Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור תרביות משולבות בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית של נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC. מודל קוקולטורה זה, שנוצר בתוך פיגום הידרוג'ל בפורמטים של 96 או 384 בארות, מדגים כדאיות גבוהה לאחר ההדפסה וצמיחת עצבים תוך 7 ימים ומראה את הביטוי של סמני בשלות עבור שני סוגי התאים.
Abstract
כדי שמודל תאי יהיה בר-קיימא לבדיקת תרופות, המערכת חייבת לעמוד בדרישות התפוקה וההומוגניות לצד זמן פיתוח יעיל. עם זאת, מודלים תלת-ממדיים רבים שפורסמו אינם עומדים בקריטריונים אלה. לכן, זה מגביל את התועלת שלהם ביישומים מוקדמים לגילוי תרופות. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (3D) היא טכנולוגיה חדשנית שניתן ליישם בפיתוח מודלים תלת-ממדיים כדי לזרז את זמן הפיתוח, להגדיל את הסטנדרטיזציה ולהגדיל את התפוקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים תלת-ממדיים של חקלאות משותפת מודפסת ביולוגית של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי גזע גלוטמטרגיים ואסטרוציטים. תרבויות קו-תאיות אלה מוטמעות בתוך מטריצת הידרוג'ל של פפטידים ביו-אקטיביים, חלבוני מטריצה חוץ-תאית באורך מלא (ECM), ועם קשיחות פיזיולוגית של 1.1 kPa. ניתן לבסס את המודל במהירות בפורמטים של 96 בארות ו-384 בארות והוא מייצר כדאיות ממוצעת לאחר הדפסה של 72%. יחס אסטרוציטים לנוירונים במודל זה מוצג כ-1:1.5, הנמצא בטווח הפיזיולוגי של המוח האנושי. אוכלוסיות תאים אלה המודפסות ביולוגית בתלת-ממד מראות גם ביטוי של סמנים בוגרים מסוג תאים עצביים וצמיחה של תחזיות נוירוריט ואסטרוציטים תוך 7 ימים מהתרבית. כתוצאה מכך, מודל זה מתאים לניתוח באמצעות צבעי תאים וטכניקות אימונוסטיין לצד בדיקות צמיחת עצבים. היכולת לייצר מודלים פיזיולוגיים מייצגים אלה בקנה מידה גדול הופכת אותם לאידיאליים לשימוש במבחני סינון בתפוקה בינונית עד גבוהה עבור מטרות במדעי המוח.
Introduction
המחקר על מחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS) בתעשיית גילוי התרופות מתרחב1. עם זאת, מחלות CNS נפוצות רבות כגון אפילפסיה, סכיזופרניה ואלצהיימר עדיין אין טיפולים מרפאים 2,3,4. היעדר טיפולים יעילים במחלות CNS יכול, לפחות בחלקו, להיות מיוחס לחוסר מודלים מדויקים במבחנה של המוח5. זה הביא לפער תרגומי בין מודלים נוכחיים במבחנה לבין נתוני in vivo וצוואר בקבוק עוקב במאמצי המחקר.
מונע על ידי פער תרגומי זה, חלה עלייה משמעותית בפיתוח מודלים חדשניים של תאים תלת-ממדיים בשנים האחרונות, כולל אורגנואידים עצביים, נוירוספרואידים ומודלים מבוססי פיגומים6. המבנה התלת-ממדי של מודלים אלה מסייע בשחזור המיקרו-סביבה העצבית, כולל לחצים ביומכניים, מגעים בין תאים ומטריצה חוץ-תאית במוח (ECM)7. ECM המוח הוא אלמנט דינמי של נוירופיזיולוגיה התופס את החלל בין סוגי תאים עצביים, כולל נוירונים, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים, והיחידה הנוירו-וסקולרית7. רקפיטולציה של המוח ECM הוכחה כמשפיעה על מורפולוגיה עצבית וירי עצבי, ומודלים תלת-ממדיים מורכבים רבים של המוח הדגימו שקיעת חלבוני ECM על ידי סוגי תאים עצביים 8,9,10,11. מודלים מבוססי פיגומים מורכבים מתרבויות עצביות בוגרות המרחפות במטריצת הידרוג'ל סינתטית או ביולוגית נקבובית המייצגת את המוח ECM12. שלא כמו מערכות אורגנואידים וכדורואידים, מודלים תלת-ממדיים מבוססי פיגומים מאפשרים התאמה אישית של חלבוני ECM הקיימים ויש להם יתרון נוסף של כוונון קשיחות הידרוג'ל כדי לחקות לחצים ביומכניים13,14.
למרות שרוב מכריע של מודלים עצביים תלת-ממדיים מדגימים שחזור מוגבר של מיקרו-סביבה במוח, לא כל המודלים מתאימים היטב ליישום יישומי גילוי תרופות15. כדי שמודל תלת ממדי יוטמע בתהליכים תעשייתיים, המערכת חייבת לעמוד בדרישות התפוקה לסינון יישומים ולהיות בעלת זמן פיתוח קצר יחסית16. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית היא טכנולוגיה חדשנית המציעה פוטנציאל ליצירת מודלים עצביים מבוססי פיגומים תלת-ממדיים עם זמן פיתוח מהיר, תפוקה מוגברת ורמות גבוהות יותר של בקרה מדויקת, לצד הסרת השונות הנגרמת כתוצאה מטעויות אנוש17. פרוטוקול זה מציג מודל קו-קולטורה תלת-ממדי של נוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים אנושיים שמקורם ב-iPSC בפיגום הידרוג'ל. פיגום הידרוג'ל זה מכיל פפטידים ביו-אקטיביים מייצגים פיזיולוגית (RGD, IKVAV, YIGSR) וחלבוני ECM בתוך קשיחות ביומכנית מימטית. חלבוני ECM באורך מלא אלה כוללים למינין-211 באורך מלא וחומצה היאלורונית, המצויים בשפע בקליפת המוח האנושית, עם קשיחות של 1.1 kPa בהתאם למדידות in vivo 18. מודל זה מתוכנן באופן מעשי לגילוי תרופות, ונוצר באמצעות מדפסת ביולוגית תלת-ממדית בפורמט צלחת של 96 בארות או 384 בארות המתאים לניתוח סינון באמצעות טכניקות הדמיה עם צבעי תאים ונוגדנים, לצד מבחני צמיחה של נוירוטים. תאים מראים ביטוי של סמנים מסוג תא עצבי וצמיחה של תחזיות נוירוריט ואסטרוציטים תוך 7 ימים מהתרבית. לפיכך, פרוטוקול זה יציג את המתודולוגיה לפיתוח מודל קוקולטורה עצבית תלת-ממדית בתפוקה גבוהה לשימוש ביישומי גילוי תרופות.
איור 1: סקירה כללית להמחשה של מתודולוגיה המשמשת להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תרבויות משותפות. תאי עצב ואסטרוציטים אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים משולבים עם תמיסות אקטיבטור וביודיו המכילות פפטידים ביו-אקטיביים ומודפסים ביולוגית על פיגומי הידרוג'ל בפורמטים של 96 בארות או 384 בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית לפי דרישה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
1. הדפסה ביולוגית של מודלים תלת ממדיים
- יצירת מפת לוחות וקובץ הדפסה
- לפני יצירת הדגם, צור מפת לוחות, פרוטוקול וקובץ הדפסה באמצעות תוכנת מפת הלוחות. פתח את תוכנת מפת הלוחות ובחר באפשרות תאי תרבות בתלת-ממד .
- בחר את סוג הדגם להדפסה ביולוגית מתוך האפשרויות הזמינות בתפריט הנפתח; מודל זה אומת בתבניות מודל הדמיה ומודל HTP . בחר מודל הדמיה עבור לוחות 96 בארות ו - HTP עבור לוחות 384 בארות.
- בחלון בחירת מטריצה , בחר הידרוג'ל Px02.53, המכיל חלבוני Laminin-211 וחומצה היאלורונית, עם פפטידי IKVAV, RGD ו- YIGSR.
- בחלון הקופץ, הזן את סוגי התאים כנוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים והזן את צפיפות התא כ- 20 מיליון תאים/מ"ל.
- השתמש בתוכנה כדי לעצב את מפת הלוחות הרצויה על ידי הדגשת בארות על הלוח על המסך. כלול לפחות שורה אחת של בקרה דו-ממדית על פלסטיק בעיצוב. בקרה דו-ממדית על בארות פלסטיק מורכבת מתאים שהופקדו ישירות לתוך הבאר ללא כל פיגום הידרוג'ל; מצפים בארות אלה לפי שלב 1.2.
- ודא שדגם הלוח המופיע בראש החלון השתנה לדגם הלוח המיועד לשימוש (ראה טבלת חומרים).
- הורד את הפרוטוקול ואת קובץ ההדפסה עבור מפת הלוחות באמצעות לחצני ההורדה ושמור אותם במחשב המקושר למדפסת ביולוגית.
- ציפוי בקרה דו-ממדית על בארות פלסטיק
- לפחות 24 שעות לפני ההדפסה, צפו את הבארות עבור מודלים דו-ממדיים של בקרה להיצמדות תאים וצמיחה. בארות מודל תלת מימד אינן דורשות ציפוי מראש. כל התהליכים יבוצעו בארון בטיחות ביולוגית, אלא אם צוין אחרת. ניתן לצפות ולהכין לוחות עד 7 ימים לפני ההדפסה.
- הפוך 50 מ"ל של 1x borate buffer על ידי דילול 2.5 מ"ל של 20x borate stock solution עם 47.5 מ"ל של dHסטרילי 2O.
- הוסף 100 μL של 50% (w/v) פוליאתילנימין (PEI) ל- 50 מ"ל של חיץ בוראט 1x כדי ליצור תמיסת PEI של 0.1% (w/v) ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
- הוסף פתרון PEI של 0.1% (w/v) לכל באר פקד דו-ממדית, כפי שמצוין על-ידי מפת הלוחות שנוצרה בשלב 1.1. הוסף 100 μL / באר אם אתה משתמש בצלחת 96 באר או 25 μL / באר אם אתה משתמש בצלחת 384 באר.
- דגרו על הצלחת במשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C לפני שתשאפו את תמיסת ה-PEI של 0.1% (w/v) ותשטפו את הבארות פי 5 עם PBS. תנו לבארות להתייבש לחלוטין בארון הבטיחות הביולוגית.
- לדלל 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל תמיסת למינין ב 5 מ"ל של מדיום neurobasal. הוסף 100 μL לכל באר בקרה דו-ממדית אם אתה משתמש בצלחת של 96 בארות או 25 μL אם אתה משתמש בצלחת של 384 בארות. לדגור במשך 4 שעות ב 37 ° C.
- אם אתם מאחסנים צלחות, השאירו את תמיסת הלמינין במקומה לאחר הדגירה ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חממו מראש את הצלחות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
- הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של מודלים של קוקולטורה
- הקפידו תמיד על טכניקה סטרילית בעת השימוש במדפסת הביולוגית, ונגבו כפפות, מחסניות וצלחות תרבית עם 70% EtOH לפני הכנסתן למדפסת. אלא אם צוין אחרת, בצע את כל התהליכים מחוץ למדפסת הביולוגית בארון בטיחות ביולוגית.
- הפעל את המדחס עבור המדפסת הביולוגית ואתחל את המדפסת על-ידי בחירה בלחצן Initialize בתוכנת המדפסת הביולוגית. לאחר שזרימת האוויר במדפסת החלה, נגב את המשטחים בתוך המדפסת באמצעות מגבון EtOH של 70%.
- ביום ההדפסה, בצע את תהליך התאורה הירוקה המודרך של תחילת היום כדי להבטיח את מצב הזרבובית הנכון עבור ריצת ההדפסה (מצב זרבובית מינימלי 2A2B).
- קח מחסנית מדפסת ביולוגית מהאריזה הסטרילית, הוסף 20 מ"ל של dH2O סטרילי בתא A, והוסף 6 מ"ל של 70% EtOH מסונן סטרילי לתאים B1-4. הכנס את המחסנית למחזיק המחסנית השמאלי בתוך המדפסת הביולוגית והנח את מכסה הלוחית במחזיק המכסה הייעודי.
- בחר בלחצן Greenlighting במסך הבית של התוכנה ואשר בתוכנה שהמחסנית נמצאת במקומה בתוך המדפסת הביולוגית ושהמכסה הוסר. להתחיל את תהליך התאורה הירוקה.
- כאשר תתבקש על ידי התוכנה, ודא שלא ניתן לראות טפטופים עקביים מהמחט השמאלית או הימנית. לאחר מכן, כאשר תתבקש על ידי התוכנה, ודא כי מים נמצאים בתאים B7 ו- B8.
- לאחר שהמדפסת הביולוגית השלימה את שלב התאורה הירוקה בהדרכה עצמית, הכנס לוח תחתון סטרילי לא מצופה בעל 96 בארות (נפרד מהלוח המצופה עבור תרביות הדפסה ביולוגית) והכנס לוח חדש זה לאזור מחזיק הלוחות הימני של המדפסת הביולוגית כאשר תתבקש על ידי התוכנה. ודא שמחזיק הצלחת מוגדר ללוחית בעלת פרופיל גבוה, והמכסה מוסר ומונח במחזיק המכסה הייעודי לפני תחילת השלב הבא.
- המדפסת הביולוגית תפקיד טיפות מים בכל באר של צלחת 96 הקידוחים. לאחר שתסיים, הניחו את הצלחת מהמדפסת הביולוגית ואשרו כי טיפות מים נמצאות בכל באר של הצלחת.
- השליכו את לוח 96 הקידוחים המשמש לתאורה ירוקה ואפשרו למדפסת הביולוגית לסיים את תהליך התאורה הירוקה. לאחר השלמתה, התוכנה תציין את מצב הזרבובית של המדפסת הביולוגית ותאשר שהמדפסת הביולוגית מוכנה להדפיס מודלים. הנח את המכסה על מחסנית ההדפסה והעבר אותו לארון הבטיחות הביולוגית לשלבים הבאים.
- באמצעות תוכנת המדפסת הביולוגית, טען את קובץ ההדפסה (שנוצר בשלב 1.1) לתוך התוכנה באמצעות לחצן התוכנה Print Run ופתח את פרוטוקול ההדפסה pdf.
- אחזר ביו-דיו ונוזלי אקטיבטור, כפי שמצוין בפרוטוקול ההדפסה PDF, מ-20°C - והפשיר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 40 דקות. עבור מטריצת הידרוג'ל Px02.53 זה יכלול: 1x בקבוקון F32, 1xvial F3, 1x בקבוקון F261, 1x בקבוקון F299. אין להפשיר ביודיו ונוזלי אקטיבטור בידיים או באמבטיות מים.
- הביאו 50 מ"ל של מדיה מלאה עם דוקסיציקלין ומעכב ROCK (מדיה מלאה +DOX/ROCKi) (ראה שלב 2.2) ל-RT בזמן שנוזלי ביודיו ואקטיבטור מפשירים.
- לאחר הפשרת הדיו הביולוגי והאקטיבטורים, הכן את מחסנית ההדפסה בהתאם להוראות בשני העמודים האחרונים של מסמך PDF של פרוטוקול ההדפסה שנוצר. נעשה שימוש חוזר במחסנית מדפסת התאורה הירוקה עבור שלבי הדפסת הדגם.
- ודא שיש 40 מ"ל של dH2O בתא A1 ו- 8 מ"ל של 70% EtOH בתאים B1 ו- B2. הוסף 1.2 מ"ל של מפעיל F32 ל- C1, 1.2 מ"ל של F3 ל- C2 ו- 200 מיקרוליטר של F261 ל- C4.
- שלפו את ה-PEI ואת הצלחת המצופה למינין מהאינקובטור והניחו אותה בתוך המדפסת בתא מחזיק הלוחות הימני. אין להסיר את תמיסת המדיה הלמינינית מהבארות בשלב זה. ודא שתא מחזיק הלוחיות מוגדר ללוחית בפרופיל נמוך והמכסה הוסר ובמחזיק המכסה.
- הכנס את מחסנית ההדפסה למדפסת הביולוגית, ודא שהמכסה הוסר והונח במחזיק, והתחל את הפעלת ההדפסה בתוכנה על-ידי בחירה בלחצן Print Inert Base בתוכנת המדפסת הביולוגית.
- בזמן שהבסיס האינרטי מדפיס, אחזר את הבקבוקונים של נוירונים גלוטמטרגיים ואסטרוציטים מאחסון חנקן נוזלי, הפשיר והשהה מחדש בהתאם להוראות בסעיף 2.
- לאחר הפשרת התאים, והוספת 8 מ"ל של מדיה מלאה +DOX/ROCKi לכל סוג תא בנפרד (לפי סעיף 2), צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
- שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את שני סוגי התאים בנפרד ב-1 מ"ל של מדיה שלמה +DOX/ROCKi.
- הוסף 20 μL של תרחיף תאים ל 20 μL של כחול טריפאן וערבב לפני ספירת תאים כדי לקבוע ריכוז תאים קיימא לכל מ"ל עבור כל סוג תא.
- שלבו סך של 3 מיליון נוירונים גלוטמטרגיים עם מיליון אסטרוציטים בצינור של 15 מ"ל. הוסף מדיה כדי ליצור נפח כולל של 8 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
- שאפו כמה שיותר מהסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא והשהו מחדש את כדורית התא ב-200 מיקרוליטר של נוזל מפעיל F299.
- שים לב כי נוזל activator הוא צמיג; פיפטה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את הגלולה במלואה. סוגי התאים עדינים; צמצמו את הגזירה והבועות על ידי שימוש בקצה פיפטה רחב ושעמום ובטכניקת הפיפט ההפוך. פיפטה למעלה ולמטה בחוזקה לא יותר מ 3 פעמים כדי למנוע אובדן תאים.
- לאחר סיום הדפסת שלב הבסיס האינרטי, הנח את המכסים על המחסנית ועל לוח התרבית, הסר את שניהם מהמדפסת הביולוגית והנח בארון הבטיחות הביולוגית.
- הוסף את 200 μL של מתלה התא ב- F299 לבאר C3 של מחסנית ההדפסה, הכנס מחדש את המחסנית למדפסת הביולוגית, הסר את המכסה והנח אותו במחזיק המכסה. עדיין אין להכניס מחדש את צלחת התרבית.
- התחל את שלב הדפסת המודלים של ריצת ההדפסה. בזמן שהמדפסת הביולוגית מכינה נוזלים, הסר את תמיסת המדיה למינין מבארות הבקרה הדו-ממדיות של הצלחת והחלף אותה ב- 150 μL של מדיה שלמה +DOX/ROCKi בכל באר בקרה דו-ממדית אם אתה משתמש בלוח 96 בארות ו- 50 מיקרוליטר של מדיה שלמה +DOX/ROCKi אם אתה משתמש בלוח 384 בארות.
- לאחר שהנוזלים התכווצו, הכנס את לוח מיקוד ההדפסה הביולוגית למדפסת הביולוגית, הסר את המכסה והנח אותו במחזיק המכסה.
- התחל את תהליך הפילוח של המדפסת הביולוגית.
- כאשר תתבקש על-ידי תוכנת ההדפסה הביולוגית, הסר את לוח היעד מהמדפסת הביולוגית.
- השתמש במדריך כדי לבחור היכן ניתן לצפות בטיפות על הצלחת. הכנס מחדש את לוח היעד למדפסת הביולוגית וחזור על תהליך ההדפסה והבחירה של טיפות.
- כשתתבקש, הסר שוב את לוח היעד, ולאחר מכן החלף אותו בלוח תרבית התא (המכיל מדיה בבארות הבקרה הדו-ממדיות לפי שלב 1.3.25). ודא שמכסה צלחת התרבית כבוי ומונח במחזיק. המדפסת הביולוגית תסיים את הדפסת הדגם.
- לאחר השלמת הדפסת הדגם, בצע את שיטות תרבית התאים בסעיף 2 (שלב 2.8) כדי להוסיף מדיה לבארות.
- התחל בתהליך ניקוי המדפסת הביולוגית, ולאחר השלמתו, השליך את המחסניות והנוזלים שנותרו בהתאם לפרוטוקולי המעבדה.
2. תרבית תאים
- מודלים נוצרים באמצעות בקבוקון 1x של נוירונים גלוטמטרגיים (>5 מיליון תאים לכל בקבוקון) ובקבוקון אחד של אסטרוציטים (>1 מיליון תאים לכל בקבוקון).
- מחממים את אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס.
- מעבירים את שני בקבוקוני התאים למעבדה על קרח יבש וטובלים באמבט מים מיד לאחר הסרתם מקרח יבש. הפשירו את שני הבקבוקונים בו זמנית.
- הסר את הבקבוקונים מאמבט המים כאשר נותר רק גביש קרח קטן; זה ייקח בערך 3 דקות לאחר טבילה. אין לערבל או לערבב את התאים באמבט המים.
- רססו את הבקבוקונים ב-70% EtOH והעבירו אותם לארון הבטיחות הביולוגית.
- הוסף 500 μL של מדיה שלמה +DOX/ROCKi טיפה לכל בקבוקון לפני העברת כל מתלה לצינורות נפרדים של 15 מ"ל.
- טען את המדיה בכל שפופרת ל- 8 מ"ל והמשך בשלבי ההדפסה הביולוגית לפי שלב 1.3.
- לאחר מודלים של הדפסה ביולוגית (שלב 1.3), הוסף מיד מדיה מלאה +DOX/ROCKi לכל בארות התרבות התלת-ממדית ומקם את המודלים באינקובטור ב 37 oC ו 5% CO2. אם אתה משתמש צלחת 96 באר, להוסיף 150 μL של מדיה לכל באר; אם אתה משתמש בצלחת 384 באר, השתמש 50 μL של מדיה לכל באר.
- אין צורך בשינויי מדיה במשך 48 השעות הראשונות של התרבות.
- בעת ביצוע שינויי מדיה בפקדים ובמודלים דו-ממדיים, יש להקפיד למנוע גרימת לחץ מכני, שעלול לנתק תרביות דו-ממדיות או לגרום לעיוות של ההידרוג'ל. בצע שאיפת מדיה והוספה איטית באמצעות מיקרופיפטה המצביעה על דופן הבאר.
- לאחר 48 שעות, בצע שינוי מדיה של 90% בכל הבארות והסר את ROCKi מהרכב המדיה (ראה שלב 2.14).
- לאחר 96-h, בצע שינוי מדיה נוסף של 90% בכל הבארות כדי להסיר DOX מהרכב המדיה (ראה שלב 2.14).
- לאחר שני שינויי מדיה של 90% ב- 48 שעות ו- 96 שעות, בצע 50% שינויי מדיה כל 48 שעות, כאשר 50% מהמדיה נשאפת ומוחלפת במדיה שלמה רעננה
- הרכב מדיה:
- מדיה מלאה: מדיה נוירובזאלית עם 1x GlutaMAX, 1x B27, 12.5 nM 2-mercaptoethanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF.
- מדיה מלאה בתוספת דוקסיציקלין (DOX): מדיה נוירובזאלית עם 1x GlutaMAX, 1x B27, 12.5 nM 2-מרקפטואתנול, 10 ng/mL נוירוטרופין-3 (NT3), 5 ng/μL גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), ו 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין.
- מדיה מלאה בתוספת מעכב DOX/ROCK (ROCKi): מדיה נוירובזאלית עם 1x GlutaMAX, 1x B27, 12.5 nM 2-מרקפטואתנול, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין ומעכב ROCK 10 μM.
3. ניתוח צמיחה עצבית
- מקם תאים במיקרוסקופ תא חי להדמיית שדה בהיר מיד לאחר הוספת מדיה לאחר הדפסה ביולוגית.
- השתמש בתוכנת מיקרוסקופ כדי לתזמן תאים לצילום בהגדלה של פי 4 בכל באר, כולל פקדים דו-ממדיים, כל 12 שעות למשך 7 ימים לפחות.
- בצע שינויי מדיה כל 48 שעות, כמפורט בסעיף 2, והחזיר את התאים למיקרוסקופ לאחר שינויי מדיה בכל פעם.
- לאחר 7 ימים של נתונים, לייצא את התמונות מהתוכנה בפורמט .jpg
- ייבא את כל התמונות .jpg לתוכנת ImageJ והמר קבצים לפורמט 8 סיביות. טען את תוסף NeuronJ ועקוב אחר צמיחת נוירויט בתמונות, כולל נקודות הסתעפות, באמצעות כלי העקיבה.
- השתמש בנתוני מעקב אחר נוירוטים שנוצרו מ- NeuronJ כדי להתוות צמיחת נוירוט לאורך זמן.
4. ניתוח כדאיות התא
- בכל נקודת זמן של 24 שעות בתרבית, יש להכתים 3 בארות או יותר לצורך ניתוח כדאיות התא באמצעות ערכת כדאיות חי/מת. חזור על שלב זה בנקודות זמן של 24 שעות או 48 שעות למשך המחקר.
- הכן מדיה מגיב חי/מת על ידי השעיית מגיב תאים חיים (1x Calcein-AM) ומגיב תאים מתים (1x ethidium homodimer-1) וכתם גרעיני 1x תאים חיים (Hoechst 33342) ב- 10 מ"ל של מדיה מופחתת בסרום ללא אדום פנול (Opti-MEM) 30 דקות לפני ההדמיה. תן למדיה מגיבה חיה/מתה להגיע ל- RT. אחסן מדיה מגיבה חיה/מתה מאור ישיר עקב הלבנה פלואורסצנטית.
- יש להסיר מדיה מ-3 בארות המכילות מודלים סלולריים/בקרות דו-ממדיות, תוך מניעה זהירה של הפרעות בג'ל. שטפו את דגמי התאים פעם אחת עם PBS סטרילי RT. הוסף 100 μL של מדיה מגיב חי/מת לכל באר עבור צלחת 96 באר או 25 μL עבור צלחת 384 באר.
- דגרו על הדגמים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- לאחר הדגירה, מודלים מוכנים להדמיה. בצע הדמיה על כל מיקרוסקופ סטנדרטי עם תעלות עירור אדומות (647 ננומטר, תאים מתים), ירוק (488 ננומטר, תאים חיים) וכחול (405 ננומטר, כתם גרעיני). לקבלת התוצאות הטובות ביותר במודלים תלת-ממדיים, מודלי תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל תוכן גבוה ובצעו הדמיה באמצעות פונקציית Z-stack בהגדלה של פי 4 או 10x.
הערה: במחקר זה, מודלים של תאים צולמו באמצעות INCell Analyzer 6500HS (מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה), והניתוח בוצע באמצעות Signals Image Artist (פלטפורמת ניתוח תמונות, ראה שלב 4.7). - לאחר השלמת ההדמיה, יש להחזיר מודלים של תאים לאינקובטור תרביות התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2. עם זאת, השמיט מודלים של תאים המשמשים לניתוח כדאיות ממחקרים נוספים בגלל מדיה מגיב חי/מת על כדאיות לטווח ארוך.
- ניתוח תמונות על פלטפורמת ניתוח תמונות
- בחר כל מישור של תמונת Z-stack בתוכנה. שלבו תמונות מישור כתמונת הקרנה בעוצמה מרבית.
- צור ניתוח חדש על-ידי בחירת המודל המודפס ביולוגית כאזור עניין (ROI) על-ידי זיהוי פלואורסצנטיות מערוץ התא החי ב- 488 ננומטר (ודא שכל התאים נבחרים תחת החזר השקעה).
- בתוך אזור העניין, השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לזהות את מספר התאים בהחזר ההשקעה באמצעות תעלת הכתם הגרעיני (405 ננומטר), מספר התאים החיים ב- ROI באמצעות ערוץ 488 ננומטר, ומספר התאים המתים ב- ROI באמצעות ערוץ 647 ננומטר.
- הפעל את הניתוח על כל בארות מודל התא המטופל חי/מת וייצא את טבלת הנתונים המכילה שטח ROI, מספר התאים הכולל, מספר התאים החיים ומספר התאים המתים.
- חשב את מספר התאים החיים והמתים כאחוז ממספר התאים הכולל ליום ניתוח.
5. אימונוסטיין וניתוח אוכלוסיית תאים
- לפני הקיבוע, הסר מדיה מדגמי התאים ושטוף את הדגמים פעם אחת ב- PBS.
- תקן תאים עם 4% (v/v) paraformaldehyde ב- PBS ב- RT למשך 20 דקות.
זהירות: כל עבודה עם paraformaldehyde חייב להתבצע על פי נהלי מעבדה. - שאפו 4% (v/v) תמיסת פרפורמלדהיד מהדגמים ושטפו את הדגמים ארבע פעמים ב-PBS כדי להסיר לחלוטין את הפרפורמלדהיד.
- חדרו את דגמי התאים עם 0.2% טריטון-X למשך 30 דקות ב-RT ושטפו שלוש פעמים עם PBS.
- חסום את דגמי התאים באמצעות 10% (v/v) סרום חמור רגיל (NDS) למשך 3 שעות ב- RT.
- הסר את תמיסת החסימה והוסף נוגדנים ראשוניים (מדוללים ב- 1% v/v NDS ב- PBS) למודלים. אם אתם מבצעים ניתוח יחס אוכלוסיית תאים (ראו שלב 5.11), הקפידו לכלול מודלים של תאים המוכתמים יחד עבור טובולין Β-III (עם צימוד AF647 אדום) ו-GFAP (עם צימוד AF488 ירוק). לדגור מודלים עם נוגדנים ראשוניים במשך 24 שעות ב 4 ° C.
- לאחר הדגירה הראשונית, שטפו את הדגמים המוכתמים בנוגדנים ראשוניים מצומדים שלוש פעמים ב-PBS וכתם נגדי עם 20 מיקרומטר Hoechst למשך 30 דקות. התמונה כמפורט בשלב 5.10.
- שטפו את הדגמים המוכתמים בנוגדנים ראשוניים לא מצומדים שלוש פעמים ב-PBS והוסיפו נוגדנים משניים (מדוללים ב-1% v/v NDS ב-PBS). לדגור במשך 24 שעות ב 4 ° C.
- הסר נוגדנים משניים על ידי שטיפה שלוש פעמים ב- PBS, ומודלים נגד כתמים עם 20 מיקרומטר Hoechst במשך 30 דקות לפני ההדמיה.
- בצע הדמיה על מיקרוסקופים סטנדרטיים עם תעלות עירור אדומות (647 ננומטר) וירוקות (488 ננומטר). עם זאת, לקבלת התוצאות הטובות ביותר במודלים תלת-ממדיים, מודלי תמונה המשתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי בעל תוכן גבוה ומבצעים הדמיה באמצעות פונקציית Z-stack בהגדלה של פי 4 או 10x.
- ניתוח יחסי אוכלוסיית תאים על פלטפורמת ניתוח התמונה
- קבל ניתוח של אוכלוסיות תאים באמצעות מודלים המוכתמים במשותף עבור GFAP (עם צימוד AF488) וטובולין Β-III (עם צימוד AF647).
- בחר כל מישור של תמונת ערימת Z בתוכנה ושלב את תמונות המישור כתמונת הקרנה בעוצמה מרבית.
- צור ניתוח חדש על-ידי בחירת המודל המודפס ביולוגית כהחזר השקעה על ידי זיהוי פלואורסצנטיות מתעלת הטובולין Β-III ב- 647 ננומטר (ודא שכל האזור המכיל תאים נבחר תחת החזר השקעה).
- במסגרת החזר ההשקעה, השתמש בתוכנה כדי לזהות את מספר התאים בערוץ Hoechst (405 ננומטר), מספר האסטרוציטים של GFAP+ בהחזר ההשקעה באמצעות ערוץ 488 ננומטר, ומספר תאי Β-III tubulin+ בערוץ ROI באמצעות ערוץ 647 ננומטר.
- הפעל את הניתוח על כל בארות מודל התאים המוכתמות במשותף וייצא את טבלת הנתונים המכילה אזור ROI, מספר התאים הכולל, מספר תאי GFAP+ ומספר תאי Β-III tubulin+.
- חשב את מספר תאי GFAP+ ו- Β-III tubulin+ כאחוז ממספר התאים הכולל.
Representative Results
ניתוח גדילה של נוירויט
בפרוטוקול זה, נוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים שמקורם ב-iPSC הודפסו ביולוגית בחקלאות משותפת למטריצת הידרוג'ל באמצעות המדפסת הביולוגית התלת-ממדית. במהלך 7 הימים הראשונים לאחר ההדפסה, תאים צולמו כל 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים. לאחר הדפסה ביולוגית, תאים צריכים להיות בעלי מורפולוגיה מעוגלת ויש לפזר אותם ברחבי מטריצת ההידרוג'ל, תוך שינוי הדרגתי ליצירת צבירי תאים קטנים יותר עם מעט בליטות במהלך הימים הראשונים של התרבית (ראה סרטון משלים 1 לצמיחת תאים בריאה מייצגת). ביום הרביעי, תאים בריאים ינדדו לאורך הג'ל ויצרו אשכולות גדולים יותר, המחוברים דרך גידולי עצבים. ביום ה-7 כמעט ולא אמורים להישאר תאים בודדים, הצרורות המחוברים של תאי עצב ותחזיות אסטרוציטיות אמורים להיראות מבוצרים, וניתן לראות הרבה גידולים קטנים יותר של תאי עצב נוצרים מהצבירים (איור 2A). באמצעות סדרה של תמונות שדה בהיר של תאים חיים שצולמו במהלך תקופת הגדילה בת 7 הימים, בוצע ניתוח של צמיחת נוירוטים כמפורט בסעיף 3. ניתוח זה הראה כי צמיחת תאי עצב גדלה באופן ליניארי כמעט (ערך R2 = 0.84) בין 12 שעות ל-156 שעות (איור 2B). במהלך תקופה זו של צמיחת נוירוטים, אשכולות גוף התא גדלים גם הם (ראה סרטון משלים 1), מה שמעיד על נדידת תאים לאורך ההידרוג'ל.
כדאיות התא ויחס האוכלוסייה
בפרוטוקול זה, ריכוז של 20 מיליון תאים/מ"ל, הכולל 15 מיליון נוירונים/מ"ל ו-5 מיליון אסטרוציטים/מ"ל, משמש להדפסה ביולוגית של מודלי התא. באמצעות צביעת תאים חיים עם calcein-AM (תאים חיים), ethidium homodimer-1 (תאים מתים) וכתם גרעיני, ניתן לחשב את מספר התאים ששרדו במשך תקופה של 7 ימים לפי סעיף 4 (איור 3A). תוצאות כדאיות התא עבור תרביות מייצגות מוצגות ליום 4, שבו 72% ±-1% (ממוצע ± SEM) מכלל התאים חיים ומראים צביעה עבור Calcein-AM, בעוד ש-29% ±-2% (ממוצע ± SEM) בסך הכל תאים מתים ומראים צביעה עם אתידיום הומודימר-1 (איור 3B). תמונות מייצגות של צביעת תאים עם Calcein-AM ו-ethidium homodimer-1 ניתן לראות באיור משלים 1. יש לציין כי לא ניתן להשוות ישירות את ערכי הישרדות התאים של תרביות תלת ממדיות לתרביות דו-ממדיות, שכן תאים מתים נשמרים בהידרוג'ל ולא יוסרו במהלך תהליכי הזנת תאים.
באמצעות הצביעה האימונופלואורסצנטית עבור Β-III tubulin ו-GFAP, כפי שמתואר בסעיף 5 ובאיור 4, ניתן לבצע ניתוח תמונה כדי לקבוע את יחסי אוכלוסיית התאים בין תאי עצב לאסטרוציטים (איור 3A). מתוך סך התאים למודל בתרביות מייצגות, נוירונים חיוביים של Β-III טובולין מייצגים 49% ± 3% (ממוצע ± SEM), בעוד אסטרוציטים חיוביים GFAP מייצגים 30% ± 4% (ממוצע ± SEM). זה נותן יחס של 1:1.5, אסטרוציטים לנוירונים, בהתאמה. פעולה זו משאירה שארית של 21% בסך התאים לכל דגם, שאינם מכתימים אף אחד מסמני התא. מכיוון שניתוח כדאיות התא הראה כי ערך ממוצע של 29% מהתאים אינו בר קיימא ביום 4, סביר להניח כי תאים אלה מתים בתוך ההידרוג'ל.
ביטוי סמני תא
המורפולוגיה של תאי העצב והאסטרוציטים המודפסים ביולוגית הוערכה באמצעות צביעה חיסונית עבור סמן מסוג תא עצבי (Β-III tubulin) וסמן אסטרוציטי (GFAP). בתרביות המייצגות המוצגות, צביעת מערכת החיסון ממוקמת לסוגי תאים בודדים, ומראה מורפולוגיה בריאה של התא, כאשר שני סוגי התאים מציגים צמיחה של בליטות תאיות (איור 4A,B). מאחר שמבני ההידרוג'ל והתא הם תלת-ממדיים, כל תמונה מייצגת רק פרוסה אחת דרך המבנה באיור 4A,B. איור 4C מראה ערימה ממוזגת של תמונות ברחבי ההידרוג'ל, המדגימות תצוגות של לוקליזציה של תאים במישורי X, Y ו-Z. איור 4D מראה צביעה חיסונית עבור טובולין Β-III בלבד; הדגשת גידולי עצבים עדינים יותר מצברי גוף התא. כדי לבחון עוד יותר את הפנוטיפ של הנוירונים הגלוטמטרגיים, ניתן לבצע צביעה חיסונית עבור סמן הקולטן היוני הגלוטמטרגי, GluR2. בתוך איור 4E, אזור 4E.1 (כניסה) הודגש כדי להראות צביעת ניקוב ברזולוציה גבוהה יותר לאורך צרורות הנוריט. לכן, זה מאשר כי נוירונים ב coculture זה יש פנוטיפ גלוטמטרגי. בכל התמונות של צביעת מערכת החיסון, ניתן לראות מבנים לא-תאיים מוכתמים אימונופלואורסצנטיים סביב צבירי התאים ותאי העצב. סביר להניח כי מבנים אלה מייצגים פסולת הנשמרת בתוך ההידרוג'ל בשילוב עם כמויות קטנות של נוגדנים לא ספציפיים הנקשרים להידרוג'ל. זה צפוי בתרביות מודפסות ביולוגיות, שכן במודלים של פיגומים תלת-ממדיים, תאים מתים ופסולת אינם מוסרים במהלך הזנת תאים. תמונה מייצגת של בקרה שלילית של אימונוסטיין מוצגת באיור משלים 2 להדגמה של קשירה לא ספציפית של נוגדנים משניים באמצעות הידרוג'ל.
איור 2: תאי עצב ואסטרוציטים גלוטמטרגיים הודפסו ביולוגית לתוך מטריצת ההידרוג'ל באמצעות המדפסת הביולוגית וצולמו כל 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. (A) תמונת שדה בהיר לדוגמה שצולמה של תרביות תאים במהלך ניתוח. התמונה מייצגת נקודת זמן של 156 שעות, וסרגל קנה המידה מייצג 400 מיקרומטר. (B) האורך הממוצע של גידולי נוירונים (μm) מהתרביות שנמדדו באמצעות חבילת NeuronJ עבור ImageJ. כל נקודת נתונים היא n = 3 נוירונים, והנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ריכוז של 20 מיליון תאים/מ"ל של תמיסת אקטיבטור שימש להדפסה ביולוגית של מודלים של תאים. (A) כדאיות התא חושבה באמצעות צבעי תאים חיים/מתים (Calcein-AM ו-ethidium homodimer-1, בהתאמה). הערכים מראים כי 72% ± 1% (ממוצע ± SEM, n = 3) מכלל התאים לבאר הם חיים ו- 29% ± 2% (ממוצע ± SEM, n = 3) מהתאים מתים מכלל אוכלוסיית התאים לבאר ביום 4. הערכים המוצגים מייצגים ממוצע ± SEM. (B) אחוז אוכלוסיות התאים של תאי עצב ואסטרוציטים לבאר חושבו באמצעות ניתוח תמונה של צביעה המוצגת באיור 4. תאי עצב מייצגים את אחוז התאים שהוכתמו חיוביים לטובולין Β-III ביום 7 (49% ± 3%, ממוצע ± SEM, n = 3), בעוד שאסטרוציטים מייצגים את אחוז התאים שהוכתמו חיוביים ל-GFAP ביום 7 (30% ±-4%, ממוצע ± SEM, n = 3). הערכים המוצגים מייצגים ממוצע ± SEM. כל ההדמיה לחישובים המוצגים באיור 3 בוצעה על מערכת הדמיה קונפוקלית, וכל הניתוחים בוצעו על פלטפורמת ניתוח התמונה ועל GraphPad Prism בהתאם לשיטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי של סמנים מסוג תא עצבי בתרביות תלת-ממדיות מודפסות ביולוגית של נוירונים גלוטמטרגיים ואסטרוציטים ביום 7 . (A,B) צביעה אימונופלואורסצנטית של הסמן העצבי Β-III טובולין וסמן אסטרוציטים GFAP, שצולם על פלטפורמת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (C) צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן עצבי β-III טובולין וסמן אסטרוציטים GFAP מוכתם יחד עם Hoechst, מוצג בתצוגת מישור XYZ, מצולם על מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 10. נוצר בפלטפורמת ניתוח התמונות. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (D) צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן עצבי β-III טובולין מוכתם יחד עם Hoechst, בתמונה על מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 20. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (E) צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן גלוטמטרגי GluR2 מוכתם יחד עם Hoechst, מצולם על פלטפורמת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10. תיבה 3E.1 מציגה אזורים מודגשים של צביעת GluR2. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון משלים 1: נוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים הודפסו ביולוגית לתוך מטריצת ההידרוג'ל באמצעות המדפסת הביולוגית וצולמו כל 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. וידאו של תמונות שדה בהיר שצולמו של תרביות תאים במהלך ניתוח, נקודות זמן מסומנות בפינה הימנית התחתונה, וסרגלי קנה מידה מייצגים 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 1: תמונות לדוגמה של ניתוח חי/מת של תאי עצב ואסטרוציטים מודפסים ביולוגית ביום 4. כתם Calcein-AM מוצג בירוק (488 ננומטר), וכתם אתידיום הומודימר מוצג באדום (647 ננומטר). התמונה מוצגת בתצוגת מישור XYZ, שנוצרה בפלטפורמת ניתוח התמונה . סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (A) ההדמיה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 4. (ב) ההדמיה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 10 אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים 2: דוגמה לתמונת בקרה שלילית לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית. נוגדנים ראשוניים הושמטו, ונוגדנים משניים ירוקים (488 ננומטר) ואדומים (647 ננומטר) שימשו בהתאם לפרוטוקולים של צביעת מערכת החיסון. התמונה מוצגת בתצוגת מישור XYZ, שנוצרה בפלטפורמת ניתוח התמונות. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. ההדמיה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 10. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הצורך במודלים מדויקים של מערכת העצבים המרכזית מעולם לא היה גבוה יותר, והמגבלות של מודלים דו-ממדיים מסורתיים (2D) של תרביות תאים הניעו דור של מודלים מורכבים של מערכת העצבים המרכזית בשניםהאחרונות 19. עם זאת, מודלים תלת-ממדיים מורכבים רבים המייצגים אינטראקציות בין סוגי תאים עצביים לבין ECM יש מגבלות שימנעו את היישום של מודלים אלה בתהליכים תעשייתיים 6,20,21. בפרוטוקול זה, אנו מפתחים מודל קוקולטורה תלת-ממדית של נוירונים ואסטרוציטים אנושיים שמקורם ב-iPSC, שמטרתו לפתור חלק מהמגבלות הללו באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כדי ליצור פיגום הידרוג'ל ביו-אקטיבי בפורמטים של 96 בארות ו-384 בארות.
המתודולוגיה לפיתוח מודלים אלה פשטה באמצעות תוכנת עיצוב מפת הלוחות, פרוטוקולי הדפסה שנוצרו באופן אוטומטי ותהליך הדפסה מודרך מהמדפסת הביולוגית. עם זאת, בשל האופי הרגיש של סוגי התאים הרגישים שמקורם ב-iPSC המשמשים בפרוטוקול זה, יש לנקוט בזהירות עם השלבים הקריטיים הבאים בהפשרה ובתרבית. ראשית, להכללת מעכב ROCK (ROCKi) יש מספר יתרונות לאורך תהליך ההדפסה הביולוגית ובמהלך התרבות המוקדמת. הפשרת תאים היא נקודה קריטית שבה תאי העצב יכולים לחוות תגובת דחק, ופרוטוקולי הפשרה לא נכונים יכולים להקטין את סיכויי ההישרדות22. בדרך כלל מומלץ להפשיר תאים, להוסיף מדיה ולהעלות את התאים לטמפרטורת האינקובטור בצורה יעילה ככל האפשר23. עם זאת, במהלך תהליך ההדפסה הביולוגית המתואר בפרוטוקול זה, יש צורך שתאי עצב ואסטרוציטים יושהו מחדש בתמיסת אקטיבטור ולא במדיה, ותאים לא יתרוממו מעל טמפרטורת החדר עד סוף ריצת ההדפסה (עד 30 דקות לאחר ההפשרה). לפיכך, הוספת ROCKi למדיה מיד לאחר ההפשרה והכללתה במהלך שני שלבי הצנטריפוגה (שלבים 2.1--2.7 ו-1.3.15-1.3.20) הכרחית כדי לעכב מסלולי לחץ תאי, מה שיביא לרמות כדאיות נמוכות יותר24. יתר על כן, הוכח כי ROCKi מקדם צמיחה של נוירוטים ומשפר את ההתבגרות העצבית25. לפיכך, תוספת ROCKi נמשכת במשך 48 שעות לאחר הדפסה ביולוגית. עם זאת, זה הכרחי להסיר תוספת ROCKi לאחר 48 שעות כדי להבטיח שטיפה מלאה במהלך שינויי המדיה הבאים לפני התאים משמשים לבדיקה.
צעד נוסף הדורש תשומת לב קריטית הוא במהלך הוספת מדיה לאחר הדפסה ושינויים במדיה (שלבים 2.8-2.13). פיגום ההידרוג'ל המודפס ביולוגית הוא בעל קשיחות ביומכנית שוות ערך של 1.1 kPa בלבד, שווה ערך לחומר אפור. כפי שמתואר בשלב 2.10, קריטי לחדור בעדינות לצד הבאר במהלך חיבור המדיה ושאיפה למניעת הפרעה. זה רלוונטי במיוחד לצלחות 384 באר, שם רמת הג'ל תופסת שיעור גבוה יותר מנפח הבאר הכולל. שיטה זו צריכה לשמש גם בארות בקרה דו-ממדיות כדי למנוע הרמת קצה של תאים וגזירה של גידולי עצבים. המחברים רוצים גם להדגיש את החשיבות של טכניקה סטרילית בתוך המדפסת הביולוגית, אשר יש להתייחס אליה בזהירות שווה לזו של ארון בטיחות ביולוגית המשמש לתרביות תאים שמקורם ב- iPSC. זה כולל סינון סטרילי 70% EtOH ו-dH2O המשמש בתהליכי התאורה הירוקה וההדפסה, שמירה על מכסים על המחסניות והלוחות בעת העברת ידיים פנימה והחוצה מהמדפסת הביולוגית, וחיטוי משטחים בתוך המדפסת הביולוגית עם מגבוני אתנול 70% לפני ואחרי ההדפסה.
פיגום ההידרוג'ל המודפס ביולוגית, הנוצר מפתרונות ביו-דיו ואקטיבטור, שנבחר לפיתוח מודל זה, נבחר מתוך מגוון פתרונות ביו-דיו ואקטיבטור שפותחו על ידי Inventia Life Science לשימוש במדפסת הביולוגית RASטרום. למינין וחומצה היאלורונית זוהו כמולקולות רלוונטיות להבשלה עצבית הנגזרת מ- iPSC בשל תפקידן בהנחיה אקסונלית, היווצרות סינפסות ויצירת הרשת הפרינוירונלית26,27. יתר על כן, נבחרה קשיחות ביומכנית של 1.1 kPa, שכן הידרוג'לים בצפיפות נמוכה יותר הוכחו כמאפשרים צמיחה טובה יותר של נוירונים12. אם נעשים שינויים בפרוטוקול באמצעות נוירונים ואסטרוציטים שהובחנו בתוך החברה או מספק מסחרי אחר, מומלץ לבצע בדיקת בחירת מטריצה כדי לקבוע את פיגום ההידרוג'להתומך ביותר 15. יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות התאים אם נעשים שינויים במקורות התא כדי להבטיח כדאיות אופטימלית ולמנוע צפיפות הידרוג'ל. עבור כל השינויים ופתרון הבעיות הקשורים לפונקציית המדפסת הביולוגית, המחברים ממליצים לפנות ליצרנים ולהפנות לפרוטוקולי יצרן.
מערכת העצבים המרכזית מכילה מגוון רחב של תת-סוגים עצביים ותאי גלייה, שכולם קיימים בגומחות מוח שונות ויש להם תפקידים ספציפיים התורמים לתפקוד העצבי28. בהקשר של טווח רחב זה, מודל זה מייצג רק את שני סוגי התאים הנפוצים ביותר (אסטרוציטים ונוירונים גלוטמטרגיים מעוררים). סוגי תאים חשובים כגון מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים ותאי אנדותל יוצרי מחסום דם-מוח מושמטים ממערכת זו. הכללת מיקרוגליה יכולה להיות רלוונטית בהתמקדות באינטראקציות נוירואימוניות, ואוליגודנדרוציטים יכולים להיות בעלי עניין במחלות המשפיעות על מיאלינציה מרכזית. בנוסף לתפקידם בפתולוגיה, תאים כגון תאי אנדותל יוצרי מחסום דם-מוח מפרישים אנזימים לחילוף חומרים של תרופות, מה שעשוי להשפיע על השימוש במודל זה לבדיקות פרמקוקינטיות29. מגבלה נוספת של המודל עשויה להיות היחס בין אסטרוציטים לנוירונים; היחס בין אסטרוציטים לנוירונים משתנה מאוד בין אזורי המוח, עם ערכים מוצעים של בין 1:1 ל-1:330,31. מודל זה יש יחס משוער של 1:1.5 אסטרוציטים לנוירונים; לכן, ייתכן שהמודל הזה לא יהיה רלוונטי למודלים של אזורים במוח שבהם אסטרוציטים נפוצים יותר, כמו למשל באזורי החומר הלבן30.
פרוטוקולים אחרים לפיתוח מודלים של חקלאות ביולוגית מודפסת בתלת ממד פורסמו בשנים האחרונות. פרסום של Sullivan et al., 2021, הציג מודל עצבי מודפס ביולוגית תלת-ממדית באמצעות תאי אב עצביים שמקורם ב-iPSC, אשר מדגים כדאיות גבוהה לאחר הדפסה ושיפור התפקוד העצבי בהשוואה לתרביות דו-ממדיות32. עם זאת, בפרוטוקול זה, תאי אב עצביים שימשו כמקור תא ונשמרו בתרבית במשך 4 שבועות. בפרוטוקול זה נעשה שימוש מסחרי בנוירונים גלוטמטרגיים ובאסטרוציטים שמקורם ב-iPSC. זה מאפשר רשת תלת ממדית של תאים בתרבית משותפת כדי לקום בתוך 7 ימים בלבד; כפי שהודגם על ידי ניתוח צמיחת נוירוטים, צמיחת נוירויט מתחילה תוך 24 שעות וממשיכה באופן ליניארי לאורך 156 השעות שעבורן נוטרה צמיחת תאים. את ההקמה המהירה של רשתות אלה ניתן לייחס בחלקה לשימוש בנוירונים גלוטמטרגיים המשתמשים בביטוי גנים אופטימלי של NGN2 המושרה על ידי דוקסיציקלין, אשר מראה ביטוי של סמנים תת-עצביים בוגרים בתוך 7 ימים, אפילו בתרבית דו-ממדית33. קיצור תקופת צמיחה זו באמצעות טכניקה זו חשוב ליישום מודלים בתעשיית הביו-פרמצבטיקה, שכן פיתוח בדיקות דורש תפנית ופיתוח מהירים של מודלים תאיים15.
לסיכום, מודל זה מראה פוטנציאל למודל תלת ממדי של נוירונים ואסטרוציטים, אשר נקבע במהירות ובנוחות למטרות סינון. יישומים עתידיים עבור סוג מודל זה יכולים להיות עבור מאמצי גילוי תרופות על פני מחלות CNS שונות, עם הזדמנות להתרחב למחלות שונות באמצעות חולים או מחלות ערוכות גנטית iPSC. יתר על כן, השימוש בתאי עצב גלוטמטרגיים המופקים מ-iPSC בביטוי NGN2 המושרה על ידי דוקסיציקלין מאפשר לתאים להגיע לבגרות בפחות זמן, אשר ניתן לנצל לפיתוח מודלים של המוח המזדקן לחקר ניוון עצבי. מערכת זו יכולה להתרחב גם באמצעות שימוש בסוגי תאים נוספים בחקלאות משותפת, כולל מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים.
Disclosures
CW, NC ו-JB הם עובדים של Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, לונדון, בריטניה. YH הוא עובד של Merck Sharp & Dohme LLC, חברת בת של Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
איור 1 נוצר באמצעות Biorender.com.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאלכס וולקרלינג, מרטין אנגל ורייצ'ל אקונומיק על עזרתם בפיתוח הפרוטוקול והמשוב על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 384-well plate | PerkinElmer | 6057300 | |
| 96-well plate | PerkinElmer | 6055300 | |
| Activator fluid F299 | Inventia Life Science | N/A | |
| Activator fluid F3 | Inventia Life Science | N/A | |
| B27 (50x) minus Vit A | Thermofisher | 12587010 | |
| Bioink fluid F261 | Inventia Life Science | N/A | |
| Bioink fluid F32 | Inventia Life Science | N/A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D5207 | |
| GlutaMAX (100x) | Thermofisher | 35050061 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Hoechst | Abcam | ab228551 | |
| Human BDNF Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7074 | |
| Human NT3 Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7036 | |
| iCell Astrocytes | Fujifilm CDI | 1434 | |
| INCell Analyser 6500HS | Molecular Devices | N/A | high content imaging system |
| Incucyte S3 | Sartorius | N/A | |
| ioGlutamatergic Neurons (Large vial) | Bit.bio | e001 | |
| Laminin (1 mg/mL) | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Neurobasal media | Thermofisher | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Abcam | ab7475 | |
| NucBlue Live (Hoechst 33342) | Thermofisher | R37605 | |
| Opti-MEM | Thermofisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PEI 50% in H2O | Sigma Aldrich | 181978 | |
| Pierce Borate Buffer 20x | Thermofisher | 28341 | |
| Prism | GraphPad | Data analysis software | |
| Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) | Abcam | ab206293 | |
| RASTRUM(TM) Bioprinter | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter |
| RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter Cartridges |
| RASTRUM(TM) Targeting plate | Inventia Life Science | N/A | Targeting plate |
| Rho kinase (ROCK) inhibitor | Abcam | ab120129 | |
| Sheep anti-GFAP NL493 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Signals Image Artist | PerkinElmer | N/A | Image analysis platform |
| Triton X-100 | Thermofisher | HFH10 | |
| Zeiss Axio Observer | Zeiss | N/A | Inverted microscope platform |
References
- Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
- Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1 (2020).
- Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , Springer, Singapore. (2019).
- Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22 (2021).
- Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
- Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
- Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
- Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
- Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159 (2019).
- Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760 (2022).
- Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242 (2019).
- Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
- Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165 (2018).
- Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
- Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876 (2021).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
- Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
- Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328 (2020).
- de Souza, N.
- Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
- Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960 (2021).
- Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
- Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799 (2022).
- Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
- Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
- Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
- Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
- Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
