Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera 3D-bioprintade samkulturer av iPSC-härledda neuroner och astrocyter. Denna samodlingsmodell, genererad i en hydrogelställning i 96- eller 384-brunnsformat, visar hög post-print-viabilitet och neuritutväxt inom 7 dagar och visar uttrycket av mognadsmarkörer för båda celltyperna.
Abstract
För att en cellmodell ska vara användbar för läkemedelsscreening måste systemet uppfylla kraven på genomströmning och homogenitet samtidigt som det har en effektiv utvecklingstid. Många publicerade 3D-modeller uppfyller dock inte dessa kriterier. Detta begränsar därför deras användbarhet i tidiga läkemedelsupptäcktstillämpningar. Tredimensionell (3D) bioprinting är en ny teknik som kan tillämpas på utvecklingen av 3D-modeller för att påskynda utvecklingstiden, öka standardiseringen och öka genomströmningen. Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla 3D-bioprintade samodlingsmodeller av humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda glutamatergiska neuroner och astrocyter. Dessa samkulturer är inbäddade i en hydrogelmatris av bioaktiva peptider, fullängds extracellulär matris (ECM) proteiner och med en fysiologisk styvhet på 1,1 kPa. Modellen kan snabbt etableras i format med 96 brunnar och 384 brunnar och ger en genomsnittlig post-print-viabilitet på 72 %. Förhållandet mellan astrocyter och neuroner i denna modell visar sig vara 1:1,5, vilket ligger inom det fysiologiska intervallet för den mänskliga hjärnan. Dessa 3D-bioprintade cellpopulationer visar också uttryck av mogna neurala celltypsmarkörer och tillväxt av neurit- och astrocytprojektioner inom 7 dagar efter odling. Som ett resultat är denna modell lämplig för analys med hjälp av cellfärgämnen och immunfärgningstekniker tillsammans med neuritutväxtanalyser. Förmågan att producera dessa fysiologiskt representativa modeller i stor skala gör dem idealiska för användning i screeninganalyser med medelhög till hög genomströmning för neurovetenskapliga mål.
Introduction
Forskningen om sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) inom läkemedelsindustrin expanderar1. Men många vanliga CNS-sjukdomar som epilepsi, schizofreni och Alzheimers sjukdom har fortfarande inga botande behandlingar 2,3,4. Bristen på effektiva terapier för CNS-sjukdomar kan, åtminstone delvis, tillskrivas bristen på exakta in vitro-modeller av hjärnan5. Detta har resulterat i en translationell klyfta mellan nuvarande in vitro-modeller och in vivo-data och en efterföljande flaskhals i forskningsinsatserna.
Drivet av detta translationella gap har det skett en betydande ökning av utvecklingen av nya 3D-cellmodeller under de senaste åren, inklusive neurala organoider, neurosfäroider och ställningsbaserade modeller6. 3D-strukturen i dessa modeller hjälper till att rekapitulera den neurala mikromiljön, inklusive biomekaniska påfrestningar, cell-cellkontakter och hjärnans extracellulära matris (ECM)7. Hjärnans ECM är ett dynamiskt element i neurofysiologin som upptar utrymmet mellan neurala celltyper, inklusive neuroner, astrocyter, oligodendrocyter och den neurovaskulära enheten7. Rekapitulation av hjärnans ECM har visat sig påverka neuronal morfologi och neuronal avfyrning, och många komplexa 3D-modeller av hjärnan har visat avsättning av ECM-proteiner av neurala celltyper 8,9,10,11. Ställningsbaserade modeller består av mogna neurala samkulturer suspenderade i en porös syntetisk eller biologisk hydrogelmatris som representerar hjärnans ECM12. Till skillnad från organoid- och sfäroidsystem tillåter ställningsbaserade 3D-modeller anpassning av närvarande ECM-proteiner och har den extra fördelen att hydrogelstyvheten kan justeras för att efterlikna biomekaniska spänningar13,14.
Även om en överväldigande majoritet av 3D-neurala modeller visar en ökad rekapitulation av hjärnans mikromiljö, är inte alla modeller väl lämpade för att implementera applikationer för läkemedelsupptäckt15. För att en 3D-modell ska kunna implementeras i industriella processer måste systemet uppfylla genomströmningskraven för screeningapplikationer och ha en relativt kort utvecklingstid16. 3D-bioprinting är en ny teknik som erbjuder potential att skapa 3D-stödbaserade neurala modeller med snabb utvecklingstid, ökad genomströmning och högre nivåer av precisionskontroll, tillsammans med avlägsnande av variabilitet orsakad av mänskliga fel17. Detta protokoll presenterar en 3D-samodlingsmodell av humana iPSC-härledda glutamaterga neuroner och astrocyter i en hydrogelställning. Denna hydrogelställning innehåller fysiologiskt representativa bioaktiva peptider (RGD, IKVAV, YIGSR) och ECM-proteiner inom en mimetisk biomekanisk styvhet. Dessa fullängds ECM-proteiner inkluderar fullängdslambinin-211 och hyaluronsyra, som finns rikligt i den mänskliga hjärnbarken, med en styvhet på 1,1 kPa i linje med in vivo-mätningar 18. Denna modell är utformad med praktiska egenskaper för läkemedelsupptäckt och skapas med hjälp av en 3D-bioprinter i ett 96-brunnars eller 384-håls plattformat som är lämpligt för screeninganalys med hjälp av avbildningstekniker med cellfärgämnen och antikroppar, tillsammans med neuritutväxtanalyser. Cellerna visar uttryck av neurala celltypsmarkörer och tillväxt av neurit- och astrocytiska projektioner inom 7 dagar efter odling. Således kommer detta protokoll att presentera metodiken för att utveckla en 3D-modell för neural samkultur med hög genomströmning för användning i läkemedelsupptäcktsapplikationer.
Figur 1: Illustrativ översikt över den metod som används för att 3D-bioprinta samkulturer. Humana iPSC-härledda neuroner och astrocyter kombineras med aktivator- och biobläcklösningar som innehåller bioaktiva peptider och bioprintas till hydrogelställningar i 96-brunnars eller 384-brunnars format med hjälp av drop-on-demand bioprintningsteknik. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
1. Bioprintning av 3D-modeller
- Generering av plåtkarta och tryckfil
- Innan du skapar en modellritning ska du generera en plåtkarta, ett protokoll och en utskriftsfil med hjälp av plåtkartprogrammet. Öppna programvaran för plattkarta och välj alternativet Odlingsceller i 3D .
- Välj den modelltyp som ska bioprintas bland de tillgängliga alternativen i rullgardinsmenyn. Denna modell har validerats i modellformaten Imaging Model och HTP. Välj Bildmodell för 96-hålsplattor och HTP för 384-hålsplattor.
- I fönstret Matrisval väljer du Hydrogel Px02.53, som innehåller Laminin-211 och hyaluronsyraproteiner, med IKVAV-, RGD- och YIGSR-peptider.
- I popup-fönstret anger du celltyperna som glutamaterga neuroner och astrocyter och anger celltätheten som 20 miljoner celler/ml.
- Använd programvaran för att designa önskad plattkarta genom att markera brunnar på skärmplattan. Inkludera minst 1 rad med 2D-kontroll på plast i designen. 2D-kontroll på plastbrunnar består av celler som deponeras direkt i brunnen utan någon hydrogelställning; Belägg dessa brunnar enligt steg 1.2.
- Se till att plåtmodellen som anges högst upp i fönstret ändras till den avsedda plattmodellen för användning (se materialtabell).
- Ladda ner protokollet och utskriftsfilen för plåtkartan med hjälp av nedladdningsknapparna och spara dem på den bioprinterkopplade datorn.
- Beläggning av 2D-styrning på plastbrunnar
- Minst 24 timmar före utskrift, belägg brunnarna för 2D-kontrollmodellerna för cellvidhäftning och tillväxt. Brunnar av 3D-modell kräver ingen förbeläggning. Alla processer ska utföras i ett biosäkerhetsskåp om inget annat anges. Plåtar kan beläggas och förberedas upp till 7 dagar före tryckning.
- Gör 50 ml 1x boratbuffert genom att späda 2,5 ml 20x boratstamlösning med 47,5 ml steril dH2O.
- Tillsätt 100 μl 50 % (vikt/volym) polyetenimin (PEI) till 50 ml 1x boratbuffert för att skapa en 0,1 % (vikt/volym) PEI-lösning och sterilt filter genom ett 0,22 μm filter.
- Tillsätt 0,1 % (vikt/volym) PEI-lösning till varje 2D-kontrollbrunn, vilket indikeras av plattkartan som genererades i steg 1.1. Tillsätt 100 μL/brunn om du använder en 96-hålsplatta eller 25 μL/brunn om du använder en 384-hålsplatta.
- Inkubera plattan i 2 timmar vid 37 °C innan du aspirerar 0,1 % (vikt/volym) PEI-lösningen och sköljer brunnarna 5 gånger med PBS. Låt brunnarna torka helt i biosäkerhetsskåpet.
- Späd 100 μl 1 mg/ml lamininlösning i 5 ml neurobasalt medium. Tillsätt 100 μl till varje 2D-kontrollbrunn om du använder en 96-hålsplatta eller 25 μL om du använder en 384-hålsplatta. Inkubera i 4 timmar vid 37 °C.
- Om du förvarar plattor, låt lamininlösningen sitta kvar efter inkubationen och förvara vid 4 °C. Förvärm plattorna i 1 timme vid 37 °C före användning.
- 3D-bioprintning av samkulturmodeller
- Upprätthåll alltid en steril teknik när du använder bioprintern och torka av handskar, patroner och odlingsplattor med 70 % EtOH innan du sätter in dem i skrivaren. Om inget annat anges, utför alla processer utanför bioprintern i ett biosäkerhetsskåp.
- Slå på kompressorn för bioprintern och initiera skrivaren genom att välja knappen Initialize (Initiera ) på bioprinterprogramvaran. När luftflödet i skrivaren har startat torkar du av ytorna inuti skrivaren med en 70 % EtOH-servett.
- På utskriftsdagen, genomför den guidade Start of Day Greenlighting-processen för att säkerställa korrekt munstycksstatus för utskriftskörningen (minsta munstycksstatus 2A2B).
- Ta en bioprinterpatron från den sterila förpackningen, tillsätt 20 ml steril dH2O i fack A och tillsätt 6 ml sterilfiltrerad 70 % EtOH i fack B1-4. Sätt i patronen i den vänstra patronhållaren inuti bioprintern och placera tallrikslocket i den dedikerade lockhållaren.
- Välj knappen Greenlighting på programvarans startskärm och bekräfta i programvaran att patronen är på plats i bioprintern och att locket har tagits bort. Initiera greenlighting-processen.
- När du uppmanas av programvaran, bekräfta att inga konsekventa droppar kan ses från varken vänster eller höger nål. Därefter, när du uppmanas av programvaran, bekräfta att det finns vatten i B7- och B8-facken.
- Efter att bioprintern har slutfört det självstyrda greenlighting-steget, sätt in en obestruken steril 96-håls platt bottenplatta (separat från den belagda plattan för bioprintning av samkulturer) och sätt in den nya plattan i den högra platthållarsektionen på bioprintern när programvaran uppmanar dig att göra det. Se till att tallrikshållaren är inställd på High Profile Plate och att locket tas bort och placeras i den dedikerade lockhållaren innan du påbörjar nästa steg.
- Bioprintern kommer att deponera vattendroppar i varje brunn på plattan med 96 brunnar. När du är klar, placera plattan från bioprintern och kontrollera att det finns vattendroppar i varje brunn på plattan.
- Kassera plattan med 96 brunnar som används för grönt ljus och låt bioprintern avsluta greenlighting-processen. När det är klart kommer programvaran att ange munstycksstatus för bioprintern och bekräfta att bioprintern är redo att skriva ut modeller. Sätt på locket på bläckpatronen och ta bort den till biosäkerhetsskåpet för nästa steg.
- Med hjälp av bioprinterprogrammet laddar du utskriftsfilen (genererad i steg 1.1) i programvaran med hjälp av knappen Print Run Software och öppnar utskriftsprotokollets pdf-fil.
- Hämta biobläck och aktivatorvätskor, enligt utskriftsprotokollets pdf, från -20 °C och tina i rumstemperatur (RT) i 40 minuter. För hydrogelmatris Px02.53 kommer detta att inkludera: 1x injektionsflaska F32, 1xinjektionsflaska F3, 1x injektionsflaska F261, 1x injektionsflaska F299. Tina inte biobläck och aktivatorvätskor i händer eller vattenbad.
- Ta 50 ml komplett media med doxycyklin och ROCK-hämmare (komplett media +DOX/ROCKi) (se steg 2.2) till RT medan biobläck och aktivatorvätskor tinar.
- När biobläck och aktivatorer har tinats upp förbereder du bläckpatronen enligt instruktionerna på de två sista sidorna i pdf-filen med det genererade utskriftsprotokollet. Greenlighting-bläckpatronen kommer att återanvändas för modellutskriftsstegen.
- Se till att det finns 40 ml dH2O i fack A1 och 8 ml 70 % EtOH i facken B1 och B2. Tillsätt 1,2 ml aktivator F32 till C1, 1,2 ml F3 till C2 och 200 μl F261 till C4.
- Ta upp PEI- och lamininbelagd platta från inkubatorn och placera den inuti skrivaren i det högra platthållarfacket. Ta inte bort lamininmedialösningen från brunnarna vid denna tidpunkt. Se till att platthållarfacket är inställt på Low Profile Plate och att locket är borttaget och i lockhållaren.
- Placera bläckpatronen i bioprintern, se till att locket tas bort och placeras i hållaren, och starta utskriften på programvaran genom att välja knappen Print Inert Base (inert utskrift) i bioprinterprogrammet.
- Medan den inerta basen skrivs ut, hämta injektionsflaskorna med glutamaterga neuroner och astrocyter från lagring av flytande kväve, tina och återsuspendera enligt instruktionerna i avsnitt 2.
- När cellerna har tinats upp och 8 ml komplett media +DOX/ROCKi har tillsatts till varje celltyp separat (enligt avsnitt 2), centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera båda celltyperna separat i 1 ml komplett medium +DOX/ROCKi.
- Tillsätt 20 μl cellsuspension till 20 μl trypanblått och blanda innan cellerna räknas för att bestämma livskraftig cellkoncentration per ml för varje celltyp.
- Kombinera totalt 3 miljoner glutamaterga neuroner med 1 miljon astrocyter i ett 15 ml rör. Lägg till media för att skapa en total volym på 8 ml.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
- Aspirera så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa cellpelleten och återsuspendera cellpelleten i 200 μL aktivatorvätska F299.
- Observera att aktivatorvätskan är trögflytande; pipettera upp och ner för att återsuspendera pelleten helt. Celltyperna är känsliga; Minimera skjuvning och bubblor genom att använda en pipettspets med bred borrning och omvänd pipetteringsteknik. Pipettera upp och ner ordentligt inte mer än 3 gånger för att förhindra cellförlust.
- När det inerta bassteget är klart med utskriften, placera locken på patronen och odlingsplattan, ta bort båda från bioprintern och placera dem i biosäkerhetsskåpet.
- Tillsätt 200 μL cellsuspension i F299 till brunn C3 i tonerkassetten, sätt tillbaka patronen i bioprintern, ta bort locket och placera den i lockhållaren. Sätt inte tillbaka odlingsplattan ännu.
- Starta steget Utskriftsmodeller i utskriftskörningen. Medan bioprintern fyller på vätskor, ta bort lamininmedielösningen från plattans 2D-kontrollbrunnar och ersätt den med 150 μL komplett media +DOX/ROCKi i varje 2D-kontrollbrunn om du använder en 96-hålars platta och 50 μL komplett media +DOX/ROCKi om du använder en 384-hålars platta.
- När vätskorna har fyllts sätter du in målplattan för bioutskrift i bioprintern, tar bort locket och placerar den i lockhållaren.
- Påbörja inriktningsprocessen för bioprinter.
- När du uppmanas av programvaran för bioutskrift, ta bort målplattan från bioprintern.
- Använd guiden för att välja var droppar kan observeras på plattan. Sätt tillbaka inriktningsplattan i bioprintern och upprepa dropputskriften och urvalsprocessen.
- När du uppmanas, ta bort målplattan igen och ersätt den sedan med cellodlingsplattan (som innehåller media i 2D-kontrollbrunnarna enligt steg 1.3.25). Se till att kulturplattans lock är av och placerat i hållaren. Bioprintern kommer att slutföra modellutskriften.
- När modellutskriften är klar, följ cellodlingsmetoderna i avsnitt 2 (steg 2.8) för att tillsätta media till brunnarna.
- Påbörja rengöringsprocessen för bioprintern och, när den är klar, kassera patroner och återstående vätskor enligt laboratorieprotokoll.
2. Cellodling
- Modeller genereras med hjälp av 1x injektionsflaska med glutamaterga neuroner (>5 miljoner celler per injektionsflaska) och 1x injektionsflaska med astrocyter (>1 miljon celler per injektionsflaska).
- Värm vattenbadet till 37 °C.
- Transportera båda cellflaskorna till laboratoriet på torris och nedsänkta i ett vattenbad omedelbart efter avlägsnande från torrisen. Tina båda injektionsflaskorna samtidigt.
- Ta bort injektionsflaskorna från vattenbadet när endast en liten iskristall återstår. Detta tar cirka 3 minuter efter nedsänkning. Virvla eller blanda inte cellerna i vattenbadet.
- Spraya injektionsflaskorna med 70 % EtOH och överför dem till biosäkerhetsskåpet.
- Tillsätt 500 μl komplett medium +DOX/ROCKi droppvis i varje injektionsflaska innan varje suspension överförs till separata 15 ml rör.
- Fyll på materialet i varje tub till 8 ml och fortsätt med bioprintningsstegen enligt steg 1.3.
- Efter bioprintningsmodeller (steg 1.3), tillsätt omedelbart komplett media +DOX/ROCKi till alla 3D-samkulturbrunnar och placera modellerna i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 °C. Om du använder en 96-hålsplatta, tillsätt 150 μL media per brunn; Om du använder en platta med 384 brunnar, använd 50 μL media per brunn.
- Inga medieändringar krävs för de första 48 timmarna av kulturen.
- När du utför mediebyten på 2D-kontroller och modeller bör du vara försiktig för att förhindra att mekanisk spänning induceras, vilket kan lossna 2D-kulturer eller orsaka deformation av hydrogelen. Utför medieaspiration och tillsats långsamt med hjälp av en mikropipett som pekar nedåt på sidan av brunnen.
- Efter 48 timmar, utför ett 90 % mediebyte på alla brunnar och ta bort ROCKi från mediesammansättningen (se steg 2.14).
- Efter 96 timmar ska ytterligare 90 % av alla brunnar bytas ut för att avlägsna DOX från mediesammansättningen (se steg 2.14).
- Efter de två 90 % mediebytena vid 48 timmar och 96 timmar utförs 50 % mediebyten var 48:e timme, där 50 % av medierna aspireras och ersätts med nya kompletta medier
- Mediernas sammansättning:
- Kompletta medier: Neurobasala medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF.
- Komplett media plus doxycyklin (DOX): Neurobasala medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml neurotrofin-3 (NT3), 5 ng/μL hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) och 1 μg/ml doxycyklin.
- Komplett media plus DOX/ROCK-hämmare (ROCKi): Neurobasala medier med 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/ml doxycyklin och 10 μM ROCK-hämmare.
3. Analys av neurittillväxt
- Placera celler i ett levande cellmikroskop för ljusfältsavbildning omedelbart efter tillsats av media efter bioprinting.
- Använd mikroskopprogramvara för att schemalägga celler som ska avbildas med 4x förstoring i varje brunn, inklusive 2D-kontroller, var 12:e timme i minst 7 dagar.
- Utför mediebyten var 48:e timme, enligt beskrivningen i avsnitt 2, och sätt tillbaka cellerna i mikroskopet efter mediebyten varje gång.
- Efter 7 dagars data, exportera bilderna från programvaran i .jpg format
- Importera alla .jpg bilder till ImageJ-programvaran och konvertera filer till 8-bitarsformat. Läs in plugin-programmet NeuronJ och spåra neurittillväxt i bilder, inklusive grenpunkter, med hjälp av spårningsverktyget.
- Använd neuritspårningsdata som genereras från NeuronJ för att plotta neuritutväxt över tid.
4. Analys av cellviabilitet
- Vid varje 24-timmarstidpunkt i odlingen, färga 3 eller fler brunnar för cellviabilitetsanalys med hjälp av ett levande/dött viabilitetskit. Upprepa detta steg vid 24 timmar eller 48 timmar under hela studien.
- Förbered levande/döda reagensmedier genom att suspendera levande cellreagens (1x Calcein-AM) och döda cellreagens (1x etidiumhomodimer-1) och 1x levande cellkärnfärgning (Hoechst 33342) i 10 ml reducerat serummedium utan fenolrött (Opti-MEM) 30 minuter före avbildning. Låt levande/döda reagensmedier komma till RT. Förvara levande/döda reagensmedier från direkt ljus på grund av fluorescensblekning.
- Ta bort media från 3 brunnar som innehåller cellmodeller/2D-kontroller, för att noggrant förhindra gelstörning. Tvätta cellmodellerna en gång med RT steril PBS. Tillsätt 100 μl levande/dött reagensmedium till varje brunn för en 96-hålsplatta eller 25 μL för en 384-hålsplatta.
- Inkubera modellerna i 30 minuter vid 37 °C och 5 % CO2 .
- Efter inkubationen är modellerna redo för avbildning. Utför avbildning på valfritt standardmikroskop med röda (647 nm, döda celler), gröna (488 nm, levande celler) och blå (405 nm, nukleär fläck) excitationskanaler. För bästa resultat i 3D-modeller, bildmodeller med hjälp av ett konfokalmikroskop med högt innehåll och utför avbildning med hjälp av en Z-stackfunktion vid 4x eller 10x förstoring.
OBS: I denna studie avbildades cellmodeller med hjälp av INCell Analyzer 6500HS (high-content imaging system), och analysen utfördes med hjälp av Signals Image Artist (bildanalysplattform, se steg 4.7). - När avbildningen är klar, returnera cellmodellerna till cellodlingsinkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2 .Utelämna dock cellmodeller som används för viabilitetsanalys från ytterligare studier på grund av de levande/döda reagensmedierna på långsiktig viabilitet.
- Analys av bilder på bildanalysplattformen
- Välj varje plan i Z-stackbilden i programvaran. Kombinera plana bilder som en projektionsbild med maximal intensitet.
- Skapa en ny analys genom att välja den bioprintade modellen som en intresseregion (ROI) genom att identifiera fluorescens från den levande cellkanalen vid 488 nm (se till att alla celler är valda under ROI).
- Inom det intressanta området kan du använda avbildningsprogrammet för att identifiera antalet celler i ROI genom kärnfärgningskanalen (405 nm), antalet levande celler i ROI med 488 nm-kanalen och antalet döda celler i ROI med 647 nm-kanalen.
- Kör analysen på alla brunnar för levande/döda behandlade cellmodeller och exportera datatabellen som innehåller ROI-area, totalt cellantal, antal levande celler och antal döda celler.
- Beräkna antalet levande och döda celler i procent av det totala cellantalet per analysdag.
5. Immunfärgning och cellpopulationsanalys
- Före fixering, ta bort media från cellmodellerna och tvätta modellerna en gång i PBS.
- Fixera celler med 4% (v/v) paraformaldehyd i PBS vid RT i 20 min.
VARNING: Allt arbete med paraformaldehyd måste utföras enligt laboratorieprocedurer. - Aspirera 4 % (v/v) paraformaldehydlösning från modellerna och tvätta modellerna fyra gånger i PBS för att helt ta bort paraformaldehyd.
- Permeabilisera cellmodellerna med 0,2 % triton-X i 30 min vid RT och tvätta tre gånger med PBS.
- Blockera cellmodellerna med 10 % (v/v) normalt åsneserum (NDS) i 3 timmar vid RT.
- Ta bort den blockerande lösningen och tillsätt primära antikroppar (utspädda i 1 % v/v NDS i PBS) till modellerna. Om du utför analys av cellpopulationsförhållandet (se steg 5.11), se till att inkludera cellmodeller som är samfärgade för Β-III-tubulin (med röd AF647-konjugering) och GFAP (med grön AF488-konjugering). Inkubera modeller med primära antikroppar i 24 timmar vid 4 °C.
- Efter primär inkubation tvättas modellerna färgade med konjugerade primära antikroppar tre gånger i PBS och motfärgas med 20 μM Hoechst i 30 min. Bilden beskrivs i steg 5.10.
- Tvätta modellerna färgade med okonjugerade primära antikroppar tre gånger i PBS och tillsätt sekundära antikroppar (utspädda i 1% v/v NDS i PBS). Inkubera i 24 timmar vid 4 °C.
- Ta bort sekundära antikroppar genom att tvätta tre gånger i PBS och motfärga modellerna med 20 μM Hoechst i 30 minuter före avbildning.
- Utför avbildning på standardmikroskop med röda (647 nm) och gröna (488 nm) excitationskanaler. Men för bästa resultat i 3D-modeller, bildmodeller med hjälp av ett konfokalmikroskop med högt innehåll och utför avbildning med hjälp av en Z-stackfunktion vid 4x eller 10x förstoring.
- Analys av cellpopulationskvoter på bildanalysplattformen
- Få en analys av cellpopulationer med hjälp av modeller samfärgade för GFAP (med AF488-konjugering) och B-III-tubulin (med AF647-konjugering).
- Välj varje plan i Z-stackbilden i programvaran och kombinera planbilderna som en projektionsbild med maximal intensitet.
- Skapa en ny analys genom att välja den bioprintade modellen som ROI genom att identifiera fluorescens från Β-III-tubulinkanalen vid 647 nm (se till att all cellinnehållande area är vald under ROI).
- Inom ROI, använd programvaran för att identifiera antalet celler i Hoechst-kanalen (405 nm), antalet GFAP+-astrocyter i ROI med 488 nm-kanalen och antalet Β-III-tubulin+-celler i ROI med 647 nm-kanalen.
- Kör analysen på alla samfärgade cellmodellbrunnar och exportera datatabellen som innehåller ROI-area, totalt cellantal, antal GFAP+-celler och antal B-III-tubulin+-celler.
- Beräkna antalet GFAP+- och B-III-tubulin+-celler i procent av det totala celltalet.
Representative Results
Analys av neurittillväxt
I detta protokoll bioprintades iPSC-härledda glutamaterga neuroner och astrocyter i samkultur till en hydrogelmatris med hjälp av 3D-bioprintern. Under de första 7 dagarna efter tryckning avbildades cellerna var 12:e timme med hjälp av ett levande cellmikroskop. Efter bioprintning bör cellerna ha en rundad morfologi och bör spridas över hela hydrogelmatrisen och gradvis förändras för att bilda mindre cellkluster med få utsprång under de första dagarna av odlingen (se kompletterande video 1 för representativ hälsosam celltillväxt). På dag 4 kommer friska celler att migrera genom gelén för att bilda större kluster, som är sammankopplade genom neuritutväxter. På dag 7 bör nästan inga enskilda celler finnas kvar, de sammankopplade buntarna av neuriter och astrocytiska utskott bör se förstärkta ut, och många mindre neuritutväxter kan ses bildas från klustren (Figur 2A). Med hjälp av en serie levande cellljusfältsbilder tagna under den 7 dagar långa tillväxtperioden utfördes en analys av neuritutväxt enligt beskrivningen i avsnitt 3. Denna analys visade att neuritutväxten ökar på ett nästan linjärt sätt (R2-värde = 0,84) mellan12 timmar och 156 timmar (figur 2B). Under denna period av neuritutväxt ökar cellkroppskluster också i storlek (se kompletterande video 1), vilket tyder på cellmigration genom hydrogelen.
Cellviabilitet och populationskvot
I detta protokoll används en koncentration på 20 miljoner celler/ml, bestående av 15 miljoner neuroner/ml och 5 miljoner astrocyter/ml, för bioprintning av cellmodellerna. Med hjälp av färgning av levande celler med calcein-AM (levande celler), etidiumhomodimer-1 (döda celler) och en kärnfärgning kan antalet celler som överlever under en 7-dagarsperiod beräknas enligt avsnitt 4 (figur 3A). Cellviabilitetsresultat för representativa kulturer visas för dag 4, där 72 % ± 1 % (medelvärde ± SEM) av det totala antalet celler är levande och visar färgning för Calcein-AM, medan 29 % ± 2 % (medelvärde ± SEM) totala celler är döda och visar färgning med etidiumhomodimer-1 (Figur 3B). Representativa bilder av cellfärgning med Calcein-AM och etidiumhomodimer-1 kan ses i kompletterande figur 1. Det bör noteras att cellöverlevnadsvärden för 3D-kulturer inte direkt kan jämföras med 2D-kulturer, eftersom döda celler hålls kvar i hydrogelen och inte kommer att avlägsnas under cellmatningsprocesser.
Med hjälp av den immunofluorescerande färgningen för Β-III-tubulin och GFAP, som beskrivs i avsnitt 5 och i figur 4, kan bildanalys utföras för att bestämma cellpopulationsförhållandena mellan neuroner och astrocyter (figur 3A). Av det totala antalet celler per modell i representativa kulturer representerar Β-III-tubulinpositiva neuroner 49 % ± 3 % (medelvärde ± SEM), medan GFAP-positiva astrocyter representerar 30 % ± 4 % (medelvärde ± SEM). Detta ger ett förhållande på 1:1,5, astrocyter respektive neuroner. Detta lämnar en rest på totalt 21 % celler per modell, som inte färgar för någon av cellmarkörerna. Eftersom cellviabilitetsanalysen visade att ett medelvärde på 29 % av cellerna inte är livsdugliga vid dag 4, är det troligt att dessa celler är döda i hydrogelen.
Uttryck av cellmarkörer
Morfologin hos de bioprintade nervcellerna och astrocyterna utvärderades genom immunfärgning för neuronal celltypsmarkör (Β-III tubulin) och astrocytisk markör (GFAP). I de representativa odlingarna som visas är immunfärgning lokaliserad till enskilda celltyper, vilket visar frisk cellmorfologi, där båda celltyperna uppvisar utväxt av cellulära utskott (Figur 4A,B). Eftersom hydrogel- och cellstrukturerna är tredimensionella representerar varje bild endast ett snitt genom strukturen i figur 4A,B. Figur 4C visar en sammanslagen stapel av bilder i hela hydrogelen, som visar bilder av celllokalisering i X-, Y- och Z-planen. Figur 4D visar immunfärgning endast för B-III-tubulin; Framhäva finare neuritutväxter från cellkroppens kluster. För att ytterligare undersöka fenotypen hos de glutamaterga nervcellerna kan immunfärgning för den glutamaterga jonreceptormarkören, GluR2, utföras. I figur 4E har område 4E.1 (infällt) markerats för att visa punktfärgning med högre upplösning längs neuritknippena. Detta bekräftar därför att neuroner i denna samkultur har en glutamatergisk fenotyp. I alla immunfärgningsbilder kan immunofluorescerande färgade icke-cellstrukturer observeras som omger cellklustren och neuriterna. Det är troligt att dessa strukturer representerar rester som hålls kvar i hydrogelen i kombination med mindre mängder icke-specifika antikroppar som binder till hydrogelen. Detta förväntas i bioprintade kulturer, eftersom döda celler och skräp inte avlägsnas under cellmatning i 3D-ställningsmodeller. En representativ bild av immunfärgning med negativ kontroll visas i kompletterande figur 2 för en demonstration av icke-specifik hydrogelbindning av sekundära antikroppar.
Figur 2: Glutamaterga neuroner och astrocyter bioprintades in i hydrogelmatrisen med hjälp av bioprintern och avbildades var 12:e timme med hjälp av ett ljusfältsmikroskop . (A) Ett exempel på en ljusfältsbild som tagits av cellkulturer under analysen. Bilden representerar en tidpunkt på 156 timmar och skalstrecket på 400 μm. (B) Den genomsnittliga längden på neuritutväxter (μm) från odlingarna uppmätta med hjälp av NeuronJ-paketet för ImageJ. Varje datapunkt är n = 3 neuriter, och data visas som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: En koncentration på 20 miljoner celler/ml aktivatorlösning användes för bioprintning av cellmodellerna. (A) Cellviabiliteten beräknades med hjälp av färgämnen från levande/döda celler (Calcein-AM respektive etidiumhomodimer-1). Värdena visar att 72 % ± 1 % (medelvärde ± SEM, n = 3) av det totala antalet celler per brunn är levande och 29 % ± 2 % (medelvärde ± SEM, n = 3) av cellerna är döda av den totala cellpopulationen per brunn vid dag 4. Värdena som visas representerar medelvärdet ± SEM. (B) Cellpopulationernas procentuella andel av neuroner och astrocyter per brunn beräknades genom bildanalys av färgning som visas i figur 4. Neuroner representerar procentandelen celler som färgar positivt för Β-III-tubulin vid dag 7 (49 % ± 3 %, medelvärde ± SEM, n = 3), medan astrocyter representerar procentandelen celler som färgar positivt för GFAP vid dag 7 (30 % ± 4 %, medelvärde ± SEM, n = 3). Värdena som visas representerar medelvärdet ± SEM. All avbildning för beräkningar som visas i figur 3 utfördes på ett konfokalt bildsystem, och alla analyser utfördes på bildanalysplattformen och GraphPad Prism enligt metoder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uttryck av neurala celltypsmarkörer i 3D-bioprintade samkulturer av glutamaterga neuroner och astrocyter vid dag 7 . (A,B) Immunofluorescensfärgning av neuronal markör Β-III-tubulin och astrocytmarkör GFAP, avbildad på en inverterad mikroskopplattform vid 10x förstoring. Skalstaplarna representerar 100 μm. (C) Immunofluorescensfärgning av neuronal markör β-III tubulin och astrocytmarkör GFAP samfärgad med Hoechst, visad i XYZ-planvy, avbildad på ett konfokalt avbildningssystem vid 10x förstoring. Skapad på bildanalysplattformen. Skalstrecket representerar 100 μm. (D) Immunofluorescensfärgning av neuronal markör β-III-tubulin samfärgat med Hoechst, avbildat på ett konfokalt bildsystem vid 20x förstoring. Skalstapeln representerar 100 μm. (E) Immunofluorescensfärgning av glutamatergmarkören GluR2 samfärgad med Hoechst, avbildad på en inverterad mikroskopplattform vid 10x förstoring. Ruta 3E.1 visar markerade områden med GluR2-färgning. Skalstapeln representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video 1: Glutamaterga neuroner och astrocyter bioprintades in i hydrogelmatrisen med hjälp av bioprintern och avbildades var 12:e timme med hjälp av ett ljusfältsmikroskop. Video av ljusfältsbilder tagna av cellkulturer under analys, tidpunkter anges i det nedre högra hörnet och skalstaplar representerar 400 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur 1: Exempelbilder av levande/död analys av bioprintade neuroner och astrocyter på dag 4. Calcein-AM-färgning visas i grönt (488 nm) och etidiumhomodimerfläck visas i rött (647 nm). Bilden visas i XYZ-planvyn, skapad på bildanalysplattformen . Skalstapeln representerar 100 μm. (A) Avbildningen utfördes med hjälp av ett konfokalt bildsystem med 4x förstoring. (B) Avbildningen utfördes med hjälp av ett konfokalt bildsystem med 10x förstoring Klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 2: Exempel på negativ kontrollbild efter immunofluorescensfärgning. Primära antikroppar utelämnades och gröna (488 nm) och röda (647 nm) sekundära antikroppar användes enligt immunfärgningsprotokoll. Bilden visas i XYZ-planvyn, skapad på bildanalysplattformen. Skalstapeln representerar 100 μm. Avbildningen utfördes med hjälp av ett konfokalt bildsystem med 10x förstoring. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Behovet av noggranna modeller av CNS har aldrig varit större, och begränsningar hos tvådimensionella (2D) traditionella cellodlingsmodeller har drivit en generation av komplexa CNS-modeller under de senaste åren19. Många komplexa 3D-modeller som representerar interaktioner mellan neurala celltyper och ECM har dock begränsningar som skulle förhindra tillämpningen av dessa modeller i industriella processer 6,20,21. I detta protokoll utvecklar vi en 3D-samodlingsmodell av humana iPSC-härledda neuroner och astrocyter, som syftar till att lösa några av dessa begränsningar med hjälp av 3D-bioprintningsteknik för att skapa en bioaktiv hydrogelställning i 96-brunnars och 384-brunnars format.
Metodiken för att utveckla dessa modeller har förenklats genom programvaran för design av plåtkartor, automatiskt genererade utskriftsprotokoll och guidad utskriftsprocess från bioprintern. På grund av den känsliga karaktären hos de känsliga iPSC-härledda celltyperna som används i detta protokoll bör dock följande kritiska steg vid upptining och odling vara försiktiga. För det första har införandet av ROCK-hämmare (ROCKi) flera fördelar under hela bioprintningsprocessen och under tidig odling. Cellupptining är en kritisk punkt där neuronerna kan uppleva en stressreaktion, och felaktiga upptiningsprotokoll kan minska chanserna att överleva22. Det rekommenderas vanligtvis att tina celler, tillsätta media och höja cellerna till inkubatortemperatur så effektivt som möjligt23. Under bioprintningsprocessen som beskrivs i detta protokoll är det dock nödvändigt att neuroner och astrocyter återsuspenderas i en aktivatorlösning snarare än media, och cellerna kommer inte att höjas över rumstemperatur förrän i slutet av utskriftskörningen (upp till 30 minuter efter upptining). Således är det absolut nödvändigt att tillsätta ROCKi till mediet omedelbart efter upptining och inkludera detta under de två centrifugeringsstegen (steg 2.1--2.7 och 1.3.15-1.3.20) för att hämma cellstressvägar, vilket skulle resultera i lägre viabilitetsnivåer24. Dessutom har ROCKi visat sig främja neuritutväxt och förbättra neuronal mognad25. Således fortsätter ROCKi-tillskott i 48 timmar efter bioprintning. Det är dock absolut nödvändigt att ta bort ROCKi-tillskott efter 48 timmar för att säkerställa fullständig tvättning under de efterföljande mediebytena innan cellerna används för analys.
Ytterligare ett steg som kräver kritisk uppmärksamhet är vid tillägg av media efter utskrift och byte av media (steg 2.8-2.13). Den bioprintade hydrogelställningen har en motsvarande biomekanisk styvhet på endast 1,1 kPa, vilket motsvarar grå substans. Som beskrivs i steg 2.10 är det viktigt att pipettera försiktigt in i sidan av brunnen under mediatillsats och aspiration för att förhindra störningar. Detta är särskilt relevant för 384-brunnars plattor, där gelnivån tar upp en högre andel av den totala brunnsvolymen. Denna metod bör också användas i 2D-kontrollbrunnar för att förhindra kantlyft av celler och skjuvning av neuritutväxter. Författarna vill också belysa vikten av steril teknik inom bioprintern, som bör behandlas med samma försiktighet som ett biosäkerhetsskåp som används för iPSC-härledda cellkulturer. Detta inkluderar steril filtrering av 70 % EtOH och dH2O som används vid greenlighting och utskrift, att hålla lock på patronerna och plattorna medan du flyttar händerna in och ut ur bioprintern och att dekontaminera ytorna inuti bioprintern med 70 % etanolservetter före och efter utskrift.
Den bioprintade hydrogelställningen, bildad av biobläck och aktivatorlösningar, som valts ut för att utveckla denna modell är utvald från en rad biobläck och aktivatorlösningar som utvecklats av Inventia Life Science för användning i bioprintern RATRUM. Laminin och hyaluronsyra identifierades som molekyler av relevans för iPSC-härledd neuronal mognad på grund av deras roll i axonal vägledning, synapsbildning och bildning av det perineuronala nätet26,27. Dessutom valdes en biomekanisk styvhet på 1,1 kPa, eftersom hydrogeler med lägre densitet har visat sig möjliggöra bättre neuritutväxt från neuroner12. Om ändringar görs i protokollet genom att använda neuroner och astrocyter som har differentierats internt eller från en annan kommersiell leverantör, rekommenderas att göra ett matrisurvalstest för att bestämma den mest stödjande hydrogelställningen15. Dessutom kan celldensiteten också behöva optimeras om förändringar av cellkällor görs för att säkerställa optimal livskraft och förhindra överbeläggning av hydrogeler. För alla modifieringar och felsökningar relaterade till bioprinterfunktionen rekommenderar författarna att man kontaktar tillverkare och hänvisar till tillverkarprotokoll.
CNS innehåller ett brett spektrum av neuronala subtyper och gliaceller, som alla finns i olika hjärnnischer och har specifika roller som bidrar till neural funktion28. Inom ramen för detta breda omfång representerar denna modell endast de två vanligaste celltyperna (astrocyter och excitatoriska glutamaterga neuroner). Viktiga celltyper som mikroglia, oligodendrocyter och blod-hjärnbarriärbildande endotelceller utelämnas från detta system. Inkludering av mikroglia kan vara av relevans i fokus på neuroimmuna interaktioner, och oligodendrocyter kan vara av intresse för sjukdomar som påverkar central myelinisering. Förutom sin roll i patologi utsöndrar celler såsom blod-hjärnbarriärbildande endotelceller läkemedelsmetaboliserande enzymer, vilket kan påverka användningen av denna modell för farmakokinetiska analyser29. En ytterligare begränsning i modellen kan vara förhållandet mellan astrocyter och neuroner; Förhållandet mellan astrocyter och neuroner varierar kraftigt mellan hjärnregioner, med föreslagna värden mellan 1:1 och 1:330,31. Denna modell har ett ungefärligt förhållande på 1:1,5 astrocyter till neuroner; Därför kanske denna modell inte är relevant för att modellera hjärnområden där astrocyter är vanligare, till exempel i områden med vit substans30.
Andra protokoll för att utveckla 3D-bioprintade samkulturmodeller har publicerats under de senaste åren. En publikation av Sullivan et al., 2021, presenterade en 3D-bioprintad neural modell med hjälp av iPSC-härledda neurala stamceller, som visar hög post-print-viabilitet och förbättring av neuronal funktion jämfört med 2D-kulturer32. I detta protokoll användes dock neurala stamceller som cellkälla och hölls i odling i 4 veckor. I detta protokoll användes kommersiellt tillgängliga iPSC-härledda glutamaterga neuroner och astrocyter. Detta gör det möjligt att etablera ett 3D-nätverk av samodlade celler på så lite som 7 dagar; Som framgår av neurittillväxtanalys börjar neuritutväxten inom 24 timmar och fortsätter på ett linjärt sätt under hela den 156-timmarsperiod för vilken celltillväxten övervakades. Den snabba etableringen av dessa nätverk kan delvis tillskrivas användningen av glutamaterga neuroner som använder optimerat doxycyklininducerbart genuttryck av NGN2, som visar uttryck av mogna neuronala subtypmarkörer inom 7 dagar, även i 2D-kultur33. Förkortningen av denna tillväxtperiod med hjälp av denna teknik är viktig för att implementera modeller inom den biofarmaceutiska industrin, eftersom analysutveckling kräver snabb vändning och utveckling av cellmodeller15.
Sammanfattningsvis visar denna modell potential för en 3D-modell av neuroner och astrocyter, som etableras snabbt och bekvämt för screeningändamål. Framtida tillämpningar för denna modelltyp kan vara för läkemedelsutveckling inom olika CNS-sjukdomar, med möjlighet att expandera till olika sjukdomar med hjälp av patient- eller genredigerade sjukdoms-iPSC-linjer. Dessutom gör användningen av doxycyklininducerbara NGN2-uttryck iPSC-härledda glutamaterga neuroner det möjligt för celler att nå mognad på kortare tid, vilket kan användas för att utveckla modeller av den åldrande hjärnan för neurodegenerationsforskning. Detta system skulle också kunna utvidgas genom användning av ytterligare celltyper i samodling, inklusive mikroglia och oligodendrocyter.
Disclosures
CW, NC och JB är anställda av Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, London, Storbritannien. YH är anställd av Merck Sharp & Dohme LLC, ett dotterbolag till Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Figur ett skapades med hjälp av Biorender.com.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Alex Volkerling, Martin Engel och Rachel Bleach för deras hjälp med att utveckla protokollet och återkopplingen på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 384-well plate | PerkinElmer | 6057300 | |
| 96-well plate | PerkinElmer | 6055300 | |
| Activator fluid F299 | Inventia Life Science | N/A | |
| Activator fluid F3 | Inventia Life Science | N/A | |
| B27 (50x) minus Vit A | Thermofisher | 12587010 | |
| Bioink fluid F261 | Inventia Life Science | N/A | |
| Bioink fluid F32 | Inventia Life Science | N/A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D5207 | |
| GlutaMAX (100x) | Thermofisher | 35050061 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Hoechst | Abcam | ab228551 | |
| Human BDNF Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7074 | |
| Human NT3 Recombinant Protein | Thermofisher | PHC7036 | |
| iCell Astrocytes | Fujifilm CDI | 1434 | |
| INCell Analyser 6500HS | Molecular Devices | N/A | high content imaging system |
| Incucyte S3 | Sartorius | N/A | |
| ioGlutamatergic Neurons (Large vial) | Bit.bio | e001 | |
| Laminin (1 mg/mL) | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1) | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Neurobasal media | Thermofisher | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Abcam | ab7475 | |
| NucBlue Live (Hoechst 33342) | Thermofisher | R37605 | |
| Opti-MEM | Thermofisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PEI 50% in H2O | Sigma Aldrich | 181978 | |
| Pierce Borate Buffer 20x | Thermofisher | 28341 | |
| Prism | GraphPad | Data analysis software | |
| Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2) | Abcam | ab206293 | |
| RASTRUM(TM) Bioprinter | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter |
| RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges | Inventia Life Science | N/A | Bioprinter Cartridges |
| RASTRUM(TM) Targeting plate | Inventia Life Science | N/A | Targeting plate |
| Rho kinase (ROCK) inhibitor | Abcam | ab120129 | |
| Sheep anti-GFAP NL493 conjugated | R&D systems | SC024 | |
| Signals Image Artist | PerkinElmer | N/A | Image analysis platform |
| Triton X-100 | Thermofisher | HFH10 | |
| Zeiss Axio Observer | Zeiss | N/A | Inverted microscope platform |
References
- Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
- Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1 (2020).
- Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , Springer, Singapore. (2019).
- Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22 (2021).
- Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
- Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
- Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
- Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
- Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159 (2019).
- Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760 (2022).
- Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242 (2019).
- Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
- Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165 (2018).
- Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
- Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876 (2021).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
- Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
- Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328 (2020).
- de Souza, N.
- Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
- Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960 (2021).
- Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
- Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799 (2022).
- Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
- Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
- Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
- Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
- Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
