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Neuroscience

स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए मानव IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट Cocultures के तीन आयामी bioprinting

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65856
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1MSD Research Laboratories, London, UK, 2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

Summary

यहाँ, हम IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और astrocytes के 3 डी bioprinted coculture का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. 96- या 384-अच्छी तरह से प्रारूपों में हाइड्रोजेल मचान के भीतर उत्पन्न यह कॉकल्चर मॉडल, 7 दिनों के भीतर उच्च पोस्ट-प्रिंट व्यवहार्यता और न्यूराइट प्रकोप को प्रदर्शित करता है और दोनों सेल प्रकारों के लिए परिपक्वता मार्करों की अभिव्यक्ति दिखाता है।

Abstract

एक सेल मॉडल के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए व्यवहार्य होने के लिए, सिस्टम को एक कुशल विकास समय होने के साथ-साथ थ्रूपुट और समरूपता आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए। हालांकि, कई प्रकाशित 3D मॉडल इन मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं। इसलिए, यह प्रारंभिक दवा खोज अनुप्रयोगों में उनकी उपयोगिता को सीमित करता है। त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग एक नई तकनीक है जिसे विकास के समय में तेजी लाने, मानकीकरण बढ़ाने और थ्रूपुट बढ़ाने के लिए 3 डी मॉडल के विकास पर लागू किया जा सकता है। यहाँ, हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के 3 डी bioprinted coculture मॉडल विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत (IPSC)-व्युत्पन्न glutamatergic न्यूरॉन्स और astrocytes. ये सहसंस्कृति बायोएक्टिव पेप्टाइड्स, पूर्ण लंबाई वाले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड हैं, और 1.1 केपीए की शारीरिक कठोरता के साथ। मॉडल को 96-अच्छी तरह से और 384-अच्छी तरह से प्रारूपों में तेजी से स्थापित किया जा सकता है और 72% की औसत पोस्ट-प्रिंट व्यवहार्यता पैदा करता है। इस मॉडल में एस्ट्रोसाइट-टू-न्यूरॉन अनुपात 1: 1.5 दिखाया गया है, जो मानव मस्तिष्क के लिए शारीरिक सीमा के भीतर है। ये 3 डी बायोप्रिंटेड सेल आबादी परिपक्व तंत्रिका कोशिका प्रकार मार्करों की अभिव्यक्ति और संस्कृति के 7 दिनों के भीतर न्यूराइट और एस्ट्रोसाइट अनुमानों की वृद्धि भी दिखाती है। नतीजतन, यह मॉडल न्यूराइट आउटग्रोथ परख के साथ सेल रंजक और इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। पैमाने पर इन शारीरिक रूप से प्रतिनिधि मॉडल का उत्पादन करने की क्षमता उन्हें तंत्रिका विज्ञान लक्ष्यों के लिए मध्यम से उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख में उपयोग के लिए आदर्श बनाती है।

Introduction

दवा खोज उद्योग में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों में अनुसंधान का विस्तार हो रहा है1. हालांकि, मिर्गी, एक प्रकार का पागलपन, और अल्जाइमर रोग के रूप में कई प्रचलित सीएनएस रोगों अभी भी कोई उपचारात्मक उपचार2,3,4 है. सीएनएस रोगों में प्रभावी चिकित्सा विज्ञान की कमी, कम से कम भाग में, मस्तिष्क5 के इन विट्रो मॉडल में सटीक की कमी के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इसके परिणामस्वरूप इन विट्रो मॉडल और विवो डेटा में वर्तमान और अनुसंधान प्रयासों में बाद में अड़चन के बीच एक अनुवाद संबंधी अंतर हुआ है।

इस अनुवाद अंतर से प्रेरित, हाल के वर्षों के भीतर उपन्यास 3 डी सेल मॉडल के विकास में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है, जिसमें तंत्रिका ऑर्गेनोइड्स, न्यूरोस्फेरॉइड और मचान-आधारित मॉडल6 शामिल हैं। इन मॉडलों की 3 डी संरचना तंत्रिका माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: व्यवस्थित करने में सहायता करती है, जिसमें बायोमेकेनिकल तनाव, सेल-सेल संपर्क और मस्तिष्क बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम)7शामिल हैं। मस्तिष्क ईसीएम न्यूरोफिज़ियोलॉजी का एक गतिशील तत्व है जो न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और न्यूरोवास्कुलर यूनिट7 सहित तंत्रिका कोशिका प्रकारों के बीच की जगह पर कब्जा कर लेता है। मस्तिष्क ईसीएम के पुनर्पूंजीकरण को न्यूरोनल आकृति विज्ञान और न्यूरोनल फायरिंग को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, और मस्तिष्क के कई जटिल 3 डी मॉडल ने तंत्रिका कोशिका प्रकार 8,9,10,11द्वारा ईसीएम प्रोटीन के जमाव का प्रदर्शन किया है। मचान-आधारित मॉडल में एक झरझरा सिंथेटिक या जैविक हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में निलंबित परिपक्व तंत्रिका सहसंस्कृति होते हैं जो मस्तिष्क ईसीएम12 का प्रतिनिधित्व करते हैं। ऑर्गेनॉइड और स्फेरॉइड सिस्टम के विपरीत, मचान आधारित 3 डी मॉडल मौजूद ईसीएम प्रोटीन के अनुकूलन की अनुमति देते हैं और बायोमेकेनिकल तनाव13,14की नकल करने के लिए हाइड्रोजेल कठोरता की ट्यूनेबिलिटी का अतिरिक्त लाभ होता है।

हालांकि 3 डी तंत्रिका मॉडल का एक भारी बहुमत मस्तिष्क microenvironment की एक वृद्धि हुई पुनरावृत्ति का प्रदर्शन, नहीं सभी मॉडल अच्छी तरह से दवा की खोज अनुप्रयोगों15 को लागू करने के लिए अनुकूल हैं. एक 3 डी मॉडल औद्योगिक प्रक्रियाओं में लागू किया जा करने के लिए, प्रणाली स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए थ्रूपुट आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए और एक अपेक्षाकृत कम विकास समय16. 3 डी बायोप्रिंटिंग एक उपन्यास तकनीक है जो मानव त्रुटि17 के कारण परिवर्तनशीलता को हटाने के साथ-साथ तेजी से विकास समय, बढ़ी हुई थ्रूपुट और सटीक नियंत्रण के उच्च स्तर के साथ 3 डी मचान-आधारित तंत्रिका मॉडल बनाने की क्षमता प्रदान करती है। यह प्रोटोकॉल एक हाइड्रोजेल मचान में मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स का एक 3 डी कोकल्चर मॉडल प्रस्तुत करता है। इस हाइड्रोजेल मचान में शारीरिक रूप से प्रतिनिधि बायोएक्टिव पेप्टाइड्स (RGD, IKVAV, YIGSR) और ECM प्रोटीन एक नकली बायोमैकेनिकल कठोरता के भीतर होते हैं। इन पूर्ण लंबाई ईसीएम प्रोटीन पूर्ण लंबाई laminin-211 और hyaluronic एसिड, मानव प्रांतस्था में प्रचुर मात्रा में शामिल, विवो माप18 में के साथ लाइन में 1.1 kPa की कठोरता के साथ. इस मॉडल को दवा की खोज के लिए व्यावहारिकता के साथ डिज़ाइन किया गया है, और न्यूराइट आउटग्रोथ परख के साथ-साथ सेल रंजक और एंटीबॉडी के साथ इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके स्क्रीनिंग विश्लेषण के लिए उपयुक्त 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग करके बनाया गया है। कोशिकाएं तंत्रिका कोशिका प्रकार मार्करों की अभिव्यक्ति और संस्कृति के 7 दिनों के भीतर न्यूराइट और एस्ट्रोसाइटिक अनुमानों की वृद्धि दिखाती हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल दवा खोज अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए एक उच्च throughput 3 डी तंत्रिका coculture मॉडल विकसित करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करेंगे.

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी बायोप्रिंट कॉकल्चर के लिए उपयोग की जाने वाली कार्यप्रणाली का निदर्शी अवलोकन। मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को बायोएक्टिव पेप्टाइड्स युक्त एक्टिवेटर और बायोइंक समाधान के साथ जोड़ा जाता है और ड्रॉप-ऑन-डिमांड बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्रारूपों में हाइड्रोजेल मचानों के लिए बायोप्रिंट किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. 3D मॉडल की बायोप्रिंटिंग

  1. प्लेट मैप और प्रिंट फ़ाइल जनरेट करना
    1. मॉडल पीढ़ी से पहले, प्लेट मैप सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्लेट मैप, प्रोटोकॉल और प्रिंट फ़ाइल उत्पन्न करें। प्लेट मैप सॉफ्टवेयर खोलें और 3 डी विकल्प में संस्कृति कोशिकाओं का चयन करें।
    2. ड्रॉप-डाउन मेनू पर उपलब्ध विकल्पों में से बायोप्रिंट किए जाने वाले मॉडल प्रकार का चयन करें; इस मॉडल को इमेजिंग मॉडल और एचटीपी मॉडल प्रारूपों में मान्य किया गया है। 96 अच्छी तरह से प्लेटों और 384 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए HTP के लिए इमेजिंग मॉडल का चयन करें.
    3. मैट्रिक्स चयन विंडो में, हाइड्रोजेल Px02.53 का चयन करें, जिसमें IKVAV, RGD और YIGSR पेप्टाइड्स के साथ लैमिनिन -211 और हाइलूरोनिक एसिड प्रोटीन शामिल हैं।
    4. पॉप-अप विंडो में, ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के रूप में सेल प्रकारों को दर्ज करें और सेल घनत्व को 20 मिलियन कोशिकाओं /
    5. ऑन-स्क्रीन प्लेट पर कुओं को हाइलाइट करके वांछित प्लेट मानचित्र डिजाइन करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। डिजाइन में प्लास्टिक पर 2 डी नियंत्रण की कम से कम 1 पंक्ति शामिल करें। प्लास्टिक के कुओं पर 2 डी नियंत्रण में बिना किसी हाइड्रोजेल मचान के सीधे कुएं में जमा कोशिकाएं होती हैं; चरण 1.2 के अनुसार इन कुओं को कोट करें।
    6. सुनिश्चित करें कि विंडो के शीर्ष पर सूचीबद्ध प्लेट मॉडल को उपयोग के लिए इच्छित प्लेट मॉडल में बदल दिया गया है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    7. डाउनलोड बटन का उपयोग करके प्लेट मैप के लिए प्रोटोकॉल और प्रिंट फ़ाइल डाउनलोड करें और उन्हें बायोप्रिंटर-लिंक्ड कंप्यूटर पर सहेजें।
  2. प्लास्टिक के कुओं पर 2 डी नियंत्रण की कोटिंग
    1. मुद्रण से पहले कम से कम 24 घंटे, सेल पालन और विकास के लिए 2 डी नियंत्रण मॉडल के लिए कुओं कोट. 3 डी मॉडल कुओं को किसी भी पूर्व-कोटिंग की आवश्यकता नहीं होती है। सभी प्रक्रियाओं को जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना है जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो। प्लेटों को लेपित किया जा सकता है और मुद्रण से 7 दिन पहले तक तैयार किया जा सकता है।
    2. बाँझ डीएच2ओ के 47.5 एमएल के साथ 20x बोरेट स्टॉक समाधान के 2.5 एमएल को पतला करके 1x बोरेट बफर के 50 एमएल बनाएं।
    3. 0.1% (w/v) PEI समाधान और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर बनाने के लिए 50% (w/v) पॉलीथीनमाइन (PEI) के 50 mL में 1x बोरेट बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    4. प्रत्येक 2D नियंत्रण में 0.1% (w/v) PEI समाधान अच्छी तरह से जोड़ें, जैसा कि चरण 1.1 में उत्पन्न प्लेट मानचित्र द्वारा दर्शाया गया है। 100 μL/अच्छी तरह से जोड़ें अगर एक 96 अच्छी तरह से थाली या 25 डिग्री / अच्छी तरह से अगर एक 384 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर.
    5. 0.1% (डब्ल्यू/वी) पीईआई समाधान की महाप्राण से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें और पीबीएस के साथ कुओं को 5x धोएं। जैव सुरक्षा कैबिनेट में कुओं को पूरी तरह से सूखने दें।
    6. न्यूरोबेसल माध्यम के 5 एमएल में 1 मिलीग्राम/एमएल लेमिनिन समाधान के 100 माइक्रोन को पतला करें। प्रत्येक 2 डी नियंत्रण में 100 माइक्रोन जोड़ें यदि 96-अच्छी प्लेट या 25 माइक्रोन का उपयोग कर रहे हैं यदि 384-अच्छी प्लेट का उपयोग कर रहे हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए सेते हैं.
    7. यदि प्लेटों का भंडारण करते हैं, तो इनक्यूबेशन के बाद लेमिनिन समाधान को छोड़ दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।  उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेटों को पहले से गरम करें।
  3. सहसंस्कृति मॉडल की 3 डी बायोप्रिंटिंग
    1. बायोप्रिंटर का उपयोग करते समय हमेशा एक बाँझ तकनीक बनाए रखें, और प्रिंटर के अंदर डालने से पहले दस्ताने, कारतूस और कल्चर प्लेटों को 70% EtOH से पोंछ लें। जब तक अन्यथा न कहा गया हो, जैव सुरक्षा कैबिनेट में बायोप्रिंटर के बाहर सभी प्रक्रियाएं करें।
    2. बायोप्रिंटर के लिए कंप्रेसर चालू करें और बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर पर इनिशियलाइज़ बटन का चयन करके प्रिंटर को इनिशियलाइज़ करें। एक बार प्रिंटर में एयरफ्लो शुरू हो जाने के बाद, प्रिंटर के अंदर की सतहों को 70% EtOH वाइप से पोंछ लें।
    3. मुद्रण के दिन, प्रिंट रन के लिए सही नोजल स्थिति सुनिश्चित करने के लिए निर्देशित दिन ग्रीनलाइटिंग प्रक्रिया की शुरुआत करें (न्यूनतम नोजल स्थिति 2A2B)।
    4. बाँझ पैकेजिंग से एक बायोप्रिंटर कारतूस लें, डिब्बे ए में बाँझ डीएच2ओ के 20 एमएल जोड़ें, और डिब्बों बी 1-4 में बाँझ-फ़िल्टर किए गए 70% ईटीओएच के 6 एमएल जोड़ें। बायोप्रिंटर के अंदर बाएं हाथ के कारतूस धारक में कारतूस डालें और प्लेट ढक्कन को समर्पित ढक्कन धारक में रखें।
    5. सॉफ़्टवेयर होम स्क्रीन पर ग्रीनलाइटिंग बटन का चयन करें और सॉफ़्टवेयर पर पुष्टि करें कि बायोप्रिंटर के भीतर कारतूस जगह पर है और ढक्कन हटा दिया गया है। ग्रीनलाइटिंग प्रक्रिया आरंभ करें।
    6. सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत दिए जाने पर, पुष्टि करें कि बाईं या दाईं सुइयों से कोई सुसंगत ड्रिप नहीं देखी जा सकती है। इसके बाद, सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत दिए जाने पर, पुष्टि करें कि B7 और B8 डिब्बों में पानी मौजूद है।
    7. बायोप्रिंटर ने स्व-निर्देशित ग्रीनलाइटिंग चरण पूरा करने के बाद, एक अनकोटेड बाँझ 96-अच्छी तरह से फ्लैट बॉटम प्लेट (बायोप्रिंटिंग कॉकल्चर के लिए लेपित प्लेट से अलग) डालें और इस नई प्लेट को बायोप्रिंटर के दाहिने प्लेट धारक अनुभाग में डालें जब सॉफ्टवेयर द्वारा संकेत दिया जाए। सुनिश्चित करें कि प्लेट धारक हाई प्रोफाइल प्लेट पर सेट है, और ढक्कन को हटा दिया गया है और अगला चरण शुरू करने से पहले समर्पित ढक्कन धारक में रखा गया है।
    8. बायोप्रिंटर 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में पानी की बूंदों को जमा करेगा। एक बार पूरा हो जाने पर, बायोप्रिंटर से प्लेट रखें और पुष्टि करें कि प्लेट के प्रत्येक कुएं में पानी की बूंदें मौजूद हैं।
    9. ग्रीनलाइटिंग के लिए उपयोग की जाने वाली 96-वेल प्लेट का निपटान करें और बायोप्रिंटर को ग्रीनलाइटिंग प्रक्रिया को पूरा करने की अनुमति दें। एक बार पूरा हो जाने पर, सॉफ्टवेयर बायोप्रिंटर की नोजल स्थिति बताएगा और पुष्टि करेगा कि बायोप्रिंटर मॉडल प्रिंट करने के लिए तैयार है। ढक्कन को प्रिंट कार्ट्रिज पर रखें और अगले चरणों के लिए इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट में हटा दें।
    10. बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, प्रिंट रन सॉफ्टवेयर बटन का उपयोग करके सॉफ्टवेयर में प्रिंट फाइल (चरण 1.1 में उत्पन्न) लोड करें और प्रिंट प्रोटोकॉल पीडीएफ खोलें।
    11. बायोइंक और एक्टिवेटर तरल पदार्थ प्राप्त करें, जैसा कि प्रिंट प्रोटोकॉल पीडीएफ पर संकेत दिया गया है, -20 डिग्री सेल्सियस से और 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर पिघलना। हाइड्रोजेल मैट्रिक्स Px02.53 के लिए इसमें शामिल होंगे: 1x शीशी F32, 1xvial F3, 1x शीशी F261, 1x शीशी F299। बायोइंक और एक्टिवेटर तरल पदार्थ को हाथों या पानी के स्नान में न पिघलाएं।
    12. डॉक्सीसाइक्लिन और रॉक इनहिबिटर (पूर्ण मीडिया + डॉक्स/रॉकी) (चरण 2.2 देखें) के साथ पूर्ण मीडिया के 50 एमएल को आरटी में लाएं, जबकि बायोइंक और एक्टिवेटर तरल पदार्थ पिघल रहे हैं।
    13. एक बार बायोइंक और एक्टिवेटर गल जाने के बाद, उत्पन्न प्रिंट प्रोटोकॉल पीडीएफ के अंतिम दो पृष्ठों पर निर्देश के अनुसार प्रिंटिंग कार्ट्रिज तैयार करें। मॉडल प्रिंटिंग चरणों के लिए ग्रीनलाइटिंग प्रिंटर कार्ट्रिज का पुन: उपयोग किया जाएगा।
      1. सुनिश्चित करें कि डिब्बे A1 में dH2O के 40 mL और डिब्बे B1 और B2 में 70% EtOH के 8 mL हैं। एक्टिवेटर F32 के 1.2 एमएल को C1 में, F3 के 1.2 एमएल को C2 में और F261 के 200 माइक्रोन को C4 में जोड़ें।
      2. इनक्यूबेटर से पीईआई और लेमिनिन-लेपित प्लेट को पुनः प्राप्त करें और इसे प्रिंटर के अंदर दाहिने प्लेट धारक डिब्बे में रखें। इस बिंदु पर कुओं से लैमिनिन-मीडिया समाधान को न निकालें। सुनिश्चित करें कि प्लेट होल्डर कम्पार्टमेंट लो प्रो पर सेट हैfile प्लेट और ढक्कन हटा दिया गया है और ढक्कन होल्डर में है।
    14. प्रिंट कार्ट्रिज को बायोप्रिंटर में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ढक्कन हटा दिया गया है और धारक में रखा गया है, और बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर पर प्रिंट इनर्ट बेस बटन का चयन करके सॉफ्टवेयर पर प्रिंट रन शुरू करें।
    15. जबकि निष्क्रिय आधार मुद्रण कर रहा है, तरल नाइट्रोजन भंडारण, पिघलना से ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की शीशियों को पुनः प्राप्त करें, और धारा 2 में दिए गए निर्देशों के अनुसार फिर से निलंबित करें।
    16. एक बार कोशिकाओं thawed रहे हैं, और पूरा मीडिया + DOX/ROCKi के 8 एमएल अलग से (धारा 2 के अनुसार) प्रत्येक सेल प्रकार के लिए जोड़ा गया है, आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    17. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और पूरा मीडिया + DOX/ROCKi के 1 एमएल में अलग से दोनों सेल प्रकार respend.
    18. सेल निलंबन के 20 माइक्रोन को ट्रिपैन ब्लू के 20 माइक्रोन में जोड़ें और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए प्रति एमएल व्यवहार्य सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गिनती करने से पहले मिलाएं।
    19. 15 एमएल ट्यूब में 1 मिलियन एस्ट्रोसाइट्स के साथ कुल 3 मिलियन ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स को मिलाएं। 8 एमएल की कुल मात्रा बनाने के लिए मीडिया जोड़ें।
    20. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    21. सेल गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें और एक्टिवेटर द्रव F299 के 200 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    22. ध्यान दें कि उत्प्रेरक द्रव चिपचिपा है; पिपेट ऊपर और नीचे पूरी तरह से गोली resuspended करने के लिए. सेल प्रकार नाजुक हैं; एक विस्तृत बोर विंदुक टिप और रिवर्स pipetting तकनीक का उपयोग करके बाल काटना और बुलबुले को कम. पिपेट ऊपर और नीचे मजबूती से सेल हानि को रोकने के लिए 3 बार से अधिक नहीं.
    23. एक बार अक्रिय आधार चरण मुद्रण समाप्त हो जाने के बाद, कारतूस और संस्कृति प्लेट पर ढक्कन रखें, बायोप्रिंटर से दोनों को हटा दें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें।
    24. प्रिंट कार्ट्रिज के C200 में F299 में सेल सस्पेंशन के 3 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें, कार्ट्रिज को बायोप्रिंटर में फिर से डालें, ढक्कन को हटा दें और इसे ढक्कन होल्डर में रखें। अभी तक संस्कृति थाली पुन: सम्मिलित न करें.
    25. प्रिंट रन के प्रिंट मॉडल चरण को शुरू करें। जबकि बायोप्रिंटर तरल पदार्थ भड़का रहा है, प्लेट के 2 डी नियंत्रण कुओं से लैमिनिन-मीडिया समाधान को हटा दें और इसे प्रत्येक 2 डी नियंत्रण में पूर्ण मीडिया + डॉक्स / रॉकी के 150 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से बदलें यदि 96-अच्छी प्लेट का उपयोग कर रहे हैं और 50 माइक्रोन पूर्ण मीडिया + डॉक्स / रॉकी यदि 384-अच्छी प्लेट का उपयोग कर रहे हैं।
    26. तरल पदार्थ प्राइम होने के बाद, बायोप्रिंटिंग लक्ष्यीकरण प्लेट को बायोप्रिंटर में डालें, ढक्कन को हटा दें, और इसे ढक्कन धारक में रखें।
    27. बायोप्रिंटर लक्ष्यीकरण प्रक्रिया शुरू करें।
      1. बायोप्रिंटिंग सॉफ्टवेयर द्वारा संकेत दिए जाने पर, बायोप्रिंटर से लक्ष्यीकरण प्लेट को हटा दें।
      2. यह चुनने के लिए गाइड का उपयोग करें कि प्लेट पर बूंदों को कहां देखा जा सकता है। बायोप्रिंटर में लक्ष्यीकरण प्लेट को फिर से डालें और छोटी बूंद मुद्रण और चयन प्रक्रिया को दोहराएं।
      3. जब संकेत दिया जाए, तो फिर लक्ष्यीकरण प्लेट को हटा दें, फिर इसे सेल कल्चर प्लेट (चरण 1.3.25 के अनुसार 2 डी नियंत्रण कुओं में मीडिया युक्त) के साथ बदलें। सुनिश्चित करें कि कल्चर प्लेट का ढक्कन बंद है और होल्डर में रखा गया है। बायोप्रिंटर मॉडल प्रिंटिंग खत्म कर देगा।
    28. एक बार मॉडल मुद्रण पूरा हो गया है, कुओं के लिए मीडिया जोड़ने के लिए खंड 2 (चरण 2.8) में सेल संस्कृति विधियों का पालन करें.
    29. बायोप्रिंटर सफाई प्रक्रिया शुरू करें और, एक बार पूरा होने पर, प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार कारतूस और शेष तरल पदार्थों का निपटान करें।

2. सेल संस्कृति

  1. मॉडल glutamatergic न्यूरॉन्स के 1x शीशी (शीशी प्रति >5 लाख कोशिकाओं) और astrocytes के 1x शीशी (शीशी प्रति 1x शीशी) >1 लाख कोशिकाओं) का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं.
  2. पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
  3. सूखी बर्फ पर प्रयोगशाला में कोशिकाओं के दोनों शीशियों को परिवहन करें और सूखी बर्फ से हटाने के तुरंत बाद पानी के स्नान में डूब जाएं। दोनों शीशियों को एक साथ पिघलाएं।
  4. पानी के स्नान से शीशियों निकालें जब केवल एक छोटा बर्फ क्रिस्टल रहता है; यह विसर्जन के बाद लगभग 3 मिनट लगेंगे. पानी के स्नान में कोशिकाओं को घुमाएं या मिश्रण न करें।
  5. शीशियों को 70% EtOH के साथ स्प्रे करें और उन्हें जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें।
  6. प्रत्येक निलंबन को अलग-अलग 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक शीशी में पूर्ण मीडिया + डॉक्स/रॉकी ड्रॉपवाइज के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  7. 8 एमएल के लिए प्रत्येक ट्यूब में मीडिया ऊपर और 1.3 कदम के अनुसार bioprinting कदम के साथ आगे बढ़.
  8. बायोप्रिंटिंग मॉडल (चरण 1.3) के बाद, तुरंत सभी 3 डी कॉकल्चर कुओं में पूर्ण मीडिया + डॉक्स / रॉकी जोड़ें और मॉडल को 37 ओसी और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में रखें। यदि 96-अच्छी प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रति अच्छी तरह से मीडिया के 150 माइक्रोन जोड़ें; यदि 384-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रति अच्छी तरह से मीडिया के 50 माइक्रोन का उपयोग करें।
  9. संस्कृति के पहले 48 घंटे के लिए कोई मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है।
  10. 2 डी नियंत्रण और मॉडल पर मीडिया परिवर्तन करते समय, यांत्रिक तनाव को प्रेरित करने से रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जो 2 डी संस्कृतियों को अलग कर सकती है या हाइड्रोजेल के विरूपण का कारण बन सकती है। मीडिया आकांक्षा प्रदर्शन और इसके अलावा धीरे-धीरे एक micropipette कुएं के पक्ष की ओर इशारा करते हुए का उपयोग कर.
  11. 48 घंटे के बाद, सभी कुओं पर 90% मीडिया परिवर्तन करें और मीडिया संरचना से रॉकी को हटा दें (चरण 2.14 देखें)।
  12. 96 घंटे के बाद, मीडिया संरचना (2.14 कदम देखें) से DOX को हटाने के लिए सभी कुओं पर एक और 90% मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन.
  13. 48 घंटे और 96 घंटे में दो 90% मीडिया परिवर्तनों के बाद, हर 48 घंटे में 50% मीडिया परिवर्तन करें, जहां 50% मीडिया को महाप्राण किया जाता है और ताजा पूर्ण मीडिया के साथ बदल दिया जाता है
  14. मीडिया संरचना:
    1. पूरा मीडिया: 1x GlutaMAX, 1x B27, 12.5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF के साथ न्यूरोबेसल मीडिया।
    2. पूर्ण मीडिया प्लस डॉक्सीसाइक्लिन (DOX): 1x GlutaMAX, 1x B27, 12.5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/mL neurotrophin-3 (NT3), 5 ng/μL मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF), और 1 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन के साथ न्यूरोबेसल मीडिया।
    3. पूरा मीडिया प्लस DOX/ROCK अवरोधक (ROCKi): 1x GlutaMAX, 1x B27, 12.5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/mL doxycycline, और 10 μM ROCK अवरोधक के साथ न्यूरोबेसल मीडिया।

3. न्यूराइट विकास विश्लेषण

  1. मीडिया पोस्ट-बायोप्रिंटिंग के अलावा तुरंत ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए एक लाइव सेल माइक्रोस्कोप में कोशिकाओं को रखें।
  2. कम से कम 7 दिनों के लिए हर 12 घंटे में, 2 डी नियंत्रण सहित, हर कुएं में 4x बढ़ाई पर imaged किया जा करने के लिए कोशिकाओं अनुसूची करने के लिए खुर्दबीन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
  3. मीडिया परिवर्तन हर 48 घंटे बाहर ले जाने, के रूप में खंड 2 में विस्तृत, मीडिया परिवर्तन के बाद खुर्दबीन में कोशिकाओं को वापस रखने हर बार बदल जाता है.
  4. 7 दिनों के डेटा के बाद, सॉफ़्टवेयर से छवियों को .jpg प्रारूप में निर्यात करें
  5. सभी .jpg छवियों को ImageJ सॉफ़्टवेयर में आयात करें और फ़ाइलों को 8-बिट प्रारूप में परिवर्तित करें। न्यूरॉन जे प्लगइन लोड करें और ट्रेसिंग टूल का उपयोग करके शाखा बिंदुओं सहित छवियों में न्यूराइट वृद्धि का पता लगाएं।
  6. समय के साथ न्यूराइट प्रकोप की साजिश रचने के लिए न्यूरॉनजे से उत्पन्न न्यूराइट ट्रेसिंग डेटा का उपयोग करें।

4. सेल व्यवहार्यता विश्लेषण

  1. संस्कृति में हर 24-घंटे समय बिंदु पर, एक जीवित / मृत व्यवहार्यता किट का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए 3 या अधिक कुओं को दाग दें। अध्ययन की अवधि के लिए 24 घंटे या 48 घंटे समय अंक पर इस कदम को दोहराएँ.
  2. लाइव सेल अभिकर्मक (1x Calcein-AM) और मृत सेल अभिकर्मक (1x ethidium homodimer-1) और 1x लाइव सेल परमाणु दाग (Hoechst 33342) फिनोल लाल (Opti-MEM) के बिना कम सीरम मीडिया के 10 एमएल में इमेजिंग से पहले 30 मिनट निलंबित करके जीवित / मृत अभिकर्मक मीडिया तैयार करें। लाइव / मृत अभिकर्मक मीडिया आरटी के लिए आते हैं प्रतिदीप्ति विरंजन के कारण प्रत्यक्ष प्रकाश से बाहर रहते / मृत अभिकर्मक मीडिया स्टोर करें.
  3. सेल मॉडल/2 डी नियंत्रण युक्त 3 कुओं से मीडिया निकालें, ध्यान से जेल गड़बड़ी को रोकने. आरटी बाँझ पीबीएस के साथ एक बार सेल मॉडल धो लें. 96-वेल प्लेट के लिए प्रत्येक कुएं में लाइव/मृत अभिकर्मक मीडिया के 100 माइक्रोन या 384-वेल प्लेट के लिए 25 माइक्रोन जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 30 मिनट के लिए मॉडल सेते हैं.
  5. इनक्यूबेशन बाद, मॉडल इमेजिंग के लिए तैयार हैं। लाल (647 एनएम, मृत कोशिकाओं), हरे (488 एनएम, जीवित कोशिकाओं), और नीले (405 एनएम, परमाणु दाग) उत्तेजना चैनलों के साथ किसी भी मानक माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग प्रदर्शन करें। 3D मॉडल में सर्वोत्तम परिणामों के लिए, उच्च-सामग्री कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि मॉडल और 4x या 10x आवर्धन पर Z-स्टैक फ़ंक्शन का उपयोग करके इमेजिंग करें।
    नोट: इस अध्ययन में, सेल मॉडल INCell विश्लेषक 6500HS (उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम) का उपयोग imaged थे, और विश्लेषण संकेत छवि कलाकार (छवि विश्लेषण मंच, 4.7 कदम देखें) का उपयोग किया गया था.
  6. इमेजिंग पूरा होने के बाद, सेल मॉडल को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लौटाएं। हालांकि, दीर्घकालिक व्यवहार्यता पर लाइव/मृत अभिकर्मक मीडिया के कारण आगे के अध्ययनों से व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल मॉडल को छोड़ दें।
  7. छवि विश्लेषण मंच पर छवियों का विश्लेषण
    1. सॉफ्टवेयर में जेड-स्टैक छवि के प्रत्येक विमान का चयन करें। विमान छवियों को अधिकतम-तीव्रता प्रक्षेपण छवि के रूप में मिलाएं।
    2. 488 एनएम पर लाइव सेल चैनल से प्रतिदीप्ति की पहचान करके ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के रूप में बायोप्रिंटेड मॉडल का चयन करके एक नया विश्लेषण बनाएं (सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को आरओआई के तहत चुना गया है)।
    3. ब्याज के क्षेत्र के भीतर, परमाणु दाग चैनल (405 एनएम) के माध्यम से आरओआई में कोशिकाओं की संख्या की पहचान करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, 488 एनएम चैनल का उपयोग कर आरओआई में जीवित कोशिकाओं की संख्या, और आरओआई में मृत कोशिकाओं की संख्या 647 एनएम चैनल का उपयोग कर.
    4. सभी लाइव/मृत उपचारित सेल मॉडल कुओं पर विश्लेषण चलाएं और आरओआई क्षेत्र, कुल सेल नंबर, जीवित कोशिकाओं की संख्या और मृत कोशिकाओं की संख्या युक्त डेटा तालिका निर्यात करें।
    5. प्रति विश्लेषण दिन कुल सेल संख्या के प्रतिशत के रूप में जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।

5. इम्यूनोस्टेनिंग और सेल जनसंख्या विश्लेषण

  1. निर्धारण से पहले, सेल मॉडल से मीडिया को हटा दें और पीबीएस में एक बार मॉडल धो लें।
  2. 20 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में 4% (वी / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ सभी काम प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार किए जाने चाहिए।
  3. मॉडल से एस्पिरेट 4% (वी/वी) पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान और पैराफॉर्मलडिहाइड को पूरी तरह से हटाने के लिए पीबीएस में मॉडल को चार बार धोएं।
  4. आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन-एक्स के साथ सेल मॉडल को पारगम्य करें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  5. आरटी पर 3 घंटे के लिए 10% (वी / वी) सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) का उपयोग करके सेल मॉडल को ब्लॉक करें।
  6. अवरुद्ध समाधान निकालें और मॉडल में प्राथमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में 1% वी/वी एनडीएस में पतला) जोड़ें। यदि सेल जनसंख्या अनुपात विश्लेषण (चरण 5.11 देखें) कर रहे हैं, तो सेल मॉडल को शामिल करना सुनिश्चित करें जो Β-III ट्यूबुलिन (लाल AF647 संयुग्मन के साथ) और GFAP (हरे AF488 संयुग्मन के साथ) के लिए सह-दाग हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मॉडल सेते हैं।
  7. प्राथमिक इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस में तीन बार संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग वाले मॉडल को धो लें और 30 मिनट के लिए 20 माइक्रोन होचस्ट के साथ काउंटरस्टेन करें। चरण 5.10 में विस्तृत के रूप में छवि।
  8. पीबीएस में तीन बार असंगत प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग वाले मॉडल को धोएं और माध्यमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में 1% वी / वी एनडीएस में पतला) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  9. पीबीएस में तीन बार धोने से माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, और इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए 20 माइक्रोन Hoechst के साथ counterstain मॉडल.
  10. लाल (647 एनएम) और हरे (488 एनएम) उत्तेजना चैनलों के साथ मानक सूक्ष्मदर्शी पर इमेजिंग प्रदर्शन. हालांकि, 3 डी मॉडल में सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक उच्च-सामग्री कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि मॉडल और 4x या 10x आवर्धन पर जेड-स्टैक फ़ंक्शन का उपयोग करके इमेजिंग करें।
  11. छवि विश्लेषण मंच पर सेल जनसंख्या अनुपात का विश्लेषण
    1. GFAP (AF488 संयुग्मन के साथ) और Β-III ट्यूबुलिन (AF647 संयुग्मन के साथ) के लिए सह-दाग वाले मॉडल का उपयोग करके सेल आबादी का विश्लेषण प्राप्त करें।
    2. सॉफ्टवेयर में जेड स्टैक छवि के प्रत्येक विमान का चयन करें और एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि के रूप में विमान छवियों गठबंधन.
    3. 647 एनएम पर Β-III ट्यूबुलिन चैनल से प्रतिदीप्ति की पहचान करके आरओआई के रूप में बायोप्रिंटेड मॉडल का चयन करके एक नया विश्लेषण बनाएं (सुनिश्चित करें कि सभी सेल युक्त क्षेत्र आरओआई के तहत चुने गए हैं)।
    4. आरओआई के भीतर, होचस्ट चैनल (405 एनएम) में कोशिकाओं की संख्या, 488 एनएम चैनल का उपयोग करके आरओआई में जीएफएपी + एस्ट्रोसाइट्स की संख्या, और आरओआई में Β-III ट्यूबुलिन + कोशिकाओं की संख्या की पहचान करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    5. सभी सह-सना हुआ सेल मॉडल कुओं पर विश्लेषण चलाएं और आरओआई क्षेत्र, कुल सेल नंबर, जीएफएपी + कोशिकाओं की संख्या, और Β-III ट्यूबलिन + कोशिकाओं की संख्या युक्त डेटा तालिका निर्यात करें।
    6. GFAP की संख्या की गणना करें+ और Β-III ट्यूबलिन+ कुल सेल नंबर के प्रतिशत के रूप में।

Representative Results

न्यूराइट विकास विश्लेषण
इस प्रोटोकॉल में, आईपीएससी-व्युत्पन्न ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग करके हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में सहसंस्कृति में बायोप्रिंट किया गया था। मुद्रण के बाद पहले 7 दिनों में, कोशिकाओं को एक जीवित सेल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हर 12 घंटे imaged थे. पोस्ट-बायोप्रिंटिंग, कोशिकाओं में एक गोल आकृति विज्ञान होना चाहिए और पूरे हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में फैलाया जाना चाहिए, धीरे-धीरे संस्कृति के पहले कुछ दिनों में कुछ प्रोट्रूशियंस के साथ छोटे सेल क्लस्टर बनाने के लिए बदल रहा है (प्रतिनिधि स्वस्थ सेल विकास के लिए पूरक वीडियो 1 देखें)। 4 दिन तक, स्वस्थ कोशिकाएं बड़े समूहों को बनाने के लिए जेल में पलायन करेंगी, जो न्यूराइट प्रकोप के माध्यम से जुड़े होते हैं। 7 दिन तक, लगभग कोई एकल कोशिकाओं रहना चाहिए, न्यूराइट्स और एस्ट्रोसाइटिक अनुमानों के परस्पर बंडलों को मजबूत दिखाई देना चाहिए, और कई छोटे न्यूराइट प्रकोप को समूहों (चित्रा 2ए) से बनते देखा जा सकता है। 7-दिवसीय विकास अवधि में ली गई लाइव सेल ब्राइटफील्ड छवियों की एक श्रृंखला का उपयोग करते हुए, न्यूराइट प्रकोप का विश्लेषण धारा 3 में विस्तृत रूप में किया गया था। इस विश्लेषण से पता चला है कि 12 घंटे और 156 घंटे(चित्रा 2बी)के बीच एक निकट रैखिक फैशन (आर2 मान = 0.84) में न्यूराइट बहिर्वाह बढ़ जाता है। न्यूराइट प्रकोप की इस अवधि के दौरान, सेल बॉडी क्लस्टर भी आकार में वृद्धि करते हैं (पूरक वीडियो 1 देखें), जो पूरे हाइड्रोजेल में सेल माइग्रेशन का संकेत है।

सेल व्यवहार्यता और जनसंख्या अनुपात
इस प्रोटोकॉल में, सेल मॉडल को बायोप्रिंटिंग के लिए 20 मिलियन कोशिकाओं/एमएल, जिसमें 15 मिलियन न्यूरॉन्स/एमएल और 5 मिलियन एस्ट्रोसाइट्स/एमएल शामिल हैं, की सांद्रता का उपयोग किया जाता है। कैल्सीन-एएम (जीवित कोशिकाओं), एथिडियम होमोडीमर-1 (मृत कोशिकाओं) और एक परमाणु दाग के साथ लाइव सेल धुंधला का उपयोग करना, 7-दिन की अवधि में जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना धारा 4(चित्रा 3ए)के अनुसार की जा सकती है। प्रतिनिधि संस्कृतियों के लिए सेल व्यवहार्यता परिणाम 4 दिन के लिए दिखाए जाते हैं, जहां कुल कोशिकाओं के 72% ± 1% (मतलब ± एसईएम) लाइव हैं और कैल्सिन-एएम के लिए धुंधला दिखाते हैं, जबकि 29% ± 2% (मतलब ± एसईएम) कुल कोशिकाएं मृत हैं और एथिडियम होमोडीमर-1(चित्रा 3बी)के साथ धुंधला दिखाती हैं। Calcein-AM और ethidium homodimer-1 के साथ सेल धुंधला हो जाना के प्रतिनिधि छवियों पूरक चित्रा 1 में देखा जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 3 डी संस्कृतियों के लिए सेल अस्तित्व मूल्यों को सीधे 2 डी संस्कृतियों की तुलना में नहीं किया जा सकता है, क्योंकि मृत कोशिकाओं को हाइड्रोजेल में बनाए रखा जाता है और सेल फीडिंग प्रक्रियाओं के दौरान हटाया नहीं जाएगा।

Β-III ट्यूबुलिन और GFAP के लिए immunofluorescent धुंधला का उपयोग करना, जैसा कि धारा 5 में वर्णित है और चित्र 4 में, छवि विश्लेषण न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स(चित्रा 3ए)के बीच सेल जनसंख्या अनुपात निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि संस्कृतियों में प्रति मॉडल कुल कोशिकाओं में से, β-III ट्यूबुलिन पॉजिटिव न्यूरॉन्स 49% ± 3% (मतलब ± SEM) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि GFAP पॉजिटिव एस्ट्रोसाइट्स 30% ± 4% (मतलब ± SEM) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह क्रमशः 1: 1.5, एस्ट्रोसाइट्स से न्यूरॉन्स का अनुपात देता है। यह प्रति मॉडल 21% कुल कोशिकाओं के शेष को छोड़ देता है, जो सेल मार्कर के लिए दाग नहीं करते हैं। जैसा कि सेल व्यवहार्यता विश्लेषण ने प्रदर्शित किया है कि 29% कोशिकाओं का औसत मूल्य 4 दिन में व्यवहार्य नहीं है, यह संभावना है कि ये कोशिकाएं हाइड्रोजेल के भीतर मर चुकी हैं।

सेल मार्करों की अभिव्यक्ति
बायोप्रिंटेड न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की आकृति विज्ञान का मूल्यांकन न्यूरोनल सेल टाइप मार्कर (Β-III ट्यूबुलिन) और एस्ट्रोसाइटिक मार्कर (GFAP) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से किया गया था। दिखाए गए प्रतिनिधि संस्कृतियों में, इम्यूनोस्टेनिंग को व्यक्तिगत सेल प्रकारों के लिए स्थानीयकृत किया जाता है, स्वस्थ सेल आकृति विज्ञान दिखाते हुए, दोनों सेल प्रकार सेलुलर प्रोट्रूशियंस(चित्रा 4ए,बी)के प्रकोप का प्रदर्शन करते हैं। चूंकि हाइड्रोजेल और सेल संरचनाएं त्रि-आयामी हैं, इसलिए प्रत्येक छवि चित्रा 4ए, बी में संरचना के माध्यम से केवल एक टुकड़ा का प्रतिनिधित्व करती है। चित्रा 4 सी हाइड्रोजेल भर में छवियों का एक मर्ज ढेर से पता चलता है, एक्स, वाई, और जेड विमानों में सेल स्थानीयकरण के विचारों का प्रदर्शन. चित्रा 4 डी केवल Β-III ट्यूबुलिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग दिखाता है; सेल बॉडी क्लस्टर से महीन न्यूराइट प्रकोप को हाइलाइट करना। ग्लूटामेटेर्जिक न्यूरॉन्स के फेनोटाइप की और जांच करने के लिए, ग्लूटामेटेर्जिक आयनिक रिसेप्टर मार्कर, ग्लूआर 2 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग किया जा सकता है। चित्रा 4E के भीतर, क्षेत्र 4E.1 (इनसेट) न्यूराइट बंडलों के साथ उच्च संकल्प पंचर धुंधला दिखाने के लिए प्रकाश डाला गया है. इसलिए, यह पुष्टि करता है कि इस सहसंस्कृति में न्यूरॉन्स में ग्लूटामेटेरिक फेनोटाइप होता है। सभी इम्यूनोस्टेनिंग छवियों के पार, इम्यूनोफ्लोरोसेंट सना हुआ गैर-सेल संरचनाओं को सेल समूहों और न्यूराइट्स के आसपास देखा जा सकता है। यह संभावना है कि ये संरचनाएं हाइड्रोजेल के लिए बाध्यकारी गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी की मामूली मात्रा के साथ संयोजन में हाइड्रोजेल के भीतर बनाए गए मलबे का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह बायोप्रिंटेड संस्कृतियों में अपेक्षित है, क्योंकि 3 डी पाड़ मॉडल के भीतर, सेल फीडिंग के दौरान मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाया नहीं जाता है। एक प्रतिनिधि नकारात्मक नियंत्रण immunostaining छवि माध्यमिक एंटीबॉडी के हाइड्रोजेल गैर विशिष्ट बंधन का एक प्रदर्शन के लिए पूरक चित्रा 2 में दिखाया गया है.

Figure 2
चित्रा 2: ग्लूटामेटेर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स बायोप्रिंटर का उपयोग करके हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में बायोप्रिंट किए गए थे और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हर 12 घंटे में इमेज किए गए थे । (ए) विश्लेषण के दौरान सेल संस्कृतियों की ली गई एक उदाहरण ब्राइटफील्ड छवि। छवि समय बिंदु 156 घंटे का प्रतिनिधित्व करती है, और स्केल बार 400 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करती है। (बी) ImageJ के लिए न्यूरॉनजे पैकेज का उपयोग करके मापी गई संस्कृतियों से न्यूराइट प्रकोप (माइक्रोन) की औसत लंबाई। प्रत्येक डेटा बिंदु n = 3 न्यूराइट्स है, और डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल मॉडल बायोप्रिंटिंग के लिए एक्टिवेटर समाधान के 20 मिलियन कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता का उपयोग किया गया था । (ए) सेल व्यवहार्यता की गणना लाइव/मृत सेल रंगों (क्रमशः कैल्सीन-एएम और एथिडियम होमोडीमर-1) का उपयोग करके की गई थी। मान दिखाते हैं कि 72% ± 1% (मतलब ± एसईएम, एन = 3) प्रति अच्छी तरह से कुल कोशिकाओं रहते हैं और कोशिकाओं के 29% ± 2% (एसईएम ± मतलब, एन = 3) दिन 4 पर प्रति अच्छी तरह से कुल सेल आबादी के मृत हैं। दिखाए गए मान माध्य ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) सेल आबादी अच्छी तरह से प्रति न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स का प्रतिशत चित्रा 4 में दिखाए गए धुंधला की छवि विश्लेषण के माध्यम से गणना की गई थी। न्यूरॉन्स दिन 7 (49% ± 3%, मतलब ± SEM, n = 3) पर Β-III ट्यूबुलिन के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि एस्ट्रोसाइट्स दिन 7 पर GFAP के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं (30% ± 4%, मतलब ± SEM, n = 3)। दिखाए गए मान माध्य ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 3 में दिखाए गए गणना के लिए सभी इमेजिंग एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम पर किए गए थे, और सभी विश्लेषण छवि विश्लेषण मंच और ग्राफपैड प्रिज्म पर तरीकों के अनुसार किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 7 दिन में ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के 3 डी बायोप्रिंटेड कॉकल्चर में तंत्रिका सेल प्रकार मार्करों की अभिव्यक्ति। (ए, बी) न्यूरोनल मार्कर Β-III ट्यूबुलिन और एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना, 10x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप मंच पर imaged. स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) न्यूरोनल मार्कर β-III ट्यूबुलिन और एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना, होचस्ट के साथ सह-दाग, XYZ विमान दृश्य में दिखाया गया है, 10x आवर्धन पर एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम पर imageed। छवि विश्लेषण मंच पर बनाया गया। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) न्यूरोनल मार्कर β-III ट्यूबुलिन के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना, होचस्ट के साथ सह-दाग, 20x आवर्धन पर एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम पर imaged। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (ई) ग्लूटामेटेर्जिक मार्कर GluR2 के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना, होचस्ट के साथ सह-दाग, 10x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म पर imaged। बॉक्स 3E.1 GluR2 धुंधला हो जाना के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला से पता चलता है. स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 1: ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंटर का उपयोग करके हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में बायोप्रिंट किया गया था और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हर 12 घंटे में इमेज किया गया था। विश्लेषण के दौरान सेल संस्कृतियों के लिए brightfield छवियों के वीडियो, समय अंक नीचे सही कोने में संकेत दिया जाता है, और पैमाने सलाखों 400 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: दिन 4 पर बायोप्रिंटेड न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के जीवित / मृत विश्लेषण की उदाहरण छवियां। कैल्सिन-एएम दाग हरे (488 एनएम) में दिखाया गया है, और एथिडियम होमोडीमर दाग लाल (647 एनएम) में दिखाया गया है। छवि को XYZ प्लेन व्यू में दिखाया गया है, जिसे इमेज एनालिसिस प्लेटफॉर्म पर बनाया गया है। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) इमेजिंग 4x बढ़ाई पर एक confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग किया गया था. (बी) इमेजिंग 10x आवर्धन पर एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके किया गया था कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद नकारात्मक नियंत्रण छवि का उदाहरण। प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ दिया गया था, और हरे (488 एनएम) और लाल (647 एनएम) माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। छवि XYZ प्लेन व्यू में दिखाई गई है, जिसे इमेज एनालिसिस प्लेटफॉर्म पर बनाया गया है। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। इमेजिंग 10x आवर्धन पर एक confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग किया गया था. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सीएनएस के सटीक मॉडल के लिए की जरूरत कभी अधिक नहीं किया गया है, और दो आयामी (2 डी) पारंपरिक सेल संस्कृति मॉडल की सीमाओं हाल के वर्षों में जटिल सीएनएस मॉडल की एक पीढ़ी संचालित किया है19. हालांकि, कई जटिल 3 डी मॉडल जो तंत्रिका कोशिका प्रकारों और ईसीएम के बीच बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनकी सीमाएं हैं जो औद्योगिक प्रक्रियाओं 6,20,21में इन मॉडलों के आवेदन को रोकेंगी। इस प्रोटोकॉल में, हम मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स का एक 3 डी कॉकल्चर मॉडल विकसित करते हैं, जिसका उद्देश्य 96-अच्छी तरह से और 384-अच्छी तरह से प्रारूपों में बायोएक्टिव हाइड्रोगेल मचान बनाने के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके इनमें से कुछ सीमाओं को हल करना है।

इन मॉडलों को विकसित करने की पद्धति को प्लेट मैप डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर, ऑटो-जेनरेट किए गए प्रिंट प्रोटोकॉल और बायोप्रिंटर से निर्देशित प्रिंट प्रक्रिया के माध्यम से सरल बनाया गया है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया संवेदनशील IPSC व्युत्पन्न सेल प्रकार के संवेदनशील प्रकृति के कारण देखभाल विगलन और संस्कृति में निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम के साथ लिया जाना चाहिए. सबसे पहले, रॉक अवरोधक (रॉकी) को शामिल करने से बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया और प्रारंभिक संस्कृति के दौरान कई लाभ होते हैं। सेल विगलन एक महत्वपूर्ण बिंदु है जिसमें न्यूरॉन्स एक तनाव प्रतिक्रिया का अनुभव कर सकते हैं, और अनुचित विगलन प्रोटोकॉल22 जीवित रहने की संभावना कम कर सकते हैं. यह आम तौर पर कोशिकाओं पिघलना मीडिया जोड़ने, और इनक्यूबेटर तापमान के रूप में कुशलता के रूप में संभव23 करने के लिए कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए सिफारिश की है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान, यह आवश्यक है कि न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को मीडिया के बजाय एक उत्प्रेरक समाधान में फिर से निलंबित कर दिया जाए, और कोशिकाओं को प्रिंट रन के अंत तक कमरे के तापमान से ऊपर नहीं उठाया जाएगा (30 मिनट के बाद पिघलना)। इस प्रकार, तुरंत पिघलने के बाद मीडिया के लिए रॉकी के अलावा और दो centrifugation कदम (कदम 2.1--2.7 और 1.3.15-1.3.20) के दौरान इस सहित सेल तनाव रास्ते है, जो कम व्यवहार्यता स्तर24 में परिणाम होगा बाधित करने के लिए जरूरी है. इसके अलावा, रॉकी को न्यूराइट प्रकोप को बढ़ावा देने और न्यूरोनल परिपक्वता25 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, ROCKi पूरकता 48 घंटे के बाद bioprinting के लिए जारी है. हालांकि, कोशिकाओं को परख के लिए उपयोग किए जाने से पहले बाद के मीडिया परिवर्तनों के दौरान पूर्ण धोने को सुनिश्चित करने के लिए 48 घंटे के बाद रॉकी पूरकता को हटाना अनिवार्य है।

एक और कदम है कि महत्वपूर्ण ध्यान देने की आवश्यकता है पोस्ट प्रिंट मीडिया इसके अलावा और मीडिया परिवर्तन (2.8-2.13 कदम) के दौरान है. बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचान में केवल 1.1 kPa के बराबर बायोमैकेनिकल कठोरता होती है, जो ग्रे मैटर के बराबर होती है। जैसा कि चरण 2.10 में वर्णित है, यह मीडिया जोड़ और अशांति को रोकने के लिए आकांक्षा के दौरान कुएं के किनारे में धीरे से विंदुक के लिए महत्वपूर्ण है। यह 384 अच्छी तरह से प्लेटों, जहां जेल स्तर कुल अच्छी तरह से मात्रा का एक उच्च अनुपात लेता है के लिए विशेष प्रासंगिकता की है. इस विधि का उपयोग 2 डी नियंत्रण कुओं में भी किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं के किनारे उठाने और न्यूराइट प्रकोप के बाल काटने को रोका जा सके। लेखकों को भी bioprinter के भीतर बाँझ तकनीक के महत्व को उजागर करना चाहते हैं, जो IPSC व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया एक जैव सुरक्षा कैबिनेट की है कि बराबर सावधानी के साथ इलाज किया जाना चाहिए. इसमें ग्रीनलाइटिंग और प्रिंटिंग प्रक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले बाँझ फ़िल्टरिंग 70% EtOH और dH2O शामिल हैं, बायोप्रिंटर के अंदर और बाहर हाथ ले जाते समय कारतूस और प्लेटों पर ढक्कन रखते हुए, और मुद्रण से पहले और बाद में 70% इथेनॉल पोंछे के साथ बायोप्रिंटर के अंदर सतहों को नष्ट करना।

बायोइंक और एक्टिवेटर समाधानों से बने बायोप्रिंटेड हाइड्रोगेल मचान, इस मॉडल को विकसित करने के लिए चुने गए बायोइंक और एक्टिवेटर समाधानों को रैस्ट्रम बायोप्रिंटर के भीतर उपयोग के लिए इन्वेंटिया लाइफ साइंस द्वारा विकसित बायोइंक और एक्टिवेटर समाधानों की एक श्रृंखला से चुना गया है। Laminin और hyaluronic एसिड अक्षीय मार्गदर्शन में उनकी भूमिका के कारण IPSC व्युत्पन्न neuronal परिपक्वता के लिए प्रासंगिकता के अणुओं के रूप में पहचाने गए, अन्तर्ग्रथन गठन, और perineuronal शुद्ध26,27 के गठन. इसके अलावा, 1.1 केपीए की एक बायोमेकेनिकल कठोरता का चयन किया गया था, क्योंकि कम घनत्व वाले हाइड्रोगेल को न्यूरॉन्स12 से बेहतर न्यूराइट प्रकोप को सक्षम करने के लिए दिखाया गया है। यदि न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स का उपयोग करके प्रोटोकॉल में संशोधन किए जाते हैं जिन्हें घर में या एक अलग वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से विभेदित किया गया है, तो सबसे अधिक सहायक हाइड्रोगेल मचान15 निर्धारित करने के लिए मैट्रिक्स चयन परीक्षण करने की सिफारिश की जाएगी। इसके अलावा, सेल घनत्व को भी अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है यदि सेल स्रोतों में परिवर्तन इष्टतम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने और हाइड्रोजेल भीड़भाड़ को रोकने के लिए किए जाते हैं। बायोप्रिंटर फ़ंक्शन से संबंधित सभी संशोधनों और समस्या निवारण के लिए, लेखक निर्माताओं से संपर्क करने और निर्माता प्रोटोकॉल को संदर्भित करने की सलाह देते हैं।

सीएनएस में न्यूरोनल उपप्रकार और ग्लियल कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला होती है, जो सभी विभिन्न मस्तिष्क niches में मौजूद हैं और तंत्रिका समारोह28 में योगदान करने वाली विशिष्ट भूमिकाएं हैं। इस व्यापक दायरे के संदर्भ में, यह मॉडल केवल दो सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों (एस्ट्रोसाइट्स और उत्तेजक ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स) का प्रतिनिधित्व करता है। महत्वपूर्ण सेल प्रकार जैसे माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, और रक्त-मस्तिष्क बाधा बनाने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं को इस प्रणाली से छोड़ दिया जाता है। माइक्रोग्लिया का समावेश न्यूरोइम्यून इंटरैक्शन पर ध्यान केंद्रित करने में प्रासंगिकता का हो सकता है, और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स केंद्रीय माइलिनेशन को प्रभावित करने वाली बीमारियों में रुचि हो सकती है। पैथोलॉजी में उनकी भूमिका के अलावा, रक्त-मस्तिष्क बाधा बनाने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसी कोशिकाएं दवा-चयापचय एंजाइमों का उत्सर्जन करती हैं, जो फार्माकोकाइनेटिक परख29के लिए इस मॉडल के उपयोग को प्रभावित कर सकती हैं। मॉडल की एक और सीमा न्यूरॉन्स के लिए एस्ट्रोसाइट्स का अनुपात हो सकता है; न्यूरॉन्स के लिए एस्ट्रोसाइट्स का अनुपात मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच बहुत भिन्न होता है, 1: 1 और 1: 330,31 के बीच सुझाए गए मूल्यों के साथ। इस मॉडल में न्यूरॉन्स के लिए 1: 1.5 एस्ट्रोसाइट्स का अनुमानित अनुपात है; इस प्रकार, यह मॉडल मस्तिष्क क्षेत्रों को मॉडल करने के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकता है जहां एस्ट्रोसाइट्स अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, जैसे कि सफेद पदार्थक्षेत्रों में 30.

3 डी बायोप्रिंटेड कॉकल्चर मॉडल विकसित करने के लिए अन्य प्रोटोकॉल हाल के वर्षों में प्रकाशित किए गए हैं। सुलिवन एट अल., 2021 के एक प्रकाशन ने आईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं का उपयोग करके एक 3डी बायोप्रिंटेड तंत्रिका मॉडल प्रस्तुत किया, जो 2डी संस्कृतियों की तुलना में उच्च पोस्ट-प्रिंट व्यवहार्यता और न्यूरोनल फ़ंक्शनकी वृद्धि को प्रदर्शित करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को सेल स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था और 4 सप्ताह के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया था। इस प्रोटोकॉल में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध IPSC व्युत्पन्न glutamatergic न्यूरॉन्स और astrocytes इस्तेमाल किया गया. यह सह-सुसंस्कृत कोशिकाओं के 3 डी नेटवर्क को कम से कम 7 दिनों में स्थापित करने की अनुमति देता है; जैसा कि न्यूराइट विकास विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित किया गया है, न्यूराइट प्रकोप 24 घंटे के भीतर शुरू होता है और 156 एच अवधि के दौरान एक रैखिक फैशन में जारी रहता है जिसके लिए कोशिका वृद्धि की निगरानी की गई थी। इन नेटवर्कों की तेजी से स्थापना को आंशिक रूप से ग्लूटामेटेर्जिक न्यूरॉन्स के उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो एनजीएन 2 के अनुकूलित डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसिबल जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करते हैं, जो 7 दिनों के भीतर परिपक्व न्यूरोनल उपप्रकार मार्करों की अभिव्यक्ति दिखाता है, यहां तक कि 2 डी संस्कृति33 में भी। इस तकनीक का उपयोग कर इस विकास की अवधि की कमी biopharmaceutical उद्योग के भीतर मॉडल को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है, परख विकास तेजी से बदलाव और सेल मॉडल15 के विकास की आवश्यकता है के रूप में.

अंत में, यह मॉडल न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के 3 डी मॉडल के लिए क्षमता दिखाता है, जो स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए जल्दी और आसानी से स्थापित होता है। इस मॉडल प्रकार के लिए भविष्य के अनुप्रयोगों विभिन्न सीएनएस रोगों भर में दवा की खोज के प्रयासों के लिए हो सकता है, रोगी या जीन संपादित रोग आईपीएससी लाइनों का उपयोग कर विभिन्न रोगों के लिए विस्तार करने का अवसर के साथ. इसके अलावा, डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसिबल एनजीएन 2 अभिव्यक्ति आईपीएससी-व्युत्पन्न ग्लूटामेटेर्जिक न्यूरॉन्स का उपयोग कोशिकाओं को कम समय में परिपक्वता तक पहुंचने की अनुमति देता है, जिसका उपयोग न्यूरोडीजेनेरेशन अनुसंधान के लिए उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क के मॉडल विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रणाली को माइक्रोग्लिया और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स सहित सहसंस्कृति में अतिरिक्त सेल प्रकारों के उपयोग के माध्यम से भी विस्तारित किया जा सकता है।

Disclosures

CW, NC और JB Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, London, UK के कर्मचारी हैं। YH Merck Sharp & Dohme LLC का कर्मचारी है, जो Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA की सहायक कंपनी है।

चित्र एक Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि पर प्रोटोकॉल और प्रतिक्रिया विकसित करने में उनकी सहायता के लिए एलेक्स वोल्करलिंग, मार्टिन एंगेल और राहेल ब्लीच को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermofisher 31350010
384-well plate PerkinElmer 6057300
96-well plate PerkinElmer 6055300
Activator fluid F299 Inventia Life Science N/A
Activator fluid F3 Inventia Life Science N/A
B27 (50x) minus Vit A Thermofisher 12587010
Bioink fluid F261 Inventia Life Science N/A
Bioink fluid F32 Inventia Life Science N/A
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D5207
GlutaMAX (100x) Thermofisher 35050061
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 Abcam ab150115
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Hoechst Abcam ab228551
Human BDNF Recombinant Protein Thermofisher PHC7074
Human NT3 Recombinant Protein Thermofisher PHC7036
iCell Astrocytes Fujifilm CDI 1434
INCell Analyser 6500HS Molecular Devices N/A high content imaging system
Incucyte S3 Sartorius  N/A
ioGlutamatergic Neurons (Large vial) Bit.bio e001
Laminin (1 mg/mL) Sigma Aldrich L2020
Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) Invitrogen L3224
Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated R&D systems SC024
Neurobasal media Thermofisher 21103049
Normal Donkey Serum Abcam ab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342) Thermofisher R37605
Opti-MEM Thermofisher 11058021
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
PEI 50% in H2O Sigma Aldrich 181978
Pierce Borate Buffer 20x Thermofisher 28341
Prism GraphPad Data analysis software
Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) Abcam ab206293
RASTRUM(TM) Bioprinter Inventia Life Science N/A Bioprinter
RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges Inventia Life Science N/A Bioprinter Cartridges
RASTRUM(TM) Targeting plate Inventia Life Science N/A Targeting plate
Rho kinase (ROCK) inhibitor Abcam ab120129
Sheep anti-GFAP NL493 conjugated R&D systems SC024
Signals Image Artist  PerkinElmer  N/A Image analysis platform
Triton X-100 Thermofisher HFH10
Zeiss Axio Observer Zeiss N/A Inverted microscope platform 

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References

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त्रि-आयामी बायोप्रिंटिंग मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट कोकल्चर स्क्रीनिंग एप्लीकेशन सेल मॉडल ड्रग स्क्रीनिंग थ्रूपुट एकरूपता विकास समय 3 डी मॉडल बायोप्रिंटिंग कोकल्चर मॉडल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स एस्ट्रोसाइट्स हाइड्रोजेल मैट्रिक्स बायोएक्टिव पेप्टाइड्स एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन शारीरिक कठोरता व्यवहार्यता एस्ट्रोसाइट-टू-न्यूरॉन अनुपात परिपक्व तंत्रिका सेल प्रकार मार्कर न्यूराइट आउटग्रोथ परख
स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए मानव IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट Cocultures के तीन आयामी bioprinting
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Whitehouse, C. A., He, Y., Brownlees, J., Corbett, N. Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. J. Vis. Exp. (199), e65856, doi:10.3791/65856 (2023).

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