | |
| Activator fluid F3 | Inventia Life Science | N/A | |
| B27 (50x) minus Vit A | Thermofisher | 12587010 | |
| Bioink fluid F261 | Inventia Life Science | N/A | |
| Bioink fluid F32 | Inventia Life Science | N/A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D5207 | |
| GlutaMAX (100x) | Thermofisher | 35050061 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Hoechst | Abcam | ab228551 | |
| Human BDNF Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7074 | |
| Human NT3 Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7036 | |
| iCell Astrocytes | Fujifilm CDI | 1434 | |
| INCell Analyser 6500HS | Molecular Devices | N/A | high content imaging system |
| Incucyte S3 | Sartorius | N/A | |
| ioGlutamatergic Neurons (Large vial) | Bit.bio | e001 | |
| Laminin (1 mg/mL) | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Neurobasal media | Thermofisher | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Abcam | ab7475 | |
| NucBlue Live (Hoechst 33342) | Thermofisher | R37605 | |
| Opti-MEM | Thermofisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PEI 50% in H2O | Sigma Aldrich | 181978 | |
| Pierce Borate Buffer 20x | Thermofisher | 28341 | |
| Prism | GraphPad | Data analysis software | |
| Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) | Abcam | ab206293 | |
| RASTRUM(TM) Bioprinter | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter |
| RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter Cartridges |
| RASTRUM(TM) Targeting plate | Inventia Life Science | N/A | Targeting plate |
| Rho kinase (ROCK) inhibitor | Abcam | ab120129 | |
| Sheep anti-GFAP NL493 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Signals Image Artist | PerkinElmer | N/A | Image analysis platform |
| Triton X-100 | Thermofisher | HFH10 | |
| Zeiss Axio Observer | Zeiss | N/A | Inverted microscope platform |
References
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